Isolamento de capilares retinianos de camundongos e matriz subendotelial para medição de rigidez usando microscopia de força atômica

Summary

Recentemente, identificamos o enrijecimento capilar da retina como um novo paradigma para a disfunção retiniana associada ao diabetes. Este protocolo elabora as etapas para o isolamento dos capilares retinianos de camundongos e da matriz subendotelial das culturas endoteliais da retina, seguidas de uma descrição da técnica de medição da rigidez usando microscopia de força atômica.

Abstract

A degeneração capilar da retina é uma marca clínica dos estágios iniciais da retinopatia diabética (RD). Nossos estudos recentes revelaram que o enrijecimento capilar da retina induzido por diabetes desempenha um papel causal crucial e anteriormente não reconhecido na degeneração dos capilares retinianos mediada por inflamação. O aumento da rigidez capilar da retina resulta da superexpressão da lisil oxidase, uma enzima que reticula e enrijece a matriz subendotelial. Como se espera que o combate à RD no estágio inicial previna ou retarde a progressão da RD e a perda de visão associada, a matriz subendotelial e a rigidez capilar representam alvos terapêuticos relevantes e novos para o manejo precoce da RD. Além disso, a medição direta da rigidez capilar da retina pode servir como uma etapa crucial de validação pré-clínica para o desenvolvimento de novas técnicas de imagem para avaliação não invasiva da rigidez capilar da retina em animais e seres humanos. Com essa visão em mente, fornecemos aqui um protocolo detalhado para o isolamento e medição da rigidez dos capilares retinianos de camundongos e da matriz subendotelial usando microscopia de força atômica.

Introduction

Os capilares retinianos são essenciais para manter a homeostase retiniana e a função visual. De fato, sua degeneração no diabetes precoce está fortemente implicada no desenvolvimento de complicações que ameaçam a visão da retinopatia diabética (RD), uma condição microvascular que afeta quase 40% de todos os indivíduos com diabetes¹. A inflamação vascular contribui significativamente para a degeneração capilar da retina na RD. Estudos anteriores demonstraram um papel importante para pistas moleculares e bioquímicas aberrantes na inflamação vascular da retina induzida por diabetes ^2,3. No entanto, trabalhos recentes introduziram um novo paradigma para a patogênese da RD que identifica o enrijecimento capilar da retina como um determinante crucial, mas anteriormente não reconhecido, da inflamação e degeneração vascular da retina ^4,5,6.

Especificamente, o aumento da rigidez capilar retiniana induzido pelo diabetes é causado pela regulação positiva da enzima de reticulação do colágeno lisil oxidase (LOX) nas células endoteliais da retina (CEs), que enrijece a matriz subendotelial (membrana basal)^4,5,6. O enrijecimento da matriz, por sua vez, enrijece os CEs retinianos sobrejacentes (devido à reciprocidade mecânica), levando ao aumento geral da rigidez capilar da retina⁴. Crucialmente, esse enrijecimento capilar da retina induzido por diabetes por si só pode promover a ativação da CE retiniana e a morte da CE mediada por inflamação. Essa regulação mecânica dos defeitos retinianos do EC pode ser atribuída à mecanotransdução endotelial alterada, o processo pelo qual pistas mecânicas são convertidas em sinais bioquímicos para produzir uma resposta biológica ^7,8,9. É importante ressaltar que pistas mecânicas alteradas da CE e estrutura da matriz subendotelial também foram implicadas na degeneração vascular da coroide associada à degeneração macular relacionada à idade precoce (DMRI)10,11,12, o que atesta as implicações mais amplas da mecanobiologia vascular em doenças degenerativas da retina.

Notavelmente, o enrijecimento capilar da retina ocorre no início do diabetes, o que coincide com o início da inflamação da retina. Assim, o aumento da rigidez capilar retiniana pode servir tanto como alvo terapêutico quanto como marcador diagnóstico precoce para RD. Para isso, é importante obter medições confiáveis e diretas da rigidez dos capilares retinianos e da matriz subendotelial. Isso pode ser alcançado usando um microscópio de força atômica (AFM), que oferece uma técnica única, sensível, precisa e confiável para medir diretamente a rigidez das células, matriz extracelular e tecidos¹³. Um AFM aplica a força mínima (nanoNewton-nível) do recorte na amostra cuja a rigidez determina a extensão a que o modilhão de recuo do AFM se dobra - mais dura a amostra, mais o modilhão se curva, e vice-versa. Usamos AFM extensivamente para medir a rigidez de células endoteliais cultivadas, matrizes subendoteliais e capilares retinianos de camundongos isolados 4,5,6,11,12. Essas medições de rigidez do AFM ajudaram a identificar a mecanobiologia endotelial como um determinante chave da patogênese da DR e da DMRI. Para ajudar a ampliar o escopo da mecanobiologia na pesquisa da visão, aqui fornecemos um guia passo a passo sobre o uso de AFM para medições de rigidez de capilares retinianos de camundongos isolados e matriz subendotelial.

Protocol

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e aprovados pelos Comitês Institucionais de Uso de Animais e Cuidados (IACUC; número de protocolo ARC-2020-030) na Universidade da Califórnia, Los Angeles (instituição OLAW de garantia de bem-estar animal número A3196-01). O protocolo a seguir foi realizado usando capilares retinianos isolados de camundongos C57BL/6J machos adultos (20 semanas de idade) pesando ~25 g (camundongos diabéticos) e ~32 g (camundongos não diabéticos; Laboratório Jackson).

1. Isolamento dos capilares retinianos do rato para a medida da rigidez do AFM (dias 1-4)

NOTA: Este protocolo, relatado em um estudo recente⁴, detalha a enucleação e fixação leve do olho do camundongo, isolamento retiniano e digestão de tripsina e subsequente montagem da vasculatura retiniana resultante em lâminas de microscopia para medição da rigidez do AFM.

1. Enucleação e fixação leve (Dia 1)
   1. Depois de sacrificar o camundongo com exposição ao dióxido de carbono seguida de luxação cervical, insira micro pinças atrás do globo ocular, segure a fixação muscular e puxe cuidadosamente o olho sem apertar as micropinças com muita força, o que pode cortar o nervo óptico.
   2. Colocar o olho enucleado em formol a 5% (v/v) em PBS durante 24 h a 4 °C para uma fixação ligeira.
      NOTA: Com base na experiência⁴, olhos não fixados ou mais levemente fixos produzem capilares frágeis que se fragmentam durante a preparação da amostra de AFM e medição de rigidez.
2. Isolamento da retina (dia 2)
   1. Coloque o olho fixo em um pedaço de papel encerado sob um microscópio de dissecação. Em seguida, usando uma micropinça, segure os remanescentes do músculo e do nervo óptico ligados à parte externa do olho posterior e oriente o olho de forma que a córnea fique voltada para um lado (Figura 1).
   2. Usando uma lâmina cirúrgica, faça uma incisão 1-2 mm atrás e paralela ao limbo (junção córnea-esclera). Em seguida, enquanto segura o olho no lugar com a micropinça, aplique uma força para baixo com a lâmina e continue pressionando até que o segmento anterior do olho esteja totalmente separado da extremidade posterior (Figura 1). Descarte o segmento anterior e a lente. Não serre para frente e para trás, pois isso pode causar danos à retina.
   3. Transfira o segmento posterior (esclera, coróide e retina) para uma placa de 6 cm cheia de PBS (pH 7,4).
   4. Usando uma microespátula e, simultaneamente, segurando suavemente o nervo óptico com uma micropinça, retire a retina. Conservar a retina num tubo de microcentrífuga de 2 ml contendo PBS a 4 °C até ao isolamento capilar.
       
3. Enxágues retinianos
   1. Para enxaguar uma retina, encha seis poços de uma placa de 12 poços com 1 mL de H₂O (ddH₂O) destilado. Em seguida, usando uma pipeta de Pasteur invertida, transfira a retina do tubo de microcentrífuga de 2 mL para o primeiro poço.
   2. Enxágue a retina no agitador orbital a 120 RPM por 30 min em temperatura ambiente (RT).
   3. Usando uma pipeta P1000, pipete cuidadosamente a água para cima e para baixo adjacente à retina, soprando água na retina para causar agitação suave.
   4. Usando a pipeta de vidro invertido, transfira a retina para o segundo poço e repita as etapas 1.3.2 e 1.3.3 4 vezes, com cada enxágue feito em um novo (ddH₂O-contendo)
   5. Finalmente, transfira a retina para o sexto poço e enxágue-a durante a noite (O/N) em RT no agitador orbital ajustado a 100 RPM para facilitar a separação da neuroglia retiniana dos vasos sanguíneos durante a digestão da tripsina.
4. Digestão de tripsina retiniana (Dia 3)
   1. Prepare uma solução de tripsina a 10% (p / v) dissolvendo o pó de tripsina 1: 250 em tampão Tris (pH 8; 0,1 M). Misture delicadamente invertendo o tubo cônico várias vezes para minimizar a formação de bolhas, o que dificulta a confirmação da solubilidade da tripsina.
   2. Equilibre a solução de tripsina a 10% em banho-maria a 37 °C por 10-15 min. Uma vez que o pó de tripsina esteja completamente dissolvido, filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,2 μm.
   3. Em uma placa de 12 poços, adicione 2 mL / poço / retina da solução filtrada de tripsina a 10%. Adicione um pouco de solução extra de tripsina no poço vizinho (para equilibrar as paredes da pipeta de vidro para as etapas subsequentes).
   4. Adicione 3 mL de ddH₂O em três poços de uma placa de 6 poços (dedique esses três poços para uma retina).
   5. Em um tubo cônico de 15 mL, insira uma ponta P200 antes de adicionar 4 mL da solução filtrada de tripsina a 10%. Transfira este tubo cônico para o banho de 37 ° C para permitir que a ponta seja embebida em tripsina por 2-3 min, pois isso ajuda a evitar que a retina grude nas paredes da ponta nas últimas etapas.
   6. Após o enxágue O/N da retina (da etapa 1.3.5), use uma pipeta P1000 para pipetar cuidadosamente a água para cima e para baixo adjacente à retina, esguichando água na retina para causar agitação suave.
   7. Usando uma pipeta de vidro invertido, transfira a retina lavada para o poço contendo tripsina da placa de 12 poços (da etapa 1.4.3). Certifique-se de que a retina seja transferida com uma quantidade mínima de ddH₂O residual para não diluir significativamente a solução de tripsina. Incubar durante 3 h a 37 °C.
   8. Centralizando a ponta P200 embebida em tripsina (do passo 1.4.5) na área do nervo óptico, pipetar suavemente toda a rede vascular para cima e para baixo para dissociar o tecido não vascular¹⁴.
   9. Usando uma pipeta de vidro invertido pré-enxaguada em tripsina (pipetando tripsina para cima e para baixo 5 vezes), transfira a vasculatura retiniana para o primeiro poço contendo ddH₂O da placa de 6 poços (da etapa 1.4.4).
   10. Gire a placa e pipete a vasculatura para cima e para baixo usando uma pipeta de vidro invertida enxaguada com tripsina para remover qualquer tecido não vascular residual.
   11. Utilizando a pipeta de vidro, transfira a vasculatura retiniana para o segundo poço contendo ddH2O da placa de 6 poços e conserve a 4 °C até à montagem na corrediça para medição da rigidez do AFM.
       NOTA: A vasculatura retiniana hidratada (em PBS) está estruturalmente intacta a 4 °C por até 2 semanas. No entanto, as medições de rigidez de rotina devem ser feitas a partir de capilares recém-isolados.
5. Montagem da vasculatura retiniana para medição da rigidez do AFM (Dia 4)
   1. Usando uma pipeta de vidro enxaguada com tripsina invertida, transfira a vasculatura retiniana para o terceiro poço contendo ddH₂O da placa de 6 poços para remover qualquer solução de tripsina residual.
   2. Limpe completamente (usando ddH₂O e tecido limpador) uma lâmina de microscopia de superfície carregada que será usada para montar a rede vascular para medição de rigidez AFM.
      NOTA: A superfície carregada da corrediça fornece uma ligação forte para a rede vascular durante a medição do AFM.
   3. Rotule o slide e desenhe uma região circular de 4-5 cm ao redor do centro com uma caneta hidrofóbica para evitar derramamento de água durante as etapas subsequentes.
   4. Usando uma pipeta de vidro enxaguada com tripsina invertida, transfira cuidadosamente a vasculatura da retina para o centro da região marcada.
   5. Usando uma pipeta P200, remova cuidadosamente o máximo de água em excesso possível de uma borda sem aspirar acidentalmente a vasculatura para a ponta.
   6. Coloque a lâmina em um gabinete de biossegurança (coifa BSL-2) próximo à parte frontal (malha filtrada) e deixe a água residual evaporar.
   7. Quando a vasculatura estiver quase seca, sob um microscópio de contraste de fase (ampliação de 4x), reidratar cuidadosamente a vasculatura adicionando lentamente ddH₂O com uma pipeta P200 em um lado da região marcada. Adicionar ddH₂O diretamente na vasculatura faz com que ela se desprenda.
   8. Tome imagens do contraste da fase da vasculatura reidratada em ampliações de 4x e de 20x para assegurar-se de que tem a boa integridade estrutural e é espalhada corretamente para fora (não dobrando-se em si mesma) e unida à corrediça de vidro, que são critérios essenciais para a medida segura da rigidez do AFM.

2. Obtenção de matriz subendotelial a partir de culturas de células endoteliais microvasculares (REC) da retina (Dias 1-17)

NOTA: Este protocolo, adaptado de Beacham et al.¹⁵ e relatado em estudos recentes ^4,5,6, descreve a cultura de REC em lamínulas de vidro modificadas, seguida de descelularização para obtenção de matriz subendotelial para posterior medição da rigidez do AFM.

1. Preparação de lamínulas de vidro revestidas com gelatina e revestimento celular (Dia 1)
   NOTA: Execute o revestimento de gelatina e as etapas subsequentes de enxágue de PBS⁺⁺ em uma capela de cultura de tecidos antes de passar para uma capela de exaustão química para as etapas subsequentes de tratamento com glutaraldeído e etanolamina.
   1. Coloque uma lamínula de vidro circular autoclavada de 12 mm de diâmetro por alvéolo de uma placa estéril de 24 poços e adicione 500 μL de gelatina estéril pré-aquecida a 0,2% (p/v) (diluída em PBS contendo cálcio e magnésio; PBS⁺⁺) a cada poço contendo lamínula. Incubar durante 1 h a 37 °C.
   2. Aspire a solução de gelatina, lave as lamínulas uma vez com PBS⁺⁺ estéril e reticule a gelatina revestida adicionando 500 μL de glutaraldeído a 1% (v/v) por 30 min em RT.
   3. Colete e descarte adequadamente (de acordo com as diretrizes institucionais) a solução de glutaraldeído antes de enxaguar as lamínulas com PBS⁺⁺ por 5 min em um agitador orbital a 100 RPM em RT. Repita esta etapa de enxágue 5 vezes. Durante os três primeiros enxágues, levante as lamínulas usando uma pinça estéril para permitir o enxágue completo do glutaraldeído. Qualquer quantidade residual pode reduzir a viabilidade celular.
   4. Adicione 800 μL de etanolamina 1 M à lamínula reticulada de gelatina por 30 min em RT para extinguir quaisquer vestígios remanescentes de glutaraldeído no poço.
   5. Colete e descarte adequadamente (de acordo com as diretrizes institucionais) da solução de etanolamina e enxágue as lamínulas 5 vezes com PBS⁺⁺ por 5 min em um agitador orbital a 100 rpm em RT. Durante os três primeiros enxágues, levante as lamínulas usando uma pinça estéril para permitir o enxágue completo da etanolamina. Qualquer quantidade residual pode reduzir a viabilidade celular.
   6. As lamínulas reticuladas estão agora prontas para o revestimento celular.
      NOTA: Embora rotineiramente plaqueemos as células imediatamente após a preparação da lamínula, pode valer a pena comparar o revestimento celular em lamínulas de gelatina reticuladas armazenadas em PBS ⁺⁺ a 4 ° C por 1-2 dias.
   7. Em condições estéreis em uma capa de cultura de tecidos, as células endoteliais microvasculares da retina (RECs) em placas em 500 μL de meio/poço a uma densidade que atinge 100% de confluência em 24 h, conforme confirmado por microscopia de contraste de fase.
      NOTA: Atingir a confluência dentro de 24 h é importante, pois a quiescência REC resultante aumentará a capacidade das células de secretar matriz (consulte a etapa a seguir). Em nossa experiência com RECs humanos, uma densidade de plaqueamento de 4 x 10⁴ células / cm² é suficiente para atingir a confluência em 24 h. No entanto, como o tamanho do REC varia de acordo com a espécie (por exemplo, os RECs de camundongos são significativamente menores), a densidade inicial do revestimento pode precisar ser otimizada.
2. Produção de matriz subendotelial por cultura REC (Dia 2-16)
   1. Depois que as células atingirem a confluência (~ 24 h), substitua o meio de cultura por meio fresco suplementado com ácido ascórbico filtrado estéril (concentração final de 200 μg / mL).
      NOTA: Qualquer tratamento com REC com fatores de risco de doença (por exemplo, glicose alta, produtos finais de glicação avançada, etc.) ou agentes farmacológicos pode começar agora, juntamente com o tratamento com ácido ascórbico.
   2. Troque o meio de cultura suplementado com ácido ascórbico em dias alternados por 15 dias.
      NOTA: O ácido ascórbico é instável em solução. Prepare uma solução fresca de estoque 100X a cada dois dias para suplementação média.
3. Descelularização de culturas REC para obtenção da matriz subendotelial (Dia 16)
   1. Após 15 dias de tratamento com ácido ascórbico, remova o meio e enxágue as células com PBS sem cálcio / magnésio.
   2. Descelularize as culturas REC adicionando 250 μL / por poço de tampão de descelularização quente (hidróxido de amônio 20 mM e 0,5% Triton X-100 em PBS) por ~ 2-3 min. Confirme a remoção das células em um microscópio de contraste de fase (aumento de 10x).
   3. Remova suavemente o tampão de descelularização sem perturbar a matriz subendotelial secretada por REC e adicione 0,5 mL de PBS a cada poço.
      NOTA: Para garantir que a matriz subendotelial não se desprenda durante esta e as etapas de enxágue subsequentes, realize um enxágue suave apenas com uma pipeta P1000. Não realize aspiração a vácuo.
   4. Armazene as placas a 4 °C durante a noite para estabilizar a matriz secretada por REC.
4. Tratamento DNase da matriz subendotelial para remoção de detritos celulares (Dia 17)
   1. Enxágue a matriz subendotelial da etapa 2.3.4 com 800 μL de PBS / poço.
   2. Remova suavemente o PBS e incube a matriz com 200 μL de DNase I livre de RNase (30 unidades K) a 37 ° C por 30 min para remover todos os vestígios de detritos celulares. Verifique a eficiência do tratamento com DNase procurando cuidadosamente por detritos celulares em um microscópio de contraste de fase.
   3. Remova suavemente a solução de DNase I e enxágue a matriz subendotelial duas vezes com 800 μL de PBS/poço.
   4. Verifique se a matriz subendotelial fibrosa em macroescala é visível sob um microscópio de contraste de fase (ampliação de 10x). A visualização das fibras mais finas da matriz do nanoscale exige a exploração topográfica do AFM ou a imagem latente confocal de alta resolução de proteínas imunomarcadas da matriz na ampliação de 100x.
   5. Use imediatamente a matriz subendotelial fresca (não fixada) para a medida da rigidez do AFM.
   6. Após a medição do AFM, fixe as amostras da matriz com paraformaldeído a 1% (v/v) (15 minutos à temperatura ambiente) e armazená-las a 4 °C para imunomarcação com anticorpos contra proteínas da matriz subendotelial e/ou enzimas de reticulação.

3. Medição da rigidez do AFM

NOTA: Este protocolo, adaptado de um manual do usuário padrão do AFM e relatado em estudos recentes ^4,5, detalha a aquisição e análise de dados de rigidez dos capilares retinianos e da matriz subendotelial usando um AFM e um software de análise de dados. Embora as etapas descritas abaixo sejam baseadas em um modelo específico de AFM (consulte a Tabela de Materiais), os princípios subjacentes são geralmente aplicáveis a todos os modelos de AFM.

1. Seleção de sonda cantilever
   NOTA: Amostras biológicas macias requerem balanços macios que podem dobrar com o recuo da amostra enquanto as dimensões da sonda são selecionadas para corresponder às dimensões da amostra.
   1. Para medição de rigidez de vasos retinianos de camundongos com 5-8 μm de diâmetro, use uma sonda cantilever de raio de 1 μm com uma constante de mola (k) de 0,2-0,3 N/m. Para medição de rigidez de uma matriz subendotelial composta por fibras em nanoescala, use uma sonda cantilever de raio de 70 nm com uma constante de mola (k) de 0,06-0,1 N / m.
2. Montagem em consola
   1. No computador do AFM, abra o software que controla a unidade do AFM e a câmera unida a um microscópio do contraste de fase que seja usado para visualizar o modilhão e a amostra.
   2. Fixe o suporte do cantilever no trocador do cantilever e monte o cantilever selecionado no suporte usando uma pinça de relojoeiro sob um estereoscópio sem danificar fisicamente o cantilever. Aperte o parafuso no suporte para prender o cantilever.
   3. Coloque e trave o suporte cantilever na cabeça do AFM que está apoiada no suporte.
   4. Usando a função do motor de etapa no software do AFM, retire a cabeça do AFM ao ponto o mais alto e ajuste essa posição como o ponto zero no software. Esta etapa impede que o modilhão do AFM bata acidentalmente a fase da amostra ao montar a cabeça do AFM (etapa seguinte).
   5. Levante cuidadosamente a cabeça do AFM de seu suporte e monte-a no estágio de amostra do AFM, colocando as pernas em seus respectivos slots.
3. Alinhamento a laser
   NOTA: O alinhamento inicial do laser é realizado sem qualquer amostra (ou seja, no modo Ar), pois garante um alinhamento mais preciso do feixe de laser na ponta do cantilever (evitando a refração do laser no líquido). No entanto, como as amostras biológicas são imersas em um meio que tem um índice de refração diferente do ar, é importante realinhar o laser no meio antes da medição da rigidez.
   1. Para o alinhamento do laser no ar, coloque a cabeça do AFM na fase da amostra e use o objetivo 10x e a câmera unida para visualizar o modilhão no monitor na modalidade viva. O laser infravermelho está oculto da visão do usuário, mas é visível com uma câmera CCD.
   2. Selecione a função Espectroscopia de Força do Modo de Contato no software e abra a janela intitulada Alinhamento a laser.
   3. Usando os dois parafusos marcados com laser lateral na cabeça do AFM, concentre o feixe de laser no cantilever de modo que o valor da SOMA na janela de alinhamento do laser seja o mais alto. Para conseguir isso, focalize o laser no centro ou ao redor do cantilever.
   4. Usando os parafusos de ajuste do detector, ajuste o fotodetector de forma que o ponto do laser fique no centro da janela de alinhamento do laser.
   5. Usando o parafuso de ajuste do espelho, ajuste o espelho para garantir que o valor SUM esteja no valor mais alto possível.
      NOTA: Um alto valor de SUM garante uma avaliação sensível e precisa da rigidez da amostra. Assim, as etapas de alinhamento do laser e ajuste do espelho devem ser realizadas para obter o maior valor de SUM.
   6. Em seguida, para alinhamento a laser em líquido, adicione o meio de cultura desejado em um prato e monte-o firmemente no palco para evitar qualquer vibração ou desvio, o que cria artefatos de medição durante o recuo da amostra.
   7. Enquanto olha para a transmissão da câmera ao vivo focada no cantilever, abaixe-a no líquido usando a função de motor de passo.
   8. Repita as etapas 3.3.4 e 3.3.5 para garantir que o valor SUM permaneça o mais alto e que o ponto do laser esteja no centro da janela de alinhamento do laser.
4. Calibração da constante da mola cantilever
   NOTA: Embora as sondas cantilever venham com uma constante de mola calibrada pelo fabricante (k), é uma boa prática verificar independentemente seu valor (em líquido) antes do início de uma medição. Use uma superfície de vidro limpa que minimize as interações entre a sonda cantilever e a superfície do vidro.
   1. A força do ponto de ajuste aplicada pelo cantilever define a deflexão máxima do laser do cantilever que é permitida para um recuo de força. Defina-o inicialmente em 1.5 V. Se o cantilever não se aproximar dessa força de ponto de ajuste, aumente-a incrementalmente até recuar a amostra e gerar uma curva de indentação de força.
   2. Comprimento Z significa a distância máxima pela qual o z-piezo se retira depois que o cantilever atinge o ponto de ajuste durante o recuo da amostra. O comprimento Z deve ser pelo menos suficiente para garantir que a sonda cantilever se separe perfeitamente da amostra. Para calibração da constante de mola em uma superfície de vidro, defina o comprimento Z em 1 μm.
   3. A velocidade Z refere-se à velocidade na qual o z-piezo move o cantilever verticalmente para baixo em direção à amostra durante o recuo da força. Ele deve ser otimizado porque uma velocidade muito baixa capturará principalmente o comportamento viscoso da amostra, enquanto uma velocidade muito alta capturará principalmente o comportamento elástico. Espera-se que a velocidade ideal capture a verdadeira natureza viscoelástica das amostras biológicas. Defina a velocidade Z para 2 μm/s para as amostras biológicas viscoelásticas.
   4. A altura alvo na faixa Z indica a distância aproximada da amostra na qual o z-piezo repousa após medir uma curva de força e antes de se mover para um local diferente na amostra. A altura alvo da Faixa Z deve ser maior que a altura dos recursos de amostra. Defina a altura alvo na faixa Z em 7,5 μm.
   5. Usando a função Step Motor , aproxime o cantilever bastante da superfície da amostra (a julgar pelo foco na imagem de contraste de fase com ampliação de 10x) antes de selecionar a função Approach na janela de espectroscopia de força do modo de contato para reduzir o cantilever em incrementos menores de 15 μm.
   6. Clique em Adquirir para capturar uma curva de força.
   7. Selecione a Curva de força, abra-a na janela do gerenciador de calibração e selecione Modo baseado em contato na seção do método.
   8. Usando a função Selecionar intervalo de ajuste , selecione a Curva de retração do cantilever para um ajuste de curva linear. Em seguida, marque a caixa de seleção Sensibilidade para converter a unidade de força de V para N.
   9. Levante o cantilever em 100-200 μm no líquido e selecione a função Ruído térmico . Novamente, usando Selecionar faixa de ajuste, ajuste a curva de sino de ruído térmico com uma curva de Lorentz. Após o ajuste da curva, selecione a caixa Constante de mola (k). Confirme se a constante da mola (k) está próxima do valor do fabricante e anote-a para referência futura. Após a calibração, a unidade para o ponto de ajuste mudará de mV para nN.
      NOTA: O ruído térmico é a frequência natural do cantilever a uma determinada temperatura. A correção do ruído térmico é necessária para uma medição precisa da constante da mola.
5. Aquisição de curvas de força-distância
   1. Coloque a amostra slide-montada (vasos da retina ou matriz subendotelial) na fase do AFM e selecione a espectroscopia da força do modo do contato na seção da experiência do software.
   2. Defina a força do ponto de ajuste em 0,5 nN e clique em Aproximação, que é significativamente maior do que a deflexão térmica das sondas cantilever SAA-SPH 1 μm e PFQNM-LC-A 70 nm, garantindo uma abordagem suave do cantilever em direção à amostra.
   3. Depois que o cantilever detectar a superfície e retornar à sua altura alvo de repouso, defina o ponto de ajuste em 0,2 nN para a sonda cantilever SAA-SPH 1 μm mais rígida ou 0,1 nN para a sonda cantilever PFQNM-LC-A 70 nm mais macia. Este ajuste do ponto de ajuste garante que os cantilevers rígidos e macios se dobrem prontamente durante o recuo da amostra (consulte a seção 3.1).
   4. Defina o comprimento Z em ~2.5 μm para garantir a separação limpa da sonda cantilever das amostras biológicas durante a retração (consulte a etapa 3.4.2) e a velocidade Z a 2 μm/s (consulte a etapa 3.4.3).
   5. Usando os parafusos de estágio no estágio AFM, posicione cuidadosamente a sonda cantilever em um local desejado na amostra.
      NOTA: Como os capilares nem sempre se espalham na lâmina, é seguro retirar o cantilever mais 10-20 μm de sua altura alvo de repouso antes de mover a platina.
   6. Clique em Aproximação para primeiro aproximar o cantilever da amostra e, em seguida, clique em Adquirir para capturar as curvas de força para os locais desejados. Salve todas as curvas de força para análise.
6. Análise de dados
   1. Abra a curva de força no software de processamento de dados.
   2. Selecione a Curva de Força de Retração para análise de dados (semelhante à etapa 3.4.8).
   3. Usando a função de suavização de dados, suavize a curva de força com um filtro gaussiano para remover o ruído indesejado nos dados adquiridos.
   4. Usando a função de subtração da linha de base, ajuste o valor da inclinação e a magnitude da parte da linha de base (sem contato) da curva de força para zero.
   5. Clique na função Ponto de Contato para trazer automaticamente o ponto de contato da curva de força para as coordenadas (0,0) nos eixos X e Y.
   6. Usando a função Posição da ponta vertical , calcule a posição vertical real do cantilever no eixo Y corrigindo qualquer recuo da amostra.
   7. Na curva de força processada, aplique a função Ajuste de elasticidade selecionando primeiro a forma e o raio da ponta (com base na sonda cantilever selecionada), seguida pelo ajuste da curva de força usando o modelo Hertz/Sneddon.
      1. Se o recuo da matriz pela sonda de raio de 70 nm exceder 70 nm, o que normalmente é o caso, selecione a forma da ponta parabolóide . Para medição da rigidez capilar, o recuo da amostra pela sonda de raio de 1 μm nunca excede 1 μm, portanto, selecione a forma da ponta da esfera . Além disso, se o ponto de contato da curva ajustada não coincidir com o ponto de contato da curva de retração real, marque a caixa de seleção Deslocar curva .
   8. Anote e salve o valor do módulo de Young (rigidez).

Results

Capilares da retina de camundongos
A medição da rigidez do AFM de capilares retinianos isolados envolve etapas de manuseio de amostras que podem danificar sua integridade mecanoestrutural. Para evitar isso e, assim, garantir a viabilidade, confiabilidade e reprodutibilidade das medições de AFM, os olhos enucleados são fixados em formalina a 5% durante a noite a 4 °C antes do isolamento do vaso. Este protocolo de fixação suave com concentração reduzida de formalina, baixa temperatura de fixação, tempo de fixação limitado e falta de punção da córnea foi desenvolvido para minimizar qualquer potencial artefato de reticulação/endurecimento causado pela fixação química. Como mostrado na Figura 2B, C, essa fixação relativamente leve garante que a vasculatura retiniana isolada seja estruturalmente robusta e suficientemente durável para a medição do AFM. Em contraste, os vasos retinianos isolados de olhos não fixados (usando o método hipotônico)⁴ ou olhos brevemente fixos (por 8 h) tornam-se fragmentados ou colapsam, tornando-os inadequados para medição de AFM (Figura 2B).

Matriz subendotelial retiniana
A rigidez vascular reflete a rigidez combinada das células vasculares e da membrana basal (matriz subendotelial)⁴. Uma vez que as células se adaptam à rigidez da matriz passando por uma mudança semelhante em sua própria rigidez, um processo denominado reciprocidade mecânica⁹, rigidez da matriz subendotelial, torna-se um determinante importante da rigidez vascular geral. Para a medição da rigidez da matriz, é importante obter uma matriz subendotelial homogeneamente densa. Para CEs retinianos humanos cultivados em meio de cultura suplementado com ácido ascórbico, isso geralmente leva de 10 a 15 dias (Figura 3A)^4,5,6. Essa diferença no período de cultura pode surgir de diferenças de lote para lote em CEs retinianos primários disponíveis comercialmente. Além disso, geralmente descobrimos que os CEs retinianos disponíveis comercialmente de camundongos C57BL / 6 depositam uma matriz mais densa quando comparados com a cultura primária de CE retiniano humano, indicando diferenças específicas da espécie. Conforme mostrado na Figura 3A, as imagens de contraste de fase fornecem apenas uma visão bruta da matriz em uma escala macro. No entanto, a estrutura fibrilar mais fina em nano a microescala torna-se aparente em imagens de fluorescência confocal de alta resolução da matriz imunomarcada com anticorpos contra as proteínas estruturais da matriz colágeno IV e fibronectina (Figura 3B). Deve-se notar que essas proteínas da matriz também fornecem pistas instrutivas para as células endoteliais, ligando-se a receptores específicos de integrina⁹.

Medição da rigidez do AFM
A seleção da rigidez apropriada do cantilever (constante da mola, k) e da dimensão da sonda é essencial para medições confiáveis e sensíveis. Esses parâmetros devem ser escolhidos para corresponder à rigidez e às dimensões da amostra biológica. Depois que o modilhão selecionado foi montado no AFM, o feixe de laser infravermelho deve ser focado na ponta do cantilever, e o ponto de laser refletido deve ser centrado no fotodetector. Este alinhamento a laser garante a detecção precisa e sensível da deflexão do cantilever e, consequentemente, a medição da rigidez. Uma medida da rigidez do AFM começa com o z-piezo que move o modilhão verticalmente para baixo na direção da amostra. Não há deflexão em balanço neste momento, o que produz uma linha de base plana da curva de aproximação (Figura 4A). À medida que a sonda cantilever entra em contato e recua a amostra, a cantilever se dobra, causando deflexão do laser no fotodetector, que é representada pela deflexão vertical da curva de aproximação. Depois de aplicar uma força de indentação predefinida (força de ponto de ajuste) na amostra, o cantilever se retrai para a posição inicial (altura alvo Z) longe da amostra. A curva de retração defletida é então ajustada ao modelo Hertz/Sneddon para calcular o módulo de Young (rigidez) da amostra.

A partir da medição representativa de recuo de força mostrada na Figura 4, fica claro que as curvas de aproximação e retração obtidas de um capilar retiniano isolado de um camundongo diabético (Figura 4B) são substancialmente mais íngremes do que as obtidas de um camundongo não diabético (Figura 4A). A inclinação mais acentuada das curvas de indentação de força indica maior deflexão do cantilever causada pela maior resistência da amostra à indentação de força, o que reflete maior rigidez da amostra¹³. De fato, a análise subsequente de dados de múltiplas curvas de recuo de força revelou que os capilares da retina de camundongos se tornam significativamente mais rígidos no diabetes⁴. Deve-se notar também que o contato entre a sonda cantilever e as amostras biológicas geralmente causa adesão superficial inespecífica, o que leva à deflexão negativa do cantilever durante a retração, como visto na extensão da curva de retração além da linha de base (Figura 4B). Além disso, amostras biológicas como células, matriz e vasos sanguíneos são viscoelásticas por natureza e, portanto, podem sofrer alguma deformação permanente e/ou alteração na rigidez aparente após o recuo da força. Nesse caso, isso se refletirá no desalinhamento das curvas de aproximação e retração (histerese). De fato, a comparação da Figura 4A e da Figura 4B confirma a tendência esperada em que o recuo forçado de capilares mais moles em camundongos não diabéticos produz maior histerese do que a observada em suas contrapartes mais rígidas. Como relatado anteriormente ^5,6, a rigidez (módulo de Young) de matrizes subendoteliais obtidas de culturas de CE retinianas também é calculada da maneira acima mencionada.

Figura 1: Ilustração esquemática do corte da incisão feito em um olho de camundongo para isolamento da retina. Usando uma pinça para segurar o nervo óptico, um bisturi é usado para fazer uma incisão completa posterior ao limbo para separar a retina do camundongo do cristalino e da câmara anterior. A linha tracejada roxa mostra a localização da incisão vertical. Este esquema foi desenhado usando um software de imagem e ilustração científica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Otimização do protocolo para isolamento de vasos retinianos de camundongos intactos para medição de AFM. (A) A imagem do estereoscópio mostra uma retina intacta isolada de um olho de camundongo levemente fixado antes das etapas de isolamento capilar. Barra de escala: 2 mm. (B) Imagens representativas de contraste de fase com ampliação de 4x mostram vasos retinianos de camundongos obtidos usando os diferentes métodos de isolamento. Comparando a integridade estrutural e a durabilidade dos vasos isolados, descobriu-se que a digestão de tripsina de retinas de olhos enucleados fixados em formol a 5% por 24 h a 4 ° C (caixa vermelha) produz a vasculatura retiniana mais adequada para a medição da rigidez do AFM. Os vasos retinianos isolados usando esse método exibiram uma rede vascular clara que se espalhou uniformemente ao longo da superfície do vidro. Barra de escala: 500 μm. (C) A visão de alta ampliação (20x) de uma rede capilar retiniana intacta, semelhante à mostrada em (B), confirma a alta integridade estrutural dos capilares obtidos de olhos levemente fixos. Barra de escala: 100 μm. Este número foi modificado de⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Matrizes descelularizadas obtidas de culturas primárias de REC humanas e de camundongos. (A) Imagens representativas de contraste de fase com ampliação de 20x mostrando agregados de matriz subendotelial em lamínulas de vidro após descelularização de culturas de 10 dias (10 d) ou 15 dias (15 d) de RECs humanas ou de camundongos. Barra de escala: 100 μm. (B) Imagens representativas de fluorescência confocal de alta ampliação (100x) de matrizes descelularizadas obtidas de culturas de REC humanas de 15 d e marcadas com anticorpos anticolágeno IV e antifibronectina revelam um colágeno IV nanofibrilar denso e matriz de fibronectina. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Curvas de distância de força da medição da rigidez do AFM dos capilares retinianos do rato. Os gráficos de linha indicam uma curva representativa de aproximação (cor clara) e retração (cor escura) a partir de uma única medição de indentação de força em um local de um capilar retiniano de camundongo isolado de um camundongo (A) não diabético ou (B) diabético. As curvas de força obtidas usando uma sonda cantilever hemisférica SAA-SPH de 1 μm de raio traçam a relação entre a distância cantilever-sample (controlada pelo z-piezo) e a força vertical aplicada que causa a deflexão do cantilever. (A) A seta amarela indica a aproximação do cantilever acionado por z-piezo-driven em direção à amostra, a seta branca indica o ponto de contato onde a sonda cantilever faz contato com a amostra e a seta verde indica a deflexão do cantilever até um ponto de ajuste (pico) força de indentação (*). (B) As curvas de aproximação e retração obtidas de um capilar retiniano isolado de camundongos diabéticos exibem uma inclinação marcadamente mais íngreme do que as de suas contrapartes não diabéticas (mostradas em A), o que indica maior rigidez capilar em camundongos diabéticos. A ponta da seta indica uma queda na curva de retração abaixo da linha de base, que reflete a deflexão negativa da sonda cantilever causada pela adesão entre a sonda e a amostra durante o recuo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A AFM tem sido amplamente utilizada para medir alterações associadas à doença na rigidez de vasos maiores, como a aorta e artérias¹⁶. Esses achados ajudaram a estabelecer o papel da mecanobiologia endotelial em complicações cardiovasculares, como a aterosclerose¹⁷. Com base nessas descobertas, começamos a investigar o papel anteriormente não reconhecido da mecanobiologia endotelial no desenvolvimento de lesões microvasculares da retina no início da RD. O sucesso nessa busca, no entanto, depende da medição precisa das alterações induzidas pelo diabetes na rigidez capilar da retina. Estudos recentes revelaram que, semelhante aos grandes vasos, a rigidez dos capilares retinianos e da matriz subendotelial secretada por CE da retina também pode ser medida de forma direta, precisa e confiável usando AFM ^4,5,6.

Essa abordagem envolve o isolamento dos capilares retinianos de camundongos de olhos levemente fixos usando digestão de tripsina. Com base na experiência, essa etapa de fixação leve é necessária, pois os capilares isolados de olhos não fixados (usando o método hipotônico) são frágeis e se fragmentam, tornando-os inadequados para a medição da rigidez do AFM⁴. Por outro lado, uma fixação mais forte e a consequente necessidade de digestão extensa de tripsina, que foi relatada em outros protocolos de digestão de tripsina^{retiniana 18}, também podem comprometer a integridade estrutural capilar, conforme julgado pela ruptura de junções apertadas. Assim, a fixação capilar suave e a digestão suave da tripsina empregadas aqui ajudam a reduzir os artefatos de rigidez decorrentes da reticulação excessiva induzida pela formalina e garantem a integridade estrutural dos capilares para uma medição confiável da rigidez do AFM.

Como uma abordagem alternativa, um estudo recente relatou a medição da rigidez AFM dos capilares retinianos de montagens planas de retina levemente fixadas¹⁹. Ao realizar recortes de força AFM nos capilares retinianos dentro da retina intacta, essa abordagem permite a medição de rigidez in situ . No entanto, essas medidas de rigidez capilar provavelmente incluem a rigidez da membrana limitante interna. Além disso, essa abordagem é restrita à medição apenas de capilares superficiais que são acessíveis em uma montagem plana da retina, deixando de fora o plexo capilar mais profundo que é especificamente afetado no início do DR²⁰. Esses problemas podem ser resolvidos usando essa abordagem, que extrai os vasos de forma limpa (desprovidos de tecido retiniano residual) de todas as camadas da retina. Atualmente, estamos otimizando este protocolo para isolar vasos coroidais de modelos animais de DMRI precoce. Dito isto, percebemos que a fixação leve de formalina empregada no protocolo pode causar um artefato de enrijecimento associado à reticulação nas medições de AFM. Portanto, seria prudente interpretar os valores de rigidez vascular obtidos usando essa abordagem mais em termos de mudanças relativas na rigidez (entre diferentes grupos experimentais) do que de rigidez absoluta.

Em contraste com os capilares retinianos que requerem fixação leve, a matriz subendotelial obtida de culturas de EC retinianas pode ser avaliada sem qualquer modificação. Isso se deve em grande parte à robustez da matriz depositada, que resulta de uma combinação de vários fatores, incluindo a adição de ácido ascórbico no meio de cultura (que aumenta a síntese de colágeno¹⁵), modificação química de lamínulas de vidro que evita o descolamento da matriz durante a descelularização e duração prolongada da cultura (10-15 dias). É importante ressaltar que mostramos que o aumento induzido pela hiperglicemia na rigidez da matriz subendotelial in vitro é consistente com o aumento induzido pelo diabetes na rigidez capilar da retina observado in vivo⁴. Isso não é surpreendente, pois espera-se que um aumento na rigidez da matriz aumente a rigidez dos CEs retinianos sobrejacentes (devido à reciprocidade mecânica) que, juntos, aumentam a rigidez capilar geral. De fato, mostramos recentemente que os CEs da retina tornam-se mais rígidos quando cultivados em condições diabéticas⁴, provavelmente por meio de um aumento na tensão citoesquelética de actina dependente de Rho / ROCK²¹. Esses achados também implicam que o enrijecimento da CE da coroide observado no modelo de macaco rhesus da DMRI inicial reflete o aumento da rigidez da matriz subendotelial da coroide e dos vasos intactos¹², uma ideia que está sendo testada em estudos em andamento. No geral, o fato de que as alterações de rigidez na matriz subendotelial retiniana não fixada e ECs refletem a tendência observada em vasos retinianos intactos levemente fixados atesta a validade da abordagem de fixação leve.

A medição direta da rigidez dos capilares retinianos a partir de modelos animais de RD não apenas ajuda a estabelecer a mecanobiologia endotelial como um novo alvo terapêutico para o tratamento da RD, mas também fornece uma forte justificativa para desenvolver novas técnicas de imagem sensíveis para avaliação não invasiva da rigidez capilar da retina em pacientes com RD no futuro. Essas técnicas não invasivas podem detectar mudanças sutis no fluxo sanguíneo que devem surgir do enrijecimento capilar, semelhantes às mudanças na velocidade da onda de pulso arterial que são comumente detectadas em doenças cardiovasculares induzidas por diabetes. As medições de rigidez AFM de capilares retinianos isolados de olhos humanos post-mortem de doadores diabéticos fornecerão uma importante prova de conceito a esse respeito. Dado que a rigidez capilar da retina aumenta logo no início do modelo de camundongo (estreptozotocina) do diabetes tipo^{1 4}, o uso bem-sucedido do AFM na validação das modalidades de imagem de medição de rigidez pode levar à identificação da rigidez capilar da retina como um biomarcador clínico para a patogênese precoce da RD.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolamento Capilar da Retina
0.22 µ m Filtro de seringa de PVDF	Merck Millipore	SLGVM33RS	Durapore de baixa ligação a proteínas
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Solução salina sem cálcio % magnésio	Corning	20-031-CV	Concentração final 1X, pH 7,4
Placa de 12 poços	Falcon Corning	353043
tubo de centrífuga de 15 mL	Corning	430791	livre de Rnase-Dnase, não pirogênico
20 mL Seringa Luer-Lok TIP	BD	302830
5 3/4 polegadas Descartável Vidro de Borosilicato/Pipeta Pasteur Não Estéril	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Placa de Cultura de Tecidos	Falcon Corning	353002
Placa de 6 poços	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - Caneta de 13 mL Laboratório de	Dispositivos Científicos	9804-02
Suporte de lâmina	X-ACTO
Lâmina Cirúrgica de Aço Carbono #10	Bard-Parker	371110
Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Microscópio de dissecação	Am-scope
Solução de formalina, tamponada neutra, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Concentração final 5% (v/v)
Kimwipes - tecido de limpador	Micro espátula Kimtech Science	34133
	Fine Science Tools	10089-11
Agitador Orbital	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Aço Inoxidável 115mm  Pinça	Ted Pella, Inc.	5667
Microscópio de contraste de fase	Nikon TS2
Purifier Logic + Classe II, Gabinete de Biossegurança Tipo A2	Labconco	302380001
Tubos de microcentrífuga Safe-Lock 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereomicroscope Estereomicroscópio	AmScope	SM-3 3.5X-90X
Lâmina de microscopia Superfrost Plus - Aba branca - Pré-limpa - 25x75x1,0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, solução 0,1M, pH 7,4 - Grau de Biotecnologia	VWR	E553-500ML	pH 8 para solução de tripsina
Tripsina 1:250 em pó Grau de cultura de tecidos	VWR	VWRV0458-25G	10% (p/v) solução de tripsina
Grau de Biologia Molecular	Corning	46-000-CM
Matriz subendotelial
10X	PBS Corning	20-031-CV
1X PBS com cálcio e magnésio	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Hidróxido de amônio	Sigma-Aldrich	338818
Ácido Ascórbico	Sigma-Aldrich	A4034
Colágeno IV anticorpo	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Etanolamina	Sigma-Aldrich	398136
Anticorpo de fibronectina	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890
Lamínulas de vidro (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldeído	Microscopia eletrônica Ciências	16220
Células endoteliais da retina humana (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 médio	Corning	15-100-CV
Células endoteliais da retina de camundongo (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Tripsina	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µ Ponta de prova Bruker		SAA-SPH-1UM	Uma ponta de prova hemisférica de 19 mícrons altos com raio da extremidade de 1 mícron, ponta de prova constante da mola 0.25N/m
70 nanômetro LC	Bruker	PFQNM-LC-V2	Uma ponta de prova hemisférica alta de 19 mícrons com raio da extremidade 70nm,   Constante de mola 0.1N/m
câmera	da família XCAM	Toupcam	1080P HDMI
Desktop para executar a câmera	Asus	desktop Asus CPU	Intel i5-6600 , 8GB RAM
Suporte de prato para lamínula	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm prato de fundo de vidro com   Micro-poço de 14 mm
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Microscópio de força atômica Bioscience montado em um microscópio óptico para medição sensível das propriedades mecanoestruturais (rigidez e topografia) de amostras biológicas moles
Microscópio de contraste de fase	Zeiss	Axiovert 200	Microscópio invertido com objetiva de 10X