Ressonância magnética e espectroscopia de pulmão hiperpolarizada 129Xe em camundongos ventilados mecanicamente

Resumo

A ressonância magnética de xenônio hiperpolarizada pode quantificar a microestrutura pulmonar regional (dimensões do espaço aéreo) e a fisiologia (ventilação e troca gasosa) em pesquisa translacional e atendimento clínico. Embora desafiador, pode fornecer insights pulmonares comparáveis em estudos pré-clínicos. Este protocolo descreve a infraestrutura e os procedimentos necessários para realizar ressonância magnética pulmonar de xenônio de rotina em camundongos.

Resumo

O xenônio-129 (¹²⁹Xe) hiperpolarizado (HP) é um agente de contraste de ressonância magnética inalada (RM) com propriedades espectrais e físicas únicas que podem ser exploradas para quantificar a fisiologia pulmonar, incluindo ventilação, difusão restrita (tamanho do espaço aéreo alveolar) e troca gasosa. Em humanos, tem sido usado para avaliar a gravidade e a progressão da doença em uma variedade de distúrbios pulmonares e é aprovado para uso clínico nos Estados Unidos e no Reino Unido. Além de suas aplicações clínicas, a capacidade da ressonância magnética ¹²⁹Xe de avaliar de forma não invasiva a fisiopatologia pulmonar e fornecer informações espacialmente resolvidas é valiosa para a pesquisa pré-clínica. Entre os modelos animais, os camundongos são os mais utilizados devido à acessibilidade dos modelos de doenças geneticamente modificadas. Aqui, a ressonância magnética ¹²⁹Xe é promissora como uma técnica minimamente invasiva, livre de radiação e sensível para monitorar longitudinalmente a progressão da doença pulmonar e a resposta à terapia (por exemplo, na descoberta de medicamentos). Essa técnica pode se estender a aplicações pré-clínicas, incorporando um aparelho de respiração livre acionado por ressonância magnética ou ventilador mecânico para fornecer gás. Aqui, descrevemos as etapas e fornecemos listas de verificação para garantir uma coleta e análise de dados robustas, incluindo a criação de um simulador de gás xenônio polarizado termicamente para controle de qualidade, otimização da polarização, manuseio de animais (sedação, intubação, ventilação e cuidados com camundongos) e protocolos para ventilação, difusão restrita e dados de troca gasosa. Embora a ressonância magnética pré-clínica ^{de 129}Xe possa ser aplicada em vários modelos animais (por exemplo, ratos, porcos, ovelhas), este protocolo se concentra em camundongos devido aos desafios impostos por sua pequena anatomia, que são equilibrados por sua acessibilidade e a disponibilidade de muitos modelos de doenças.

Introdução

Embora os distúrbios pulmonares continuem sendo as principais causas de morbidade e mortalidade global¹, a última década viu melhorias dramáticas nos resultados dos pacientes. Essas melhorias são impulsionadas em parte por dois fatores. Em primeiro lugar, os ensaios clínicos de Fase III agora priorizam as mudanças na função pulmonar como desfechos em vez da mortalidade, acelerando os testes de medicamentos 2,3,4,5. Em segundo lugar, os avanços em modelos animais aprimorados forneceram informações sobre os mecanismos da doença e ajudaram no desenvolvimento da terapia ^6,7. Os modelos de camundongos são frequentemente favorecidos para pesquisa translacional porque oferecem paralelos fisiológicos com os humanos, acessibilidade e rápido desenvolvimento de doenças. A engenharia genética expandiu o alcance e a qualidade dos modelos disponíveis, com o International Mouse Strain Resource agora ostentando mais de 32.000 cepas de camundongos⁸, em comparação com apenas 4.218 cepas de ratos (Rat Genome Database⁹). Esses modelos abriram novos caminhos para investigar os fatores mecanicistas e as respostas terapêuticas para uma variedade de doenças pulmonares, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)¹⁰, fibrose cística (FC)¹¹, fibrose pulmonar12,13, hipertensão ^{pulmonar14,15} e^asma16.

Infelizmente, a pesquisa pulmonar envolvendo camundongos é limitada pelas técnicas disponíveis para quantificar a carga da doença. Os estudos geralmente dependem de procedimentos terminais que 1) fornecem informações de todo o pulmão (ensaios bioquímicos) ou informações localizadas (histologia) e 2) exigem desenhos transversais e grandes tamanhos de amostra. Assim, eles não capturam a dinâmica espacial nem temporal da doença. Em contraste, a imagem tridimensional não invasiva pode avaliar a estrutura, os processos moleculares e a função nos pulmões ao longo do tempo.

A estrutura pulmonar (por exemplo, anormalidades das vias aéreas e fibrose intersticial) pode ser visualizada com ressonância nuclear magnética (RNM) ultracurta (UTE) e tomografia computadorizada (μTC) em alta resolução. Informações funcionais e mecanicistas (por exemplo, ventilação, perfusão, metabolismo tumoral e processos inflamatórios) podem ser obtidas com agentes de contraste exógenos (por exemplo, TC com xenônio e UTE com oxigênio) e abordagens de medicina nuclear ionizante (ou seja, tomografia por emissão de pósitrons [PET] e tomografia computadorizada por emissão de fóton único [SPECT]). No entanto, a imagem funcional é desafiadora devido ao modesto contraste com ruído (particularmente para UTE com oxigênio aprimorado nas altas intensidades de campo magnético usadas para ressonância magnética pré-clínica, onde T₁ é alongado) disponível sem empregar modalidades ionizantes com níveis de radiação mais altos do que o normal. Embora a imagem com essas modalidades seja bem tolerada em modelos animais usando doses convencionais, a radiação cumulativa pode confundir os resultados em estudos sobre imunologia, inflamação e câncer de pulmão¹⁷. No entanto, a ressonância magnética (MRI) de xenônio-129 (¹²⁹Xe) hiperpolarizada (HP) fornece informações estruturais e funcionais minimamente invasivas, não irradiantes e altamente sensíveis. Embora essa técnica tenha sido empregada em pesquisas pré-clínicas para caracterizar condições como enfisema^18,19, fibrose²⁰, câncer de pulmão²¹, DPOC²² e lesão pulmonar induzida por radiação²³ em pontos de tempo únicos ou múltiplos, ela permanece subutilizada no ambiente pré-clínico.

Para permitir a ressonância magnética pré-clínica de ^{rotina de 129}Xe, vários pré-requisitos são necessários, incluindo suporte regulatório institucional, um dispositivo de hiperpolarização, uma bobina de radiofrequência (RF) sintonizada em ¹²⁹Xe e um scanner com capacidade multinuclear. Embora os aplicativos avançados 24,25,26,27,28,29,30,31,32,33 exijam programação de pulso específica do fornecedor que está fora do escopo deste protocolo, os aplicativos básicos podem ser alcançados com modificações modestas de software. Portanto, nos concentramos no controle de qualidade, manuseio de magnetização, coleta de dados e procedimentos de manuseio de animais - incluindo ventilação mecânica - que são exclusivos da ressonância magnética pré-clínica ^{de 129}Xe (Figura 1).

Até o momento, a imagem de ¹²⁹Xe de pequenos animais empregou três abordagens de entrega de gás seguras para RM, cada uma com vantagens e desvantagens: respiração livre, acionada por pistão e queda de pressão. A respiração livre permite a inalação espontânea sem risco de lesão por intubação ou traqueostomia, mas consome significativamente mais gás HP e pode introduzir artefatos de movimento^34,35. Dispositivos comerciais acionados por pistão são autocalibrados e fáceis de usar prontos para uso, mas podem ser proibitivamente caros³⁶. A abordagem baseada em queda de pressão usada aqui é bem descrita na literatura, modular, personalizável e executada por código-fonte aberto 37,38,39,40. Além disso, é econômico, normalmente totalizando menos de US$ 10 mil e algumas semanas de tempo de construção dedicado. O ventilador de queda de pressão fornece ¹²⁹Xe de uma bolsa de dose dentro de um recipiente pressurizado enquanto monitora a pressão das vias aéreas de um camundongo intubado.

Figura 1: Visão geral do protocolo para coletar ressonância magnética (MRI) de rotina de xenônio-129 (¹²⁹Xe) em camundongos. (A) Etapas para configuração inicial. (Observação: a programação do scanner é exclusiva para cada fornecedor e não está descrita neste protocolo). (B) Etapas para coletar dados diários de garantia de qualidade (QA) e animais. (C) Etapas para a conclusão bem-sucedida do experimento e análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui, coletamos e analisamos as três classes comuns de dados de ressonância magnética de ¹²⁹Xe: ventilação, imagem ponderada por difusão (tamanho do espaço aéreo alveolar) e troca gasosa. As imagens de ventilação mostram a distribuição do gás ¹²⁹Xe inalado. Regiões dos pulmões com fluxo de ar reduzido parecem escuras nas imagens de gás HP, e a patologia é quantificada pelo volume de ventilação defeituosa. Em humanos, o percentual de defeitos ventilatórios (VDP) tem apresentado forte repetibilidade^41,42 e alta sensibilidade à obstrução pulmonar em doenças como DPOC 43,44,45 e asma ^46,47.

A difusão restrita dos ¹²⁹átomos de Xe no espaço aéreo pode ser medida através do coeficiente de difusão aparente (ADC) e serve como um substituto para o tamanho do espaço aéreo. O ADC é calculado adquirindo uma imagem de linha de base (b₀) sem ponderação de difusão e uma ou mais imagens adquiridas na presença de ponderação de difusão induzida por gradiente bipolar (b_N). Um ADC elevado reflete um aumento no tamanho do espaço aéreo devido ao envelhecimento ou remodelação enfisematosa^18,48. Além disso, o uso de múltiplas imagens de valor b (≥4) permite que informações morfométricas mais detalhadas (por exemplo, intercepto linear médio) sejam calculadas^49,50.

As trocas gasosas podem ser caracterizadas devido a 1) a solubilidade de ¹²⁹Xe no tecido da membrana capilar, plasma e hemácias (glóbulos vermelhos) e 2) o deslocamento químico de >200 ppm no campo descendente de ¹²⁹Xe quando dissolvido nesses compartimentos. Tanto os dados espectroscópicos quanto os de imagem fornecem informações sobre doenças cardiopulmonares (por exemplo, hipertensão pulmonar e insuficiência cardíaca esquerda 51,52,53). Enquanto muitas espécies (humanos, caninos e ratos) exibem picos espectrais únicos originados de cada compartimento, os camundongos não possuem um sinal único de hemácias devido a diferenças nas interações do local de ligação hemoglobina-xenônio. Em vez disso, todos os componentes dissolvidos são combinados em um único sinal em camundongos⁵⁴. No entanto, é possível observar uma ressonância distinta de hemácias em camundongos transgênicos que expressam hemoglobina humana, como os usados em modelos de doença falciforme⁵⁴. No geral, a espectroscopia e a imagem de ^{Xe 129}dissolvido fornecem informações únicas sobre a fisiopatologia cardiopulmonar em camundongos ^55,56.

Antes de tentar este protocolo, é necessário entender as informações básicas sobre o scanner de ressonância magnética, ventilação mecânica e técnicas de manuseio de camundongos necessárias para estudos com camundongos. Antes de iniciar os estudos em animais, todos os procedimentos devem ser aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) ^local57. Como o momento magnético total disponível no pulmão do camundongo é intrinsecamente baixo (ou seja, volume corrente ~ 250 μL), o tamanho do voxel deve ser 1000 vezes menor do que em humanos para atingir uma resolução anatomicamente equivalente. A frequência respiratória murina também é extremamente rápida (>100 respirações/minuto). Como tal, os procedimentos de apneia única normalmente usados para imagens humanas não são viáveis. Em vez disso, apenas algumas excitações de RF podem ser aplicadas em cada respiração, portanto, ¹²⁹imagens Xe devem ser codificadas em dezenas a centenas de respirações. A programação de pulso pode ser necessária para permitir o disparo externo de aquisições e para fazer um loop adequado de fatias, codificações de fase e/ou imagens ponderadas por difusão, equilibrando a relação sinal-ruído (SNR), a resolução e a duração da varredura. Aqui, o ventilador emite um pulso lógico transistor-transistor (TTL) uma vez por respiração para acionar a aquisição de dados (Figura 2).

Figura 2: Ventilação mecânica representativa e tempo de aquisição de dados. (A) A ventilação controlada pelo usuário pode desencadear a aquisição de dados no final da inspiração, durante a apneia ou no final da expiração. (B) Para esta sequência de ventilação radial 3D, o usuário define o número total de projeções adquiridas e o número de projeções por respiração. (C) Para uma imagem ponderada por difusão 2D seletiva de fatias, o usuário define a ordem das fatias, imagens de valor b e codificações de fase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para permitir ventilação confiável e entrega de ¹²⁹Xe, são necessários procedimentos robustos de sedação e intubação. Para cada estudo, os efeitos a jusante de cada anestésico devem ser considerados - incluindo alterações na ventilação-minuto, frequência cardíaca (FC) e pressão arterial 58,59,60,61,62,63,64,65,66. Embora uma variedade de sedativos tenha sido usada para ressonância magnética pré-clínica de gases HP, empregamos uma mistura de cetamina, xilazina e acepromazina, devido à sua disponibilidade, custo-benefício, confiabilidade e duração^67,68. Uma vez sedados, os animais devem ser intubados para ventilação mecânica eficaz. A intubação de camundongos é difícil devido ao pequeno tamanho de sua anatomia e, portanto, é importante treinar minuciosamente nessa técnica. Encorajamos os investigadores a revisar os protocolos de vídeo publicados^69,70. Como a maioria das cânulas de intubação comerciais contém aço inoxidável, introduzimos uma técnica para criar cânulas em forma de cunha sem metal (ou seja, compatíveis com ressonância magnética e gás HP) que podem ser personalizadas para corresponder ao diâmetro das vias aéreas para criar uma vedação hermética com a parede traqueal do camundongo.

Como ¹²⁹imagens Xe são coletadas em muitas respirações, as configurações do ventilador são críticas. Estratégias de ventilação protetora devem ser cuidadosamente consideradas para prevenir lesões pulmonares 71,72,73,74. Em particular, o uso de baixo volume corrente (VC), pressão expiratória final positiva moderada (PEEP) e manobras de recrutamento alveolar (MRs) reduzem o risco de lesão pulmonar induzida por ventilador em pacientes humanos e modelos animais 75,76,77,78,79,80,81. Aqui, recomendamos uma técnica simples que seja compatível com a ventilação mecânica de queda de pressão ¹²⁹Xe que seja protetora e forneça SNR de imagem ¹²⁹Xe suficiente. Especificamente, aplicamos a PEEP adicionando uma válvula PEEP comercial à linha de expiração do ventilador. Para realizar RMs, a linha de expiração deve ser fechada para que o animal receba múltiplas inalações sem expiração até que uma pressão e duração alvo sejam atingidas.

Ao longo do tempo, fornecemos configurações gerais de ventilação, mas é aconselhável revisar a literatura para abordar os objetivos específicos do estudo^82,83. Além de monitorar o pico de pressão inspiratória durante a ventilação mecânica, é importante monitorar a temperatura do animal, o que pode ser feito usando métodos padrão de monitoramento de temperatura em camundongos. Embora não seja necessário para imagens, o monitoramento da frequência cardíaca por meio de eletrocardiograma (ECG) pode ser vantajoso; O ECG pode indicar se um animal está acordando de sedação, overdose ou angustiado, permitindo que o pesquisador intervenha.

O protocolo que descrevemos foi projetado para coletar ¹²⁹dados de ventilação radial Xe 3D⁶¹, dados ponderados por difusão 2D GRE⁷⁶ e dados de troca gasosa de espectroscopia de aquisição de pulso dinâmico. Este protocolo visa preencher a lacuna entre a pesquisa pré-clínica em modelos de pequenos animais e o potencial da ressonância magnética ^{de 129}Xe para avançar nossa compreensão dos distúrbios pulmonares.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati.

1. Preparação inicial do site

1. Crie e teste um fantasma de gás ¹²⁹Xe polarizado termicamente (Figura 3).
   1. Obtenha um recipiente de vidro borossilicato (~ 60 mL), uma válvula de êmbolo com um O-ring de vedação frontal e uma haste de vidro borossilicato retificada, todos classificados em até 150 psig. Certifique-se de que não haja peças magnéticas. Conecte um encaixe de compressão à haste de vidro. Aperte para produzir uma vedação à prova de gás.
   2. Conecte o recipiente a uma bomba de vácuo e reservatório de oxigênio de acordo com a Figura 3A. Recipiente de vácuo a menos de 100 mTorr de pressão absoluta.
   3. Encha o recipiente com oxigênio até a pressão de 1.5 atm para reduzir o ¹²⁹Xe T₁ de > 30 min para ~ 2 s (com intensidade de campo magnético de 7 T; Para um scanner de 9,4 T, use oxigênio de 1,6 atm). Recipiente de vedação.
      NOTA: Para intensidades de campo mais altas, será necessária uma pressão parcial de oxigênio um pouco mais alta para atingir T₁≤ 2 s⁸⁴.
   4. Encha um reservatório impermeável a gás com 400 mL de xenônio enriquecido isotopicamente (85% ¹²⁹Xe).
      NOTA: O xenônio de abundância natural (26% ¹²⁹Xe) também pode ser usado, mas a taveragem de sinal precisará ser aumentada para mitigar a redução de ~ 3 vezes no SNR.
   5. Conecte a embarcação ao reservatório de ¹²⁹Xe. Tubulação de vácuo com pressão absoluta inferior a 100 mTorr.
   6. Encha um líquido de bancada N₂ Dewar de boca aberta a ~ 90%. Mergulhe o fundo do recipiente (~ 5 cm) em nitrogênio líquido para condensar O₂ e criar um vácuo (Figura 3B). Enquanto estiver submerso, abra a válvula para permitir que ¹²⁹Xe do reservatório flua para o vaso (Figura 3C).
   7. Vede a válvula de êmbolo puxando lentamente a haste até que o orifício de entrada no êmbolo seja puxado para além do O-ring. Imediatamente após o orifício passar pelo O-ring, aperte manualmente para vedar o recipiente. Remova o recipiente do nitrogênio líquido e deixe-o descongelar.
      NOTA: Uma vez descongelado, o vaso pressurizará a ~ 4.5 atm (2 atm O₂ + 2.5 atm ¹²⁹Xe).
   8. Proteja os copos (por exemplo, insira o recipiente no recipiente acolchoado de tubo de cloreto de polivinila (PVC), Figura 3D).
      NOTA: Se mantido adequadamente, o simulador pode manter a pressão por uma década ou mais.
   9. Meça o T₁ do simulador (por exemplo, usando uma sequência de recuperação de inversão espectroscópica). Confirme T₁ < 2 s para scanners de 7 T. Rastreie o sinal e o T₁ ao longo do tempo para garantia de qualidade (QA).

Figura 3: Criação de um simulador de gás ¹²⁹Xe polarizado termicamente guiado pelo protocolo detalhado na Etapa 1.1. As pressões parciais de O₂ e ¹²⁹Xe podem ser alteradas para personalizar o T₁ para produzir ¹²⁹Xe T₁ vezes apropriados e intensidade do sinal em uma determinada intensidade de campo⁸⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Realize a garantia de qualidade com o simulador de gás polarizado termicamente (Tabela 1 e Figura 4).
   1. Coloque a bobina de ¹²⁹Xe no isocentro do ímã e centralize o fantasma de gás ¹²⁹Xe dentro da bobina. Em uma única sequência de pulso e aquisição ("pulso único"), defina a frequência de trabalho para corresponder à frequência aproximada de ^{gás 129}Xe no simulador (~ 83.07 MHz a 7T).
   2. Centralize as frequências de aquisição e excitação para a frequência ¹²⁹Xe Larmor e use essa frequência para todas as varreduras ¹²⁹Xe de calibração fantasma e controle de qualidade. Consulte a Tabela 1 para parâmetros experimentais para todas as varreduras de controle de qualidade. Confirme se o simulador está centralizado com um localizador fantasma (Figura 4A).
   3. Realize o experimento de nutação para calibrar o ângulo de inversão: Supondo que o SNR seja suficiente, use pulsos de RF únicos com espaçamento de tempo de repetição (TR) > 5 x T₁. Para cada aquisição, aumente incrementalmente a potência de RF até que o sinal seja nulo e comece a inverter. O padrão usado aqui é: número de pulsos = 65; TR = 10 s; duração do pulso = 125 μs; Potência de RF = 1-13,8 W, incrementada em 0,2 W
   4. Transformada de Fourier e fase do primeiro espectro (ou seja, o espectro adquirido com a menor potência de RF). Aplique a mesma fase para todos os espectros. Plote os espectros reais em função da potência do pulso de RF (Figura 4B).
   5. A potência que produz um pico nulo (ou seja, altura mínima do pico) corresponde ao ângulo de inversão de 180°. Obtenha um ângulo de inversão de 90° usando a mesma potência na metade do comprimento de pulso necessário para produzir o ângulo de inversão de 180°. Supondo que o software do scanner permita, defina essa potência de referência de 90° e comprimento de pulso para o dimensionamento subsequente do ângulo de inversão.
   6. Use um único pulso para calço, minimizando a largura total na metade do máximo do espectro de ¹²⁹Xe (TR ~ 1 s). Se necessário, centralize novamente a frequência após o calço. Registre a metade máxima da largura total.
   7. Execute a verificação de controle de qualidade ¹²⁹Xe (Tabela 1 e Figura 4C). Registre os dados de controle de qualidade: SNR, sinal fantasma médio e desvio padrão do ruído.

Figura 4: Garantia de qualidade pré-digitalização. (A) Um localizador de simulador coronal GRE 2D de baixa resolução garante que o simulador esteja centralizado no ímã. (B) Um experimento de nutação para definir um pulso de 90 ° mostra um pico nulo no pulso de 180 °. (C) Depois de localizar e calibrar o ângulo de inversão, adquira uma imagem de controle de qualidade 2D GRE de resolução mais alta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome abreviado do protocolo	Descrição da sequência	TR (ms)	TE (ms)	Médias / Repetições	Ângulo de inversão (°)	Tamanho da matriz ou Npts	FOV (mm2)	RF BW (kHz)	Espessura da fatia / laje (mm)	Duração da varredura
Pulso único	Aquisição de pulso	1000		1 / 1	60	2048		10		1 s
Localizador fantasma	2D GRE	200	3.7	20 / 1	48	60 × 32	120 × 48	3	60	2 min
Calibração de ângulo de inversão	Aquisição de pulso	7000		1 / 65	20	2048		5.12		7,5 min
129Xe QA	2D GRE	5000	3.3	8 / 1	90	322	322	3	40	21 minutos

Tabela 1: Parâmetros da sequência de garantia de qualidade da calibração fantasma. TR = tempo de repetição, TE = tempo de eco, N_pts = número de pontos, FOV = campo de visão, BW = largura de banda. Clique aqui para baixar esta tabela.

3. Polarização do plano (Figura 5A, B).
   1. Selecione o volume polarizado ^{de 129}Xe e o tempo de acumulação: 400 mL em 15 min é ideal para este protocolo (Figura 5), mas pode ser facilmente ajustado para outras aplicações e equipamentos.
   2. Assumindo um volume morto conhecido dentro do hiperpolarizador (por exemplo, _{V volume morto} = 80 mL), calcule a taxa de fluxo (F_Xe em SLM) para um volume dispensado V_desejado, fração de gás ¹²⁹Xe f e tempo de acumulação t_acc:
      (1)
      NOTA: Embora tempos de produção mais longos normalmente produzam maior polarização, eles podem não ser práticos para imagens in vivo. Use um modelo apropriado para o hiperpolarizador 85,86,87,88 para determinar uma taxa de fluxo que equilibrará o tempo de produção e a polarização. Aqui, foi utilizado o modelo de J. W. Plummer et ^al.89 (Figura 5A). Isso se aplica a polarizadores de fluxo contínuo e não é aplicável a hiperpolarizadores de fluxo interrompido⁹⁰.
   3. Polarize o gás de acordo com esses parâmetros, meça a polarização com um dispositivo comercial ou caseiro e compare-a com a polarização prevista para controle de qualidade.
   4. Meça a perda de polarização durante o transporte. Se a polarização diminuir em uma quantidade suficientemente grande (por exemplo, >10%), construa um estojo de transporte magnético para proteger a polarização durante o transporte. Consulte o Arquivo Suplementar 1: Gerenciando a polarização durante o transporte e a Figura Suplementar 1.

Figura 5: Gerenciamento de polarização. (A) A polarização e o volume produzido são uma função do tempo de acumulação e da taxa de fluxo. Uma bolsa de gás de 400 mL fornece alta polarização inicial (~ 35%) em 20 min. Embora o uso de 1 L de gás possa parecer atraente, ele terá uma polarização inicial mais baixa (~ 20%). (B) Após ~ 15 minutos de ventilação, um lote de 1 litro de HP ¹²⁹Xe se esgotaria para < 10% de polarização, enquanto 600 mL de gás permaneceriam¹¹⁶. Assim, o uso de vários sacos de 400 mL de ¹²⁹Xe mantém uma polarização média mais alta. C) Locais onde o campo primário e o campo de blindagem ativo se cruzam (caixa vermelha na posição (N,N,N)) podem causar relaxamento rápido do HP ¹²⁹Xe. A caracterização do campo de franja do ímã ajuda a identificar zonas seguras onde os reservatórios de HP ¹²⁹Xe podem ser colocados sem relaxamento rápido (caixa verde na posição (0,0,n)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Gerenciando a polarização durante o transporte. Clique aqui para baixar este arquivo.

4. Meça o T₁ dependente da posição de HP ¹²⁹Xe dentro do campo de franja (Figura 5C).
   1. Crie pontos de referência com distâncias e posições conhecidas em relação ao isocentro magnético ao longo das dimensões X, Y e Z. Rotule o isocentro e rotule as outras posições de n a N. O número de posições a serem investigadas dependerá do espaço disponível.
   2. Hiperpolarize um pequeno volume de ¹²⁹Xe (~250 mL) e transporte-o para a sala de controle de ressonância magnética. Encha uma seringa grande (50-100 mL) com ¹²⁹Xe e coloque-a no isocentro dentro do ímã (Posição 1 na Figura 5C). Execute um pulso de ângulo de inversão de ~ 1 ° para medir o sinal.
   3. Deixe a seringa na posição por ~ 10 min e, em seguida, adquira outro espectro. Meça novamente o sinal a cada 10 minutos até que o sinal tenha decaído pelo menos 1 T₁ (ou seja, o sinal decaiu para ~ 1/3 de seu valor inicial).
   4. Inicie um novo experimento T₁ com uma nova seringa de ¹²⁹Xe repetindo a Etapa 1.4.2.
   5. Mova a seringa para uma nova posição (por exemplo, Posição n na Figura 5C) e deixe-a lá por 10 min. Retorne a seringa ao isocentro para adquirir um espectro de ângulo de inversão adicional de ~ 1 °.
   6. Repita este processo: mova a seringa para a posição n, aguarde 10 min, coloque-a de volta no isocentro e meça novamente o sinal até que decaia pelo menos 1 T₁.
   7. Repita as etapas 1.4.4 a 1.4.6 para as posições de referência restantes que cobrem as direções X, Y e Z.
   8. O sinal inicial (S₀) decairá monoexponencialmente em n pulsos de RF com um ângulo de inversão θ. Ajuste o sinal (S) em função do tempo (t) no campo marginal para calcular o T₁ em cada posição:
      (2)
   9. Identifique uma posição com T₁ suficiente (>20 min) para a colocação do reservatório ^{de 129}Xe.
5. Crie cânulas de intubação sem metal (Figura 6).
   1. Obtenha dois cateteres veianos de politetrafluoretileno (PTFE) com conectores Luer. Descarte as agulhas em um recipiente para descarte de objetos cortantes.
      NOTA: Para camundongos >25 g, use cateteres 18 G e 20 G. Para animais menores, use cateteres 20 G e 22 G.
   2. Corte o conector Luer dos cateteres. Alimente o cateter menor na extremidade superior do cateter maior para criar uma cânula mais acentuada e mais longa. Corte a cânula composta em ~ 4.6 cm com uma extremidade chanfrada, não incluindo a base Luer (Figura 6A, B).
   3. Corte a extremidade mais larga de uma ponta de pipeta de 200 μL em um comprimento de ~ 2.6 cm ( Figura 6C ).
   4. Cubra o interior da ponta da pipeta com lubrificante geral de desmoldagem. Use outra ponta de pipeta inserida no interior para distribuir finamente o lubrificante. Encha a ponta da pipeta com pasta de vulcanização de silicone acetóxi epóxi (Figura 6D, E).
   5. Conecte a cânula com um fio de 22 G que se estende para fora de ambas as extremidades. Passe o tubo da cânula através de silicone na ponta da pipeta. Estenda o tubo ~7 mm além da extremidade da ponta da pipeta (Figura 6F, G).
   6. Deslize o tubo da cânula no lado mais largo da ponta da pipeta através de um conector Luer de deslizamento macho de plástico, colando as peças com o epóxi. Tubulação de acabamento que se estende além do conector Luer (Figura 6H).
   7. Aguarde a secagem do epóxi (>24 h) e, em seguida, remova cuidadosamente a cânula de intubação de silicone do molde da ponta da pipeta. Remova o fio da cânula, certificando-se de que o tubo não tenha sido ocluído (Figura 6I).
   8. Para fazer uma alça para facilitar a intubação, conecte a tubulação (1/16" ou 1/8") a um conector Luer fêmea. Quando estiver pronto para a intubação, conecte este conector Luer fêmea à cânula de intubação Luer macho. Esta peça pode ser facilmente destacada após a intubação (Figura 6J).
   9. Higienize antes de cada uso em animais: limpe a parte externa da cânula com álcool 70%. Limpe o fio de 20 G com desinfetante e, em seguida, passe o fio pela cânula para higienizar o interior e garantir que não haja bloqueios.

Figura 6: Criação de cânulas de intubação de mouse compatíveis com ressonância magnética e HP ¹²⁹Xe. Essas cânulas são construídas com cateteres venosos, pontas de pipeta e selante de silicone, conforme descrito na Etapa 1.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Coleta diária de dados

NOTA: Consulte o Arquivo Suplementar 2: Lista de verificação de controle de qualidade de varredura pré-clínica.

Arquivo Suplementar 2: Lista de verificação de controle de qualidade de varredura pré-clínica. Clique aqui para baixar este arquivo.

1. Controle diário completo de qualidade do scanner e ventilador de configuração (Figura 4).
   1. Com fantasmas, execute protocolos de controle de qualidade no scanner (consulte a Tabela 1 para obter os parâmetros de verificação de controle de qualidade e a Etapa 1.2 para obter as etapas diárias de controle de qualidade).
   2. Calibrar o ventilador de acordo com o método de J. Nouls et ^al.38. Consulte o Arquivo Suplementar 3: Calibração do ventilador, Figura Suplementar 2 e Figura Suplementar 3.
   3. Defina as configurações do ventilador para imagens no final da inspiração (Tabela 2). Coloque a cama do animal no rack do scanner e o módulo de suporte de vida (ou seja, peças do ventilador mecânico) na mesa ao lado do scanner.
   4. Ative o sistema de aquecimento animal específico do local. Defina um aquecedor para 35,5 - 40 °C, ligue o ar circulante e coloque a mangueira de ar a ~5" de onde a cabeça do animal descansará para pré-aquecer o orifício do scanner.

Configuração de ventilação	Recomendação para HP 129Xe MRI	Anotações
Volume corrente (TV)	8–10 mL/kg de peso corporal ideal	TV moderada; TV baixa requer BR mais alto, o que pode causar artefatos de movimento nas imagens
Pressão expiratória final positiva (PEEP)	2–6 cmH2O
Frequência respiratória (BR)	80–120 br/min
Manobras de recrutamento (RMs)	~ 35 cmH2O por 6 s a cada 5 min
Duração da ventilação; Posição	< 6 h; supino	Supino para ver melhor o movimento do peito
Fração inspirada de oxigénio(FIO2)	0.3–0.5	Previna a hipóxia em camundongos anestesiados
Relação inspiratória/expiratória (I:E)	1:2–1:4
Duração do ciclo inspiratório para total	0.2–0.4
Ventilação minuto	≥0,57 mL·g-1·min-1
Nossos padrões:
BR = 80 br/min, duração da inspiração = 200 ms, FIO2 = 0,3
Imagem no final da inspiração: apneia = 200 ms, atraso do gatilho = 200 ms após o início da inspiração
Exames de imagem durante a apneia: apneia = 250 ms, atraso do disparo = 250 ms após o início da inspiração
Imagem no final da expiração: apneia = 200 ms, atraso do disparo = 650 ms após o início da inspiração

Tabela 2: Configurações recomendadas do ventilador para imagens ¹²⁹Xe. Os parâmetros podem ser ajustados para objetivos de estudo específicos e condições experimentais 117,118,119,120,121,122,123,124. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 3: Calibração do ventilador. Clique aqui para baixar este arquivo.

2. Sedar e intubar o animal.
   1. Ligue a incubadora a 27.7 °C e/ou a almofada de aquecimento elétrico a 37.7 °C. Meça e registre a massa corporal do animal. Calcule a dosagem de sedativo com base na massa. Consulte a Tabela 3 para um regime posológico típico.
   2. Injete o sedativo por via intraperitoneal. Anote o tempo de injeção e defina o cronômetro para a próxima dose de sedativo.
      NOTA: Conclua as etapas restantes na Seção 2 (Coleta diária de dados) o mais rápido possível para minimizar o tempo sob sedação e o risco de overdose.
   3. Aplique lubrificante ocular nos olhos do animal e coloque-o em uma gaiola na almofada de aquecimento ou dentro de uma incubadora para evitar hipotermia.
   4. Confirme se o animal está totalmente sedado realizando um teste de beliscão do dedo do pé 10-15 min após a injeção de sedativo⁶⁸. Intubar seguindo os procedimentos descritos em Das et ^al.69.
      NOTA: O artigo de Das et ^al.69 é acompanhado por uma demonstração abrangente em vídeo da técnica. As etapas são as seguintes:
   5. Pendure o animal em decúbito dorsal pelos dentes em uma tábua inclinada. Use um abaixador de língua de roedor para puxar a língua.
   6. Para garantir que as cordas vocais estejam visíveis, forneça luz branca por meio de um cabo de fibra óptica dentro da cânula de intubação ou uma luz brilhante colocada na parte externa da garganta. Insira a cânula a menos de 5 mm após as cordas vocais.
   7. Certifique-se de que a cânula esteja na traqueia, não no esôfago, conectando-a a um pedaço de tubo com uma pequena gota de água dentro. Se a gota de água se mover no ritmo da respiração do animal, o posicionamento provavelmente está correto.

Agente	Dose	Rota	Duração	Comentários
Agentes inalatórios
Isoflurano	Indução: 4% a 5% Manutenção: 1%– 3% ou para efeito	Inalado	Durante o fluxo contínuo	• Requer o uso de vaporizador calibrado
Agentes injetáveis
Recomendado: Cetamina + xilazina + acepromazina	90 + 9 + 3 mg/kg	Intraperitoneal	20–60 min	• Cria suscetibilidade à hipotermia
				• Para doses repetidas, recomenda-se mudar para uma mistura de cetamina + xilazina para evitar sobredosagem
				• Provoca tremores à medida que passa. Para imagens, siga rigorosamente o cronograma de dosagem
				• Pode causar bradicardia
Cetamina + xilazina	90 + 9 mg/kg	Intraperitoneal	20–40 min	• Veja acima (Cetamina + xilazina + acepromazina)
Pentobarbital	50 - 70 mg/kg	Intraperitoneal	20–60 min	• Deprime a frequência respiratória e o movimento
				• A despesa pode ser proibitiva
				• O grau farmacêutico pode não estar disponível
Isenção de responsabilidade: estas são diretrizes gerais. Consulte um veterinário para obter mais informações antes da implementação.

Tabela 3: Formulário anestésico comum para camundongos. Clique aqui para baixar esta tabela.

3. Ventilar o animal (Tabela 2).
   1. Conecte o animal ao ventilador através do conector Luer na cânula de intubação. Monitore o movimento diafragmático e a pressão inspiratória de pico (~ 10-12 cm H₂O para um volume corrente de 10 mL / kg de peso corporal). Se a pressão ou o movimento respiratório forem anormais, ajuste cuidadosamente o ângulo do pescoço e a profundidade da cânula conforme necessário.
   2. Certifique-se de que a cânula de intubação esteja hermética realizando uma manobra de recrutamento: evite a expiração (por exemplo, com um dedo, bloqueie a porta de expiração) de forma que o animal inspire várias vezes sem expirar.
      NOTA: Se a pressão das vias aéreas atingir 35 cmH₂O pico da pressão inspiratória em ~6 s, a vedação das vias aéreas está suficientemente apertada. Caso contrário, consulte a discussão para solução de problemas.
   3. Permita que a expiração normal seja retomada. Realize manobras de recrutamento entre os exames e a cada ~5 minutos quando não estiver examinando para manter a complacência pulmonar e prevenir atelectasias. Conecte a válvula PEEP à linha de expiração. Defina a PEEP para 4 cmH₂O. Observe o pico de pressão inspiratória aumentar nessa quantidade.
   4. Após a intubação bem-sucedida, planeje e inicialize a produção de HP ¹²⁹Xe em torno do cronograma de redosagem de sedativos para evitar que o animal acorde durante um exame. Monitore a temperatura corporal durante todo o experimento.
4. Aquisição de dados: Colete imagens de ventilação.
   NOTA: As etapas de aquisição de dados 2.4, 2.5 e 2.6 podem ser feitas em qualquer ordem
   1. Defina o ventilador de acordo com a Tabela 2 para imagens no final da inspiração.
   2. Carregue os seguintes protocolos de configuração: localizador de prótons para animais, pulso único para centralizar a frequência do gás nos pulmões do camundongo e localizador de animais ¹²⁹Xe. Consulte a Tabela 4 para obter os parâmetros de varredura.
   3. Posicione o animal no isocentro e confirme se a cavidade torácica está no centro do campo de visão com localização de prótons. Se estiver usando bobinas de frequência única, substitua a bobina de prótons por uma bobina de RF sintonizada em ¹²⁹Xe.
   4. Registre a polarização ^{de 129}Xe e transporte-a para o scanner de ressonância magnética. Consulte o Arquivo Suplementar 4: Lista de verificação de controle de qualidade da polarização de xenônio.
   5. Coloque um saco de ¹²⁹Xe dentro do recipiente do ventilador e lacre. Conecte o recipiente alinhado com o ventilador e deixe o recipiente pressurizar (3 - 6 psig).
   6. Inicie a ventilação mecânica ¹²⁹Xe. Cada vez que a ventilação ¹²⁹Xe for ativada, permita que o animal complete ~ 5 respirações antes de iniciar uma varredura para transformar a capacidade residual funcional dos pulmões.
      NOTA: Mude para a mistura N₂/O₂ entre ¹²⁹varreduras de Xe para conservar o gás hiperpolarizado.
   7. Usando um único pulso, ajuste a frequência de trabalho para corresponder à frequência de ressonância in vivo do gasoso ¹²⁹Xe (~ 83,07 MHz a 7 T). Copie a frequência para todas as varreduras Xe subsequentes da fase gasosa ¹²⁹. Execute a localização ^{de 129}Xe para confirmar que os pulmões estão no isocentro.
   8. Carregue e execute a sequência de ventilação radial ¹²⁹Xe. Monitore a pressão inspiratória de pico.
      NOTA: Se o gás ¹²⁹Xe acabar antes do término do protocolo, o pico de pressão inspiratória diminuirá rapidamente. Um saco de 400 mL de ¹²⁹Xe pode ventilar um camundongo de 30 g por ~ 24 min quando ventilado com 70% ^{de 129}Xe a 80 respirações por minuto com um volume corrente de 10 mL / kg de peso corporal ideal.
   9. Quando a varredura terminar, mude para ventilação com a mistura N₂/O₂ e remova o saco vazio de ¹²⁹Xe.
   10. Para imagens no final da expiração, altere a duração da apneia e o atraso do disparo de acordo com a Tabela 2 e repita as etapas 2.4.2 a 2.4.9.
   11. Exporte os dados brutos do scanner.

Nome abreviado do protocolo	Descrição da sequência	Gatilho	TR (ms)	TE (ms)	Repetições	Ângulo de inversão (°)	Tamanho da matriz ou Npts	FOV (mm2)	RF BW (kHz)	Espessura da fatia/laje (mm)	Duração da varredura
Pulso único	Aquisição de pulso (fase gasosa)	Opcional	1000		1	60	2048		10		1 s
Localizador de animais	2D GRE	Sim	50	1.7	1	60	642	322	3	25	60 s
Ventilação radial	Radial multi-eco 3D	Sim	20	Ver legenda	1	30	613	223	32.05	30	16 min
Pulso único de fase dissolvida	Aquisição de pulso (fase dissolvida)	Não	80		1	90	512		10.35		80 ms
Especificação dinâmica de fase dissolvida.	Aquisição de pulso (fase dissolvida)	Não	50		1000	90	512		10.5		50 s
Ponderada por difusão	2D GRE	Sim	12.2	8.1	4	45	642	322	3	1.5	18 min

Tabela 4: Parâmetros de sequência in vivo . A sequência de ventilação radial multi-eco 3D descrita anteriormente³⁹ adquire imagens em 6 tempos de eco. Os resultados são mostrados para a primeira imagem de eco (TE = 1,12 ms, Figura 7). Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 4: Lista de verificação de controle de qualidade da polarização de xenônio. Clique aqui para baixar este arquivo.

5. Aquisição de dados: Execute espectroscopia dinâmica de fase dissolvida.
   1. Defina o ventilador de acordo com a Tabela 2 para imagens durante a apneia. Defina o BR para 100 respirações/min. Prepare-se para um novo saco de ¹²⁹Xe como nas etapas 2.4.2 a 2.4.5.
   2. Inicie a ventilação mecânica ¹²⁹Xe. Carregue e execute um único pulso para ajustar a frequência de trabalho para corresponder à frequência dissolvida (~ 83.084 MHz a 7 T). Copie a frequência de trabalho para a espectroscopia dinâmica de fase dissolvida.
      NOTA: Este será um pico único em camundongos com hemoglobina⁵⁴ do tipo selvagem.
   3. Carregue e execute a sequência de espectroscopia dinâmica centrada na frequência dissolvida nos pulmões dos animais. Quando a varredura terminar, mude para ventilação com a mistura N₂/O₂ e remova o saco vazio de ¹²⁹Xe. Exporte os dados brutos do scanner.
6. Aquisição de dados: Colete imagens ponderadas por difusão.
   1. Defina o ventilador de acordo com a Tabela 2 para imagens durante a apneia. Prepare-se para um novo saco de ¹²⁹Xe como nas etapas 2.4.2 a 2.4.7.
   2. Carregue e execute a sequência ponderada por difusão. Quando a varredura terminar, mude para ventilação com a mistura N₂/O₂ e remova o saco vazio de ¹²⁹Xe. Exporte os dados brutos do scanner.

3. Concluindo o experimento

1. Recuperar animal.
   1. Puxe a cânula de intubação diretamente para fora da boca do animal. Se o animal não começar a respirar imediatamente espontaneamente, administre leves compressões torácicas. Se disponível, administre um leve fluxo de oxigênio de grau médico perto do rosto do animal para apoiar a recuperação da sedação.
   2. Uma vez que o animal esteja respirando por conta própria e se o animal foi sedado por >2 h, administre 0,5 - 1 mL de solução salina normal por via subcutânea para evitar a desidratação.
   3. Devolva o animal a uma gaiola sozinho. Coloque a gaiola em uma incubadora ou em uma almofada de aquecimento.
      NOTA: Animais sedados são vulneráveis ao canibalismo e não podem ser colocados em uma gaiola com companheiros de gaiola até que estejam totalmente recuperados (ou seja, deambulando de forma independente). Animais sedados não conseguem regular a temperatura corporal. Use as costas da mão para sentir a temperatura do animal a cada poucos minutos.
   4. Monitore o animal de perto até que seu reflexo de endireitamento retorne (ou seja, ele pode virar independentemente de uma posição supina para uma posição prona).
   5. Remova o animal do suporte térmico assim que ele puder deambular de forma independente. Devolva o animal a uma gaiola com seus companheiros de gaiola.
      NOTA: se o animal não tiver companheiros de gaiola, é mais suscetível à hipotermia induzida por sedação. Forneça ao animal roupa de cama extra e, se disponível, deixe-o em uma incubadora durante a noite.
   6. Registre o peso do animal uma vez por semana durante 2 semanas para monitorar sua saúde.
      NOTA: Se o animal sofreu uma lesão na boca ou no esôfago devido à intubação, ele pode parar de comer. Se o animal perder >20% do seu peso corporal inicial, consulte um veterinário sobre a eutanásia.
2. Analise as imagens de ventilação (Figura 7).
   1. Carregue dados brutos em uma plataforma de programação. Baixe a estrutura de reconstrução de código aberto para imagens não cartesianas⁹¹.
   2. Reconstrua imagens de acordo com as instruções da estrutura de software livre. Normalize o primeiro ponto em cada projeção radial³⁹.
   3. Segmente o parênquima pulmonar nas imagens, incluindo voxels com sinal ¹²⁹Xe baixo ou inexistente. Não inclua grandes vias aéreas. Segmente o ruído de fundo na imagem, excluindo pulmões, vias aéreas e artefatos de imagem.
      NOTA: A imagem do localizador de prótons pode ajudar a determinar os limites do parênquima.
   4. Calcule a SNR usando a fórmula:
      (3)
   5. Quantifique a ventilação defeituosa.
      NOTA: Vários métodos foram propostos para quantificar a ventilação prejudicada em modelos de pequenos animais. Os métodos de análise permanecem uma área aberta de investigação, mas as abordagens facilmente implementadas incluem: (i) Segmentação manual semiquantitativa⁹², (ii) Abordagem de histograma usando o sinal da traqueia para normalizar o sinal do parênquima⁴⁷ e (iii) Segmentar o volume pulmonar total (TLV) e definir um limiar de sinal (por exemplo, <60% da média do pulmão total) para dividir os pulmões em volume defeituoso e volume pulmonar ventilado (VV). Quantificar VDP^93,94 de acordo com:
      (4)
3. Analise a espectroscopia dinâmica de fase dissolvida (Figura 8).
   1. Carregue dados brutos em uma plataforma de programação. Execute uma transformada rápida de Fourier e faseie os espectros (a fase manual simultânea de ordem zero dos espectros é suficiente para esta aplicação).
   2. Calcule os dados padrão de ressonância magnética nuclear (RMN) ^95,96: SNR, largura total metade máxima, área integrada, deslocamento químico e fase de ambos os picos.
   3. A partir dos dados de magnitude, divida a amplitude do sinal do espectro dissolvido pela do espectro de gás para cada repetição para encontrar a razão entre o gás dissolvido e o gás ao longo do tempo.
4. Analise as imagens ponderadas em difusão (Figura 9).
   1. Carregue dados brutos em uma plataforma de programação. Segmente o parênquima pulmonar da imagem b₀ como na Etapa 3.2.3. Calcule o SNR para cada imagem de valor b.
   2. Calcule a relação sinal-valor-ruído, SVNR_0, dividindo o sinal em cada voxel da imagem b₀ pelo desvio padrão do ruído da imagem. Exclua voxels com SVNR₀ < 2,5 vezes o ruído da imagem⁹⁷.
      NOTA: O_{SVNR 0} é uma métrica de voxel individual, enquanto o SNR parenquimatoso é uma métrica de pulmão inteiro.
   3. Calcular ADC ajustando o decaimento do sinal sobre os valores b (b_i) de acordo com a Equação 5^98,99:
      (5)

Resultados

Imagens de ventilação

Se os procedimentos de preparação e ventilação dos animais forem implementados adequadamente, a imagem radial 3D pode capturar com sucesso os padrões de ventilação quando a aquisição de dados é realizada na inspiração ou na expiração (Figura 7). Embora essas imagens sejam coletadas em muitas respirações, o método descrito aqui é semelhante ao método de imagem de respiração única usado em humanos. Isso ocorre porque todas as linhas do espaço k são coletadas em um momento específico durante o ciclo respiratório (por exemplo, todas no final da inspiração), criando cumulativamente uma imagem representativa de uma única inspiração. Nessas imagens, as principais vias aéreas (traqueia e brônquios) são claramente visíveis, nenhum artefato de imagem óbvio está presente e o parênquima pulmonar parece totalmente inflado com SNR alta (~ 15 ou superior, dependendo da polarização inicial). Embora contra-intuitivas, as imagens adquiridas na inspiração (Figura 7A, SNR = 15) exibem SNR mais baixa do que aquelas adquiridas na expiração (Figura 7B, SNR = 27). Isso está relacionado à pressão motriz modesta e ao fluxo lento usado ao ventilar este mouse. Para imagens de inspiração, o gás HP ainda não havia entrado totalmente no parênquima dos pulmões, fazendo com que o ¹²⁹Xe (e, portanto, o sinal) se concentrasse em vias aéreas maiores. Esse efeito é visualmente exacerbado pela escala do espaço k durante a reconstrução da imagem porque o sinal de vias aéreas altas domina a faixa dinâmica dos dados. No entanto, a análise deve ser direta se o parênquima for segmentado de forma que as grandes vias aéreas sejam omitidas.

Figura 7: Imagens representativas de ventilação radial 3D em um camundongo C57BL / 6J adulto adquirido usando métodos publicados anteriormente³⁹. Embora ambas as imagens tenham SNR relativamente alto, as imagens na inspiração (A) têm SNR mais baixo do que as imagens na expiração (B), em grande parte porque o gás ¹²⁹Xe ainda não teve tempo de entrar nos pulmões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

É importante distinguir entre ventilação patologicamente obstruída e outras causas de baixa RSR. Na Figura 7A, nenhuma obstrução de ventilação é esperada (ou seja, baixo VDP) porque o animal era um camundongo saudável do tipo selvagem. Se a ventilação fosse obstruída, os defeitos normalmente apareceriam como regiões com sinal Xe baixo ou nenhum sinal de ¹²⁹. Causas não patológicas de baixo sinal geralmente incluem:

(i)  Baixa polarização ^{de 129}Xe: Isso causa baixa SNR no parênquima pulmonar e nas vias aéreas sem artefatos associados. A baixa polarização normalmente pode ser atribuída a procedimentos de polarização incorretamente, despolarização durante o transporte ou teor excessivo de gás_O2 na tubulação de entrega HP ¹²⁹Xe (por exemplo, de um ventilador calibrado incorretamente).

(ii) Cânula de intubação inserida muito profundamente: Se inserida muito profundamente na traqueia, a cânula pode desviar para baixo no brônquio esquerdo ou direito. Se alojado com força suficiente, o volume corrente de todo o pulmão pode estar confinado a apenas alguns lobos e vias aéreas, enquanto o resto do pulmão não recebe nenhum. Caso isso ocorra, os lobos hiperinflados podem ser feridos e pode ser necessário sacrificar o animal. Alternativamente, a ponta da cânula pode entrar em contato direto com o tecido. Nesse caso, o ¹²⁹Xe ficará confinado principalmente ao interior da cânula, resultando em um sinal brilhante de um tubo visivelmente reto e sinal mínimo dentro do parênquima. Nesse caso, a posição da cânula deve ser corrigida imediatamente e o animal deve ser monitorado quanto a sinais de sofrimento (por exemplo, movimento torácico anormal, ausente ou assíncrono em comparação com o ventilador).

(iii) Cânula de intubação colocada muito superficialmente: Quando um bolo de gás é entregue muito superficialmente na orofaringe, a resistência a esse bolo que flui para os pulmões pode ser mais forte do que a resistência a esse bolo que flui ao redor do exterior da cânula e para fora da boca. Isso pode resultar em baixa insuflação pulmonar. A RSR traqueal pode ser alta, enquanto a SNR parenquimatosa será baixa. Artefatos de movimento podem estar presentes devido ao gás que flui pela traqueia durante a aquisição de dados. O caráter do artefato varia de acordo com o tipo de sequência (GRE, radial, etc.).

(iv) Tempo de aquisição incorreto: Se a pulsação de RF e a aquisição de dados ocorreram durante períodos de fluxo de gás inspiratório ou expiratório, artefatos de movimento grave geralmente estarão presentes - particularmente ao usar sequências cartesianas - e a SNR parenquimatosa será baixa.

(v) Respiração espontânea: Se o animal estiver insuficientemente sedado durante a aquisição dos dados, o movimento respiratório espontâneo será sobreposto de forma assíncrona ao padrão de ventilação mecânica. Isso resultará em entrega variável de ¹²⁹Xe respiração a respiração, artefatos de movimento moderados a graves e SNR parenquimatosa ruim. O rastreamento cuidadoso da dose e do tempo do sedativo é fundamental.

(vi) Morte de animais: Em casos raros, os camundongos podem morrer (por exemplo, devido à posição incorreta da cânula, entrega insuficiente de O₂ , overdose de sedativos ou patologia experimental grave). Se isso ocorrer, o tecido pulmonar enrijece rapidamente e o parênquima pulmonar infla mal. A traqueia superior pode permanecer brilhante, mas o parênquima pulmonar terá um sinal muito baixo.

Espectroscopia de Troca Gasosa

Em seres humanos, os parâmetros derivados da espectroscopia (por exemplo, intensidade do sinal, largura espectral, deslocamento químico e fase) oferecem informações sobre a dinâmica cardiopulmonar e o estado da doença^52,53. Ao contrário dos humanos⁸⁶, cães¹⁰⁰ e ratos^20,101, os espectros de pulmão inteiro de camundongos obtidos quando a magnetização de ¹²⁹Xe está confinada ao parênquima pulmonar exibem uma ressonância de fase única, ampla e dissolvida correspondente a ¹²⁹Xe dissolvido no tecido da membrana capilar, plasma sanguíneo e hemácias⁵⁴ (Figura 8A, 197 ppm). Quando transportado pelo fluxo sanguíneo para tecidos mais distais, ^{o 129}Xe produz frequências de ressonância distintas de vários tecidos, incluindo tecido adiposo⁵⁴, músculo, substância cinzenta e substância branca^102,103. No entanto, devido a tempos de trânsito relativamente longos (vários segundos) e solubilidade modesta¹⁰⁴ (solubilidade de Ostwald = 0,1 - 0,3), esses sinais são tipicamente fracos e observados apenas durante experimentos dedicados e cuidadosos. A exceção é ¹²⁹Xe dissolvido nos tecidos adiposos (Figura 8A, 189 ppm). A partir desses tecidos, um sinal de ¹²⁹Xe pode aparecer em poucos segundos (por exemplo, nas primeiras respirações durante a configuração do animal). Além disso, a intensidade do sinal pode ser alta, porque a solubilidade de Ostwald de ¹²⁹Xe é quase 20 vezes maior nos tecidos adiposos do que no plasma sanguíneo (ou seja, 1,7 vs 0,094, respectivamente, a 37 ° C¹⁰⁴). Espera-se também que os tempos de relaxamento longitudinal sejam relativamente longos (in vivo T₁ é ~ 20 s em lipídios¹⁰⁵ vs. 3-8 s no sangue¹⁰⁶). Como resultado, o sinal de ¹²⁹Xe do tecido adiposo pode ser relativamente alto em comparação com outros tecidos.

Devido à dinâmica de sinal diferente, os experimentos de espectroscopia ¹²⁹Xe podem ser adaptados para interrogar o tecido adiposo (por exemplo, para atingir a termometria do tecido adiposo marrom¹⁰⁷) ou a captação de gás nos pulmões, selecionando os parâmetros de aquisição corretos. Quando ¹²⁹espectros de Xe dos pulmões são adquiridos com as configurações descritas na Tabela 4 (ou seja, TR = 50 ms e um ângulo de inversão de 90 ° centrado no pico da fase dissolvida), são observados os picos da fase gasosa e da fase dissolvida ( Figura 8A, B ). Notavelmente, o volume de gás no pulmão do camundongo é 2-3x maior que o volume do tecido, e a solubilidade de ¹²⁹Xe neste tecido é de apenas ~ 10% 104,108,109,110,111. Apesar disso, a amplitude do sinal dissolvido excede a da fase gasosa em aproximadamente 2 vezes porque a excitação da fase gasosa está muito fora da ressonância (~ 15 kHz a 7 T; Figura 8B, SNR = 102 vs. 43, respectivamente). Portanto, o pool de magnetização 20 a 30 vezes maior na fase gasosa pode ser aproximado como um reservatório estável (ou seja, não esgotado) para o sinal da fase de dissolução durante porções estáticas do ciclo respiratório.

Com uma nova respiração de magnetização a cada ~ 600 ms e um TR de 50 ms, a intensidade do sinal da fase gasosa e da fase dissolvida ¹²⁹Xe oscila. Para o sinal de gás, isso é atribuível à mudança no volume total de gás (ou seja, alto na inspiração e baixo na expiração). A situação é mais complexa para o sinal dissolvido porque a magnetização do gás de origem, T₂ * e o volume sanguíneo capilar podem flutuar com o estado de inflação. Como resultado, a razão de amplitude do sinal dissolvido para gás também oscila em relação ao ciclo respiratório (Figura 8C, razão média dissolvida: gás = 1,9 ± 0,39).

Figura 8: Espectroscopia dinâmica representativa em um camundongo C57BL / 6J adulto. (A) Um único espectro de pulso mostra sinal originado de ¹²⁹Xe na fase gasosa, dissolvido no tecido adiposo (189 ppm) e dissolvido na membrana capilar e nos tecidos sanguíneos (197 ppm). (B) Espectroscopia dinâmica mostrando a intensidade do sinal variável no tempo de ¹²⁹Xe dissolvido e gasoso (tempo de repetição = 50 ms). Para ajudar na visualização, apenas cinco espectros são exibidos. As linhas diagonais no eixo do tempo representam quebras de escala. (C) A razão entre a amplitude do sinal dissolvido e gasoso em um intervalo de 2 s (correspondente à quebra da escala vermelha no painel B mostra uma clara variação com o ciclo respiratório (0,6 s por respiração). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A seguir está uma lista de fatores que podem comprometer os resultados da espectroscopia de troca gasosa ^{de 129}Xe. Em cada caso, o resultado provável é SNR baixo, o que pode tornar o ajuste espectral e as métricas resultantes (por exemplo, relação de amplitude do sinal dissolvido para gás, deslocamento químico, largura espectral e fase) imprecisas.

(i) Frequência de trabalho errada: Devido ao volume de gás significativamente maior e à baixa solubilidade do tecido, os pulsos de RF centrados na frequência da fase gasosa não produzirão sinal de fase dissolvida. Os pulsos de RF devem ser centralizados na frequência da fase dissolvida ou perto dela.

(ii) Largura de banda muito ampla: A largura de banda de excitação deve ser ampla o suficiente para que alguma fase gasosa ¹²⁹Xe seja excitada para medir a razão entre a amplitude do sinal dissolvido e gasoso. Mas se a largura de banda for muito ampla, o pulso de excitação destruirá a magnetização na fase gasosa antes que ela se dissolva no tecido. Isso pode ser visto como um sinal de gás muito alto e baixo ou nenhum sinal de fase dissolvida, apesar do pulso estar centrado na frequência da fase dissolvida.

(iii) TR não otimizado: Para interrogar a dinâmica do sinal durante uma respiração, o teorema de amostragem de Nyquist-Shannon requer que o sinal seja amostrado em um mínimo de duas vezes sua frequência (aqui, 100 respirações por minuto foram amostradas a cada 50 ms, ou ~ 12x por respiração). Dependendo das condições experimentais, é possível interrogar mais a dinâmica do sinal cardiopulmonar a uma taxa de amostragem mais rápida. Os resultados desses experimentos dependeriam de muitos fatores, incluindo largura de banda de excitação, frequência respiratória e frequência cardíaca. O tempo de troca de xenônio (ou seja, o tempo para o xenônio se dissolver no tecido; ~ 56 ms⁵⁴) e o tempo de trânsito pulmonar (ou seja, o tempo para o sangue fluir do ventrículo direito para o esquerdo; ~ 830 ms para uma frequência cardíaca de ~ 436 batimentos / min¹¹²) também devem ser considerados. A amostragem com muita frequência resultará na destruição precoce da magnetização e do sinal baixo, mas também reduzirá a influência do fluxo sanguíneo. A amostragem com menos frequência permitirá que a magnetização se dissolva ainda mais e acumule mais sinal, mas se tornará mais dependente do fluxo sanguíneo e menos localizada nas regiões de troca gasosa nos alvéolos.

Imagens ponderadas por difusão

As imagens ponderadas em difusão, usadas para quantificar o tamanho do espaço aéreo alveolar, foram rigorosamente validadas em modelos de pequenos animais por meio de métodos tradicionais de histomorfometria ^98,113,114. Aqui, restringimos a discussão a imagens 2D seletivas para minimizar o tempo de varredura e o uso de gás, ao mesmo tempo em que correspondemos aos protocolos validados anteriormente⁹⁸. Um mínimo de 2 imagens de valor b é suficiente para calcular o ADC e 4 ou mais imagens de valor b são necessárias para cálculos avançados de morfometria (como interceptação linear média). A aquisição de várias imagens de valor b oferece uma vantagem significativa, aumentando a precisão dos cálculos. Ao contrário da imagem humana durante uma única apneia, a imagem pré-clínica em muitas respirações fornece um sinal continuamente reabastecido. Por causa disso, é possível adquirir muitas imagens de alto valor B de SNR, limitadas apenas pelo volume de gás HP disponível e pela duração da sedação animal. Aqui, adquirimos 7 imagens de valor b, cada uma com SNR >15, usando 400 mL de gás ¹²⁹Xe em 18 minutos de tempo de varredura (Figura 9). O sinal em cada imagem decai com o aumento da intensidade do gradiente de difusão (valor b). Este decaimento do sinal é proporcional ao ADC do ¹²⁹Xe dentro do pulmão. As grandes vias aéreas podem ser distinguidas do tecido acinar comparando as imagens b₀ e b₆. Em regiões com probabilidade anatômica de conter vias aéreas, os pixels aparecerão muito brilhantes na imagem b₀, mas aparecerão escuros na imagem b₆ (setas vermelhas, Figura 9). Esses pixels devem ser excluídos da análise do parênquima pulmonar.

Figura 9: Imagens representativas ponderadas por difusão em um camundongo C57BL / 6J adulto. As grandes vias aéreas (setas vermelhas), através das quais o ^{Xe 129}se difunde livremente quando diluído com oxigênio, exibem maior atenuação de sinal em relação ao parênquima pulmonar. Isso resulta em vias aéreas brilhantes na imagem b₀ e vias aéreas de baixo sinal na imagem b₆ . Camundongos e ratos têm valores de ADC igualmente pequenos em relação aos humanos, mas os valores dependerão de fatores biológicos e experimentais, como idade, volume corrente, pressão e parâmetros de difusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O ADC deste camundongo saudável, adulto e selvagem segue o resultado esperado com base na literatura, sua idade, SNR, parâmetros de aquisição e muito mais. Os fatores que podem afetar deletériamente a precisão e a exatidão dos resultados do ADC incluem:

(i) SNR baixo: É importante ressaltar que o SNR baixo nas imagens influencia o cálculo do ADC em direção a valores mais baixos^99,115. Por esse motivo, excluímos voxels com SVNR₀ < 2,5 vezes o ruído da imagem⁹⁷.

(ii) Segmentação inadequada: A segmentação ruim (por exemplo, usar o limite de sinal sem inspeção visual para controle de qualidade) pode distorcer os resultados. Se as imagens contiverem artefatos (como aqueles causados pelo movimento), elas podem exceder o limite e ser categorizadas incorretamente como parênquima. Além disso, é particularmente importante excluir pixels próximos a grandes vias aéreas, pois os efeitos parciais de volume podem influenciar seu ADC em direção a valores mais altos.

(iii) Ventilador mal calibrado: Em geral, a diluição de ¹²⁹Xe com gases mais leves (por exemplo, O₂ ou N₂) pode deslocar o ADC para valores mais altos, portanto, a ventilação com misturas de gases conhecidas é necessária para comparações quantitativas. Se ventilar com uma mistura ^{de 129}Xe/O₂ , um aumento na concentração de oxigênio antes da entrega aumentará o relaxamento de T₁ e reduzirá a magnetização de ¹²⁹Xe na tubulação de fornecimento de gás, diminuindo assim o SNR.

(iv) Desrecrutamento pulmonar: Em animais anestesiados e ventilados mecanicamente, o colapso alveolar (atelectasia) pode ocorrer ao longo do tempo. Quando isso acontece durante a ventilação de volume constante, o mesmo volume corrente é necessariamente redistribuído para os alvéolos que permanecem recrutados. À medida que a atelectasia moderada a grave se desenvolve, o resto do pulmão pode ficar hiperinflado, causando lesão e aumento do ADC nessas regiões. Manobras regulares de recrutamento e PEEP previnem o colapso alveolar, evitam a diminuição da complacência pulmonar e minimizam o risco de lesão pulmonar que pode distorcer os resultados do ADC.

(v) Ajuste inadequado dos dados: O método de estimativa do ADC deve ser levado em consideração. O ajuste log-linear é o mais eficiente computacionalmente, mas introduz viés em imagens de baixo SNR. Portanto, é melhor aplicado a imagens de SNR alto (>20). O método linear ponderado reduz esse viés e é apropriado em imagens com SNR > 15. A estimativa bayesiana pode produzir estimativas de ADC com baixa incerteza, mesmo com SNR <10, mas é computacionalmente cara⁹⁹.

(vi) Tempo de difusão abaixo do ideal: O tempo de difusão ideal é influenciado pela força máxima do gradiente do scanner de ressonância magnética e pelo raio das vias aéreas acinares em camundongos (raio ~ 100 μm⁴⁹), que é aproximadamente três vezes menor do que em humanos. Para garantir condições ideais, o tempo de difusão é definido para atingir um comprimento de difusão maior que o raio alveolar médio, mas menor que o comprimento médio dos ductos alveolares. O tempo ideal de difusão para a força máxima do gradiente específico do local pode ser determinado usando os métodos descritos por Sukstanskii e Yablonskiy⁴⁹. O uso de um tempo de difusão abaixo do ideal pode levar a reduções não lineares no ^{ADC de 129}Xe, complicando a interpretação dos resultados.

(vii) Valores b abaixo do ideal: Há uma compensação entre maximizar o SNR e maximizar a relação contraste-ruído (CNR) gerada nas imagens de valor b. Se o CNR for sacrificado pelo uso de apenas valores b baixos (ou seja, decaimento do sinal difusivo como se estivesse adquirindo apenas as 3 primeiras imagens de valor b na Figura 9), a estimativa do ADC será imprecisa devido ao ajuste inadequado. Se a ponderação da difusão for muito forte, o SNR resultante será insuficiente e o ADC será tendencioso para valores mais baixos.

Discussão

A ressonância magnética hiperpolarizada ^{de 129}Xe está emergindo como uma técnica sofisticada e poderosa para estudar a microestrutura e a função pulmonar em modelos de pequenos animais. Este protocolo destina-se a orientar a preparação inicial do local e descrever os procedimentos experimentais necessários para quantificar a ventilação, difusão e troca gasosa em pulmões de camundongos com HP ¹²⁹Xe. Os principais pré-requisitos para experimentos incluem estabelecer um simulador de gás ¹²⁹Xe e garantir que a alta polarização do gás seja entregue ao animal. Este último requer um planejamento cuidadoso dos parâmetros de polarização, mitigando as perdas de polarização durante o transporte de gás (por exemplo, construindo um estojo de transporte magnético) e caracterizando (e idealmente evitando) o relaxamento de T₁ dentro do campo marginal do ímã de ressonância magnética pré-clínica^116,125. Paralelamente ao desenvolvimento da infraestrutura HP ¹²⁹Xe necessária, é imperativo estabelecer protocolos e procedimentos robustos de manejo de animais. Isso inclui sedação eficaz para permitir ventilação mecânica robusta, intubação não prejudicial para permitir estudos longitudinais e estratégias de ventilação que equilibram a necessidade de fornecer alta magnetização de ¹²⁹Xe com condições de ventilação seguras e fisiologicamente relevantes.

Até certo ponto, os métodos, procedimentos e resultados descritos aqui dependem do hardware específico usado (por exemplo, ventilador, polarizador e tipo de scanner de ressonância magnética). Se houver equipamentos alternativos disponíveis, as técnicas experimentais podem ser modificadas com relativa facilidade. Além disso, os procedimentos diários de garantia de qualidade podem ser otimizados (Etapa 1.2, Figura 4 e Tabela 1). A manutenção meticulosa de registros durante os ~ 30 minutos de controle de qualidade é fundamental durante o estabelecimento de um novo site. Ele permite a detecção precoce de problemas de hardware e a capacidade de descartá-los durante a solução de problemas. Uma vez que as variações diárias nas métricas de controle de qualidade estejam bem caracterizadas, a calibração do ângulo de inversão e a varredura de controle de qualidade de ~ 21 minutos podem ser reduzidas para maior eficiência. Além disso, a abordagem geral pode ser estendida a outras espécies comuns de pequenos animais (por exemplo, ratos e coelhos) ajustando as dosagens anestésicas, as configurações do ventilador e os parâmetros de aquisição. Os protocolos básicos podem ser usados para explorar a fisiologia dependente do ventilador, como o impacto da frequência respiratória, volume e níveis de PEEP nas trocas gasosas ou no recrutamento alveolar. Se os dados longitudinais não forem necessários ou se um estudo longitudinal for concluído, a cânula de intubação permite a lavagem broncoalveolar ou a rápida fixação e coleta pulmonar para análises convencionais (por exemplo, histologia ou medições morfométricas). Além disso, o potencial de modificação deste protocolo se estende às sequências e parâmetros de ressonância magnética, representando um aspecto dinâmico da pesquisa de ressonância magnética de ¹²⁹Xe.

A colocação da cânula é fundamental para a segurança animal e a qualidade da imagem. Como a cânula de intubação não é rigidamente fixada - por exemplo, suturando ao redor da traqueia - deslocamentos relativamente pequenos (por exemplo, movimentos ao conectar equipamentos de monitoramento fisiológico) podem quebrar a vedação hermética com a traqueia. Essa vedação hermética é necessária para manobras de recrutamento (~35 cm H₂O pico de pressão inspiratória), que são cruciais para manter a complacência pulmonar e prevenir atelectasias. Caso a manobra de recrutamento não atinja a pressão alvo, o investigador deve pesar as estratégias corretivas no contexto dos objetivos do estudo (por exemplo, imagem ponderada em difusão vs. imagem de ventilação; ponto de tempo único vs. longitudinal). As estratégias de mitigação podem incluir 1) remover a cânula e reintubar, 2) ajustar a posição da cânula para aumentar o contato com as paredes traqueais enquanto ainda estiver inserida e 3) prosseguir com o experimento sem obter uma vedação à prova de gás. Do ponto de vista da fidelidade dos dados, a reintubação é a opção mais robusta, mas pode ser demorada e levar a um decaimento indesejado da magnetização de ¹²⁹Xe. O ajuste da posição da cânula é mais rápido, mas deve ser feito com cautela, pois acarreta um risco maior de lesão. Continuar o experimento sem RMs é melhor usado quando o camundongo será ventilado por <20 min para evitar alterações induzidas por atelectasia na dinâmica pulmonar¹¹⁷.

Além da necessidade óbvia de manuseio seguro de animais, a chave para desenvolver um programa de ressonância magnética de mouse HP ¹²⁹Xe robusto e confiável - e para solucionar seus desafios - é a manutenção meticulosa de registros. Para a produção do HP ¹²⁹Xe, é aconselhável rastrear a potência do laser, o tempo de acumulação, a taxa de fluxo e a polarização. Durante a imagem fantasma e a espectroscopia, é melhor registrar a SNR da imagem, a posição de pico, a largura de linha espectral e a potência de RF necessária para obter um pulso de 90°. Para imagens in vivo , dados de controle de qualidade semelhantes devem ser registrados junto com parâmetros de monitoramento fisiológico (pressão inspiratória de pico, temperatura corporal, etc.) e uma linha do tempo detalhada dos eventos de manuseio de animais. Alguns equipamentos importantes podem facilitar a solução de problemas do ventilador. Isso inclui um sensor de O₂ , um espirômetro para pequenos animais e um manômetro para calibrar a ventilação e a pressão da PEEP. Um osciloscópio e um voltímetro podem ajudar a confirmar que o tempo do ventilador é preciso e compatível com o scanner de ressonância magnética. Finalmente, um gaussímetro portátil é indispensável para confirmar a integridade de um estojo de transporte magnético, se for necessário para o transporte. Em relação à solução de problemas de sequência de ressonância magnética, recomenda-se o uso do simulador de gás descrito neste protocolo e de uma seringa cheia de gás HP. O uso de uma seringa contendo gás HP ¹²⁹Xe é particularmente benéfico para a solução de problemas de sequências ponderadas por difusão, pois a precisão dos dados pode ser avaliada com base no fato de refletirem uma verdade fundamental: o coeficiente de difusão livre de ¹²⁹Xe puro dentro da seringa.

Várias limitações devem ser reconhecidas ao aplicar este protocolo. Em primeiro lugar, depende de equipamentos e conhecimentos especializados, o que reduz a acessibilidade para novos locais. No entanto, com a recente aprovação regulatória para uso clínico nos EUA, espera-se que o número de locais equipados com recursos de ressonância magnética ¹²⁹Xe aumente. A técnica também é limitada por limitações inerentes ao gás hiperpolarizado, incluindo uma vida útil de polarização relativamente curta e a necessidade de aquisição rápida de dados. O uso de um ventilador mecânico normalmente melhora a SNR da imagem e evita intrinsecamente artefatos de movimento, mas mascara a dinâmica natural da respiração que pode ser capturada empregando um dispositivo de entrega de gás de respiração livre. Além disso, os achados de modelos de pequenos animais usando este protocolo devem ser interpretados com cautela ao extrapolar para a fisiologia humana, dadas as variações significativas das espécies. Outra limitação é a natureza desafiadora da intubação oral e da ventilação mecânica, que são difíceis em camundongos com peso inferior a 25 g. Isso pode excluir homens com menos de ~ 8 semanas e mulheres com menos de ~ 20 semanas, a menos que equipamentos e procedimentos dedicados sejam usados. A limitação mais gritante deste protocolo é a ausência de programação de pulso e técnicas avançadas de reconstrução de imagem. A inclusão de tais métodos em um protocolo generalizado é impraticável devido aos seus intrincados detalhes técnicos e conhecimento especializado. Finalmente, este protocolo descreve métricas quantitativas básicas como SNR, VDP e ADC, mas não medidas mais avançadas, como ventilação fracionada regional, morfometria de difusão e imagens de troca gasosa. Essas métricas avançadas serão implementadas com mais facilidade assim que a infraestrutura básica descrita aqui for configurada.

Embora a ressonância magnética com gás HP ¹²⁹Xe de pequenos animais exija muitos recursos e seja experimentalmente desafiadora, ela tem o potencial de avançar significativamente na pesquisa pulmonar pré-clínica. Ele oferece um meio minimamente invasivo e sensível para quantificar a ventilação regional, o tamanho do espaço aéreo alveolar e a dinâmica das trocas gasosas. Como tal, pode fornecer um meio único de avaliar a fisiologia pulmonar, a progressão da doença e as intervenções terapêuticas ao longo do tempo. Portanto, representa uma melhoria em relação às técnicas pré-clínicas tradicionais, incluindo histologia, análises bioquímicas, modalidades de imagem ionizante e medições invasivas da mecânica pulmonar. Além disso, a ressonância magnética ¹²⁹Xe de pequenos animais continua sendo um subcampo de pesquisa em desenvolvimento ativo, e equilibrar a física de imagem relevante com os requisitos pré-clínicos representa oportunidades substanciais de pesquisa por si só. Finalmente, à medida que a ressonância magnética clínica ¹²⁹Xe se torna mais amplamente aceita e usada clinicamente, as oportunidades para estudos de camundongo para humano e retrotradução continuarão a crescer com o tempo.

Figura suplementar 1: Um diagrama de circuito para o estojo de transporte magnético. Um solenóide feito de fio de cobre esmaltado, L1, é conectado em paralelo com V1, uma bateria de chumbo-ácido selada recarregável de 12 volts. A resistência do resistor R1 pode ser selecionada para controlar a corrente através de V1 e L1. Uma lâmpada LED indicadora do painel, R2 e D1, também é conectada em paralelo com V1. Um interruptor liga-desliga, S1, é conectado em série com V1. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Resultados da calibração do ventilador para nitrogênio. A saída de volume de 30 respirações foi medida em triplicata. Uma regressão linear foi realizada para determinar a pressão motriz necessária para produzir volumes de gás relevantes. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Folha de dicas das configurações de pressão do ventilador. Os resultados da inclinação e da interceptação da regressão linear de cada gás são usados na Equação S1. Esta equação foi usada para determinar a pressão motriz necessária para produzir um volume corrente de 10 ml/kg de peso corporal ideal para misturas gasosas de 70% N₂ + 30% O₂ e 70% ¹²⁹Xe + 30% O₂ para pesos animais pertinentes. Clique aqui para baixar este arquivo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 mL	fisher scientific	Catálogo No.14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464
cilindro graduado de 10 mL	Cole-Parmer	UX-34502-69	https://www.coleparmer.com/i/cole-parmer-essentials-graduated-cylinder-glass-hexagonal-base-10-ml-2-pk/3450269?PubID=UX&persist=true&ip=no& gad_source=1& gclid=CjwKCAi A6KWvBhAREiwAFPZM7h3do -ssjascARuVviKd7V7kC5ztdIB6 _70DnMr-K3qk9RKeJ7-IrhoCeT 0QAvD_BwE
18 G - cateteres de PFTE veinosos (não estéreis)	Terumo Surflo	SROX1832CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-18-x-1-25inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google& utm_medium=google_ compras& gad_source=1& gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 4oTvZkAgWQCda6ocVtQlulVrG 2536FNbu5soMVSFN8xK_g1Uh pXIRoCGwoQAvD_BwE
20 G - cateteres PFTE veianos (não estéreis)	Terumo Surflo	SROX2051CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-20-x-2inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source =google& utm_medium=google_ compras& gad_source=1& gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 87ggCkgToD_XF_UgpQBTpmN dgSNfCml6TkDKlW8k27Dq_daR itPuhoCnBQQAvD_BwE
22 G - cateteres veiosos, PFTE (não estéreis)	Terumo Surflo	SROX2225CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-22-x-1inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google& utm_medium=google_ compras& gad_source=1& gclid =CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEso W9IM6mpee6m7e-lBfR8dZhSN KYbMUs7qgEU4gYCRTW_rJAs W_lGkthoCm30QAvD_BwE
Sacos de tedlar de 400 mL	Jensen Inert Products	GST-001S-3507TJC	NA
Seringa de 60 mL	fisher scientific	Nº de catálogo.14-955-461	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955461
70% de álcool	Cole-Parmer	UX-80024-34	https://www.coleparmer.com/i/labchem-isopropyl-alcohol-70-v-v-500-ml/8002434?PubID=UX&persist=true&ip= não & gad_source=1& gclid=CjwKC AiA6KWvBhAREiwAFPZM7gGh p8g7MBHBBKadaRCAwfEMgV gna5fhYRsuXIuqoqOiToCC4fem nhoCGMEQAvD_BwE
Dewar para nitrogênio líquido	Terra Universal	4LDB	https://www.laboratory-equipment.com/tw-4ldb-liquid-nitrogen-dewar-ic-biomedical.html?srsltid=AfmBOooxwMtOA1Z2TweR P8V5Iy5EvYT3alZuzoiY 3UF3Ib9RgFnDxVTfWP0
Lubrificante para os olhos	Refresh	ATUALIZE PM	https://www.refreshbrand.com/Products/refresh-pm
Luminária de fibra óptica	AmScope	HL250-AY	https://amscope.com/products/hl250-ay?tw_source=google & tw_adid=& tw_campaign= 16705014684& gad_source= 1& gclid=CjwKCAiA6KWvBhA REiwAFPZM7p-DpyvHJaGxR pAD1385hzGf1oPdKHHLFDR Sp8yrtxry11SNJeJnKxoCtAoQ AvD_BwE
Gaussmeter	Apex Magnets	GMHT201	https://www.apexmagnets.com/magnets/accessories/ht-digital-gaussmeter-with-peak-hold-can-display-gauss-or-tesla
Recipiente de vidro (fantasma)	Ace Glass	8648-24	https://aceglass.com/results.php?t=8648-24&t=8648-24
Almofada de aquecimento	Office Depot	9206211	Almofada de Aquecimento da Série Designer Express PureRelief da Pure Enrichment 12 x 15 Palm Aqua - Office Depot
Hyperpolarizer	Polarean	9820	https://polarean.com/xenon-mri-platform/
	Hallowell EMC	000A3467	https://hallowell.com/product/rodent-tilting-workstand/
Suprimentos de intubação	Lista de peças publicada em outro lugar	NA	https://app.jove.com/t/50318/a-simple-method-of-mouse-lung-intubation
Cilindro de xenônio enriquecido isotopicamente	Isótopos de Linde	XE-129(1%)N2(10%)HE CGMP 302SZ	NA
Nitrogênio líquido	Linde	NI LC160-22	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/nitrogen_n2_nitrogen_liquid _lc160_22_psi_ni_lc160_22 /ni-lc160-22?cat_id=shop& node=b89
Deslizamento macho luer	Cole-Parmer	UX-21943-27	https://www.coleparmer.com/i/diba-omnifit-t-series-solvent-waste-cap-adapter-polypropylene-male-luer-slip-x-1-16-id-hose-barb-5-pk/2194327
Manômetro	Grainger	3T294	https://www.grainger.com/product/3T294?gucid=N:N:PS: Pago:GGL:CSM-2295:4P7A1P: 20501231& gad_source=1& gclid =CjwKCAiAi6uvBhADEiwAWiyR dltxrPJmmcm0bFiYLuPrB25HV QFdEfKMBqvgJBNdQUs3DZ7b TLr8CRoCanAQAvD_BwE& gclsrc=aw.ds
Minivent ventilador	harvard aparelho	73-0044	https://www.harvardapparatus.com/minivent-ventilator-for-mice-single-animal-volume-controlled-ventilators.html
Perfurador de orelha de rato	fisher scientific	13-812-201	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-animal-ear-tag-punch/13812201
Abaixador de língua de rato	Ferramentas médicas	VRI-617	https://medical-tools.com/shop/rodent-tongue-depressor.html
Balança de peso para camundongos	Cole-Parmer	UX-11712-12	https://www.coleparmer.com/i/adam-equipment-cqt2000-core-portable-balance-2000g-x-1g-220-v/1171212?PubID=UX&persist=true&ip=no&gad _source=1& gclid=CjwKCAiA6K WvBhAREiwAFPZM7iYnAG5Ilc Z5DZWrdJ6wcLDZSCSfNJHOH m2PQOpyyWe0TjFa75R3tBoCjB sQAvD_BwE
scanner de ressonância magnética	Sistema horizontal Bruker	7T Biospec	https://www.bruker.com/de/products-and-solutions/preclinical-imaging/mri/biospec.html
Multímetro	Home Depot	1007898529	https://www.homedepot.com/p/Klein-Tools-600-Volt-Digital-Multi-Meter-Manual-Ranging-MM325/320822947
Abundância natural de xenônio	Isótopos Linde	Agulha UN 2036	NA
	Fisher Scientific	305194	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-precisionglide-hypodermic-needles-20/148266C?keyword=true
Porta-seringas seguro para agulhas	Fisher scientific	NC2703873	https://www.fishersci.com/shop/products/ndlsafe-ii-syr-uncap-deca/NC2703873#?keyword=needlesafe
Cilindro de nitrogênio	Linde	NI MK	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/nitrogen_n2_nitrogen_nf_k/ni-m-k?cat_id=shop&node=b89
Cilindro de oxigénio	Linde	OX M-K	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/oxygen_o2_oxygen_usp_k/ox-m-k?cat_id=shop&node=b90
Sensor de oxigénio	Instrumentos Apogee	MO-200	https://www.apogeeinstruments.com/mo-200-oxygen-sensor-with-handheld-meter/
Sensor de oxigênio em linha	Apogee instruments	AO-002	https://www.apogeeinstruments.com/ao-002-oxygen-meter-sensor-flow-through-head/
Válvula PEEP	Hallowell EMC	000A6556A	https://hallowell.com/product/adjustable-peep-valve-with-exhaust-port-range-5-20cm-disposable/
Pontas de pipeta	fisher scientific	Nº de catálogo02-707-108	Pontas de Economizador de Espaço Fisherbrand Stack-Rack: 101-1000 L Padrão; Azul; Volume: | Válvula
êmbolo Fisher Scientific	Ace glass	8648-20	https://www.aceglass.com/results.php?t=8648
Bobina pré-clínica	Doty scientific	custom built	https://dotynmr.com/products/bmax-xy-low-e/
Reguladores de pressão	Cole-Parmer	UX-98202-11	https://www.coleparmer.com/i/cole-parmer-single-stage-regulator-1500-scfh-capacity-346-cga-fitting/9820211?PubID=UX&persist=true&ip=no& gad_source=1& gclid=CjwKCAi A6KWvBhAREiwAFPZM7pruR xCAiaj52nA_8Y1nveQZRsD6B f0QO65o2DKFYqRoz0PopSkX QxoCxqcQAvD_BwE
Ventilador de queda de pressão	Lista de peças publicada em outro lugar	NA	https://sites.duke.edu/driehuyslab/resources/
Tubo de PVC para 193682			fantasma da Home Depothttps://www.homedepot.com/p/IPEX-1-2-in-x-10-ft-White-PVC-SCH-40-Potable-Pressure-Water-Pipe-30-05010HD/319692959
sistema de aquecimento animal SAI	SAII	Modelo 1030	https://i4sa.com/product/model-1030-monitoring-gating-system/
Saline	Farris Laboratories Inc.	0409488820-1	https://www.farrislabs.com/products/bacteriostatic-sodium-chloride-0-9-30ml-bottle?variant=42807174824167¤cy =USD& utm_medium=product_ sincronização& utm_source=google& utm_ conteúdo=sag_organic& utm_ campanha=sag_organic& utm_ campanha=gs-2021-09-24& utm _source=google& utm_medium =smart_campaign& gad_source =1& gclid=CjwKCAiA6KWvBh AREiwAFPZM7oS3-hFDETO_2f6OWOoKyBMb WuDuWqYxdWRYUWEkY M2Py73VfGzVtRoC2FQQAvD_BwE
Recipiente para objetos cortantes	fisher scientific	22-730-455	https://www.fishersci.com/shop/products/sharps-container-47/p-7250579#?keyword=needle%20safe
Silicone epóxi	Grainger	3KMY7	https://www.grainger.com/product/3KMY7?gucid=N:N:PS:Paid:GGL:CSM- 2295: 4P7A1P: 20501231 e gad_ source=1& gclid=CjwKCAiA6KW vBhAREiwAFPZM7voahkm8tda t1Euql1A8DFhC6AZVJ0wXzCE PfE6iUzrIJXV-Hl8o4xoCQLYQA vD_BwE& gclsrc=aw.ds
Lubrificante antiaderente de silicone	Grainger	19MW95
https://www.grainger.com/product/CRC-Mold-Release-Agent-16-oz-19MW95 Espirômetro	ADInstruments	FE141	https://www.adinstruments.com/products/spirometer
Espirômetro - cabeçote de fluxo de mouse	ADInstruments	MLT1L	https://www.adinstruments.com/products/respiratory-flow-heads
Tubulação - 1/4 OD	Clippard	URH1-0402-CLT-050	https://www.clippard.com/part/URH1-0402-CLT-050
Tubulação - 1/8 OD	Clippard	URH1-0804-CLT-050	https://www.clippard.com/part/URH1-0402-CLT-050
Bomba de vácuo	Cole-Parmer	UX-60062-11	https://www.coleparmer.com/i/environmental-express-diaphragm-pump-high-volume-120v/6006211?PubID=UX&persist=true&ip=no&gad _source=1& gclid=CjwKCAiA6K WvBhAREiwAFPZM7uFGwmW pRelHNFgZVvJJV09vDUVyfyG HoKeZTiFNIiVTe-05IpJJPxoCO PoQAvD_BwE
Fio - calibre 18	Digikey	2328-18H240-ND	https://www.digikey.com/en/products/detail/remington-industries/18H240/15202027?s=N4 IgjCBcoOwBxVAYygMwIYBsDOB TANCAPZQDa4YATPAGwgC6h ADgC5QgDKLATgJYB2AcxAB fQmAAMAFkqIQKSBhwFiZEA GZNATi0SGzNpE48BwsSErqw 6uQqV5CJSOQCsMF%2Bq11 GIVuy58QqLmss4gALbogvy4L AAEAO683LgMIkA
Estação de medição de polarização de xenônio	Polarean	NA	https://polarean.com/xenon-mri-platform/