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Artigo de investigação

Insights mecanicistas sobre a proteção mitocondrial do salidrosídeo via via AMPK/Sirt1/HIF-1α em células HT22 hipóxicas

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DOI:

10.3791/66923

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25 de abril de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Service Office, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan

Neste artigo

Resumo

O presente estudo identificou um mecanismo único pelo qual o salidrosídeo exerce efeitos protetores mitocondriais em células HT22 hipóxicas, em parte através da via AMPK/Sirt1/HIF-1α.

Resumo

Descobriu-se que o salidrosídeo (Sal), um ingrediente ativo da Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba exerce efeitos protetores mitocondriais, melhorando o metabolismo e aumentando o suprimento de energia das células cerebrais em condições hipóxicas. No entanto, seu mecanismo de ação não foi totalmente esclarecido. No presente estudo, a cromatografia líquida de alta eficiência foi empregada pela primeira vez para analisar os efeitos do Sal nos níveis de nucleotídeos (ATP, ADP e AMP). O ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA), um método de interação molecular amplamente utilizado para validar e quantificar o envolvimento do alvo do medicamento em células e tecidos em diferentes espécies, foi então escolhido para confirmar a afinidade de Sal por proteínas relacionadas à via AMPK / Sirt1 / HIF-1α. Os resultados revelaram que Sal aumentou os níveis de ATP e ADP em células HT22 hipóxicas enquanto reduzia os níveis de AMP. Além disso, Sal exibiu ligação estável às proteínas AMPKα, p-AMPKα, Sirt1 e HIF-1α. Em conclusão, o Sal pode exercer efeitos protetores mitocondriais modulando a via AMPK/Sirt1/HIF-1α para regular o conteúdo de nucleotídeos. Este estudo fornece um referencial metodológico para análise de conteúdo de nucleotídeos em amostras de células e contribui para a identificação e descoberta de alvos para compostos derivados da medicina tradicional chinesa.

Introdução

O cérebro é altamente sensível ao oxigênio devido às suas altas demandas metabólicas, capacidade glicolítica limitada e dependência da fosforilação oxidativa. Como resultado, a exposição a um ambiente com baixo teor de oxigênio em grandes altitudes pode levar prontamente à lesão cerebral hipóxica hipobárica (HHBI)1,2. Estudos epidemiológicos indicam que quando indivíduos não aclimatados a grandes altitudes ascendem rapidamente a regiões de alta altitude, a incidência de doença aguda da montanha pode chegar a 75%, com uma taxa de letalidade de aproximadamente 1% para casos graves. Além disso, na ausência de cuidados médicos, as taxas de mortalidade por edema cerebral ou pulmonar de grandes altitudes podem chegar a 40%3,4.

O ICHB apresenta um amplo espectro de sintomas clínicos. Casos leves a moderados podem incluir dores de cabeça, tontura e perda de memória5, enquanto casos graves podem resultar em comprometimento cognitivo, alteração da consciência e resultados potencialmente fatais5. A prevenção e o tratamento do HHBI em regiões de alta altitude tornaram-se um foco importante da pesquisa médica. As estratégias preventivas envolvem principalmente o treinamento adaptativo em ambientes de alta altitude, incluindo repouso adequado, dieta bem balanceada, nutrição adequada e exercícios físicos adequados 6,7. Além disso, as intervenções farmacológicas destinadas a proteger as células cerebrais e aliviar a hipóxia cerebral permanecem centrais para a pesquisa atual do HHBI.

As mitocôndrias servem como centros primários de produção de energia dentro das células, sintetizando trifosfato de adenosina (ATP) para atender às demandas de energia celular. Em condições hipóxicas, a produção de energia mitocondrial diminui, levando à redução dos níveis de ATP e ao comprometimento da função celular8. A lesão hipóxica também interrompe a regulação mitocondrial do Ca2+ e a homeostase do pH, desencadeando apoptose e necrose 9,10. Existe uma relação que se reforça mutuamente entre a disfunção mitocondrial e a lesão cerebral hipóxica. Por um lado, o comprometimento mitocondrial induzido por hipóxia exacerba a deficiência de oxigênio, reduzindo ainda mais o metabolismo energético celular, criando um ciclo vicioso. Por outro lado, a disfunção mitocondrial eleva os níveis intracelulares de Ca2+, ativando cascatas apoptóticas e levando à morte celular11. Embora os mecanismos subjacentes à lesão cerebral hipóxica permaneçam complexos e não totalmente compreendidos, vários estudos identificaram o metabolismo energético mitocondrial neuronal prejudicado como um fator crítico em sua patogênese12,13. Portanto, uma exploração mais aprofundada da função mitocondrial pode fornecer informações valiosas sobre potenciais alvos terapêuticos para lesão cerebral hipóxica.

O salidrosídeo (Sal) é um ingrediente ativo extraído da planta do planalto Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba e é amplamente utilizado em alimentos, produtos de saúde e produtos farmacêuticos14. A fórmula molecular do Sal é C14H20O7, e também é conhecido como 2- (4-hidroxifenil) -etil β-D-glicopiranosídeo. Possui diversas propriedades farmacológicas, incluindo efeitos anti-hipóxia, antioxidante, antifadiga, antitumoral, imunomodulador, anti-inflamatório e protetor cardiovascular e cerebrovascular 15,16,17. Entre estes, seu efeito anti-hipóxia é um dos mais bem documentados. Estudos recentes têm destacado cada vez mais os efeitos protetores mitocondriais significativos do Sal como um mecanismo potencial para seus efeitos preventivos e terapêuticos na lesão cerebral induzida por platô em camundongos14,18. No entanto, os mecanismos moleculares precisos pelos quais o Sal influencia os níveis de ATP, ADP e AMP permanecem pouco compreendidos.

A proteína quinase ativada por AMP (AMPK) atua como um sensor de energia chave que ajuda a manter a homeostase da energia celular. A ativação da AMPK estimula a Sirtuína 1 (Sirt1), levando a um aumento nos níveis intracelulares de NAD+ 19. Estudos mostraram que Sirt1 pode regular o fator 1-alfa induzível por hipóxia (HIF-1α) para coordenar a resposta celular à hipóxia20. Pesquisas anteriores demonstraram que o Sal inibe a abertura do poro de transição da permeabilidade mitocondrial neuronal, regula os processos de energia mitocondrial mediados pelo HIF-1α, atenua a apoptose neuronal e mantém a integridade da barreira hematoencefálica, protegendo assim os ratos da lesão cerebral induzida pelo platô14,21. No entanto, o efeito do Sal no ATP e seus metabólitos, ADP e AMP, permanece incerto.

Para investigar isso, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi empregada pela primeira vez para quantificar os níveis desses três nucleotídeos. Além disso, foi utilizado o ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA), uma técnica biofísica amplamente utilizada introduzida em 2013 para estudar as interações ligante-proteína em células intactas22. Este método é comumente aplicado para validar e quantificar o envolvimento do alvo do medicamento em células e tecidos em diferentes espécies. Especificamente, após a co-incubação de lisados de células-alvo com o medicamento em temperaturas variadas por um período definido, a proteína ligada ao medicamento exibe maior estabilidade térmica, tornando-a menos propensa à desnaturação e precipitação. As proteínas não ligadas precipitadas são então removidas por centrifugação e as interações medicamento-alvo são subsequentemente identificadas por meio da análise de western blot do sobrenadante22. Para identificar potenciais alvos moleculares de Sal, o CETSA foi selecionado para avaliar sua afinidade de ligação com proteínas relacionadas à via AMPK / Sirt1 / HIF-1α.

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Protocolo

Os detalhes comerciais dos reagentes e do equipamento usado neste estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Preparação da solução

  1. Prepare o meio de Eagle modificado completo de Dulbecco (DMEM) adicionando 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Prepare uma solução de Sal 20 mM dissolvendo 3 mg de Sal em 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 21 .
  3. Filtrar 500 ml de acetonitrilo cromatograficamente puro (fase móvel A) utilizando uma membrana orgânica de 0,45 μm.
  4. Prepare 1000 mL de fase móvel B adicionando 3,5 mL de reagente I a 1 L de água deionizada. Ajuste o pH para 6,15 com o reagente II, seguindo as instruções do kit de ensaio de conteúdo de nucleotídeos (ATP, ADP e AMP) (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: O reagente I e o reagente II estão incluídos no kit de ensaio de conteúdo de nucleotídeos (ATP, ADP e AMP).
  5. Filtrar a fase móvel B utilizando uma membrana aquosa de 0,22 μm.
    NOTA: A fase móvel B deve ser usada imediatamente após a preparação. As fases móveis A e B devem ser sonicadas por 30 minutos antes do uso para remover bolhas de ar.
  6. Dilua uma solução estoque padrão de ATP, ADP e AMP de 1 μM com água deionizada para obter soluções padrão das séries ATP, ADP e AMP de 0,5 μM, 0,1 μM, 0,05 μM, 0,01 μM e 0,005 μM.
  7. Filtrar a série de soluções-padrão utilizando uma membrana filtrante microporosa do tipo agulha de 0,22 μm.
    NOTA: Devem ser utilizados frascos de injecção castanhos para armazenar as soluções-padrão em série. A série preparada de soluções-padrão deve ser usada o mais rápido possível.

2. Cultura celular

NOTA: A cultura de células HT22 e o modelo de hipóxia estimulada por CoCl2 foram estabelecidos de acordo com um relatório anterior21.

  1. Cultive células HT22 a 37 ° C com 5% de CO2 até que 80% de confluência seja alcançada na placa de Petri. Digerir as células com tripsina a 0,25% por 1 min.
  2. Semeie 2 × 105 células da etapa 2.1 em placas de 6 poços com DMEM completo (grupo controle sem tratamento medicamentoso) ou DMEM completo contendo o medicamento (250 μM CoCl2, 250 μM CoCl2 + 10 μM Dor, 250 μM CoCl2 + 20 μM Sal e 250 μM CoCl2 + 10 μM Dor + 20 μM Sal). Incubar durante 24 h a 37 °C com 5% de CO2.
    NOTA: Três amostras paralelas foram montadas em cada grupo.

3. Ensaio de conteúdo de nucleotídeos (ATP, ADP e AMP)

  1. Adicione 1 mL de reagente de extração I a cada poço nas placas de 6 poços da etapa 2.2.
    NOTA: O reagente de extração I está incluído no kit de ensaio de conteúdo de nucleotídeos (ATP, ADP e AMP) (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Lise as células por sonicação em banho de gelo usando um aparelho ultrassônico de ruptura celular (potência: 300 W, ondas ultrassônicas por 3 s, intervalo de 7 s, tempo total: 3 min).
  3. Centrifugar as células lisadas a 10,304 × g durante 10 min a 4 °C utilizando uma centrifugadora refrigerada de alta velocidade.
  4. Transfira 0,75 mL de sobrenadante da etapa 3.3 para um tubo de 2,0 mL. Adicionar 0,75 ml de reagente de extracção II, agitar e misturar com um misturador de vórtice e centrifugar novamente a 10,304 × g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: O reagente de extração II está incluído no kit de ensaio de conteúdo de nucleotídeos (ATP, ADP e AMP).
  5. Pipetar o sobrenadante do passo 3.4 e filtrá-lo utilizando uma membrana filtrante microporosa do tipo agulha de 0,22 μm para um frasco castanho.
    NOTA: ATP, ADP e AMP na amostra extraída não são estáveis. Todos os procedimentos experimentais devem ser realizados a baixas temperaturas ou no gelo. As amostras devem ser processadas e testadas o mais rápido possível.
  6. Abra o software de cromatografia e defina os seguintes parâmetros: volume de injeção: 10 μL; temperatura da coluna: 27 °C; vazão: 0,8 mL/min; comprimento de onda de detecção: 254 nm; Duração da detecção: 70 min. Definir o procedimento de eluição do gradiente de acordo com o quadro 1.
  7. Clique no botão executar para injetar automaticamente a amostra e detectar o conteúdo de ATP, ADP e AMP em soluções padrão seriais (etapa 1.7) e soluções de amostra (etapa 3.5) de acordo com o programa definido na etapa 3.6.
    NOTA: No final do experimento, lave a coluna cromatográfica com 98% de fase móvel B para evitar entupimento.
  8. Plote as curvas padrão de ATP, ADP e AMP usando software de análise gráfica e estatística, com concentrações padrão seriais no eixo x e áreas de pico no eixo y.
  9. Calcule o conteúdo de ATP, ADP e AMP nas amostras usando a equação da curva padrão da etapa 3.8.

4. Ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA)

  1. Lise células HT22 normais por 20 min em uma placa de Petri usando lisado contendo inibidor de protease (lisado: inibidor de protease = 100: 1) pipetando repetidamente as células.
    NOTA: Execute esta etapa em um banho de gelo para evitar a degradação de proteínas.
  2. Coletar o lisado celular da etapa 4.1 e sonicar em um banho de gelo usando um aparelho ultrassônico de ruptura celular (potência: 300 W, ondas ultrassônicas por 3 s, intervalo de 7 s, tempo total: 3 min). Centrifugar a 10,304 × g, 4 °C durante 20 min e recolher o sobrenadante.
    NOTA: Divida o sobrenadante em 14 porções: 7 grupos para coincubação com Sal e 7 grupos para coincubação com PBS como controle. Para o grupo tratado com Sal, adicione 100 μL de sobrenadante e 0,1 μL de 20 μM de Sal por amostra. Para o grupo controle, adicione 100 μL de sobrenadante e 0,1 μL de PBS por amostra.
  3. Incube cada amostra à temperatura ambiente por 30 min e, em seguida, incube a 37 °C, 42 °C, 47 °C, 52 °C, 57 °C, 62 °C e 67 °C por 3 min usando um instrumento de controle de temperatura de aquecimento de metal.
  4. Centrifugar as amostras do passo 4.3 a 10,304 × g durante 20 min a 4 °C e recolher o sobrenadante com uma pipeta.
  5. Meça a concentração total de proteína do sobrenadante da etapa 4.4 usando um kit de ensaio de concentração de proteína BCA, seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  6. Prepare o gel de separação a 10% usando um kit de preparação rápida de gel PAGE, seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  7. Carregue 3 μL de marcador de proteína de cor pré-corado e 14 μL de amostras nos poços do gel de separação (quantidade final de proteína por poço: 20 μg).
  8. Execute o gel usando tampão de eletroforese por 1 h a 80-100 mV para obter proteínas separadas.
  9. Transfira as proteínas da etapa 4.8 para uma membrana de PVDF usando uma solução de transferência rápida de membrana e uma estrutura sanduíche (papel de filtro de algodão-PVDF membrana-proteína gel-papel de filtro-algodão) a 400 mA por 30 min.
  10. Bloqueie as membranas de PVDF da etapa 4.9 com solução de albumina de soro bovino (BSA) a 5% por 1-2 h em temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare a solução de BSA a 5% dissolvendo 5 mg de pó de BSA em 100 mL de solução de TBST contendo 100 mL de tampão TBS e 0,05% de Tween 20.
  11. Incubar as membranas de PVDF da etapa 4.10 com 5 mL de anticorpo primário diluído a 4 °C durante a noite.
    NOTA: Dilua o anticorpo primário em solução BSA (proporção de 1:1000).
  12. Lave as membranas de PVDF três vezes com TBST por 5 minutos cada para remover anticorpos primários não ligados.
  13. Incubar as membranas da etapa 4.12 com anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rábano diluído (HRP) por 2 h à temperatura ambiente em um agitador de descoloração.
    NOTA: Dilua o anticorpo secundário acoplado a HRP em solução BSA (proporção de 1:10.000).
  14. Lave as membranas três vezes com TBST por 5 min cada para remover o anticorpo secundário residual.
  15. Cubra as membranas da etapa 4.14 com o revelador de quimioluminescência ECL e, em seguida, obtenha imagens do sinal da proteína alvo usando um sistema de imagem.
    NOTA: Execute esta etapa no escuro para evitar a extinção da fluorescência.
  16. Analise e quantifique o valor de cinza das proteínas-alvo usando o software ImageJ (consulte a capacidade de Materiais).

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Resultados

As curvas padrão para ATP, ADP e AMP detectadas por HPLC foram Y = 7006,5X - 222,99, Y = 5217,3X - 17,796 e Y = 9280,1X + 22,749, respectivamente (Figura 1A-C). Os teores de nucleotídeos medidos em cada grupo por HPLC foram calculados usando as curvas padrão (Figura 1D-I). Verificou-se que o CoCl2 reduziu significativamente os níveis de ATP e ADP nas células HT22 em comparação com o g...

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Discussão

As mitocôndrias são organelas-chave envolvidas na prevenção terapêutica do HHBI 23,24,25. Estudos anteriores do grupo confirmaram que o Sal regula a expressão das proteínas AMPK, Sirt1 e HIF-1α, melhorando a função mitocondrial neuronal e protegendo contra o HHBI21,24. No entanto, o efeito direto do Sal nos nucleotídeos em células hipóxi...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274207 e 82474185), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2024NSFSC1845), pela Fundação de Ciências para Jovens do Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2023NSFSC1776), pelo Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento de Ningxia (2023BEG02012), pelo Projeto de Apoio ao Talento Juvenil da Associação Chinesa de Medicina Chinesa para 2024-2026 (2024-QNRC2-B07) e pela Pesquisa Acadêmica Xinglin Projeto de Promoção da Universidade de TCM de Chengdu (XKTD2022013 e QJJJ2024027).

CONTRIBUIÇÃO DO AUTOR:
Xiaobo Wang, Yating Zhang, Ya Hou, Rui Li e Xianli Meng conceberam este projeto. Yating Zhang, Ya Hou e Tingting Kuang realizaram os experimentos e analisaram os dados. Yating Zhang e Hong Jiang escreveram o manuscrito. Xiaobo Wang e Xianli Meng revisaram o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcetonitrilaAladdinA104440
0,22 µ m membrana aquosaJintengJTMF0445
0,22 µ Membrana de filtro microporoso tipo agulha mJintengJTSFM013001
0,45 µ m membrana orgânicaJintengJTMF0448
software Agilent OpenLab   Anticorpo AgilentVersão 2.X-AMPK
αTecnologia de Sinalização Celular#2532
Anticorpo-HIF-1&alfa;Tecnologia de Sinalização Celular#41560
Anticorpo-p-AMPK&alfa;Tecnologia de Sinalização Celular# 50081
Anticorpo-Sirt1Tecnologia de Sinalização Celular# 2028
Anticorpo-β-actinaTecnologia de Sinalização Celular# 4970
Kit de ensaio de concentração de proteína BCABoster Biological Technology17E17B46
Albumina de soro bovinoCywin Innovation (Pequim) Biotechnology Co., Ltd.SW127-02
Inibidor de fosfatase de amplo espectro (100 vezes;)Boster Biological TechnologyAR1183
AgilentSB-C18
CoCl2Sigma15862
Agitador de descolorizaçãoKylin-BellTS-2
DorsomorphinMedChemExpress (MCE)HY-13418A
Águia modificada de Dulbecco médioGibco8121587
tampão de eletroforeseNCM Biotech20230801
Soro bovino fetalGibco2166090RP
Cabra Anti-coelho IgG H & L (TRITC)ZenBioScience Co., Ltd.
GraphPad Software PrismSoftware GraphPad, LLCVersão 9.0.0
Cromatografia líquida de alto desempenhoAgilent1260 Infinity II Prime 
Centrífuga refrigerada de alta velocidadeThermo Fisher ScientificLegend Micro 17R
HRP conjugado affinipure cabra anti-coelho IgG (H + L)Boster Biological Technology Co., Ltd.BA1054
HT22 Fornecedorverificado - Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd.JNO-02001
Kit de quimioluminescência ECL hipersensívelNCM BiotechP10300
Image J softwareNational Institutes of Healthv1.8.0
Instrumento de controle de temperatura de aquecimento de metalBaiwan Electronictechnology Co., Ltd.Kit de
Fornecedor:Technology Co., Ltd.BC5114
PAGE gel kit de preparação rápidaBiosharpPL566B-5
Penicilina-estreptomicinaNCM BiotechC125C5
Solução salina tamponada com fosfato (1 e vezes;)Gibco8120485
Marcador de proteína de cor pré-corado (10-180 kDa)Cywin Innovation (Pequim) Biotechnology Co., Ltd.SW176-02
Tampão de carga de proteína (5x)Boster Biological TechnologyAR1112
PVDF (0,45 μ m)Cywin Inovação (Pequim) Biotecnologia Co., Ltd.SW120-01
Solução de transferência rápida de membranaCywin Innovation (Pequim) Biotechnology Co., Ltd.SW171-02
RIPA lisadoBoster Biological Technology Co., Ltd.AR0105
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.RFS-H0400191102
TBS tampãoNCM Biotech23HA0102
Tampão transmembranaNCM Biotech23CA2000
Tripsina (0,25%, 1 e vezes;)HyCloneJ210045
Tween 20Shanghai Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.
Aparelho ultrassônico de ruptura de célulasNingbo Xinyi ultrasonic equipment Co., Ltd.Misturador
Visionworks
Coluna cromatográfica 511202Fornecedor verificado - ensaio de conteúdo de nucleotídeo de aladina M116118 de aladina de metanol HG221-X3 (ATP, ADP e AMP) Beijing Solarbio Science &PM12012 Kylin-Bell XW-80A do vórtice de Analytik Jena UVP ChemStudio de JY92-IIDN

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