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Geração e caracterização de organoides de útero de rato a partir de células-tronco epiteliais endometriais de rato

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DOI:

10.3791/66928

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2 de agosto de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Meizhou Clinical Institute of Shantou University Medical College, 2Department of Pathology, Meizhou People's Hospital, 3Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células-tronco epiteliais endometriais (reESCs) de ratos, gerando organoides endometriais de ratos. Este método facilita estudos in vitro de doenças endometriais, permitindo a edição de genes e outras manipulações celulares.

Resumo

Os organoides endometriais oferecem informações valiosas sobre o desenvolvimento e a fisiopatologia das doenças endometriais e servem como plataformas para testes de drogas. Embora organoides endometriais humanos e de camundongos tenham sido desenvolvidos, a pesquisa sobre organoides endometriais de ratos permanece limitada. Dado que os ratos podem simular melhor certas patologias endometriais, como aderências intrauterinas, este estudo teve como objetivo estabelecer organoides endometriais de ratos. Apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e cultura de células-tronco epiteliais endometriais de ratos (reESCs) e a geração de organoides endometriais de ratos. Usando um meio de expansão refinado de reESCs, isolamos com sucesso e expandimos de forma estável as reESCs, demonstrando seu potencial de cultura a longo prazo. Os organoides gerados por reESC exibiram características estruturais e funcionais típicas do endométrio, incluindo responsividade hormonal. Nossos resultados mostraram que os organoides endometriais de ratos podem ser cultivados a longo prazo com proliferação estável, mantendo a estrutura glandular, a polaridade celular e as características funcionais do epitélio endometrial. Este novo modelo de organoide endometrial derivado de rato fornece uma plataforma valiosa para estudar doenças endometriais e testar intervenções terapêuticas, com aplicações potenciais em várias espécies de mamíferos.

Introdução

O endométrio, um tecido versátil e regenerativo do corpo humano, sofre descamação, regeneração e diferenciação periódicas sob a influência de hormônios ovarianos1. Anormalidades no endométrio estão ligadas a várias doenças do sistema reprodutor feminino, como endometriose, câncer de endométrio e infertilidade2. A falta de modelos de pesquisa confiáveis para o endométrio dificulta estudos aprofundados da patogênese, diagnóstico clínico e tratamento dessas doenças. Embora as linhagens celulares e os modelos animais sejam comumente utilizados para a pesquisa endometrial, desafios como instabilidade fenotípica nas linhagens celulares, diferenças entre espécies em modelos animais e outras limitações dificultam a replicação da complexa estrutura fisiológica e das mudanças funcionais dinâmicas no endométrio humano3.

Organoides são estruturas tridimensionais formadas pela cultura de células-tronco em um ambiente extracelular, possuindo capacidades de auto-renovação e auto-organização. Eles podem mimetizar a estrutura e função de tecidos fisiológicos e patológicos e são reconhecidos como modelos pré-clínicos de doenças humanas4. Em 2017, a construção bem-sucedida de organoides endometriais de camundongos e humanos foi alcançada incorporando tecido endometrial livre fragmentado obtido por digestão enzimática em um andaime de matriz extracelular, seguido pela adição de uma mistura de fatores de crescimento específicos e fatores de sinalização para cultivo5. Os resultados demonstraram que os organoides endometriais ex vivo exibem capacidade proliferativa estável e de longo prazo, mantendo a estrutura glandular, a polaridade celular e as características funcionais do epitélio endometrial, incluindo secreção de muco e resposta hormonal6. No entanto, a cultura ex vivo de células-tronco adultas formando os organoides endometriais requer suporte estrutural semelhante a glândula, levando a desafios como perda de estaminalidade e dificuldades na passagem7.

Atualmente, o cultivo de organoides endometriais depende do método de cultura de digestão em bloco de tecido. Em um estudo anterior, nossa equipe de pesquisa cultivou células-tronco epiteliais endometriais humanas por um longo período in vitro usando um meio de cultura primário composto principalmente de Y27632, que empregamos para construir organoides endometriais8. Com base nesse sucesso, isolamos e cultivamos células-tronco epiteliais endometriais de tecido endometrial de rato usando um meio de cultura composto de molécula pequena, estabelecendo um sistema de cultura in vitro de longo prazo. Além disso, utilizamos células-tronco epiteliais endometriais de ratos (reESCs) para gerar organoides endometriais de ratos. O desenvolvimento deste modelo irá melhorar futuros estudos in vitro e in vivo de doenças relacionadas ao endométrio em conjunto com modelos de ratos.

Protocolo

Seis ratas Sprague-Dawley de 7/8 semanas de idade, pesando 200-250 g, foram utilizadas neste trabalho. Os ratos foram alojados em uma instalação de animais climatizada com acesso ad libitum a comida e água. Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as Diretrizes Institucionais para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo comitê de revisão institucional para experimentos com animais no Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Popular de Meizhou.

A seção a seguir descreve o processo de isolamento, passagem, congelamento e descongelamento de células-tronco epiteliais endometriais de ratos usando um meio de expansão reESCs refinado (REEM) composto principalmente de Y27632, A8301 e CHIR990217 8,9. A formulação REEM é baseada em DMEM/F12 sem soro enriquecido com concentrações específicas de componentes-chave: 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 e 0,5 μM A8301. Detalhes abrangentes sobre os componentes podem ser encontrados na Tabela de Materiais. Uma vez que os ratos tenham sido anestesiados com inalação de isoflurano, os procedimentos subsequentes descritos na Figura 1 devem ser implementados.

1. Procedimento cirúrgico

  1. Anestesiar o rato por inalação de isoflurano.
    1. Coloque os ratos em uma câmara de indução cheia de isoflurano a 3-5% misturado com oxigênio. Confirme a anestesia adequada pela ausência de resposta a uma pitada do dedo do pé e pela perda do reflexo de endireitamento.
    2. Uma vez anestesiados, mantenha os ratos sob isoflurano a 1-3% por meio de um cone nasal durante o procedimento. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento enquanto o rato estiver sob anestesia.
  2. Faça uma incisão na linha média abdominal baixa para expor os chifres do útero.
    NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados antes do uso. A área cirúrgica do rato é raspada e desinfetada com uma solução anti-séptica. O cirurgião usa luvas estéreis, máscara e bata. O procedimento cirúrgico é realizado em uma cortina estéril.
  3. Faça incisões longitudinais em ambos os lados do útero para expor o endométrio interno. Use uma lâmina de bisturi T10 para raspar o endométrio até que a superfície fique áspera.
  4. Após o procedimento cirúrgico, transfira os ratos para uma área de recuperação estéril e quente com níveis regulados de temperatura e umidade e monitore-os de perto até que recuperem a consciência total e possam se sustentar em uma posição esternal reclinada. Grupos de três ratos pós-operatórios separadamente em gaiolas separadas. Para aliviar a dor pós-cirúrgica, administre analgésicos como buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, por via subcutânea); Repita a cada 8-12 h por até 48-72 h, conforme necessário.

2. Processamento de tecidos

  1. Coloque todos os fragmentos de endométrio uterino em um prato de 3,5 cm e lave-os 3x com PBS.
  2. Misture os fragmentos de endométrio uterino com 3 mL de colagenase tipo I a 1% (diluída em 0,25% de tripsina / 1 mM de EDTA) a 37 ° C por 60 min. Filtrar o tecido não digerido com um filtro de células de 100 μm para isolar e recolher o filtrado para posterior cultura.
  3. Semeie as células coletadas em placas de 12 poços em meio REEM para posterior cultivo. Calcule o volume da suspensão celular necessária para semear as células em cada poço da placa de 12 poços para atingir a densidade celular desejada (normalmente ~ 1-2 × 105 células / poço em 1,5 mL de REEM).
  4. Lave as células coletadas na etapa 2.2 por 3x com PBS. Após a lavagem inicial, centrifugue as células a 300 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante; ressuspenda o pellet celular em PBS contendo 1% de BSA (albumina de soro bovino) para minimizar a ligação inespecífica e incube por 15-30 min no gelo.
  5. Incubar as células com anticorpos primários específicos para diferentes marcadores (ver Tabela de Materiais) durante 30 min a 1 h a 4 °C. Dilua os anticorpos em PBS com 1% de BSA de acordo com as instruções do fabricante.
  6. Após a incubação, lave as células 2x com PBS para remover quaisquer anticorpos não ligados. Após a lavagem final, ressuspenda as células em 600 μL de PBS com 1% de BSA para análise de citometria de fluxo.
  7. Configure o instrumento com lasers e filtros apropriados para os fluoróforos usados no experimento (por exemplo, FITC, PE, APC). Use as configurações de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) para bloquear a população de célula única ativa, excluindo detritos e agregados de células. Calibre o citômetro de fluxo usando um controle não corado para garantir o alinhamento adequado. Defina portões específicos com base no controle não corado para definir populações positivas para cada marcador de interesse (o limite é de 0,02%).

3. Cultura a longo prazo de células-tronco epiteliais endometriais de rato

  1. Ensaio de formação de colônias
    NOTA: Este ensaio ajudou a determinar o meio de cultura ideal para reESCs.
    1. Semeie reESCs P0 em placas de 6 poços a uma densidade de 1.000 células/poço e cultive-as por 14 dias em REEM ou REEM sem A8301, Y27632 ou CHIR99021.
    2. Após o período de cultivo, fixar as células com paraformaldeído a 4% por 20 min em temperatura ambiente e, posteriormente, corá-las com solução de cristal violeta por mais 20 min.
    3. Quantifique o número de aglomerados de células contendo mais de 50 células. Selecione o meio de cultura com base em qual meio suporta o crescimento de aglomerados de células.
      NOTA: A omissão de fatores específicos do REEM resultou em uma diminuição da capacidade proliferativa das reESCs (Figura 1B,C). Com base nesses achados, o REEM foi selecionado como o meio preferido para a cultura de reESCs para otimizar as condições de cultivo.
  2. Troque o REEM a cada 2 dias. Quando as células atingirem 80-90% de confluência, digeri-las com 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA por 5-6 min.
  3. Passe as células na proporção de 1:3 em REEM.
  4. Ensaio de proliferação
    1. Semeie as reESCs P1, P7 e P14 em placas de 96 poços a uma densidade de 4 × 103 células/poço em 150 μL de REEM.
    2. Adicionar 10 μL de reagente CCK-8 a cada poço após 24, 48, 72 e 96 h de cultura, seguido de uma incubação de 2 h a 37 °C.
    3. Determinar a taxa de proliferação medindo a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.
  5. Preparação e utilização de matérias-primas congeladas
    1. Prepare a solução de estoque congelada usando REEM com DMSO a 10%.
    2. Colha as reESCs com 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA.
    3. Ressuspenda o grânulo celular em solução de estoque congelada a uma concentração de 1 × 106 células / mL. Transfira a suspensão celular para tubos.
    4. Congelar os tubos primeiro a -80 °C e, em seguida, transferi-los para nitrogênio líquido em 24 h.
      NOTA: Se pretende descongelar as células em breve, recomenda-se armazenar as células congeladas a -80 °C por um período máximo de 6 meses.
    5. Pré-aqueça o REEM a 37 °C.
    6. Recupere as reESCs congeladas e mergulhe-as em banho-maria a 37 °C por 1-2 min.
    7. Transferir as reESCs descongeladas para placas de 6 poços com uma densidade de semeadura de 1 × 105 células/poço em REEM.
  6. Coloração de imunofluorescência
    1. Semeie reESCs na fase de crescimento logarítmico em placas de 8 poços u-Slide a uma densidade de 2 × 103 células por poço e cultive-as em REEM.
    2. Quando as reESCs atingirem 90% de confluência, fixe-as com paraformaldeído a 4% por 20 min. Lave as reESCs com PBS 2x antes e depois da fixação.
    3. Permeabilize as células com 0,2% de Triton X-100 por 10 min.
    4. Bloqueie as células com 30% de soro de cabra diluído em 5% de albumina de soro bovino (BSA) por 30 min em temperatura ambiente. Lave as reESCs com PBS 2x antes e depois do bloqueio.
    5. Incubar as células com anticorpos primários (anti-SSEA-1 e anti-citoqueratina) durante 12 h a 4 °C. Lave as reESCs com PBS 2x após a incubação.
    6. Incube as células com anticorpos secundários por 1 h em temperatura ambiente. Lave as reESCs com PBS 2x após a incubação.
    7. Contra-core as células com 150 μL de DAPI para marcar todos os núcleos.
    8. Capture imagens das células coradas usando um microscópio confocal invertido.

4. Estabelecimento de organoides endometriais de ratos a partir de reESCs

  1. Geração dos organoides
    1. Quando as reESCs atingirem 70% de confluência, digerir as células com 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA por 5-6 min.
    2. Ressuspenda 5 × 105 reESCs em 500 μL de Matrigel descongelado e coloque em placas de 12 poços. Incubar as placas a 37 °C durante 20 min para permitir a gelificação.
    3. Assim que a mistura célula-Matrigel solidificar, adicione 1,5 mL/poço REEM para cobrir o Matrigel. Troque o REEM a cada 2-3 dias.
  2. Coloração de imunofluorescência
    1. Aspire o REEM e adicione 1 mL/poço de solução de colheita de organoide pré-resfriada nas placas de 12 poços. Incube no gelo por 40-60 min.
    2. Recolher os organoides com uma pipeta Pasteur e centrifugar a 300 × g durante 3 min a 4 °C.
    3. Enxágue os organoides 2-3x com PBS.
    4. Fixe os organoides com paraformaldeído a 4% por 20 min e bloqueie com BSA a 5% por 60 min.
      NOTA: Lave 2x com PBS antes e depois de cada etapa.
    5. Incubar os organoides durante a noite a 4 °C com anticorpos primários diluídos em 1% de BSA.
    6. Incubar os organoides com anticorpos secundários por 1 h à temperatura ambiente.
    7. Contra-corar os organoides com 200 μL de DAPI.
    8. Capture imagens usando um microscópio confocal invertido.
  3. Coloração HE
    1. Desidratar os organoides através de uma série graduada de etanol: etanol 70% por 30 min; Etanol a 80% por 30 min; Etanol 95% por 30 min; Etanol 100% por 2 x 30 min. Limpe os organoides mergulhando-os em xileno por 2 x 30 min.
    2. Mergulhar os organoides limpos em parafina derretida a 60 °C durante 1 h. Transfira os organoides infiltrados em parafina para moldes de incorporação, encha os moldes com parafina derretida e coloque os moldes em uma placa fria para que a parafina solidifique. Remova os blocos de parafina dos moldes depois que a parafina solidificar e apare o excesso de parafina.
    3. Monte os blocos de parafina no micrótomo. Corte seções de 5 μm de espessura e flutue-as em banho-maria morna (42-45 °C) para aplainar. Transfira cuidadosamente as seções para lâminas de vidro e seque-as em um aquecedor de lâminas.
    4. Desparafinize as seções imergindo as lâminas em xileno por 2 x 5 min. Reidratar através de uma série de etanol graduado: 100% etanol por 2 x 3 min; Etanol a 95% por 3 min; Etanol 70% por 3 min; enxágüe em água destilada.
    5. Coloração com hematoxilina por 5 min; Em seguida, enxágue em água corrente da torneira por 5 min. Diferencie em álcool ácido a 1% por alguns segundos; enxágue em água corrente da torneira por 5 min; colocar em azul em água com amônia a 0,2% por 30 s; enxágue em água corrente da torneira por 5 min; corar com eosina por 2 min. Desidratar através de etanol graduado: etanol 70% por 1 min; Etanol a 95% por 1 min; 100% etanol por 2 x 1 min. Limpe em xileno por 2 x 1 min.
    6. Adicione uma gota de meio de montagem às seções manchadas. Em seguida, coloque uma lamínula sobre a seção de tecido, evitando bolhas de ar. Observe as seções coradas sob um microscópio óptico.
  4. Coloração de fluorescência
    1. Realize a desparafinização e a reidratação conforme descrito nas etapas 4.3.1. ao ponto 4.3.4.
    2. Pré-aqueça a solução de recuperação de antígeno em um forno de micro-ondas. Coloque as lâminas na solução de recuperação de antígeno aquecida e mantenha-as em temperatura de sub-ebulição por 20 min. Deixar arrefecer as lâminas na solução de recuperação de antigénios durante 40 min. Enxágue as lâminas em água deionizada por 5 min.
    3. Incube as lâminas em peróxido de hidrogênio a 0,3% em metanol por 10 min para extinguir a atividade da peroxidase endógena. Enxágue as lâminas por 3 x 5 min em PBS e incube-as em solução de bloqueio por 1 h em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Retire o excesso de solução de bloqueio, mas não enxágue.
    4. Diluir o anticorpo primário na solução de bloqueio de acordo com as instruções do fabricante. Aplicar o anticorpo primário diluído nas secções de tecido e incubar durante a noite a 4 °C numa câmara humidificada.
    5. Lave as lâminas por 3 x 5 min em PBS. Diluir o anticorpo secundário conjugado com HRP em solução de bloqueio de acordo com as instruções do fabricante. Aplique o anticorpo secundário diluído nas seções de tecido e incube por 1 h em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Lave as lâminas por 3 x 5 min em PBS para remover o anticorpo secundário não ligado.
    6. Prepare a solução de trabalho de tiramida fluoresceína de acordo com as instruções do kit. Aplique a solução de trabalho nas seções de tecido e incube por 15 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Enxágue as lâminas por 3 x 5 min em PBS.
    7. Repita a etapa 4.4.1. a 4.4.5 até que a coloração tenha sido concluída com os três anticorpos. Aplique uma gota de meio de montagem fluorescente com DAPI em cada seção de tecido. Coloque cuidadosamente uma lamínula sobre a seção de tecido para evitar bolhas de ar. Examine o microscópio confocal invertido de lâminas.
  5. PCR quantitativo
    1. Recolha os organoides conforme descrito nos passos 4.2.1. ao ponto 4.2.3. Aspire o PBS e extraia os RNAs totais dos organoides seguindo as instruções do fabricante.
    2. Use qualquer kit de transcrição reversa disponível comercialmente para sintetizar cDNA a partir de 1 μg de RNA total. Configure uma reação q-PCR de acordo com o protocolo do fabricante do kit. Consulte a Tabela de Materiais para sequências de primers usadas para q-PCR.

5. Cultura de longo prazo de organoides endometriais de ratos

  1. Aspire o REEM e adicione 1 mL de solução de colheita de organoides por 40 min para dissociar os organoides. Incube no gelo para manter a integridade do organoide.
  2. Após a incubação, recolher os organoides utilizando uma pipeta Pasteur e centrifugar a 300 × g durante 3 min a 4 °C para os tornar em pellet para posterior processamento.
    NOTA: O corte da ponta da pipeta pode ser útil para manusear organoides maiores (acima de 500 μm) sem causar danos.
  3. Ressuspenda os organoides peletizados em Matrigel, na proporção de 1:2 ou 1:3, para incorporação e posterior cultura em placas de 12 poços.
  4. Prepare a solução de estoque congelada: REEM com 10% de DMSO.
  5. Colha os organoides, ressuspenda-os na solução de estoque congelada e armazene-os em um freezer a -80 ° C ou em nitrogênio líquido para preservação a longo prazo.
  6. Para descongelar os organoides congelados, pré-aqueça o REEM em banho-maria a 37 °C e mergulhe o tubo de estoque congelado no banho-maria para descongelar suavemente os organoides.
  7. Após o descongelamento, ressuspenda os organoides em 500 μL de Matrigel para reincorporação e cultura em uma placa de 12 poços. Siga as etapas 4.1.2. ao ponto 4.1.3.
    NOTA: É aconselhável armazenar organoides congelados a -80 °C por períodos mais curtos ou transferir para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

6. Opcional: Transição de organoides para cultura aderente

NOTA: O protocolo menciona um método alternativo para a obtenção de reESCs de cultura plana por meio da transição de organoides para cultura aderente, permitindo a reestruturação da morfologia do organoide.

  1. Aspire o REEM e adicione 1 mL de solução de colheita de organoides para dissociar os organoides. Incube no gelo para manter a integridade do organoide.
  2. Após a incubação, recolher os organoides utilizando uma pipeta Pasteur e centrifugar para os peletar a 300 × g durante 3 min a 4 °C.
  3. Ressuspenda os organoides em 3 mL de REEM pré-aquecido e transfira os organoides ressuspensos para um prato de 3,5 cm. Troque a mídia REEM a cada 2 dias.
  4. Quando as células atingirem 70% de confluência, digeri-las com 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA por 5-6 min.
  5. Reconstrua os organoides com reESCs seguindo as etapas 4.1.1 a 4.1.3.

7. Cultura sequencial de organoides com estradiol (E2) e progesterona (P4)

  1. Preparar soluções-mãe de E2 e P4 em DMSO. Diluir as soluções-mãe até às concentrações de trabalho desejadas (E2: 10 nM; P4: 1 μM) em REEM, garantindo que a concentração final de DMSO não exceda 0,1% para evitar efeitos citotóxicos.
  2. Organoides de cultura no REEM conforme as etapas 4.1.1. ao ponto 4.1.3. por 4 dias. Substituir o meio por REEM suplementado com E2 e cultivar durante 7 dias. Monitore o crescimento e a morfologia dos organoides diariamente. Troque o meio a cada 2-3 dias.
  3. Substituir o meio por REEM complementado com E2 e P4. Monitore o crescimento e a morfologia dos organoides diariamente. Troque o meio a cada 2-3 dias. Continue a cultivar os organoides por 7 dias.

Resultados

As reESCs e organoides do útero de ratas foram estabelecidos a partir de seis ratas Sprague-Dawley com peso entre 200 g e 250 g, seguindo o protocolo descrito na Figura 1. Com base no sucesso da cultura de longo prazo de células-tronco epiteliais endometriais humanas, a formulação REEM consistiu predominantemente em Y27632, A8301 e CHIR99021. Para estabilizar as reESCs in vitro, inicialmente isolamos células endometriais do endométrio de ratos usando técnicas enzimáticas e mecânicas. A análise por citometria de fluxo na Figura 2A revelou que as células endometriais primárias compreenderam aproximadamente 50% de células epiteliais expressando CD9 (49,8%), com baixos níveis de EpCAM (4,49%) e CD24 (2,64%). O marcador SSEA-1 para reESCs estava presente em 6,58%, enquanto os marcadores endoteliais CD31 (30,9%) e CD45 (70,3%) estavam relativamente altos.

No entanto, o cultivo em REEM resultou em reESCs P1 exibindo uma morfologia espiralada ou poliédrica uniforme e formando estruturas clonais compactas (Figura 2D). A remoção gradual de fatores individuais do REEM levou a uma diminuição correspondente na capacidade proliferativa das reESCs. O ensaio de formação de clones destacou o papel crítico de Y27632 na cultura estável de reESCs ( Figura 2B , C ). Na terceira passagem, as reESCs exibiram expressão consistente de SSEA-1 e citoqueratina, indicando expansão bem-sucedida de reESCs primárias durante a cultura (Figura 2F). Além disso, as reESCs mantiveram uma capacidade proliferativa robusta e estável mesmo em passagens tardias (Figura 2E), demonstrando seu isolamento e expansão bem-sucedidos no atual sistema REEM.

As culturas organoides foram estabelecidas seguindo um sistema previamente relatado derivado de células-tronco endometriais humanas8. Em 3 dias, as reESCs exibiram rápida auto-organização em estruturas semelhantes a organoides com um centro oco, que posteriormente aumentou em tamanho e espessura (ver Figura 3A). Os resultados típicos da coloração HE que ilustram a formação de organoides por reESCs são apresentados na Figura 3B. Essas culturas organoides podem ser sustentadas por passagem, como evidenciado pela alta viabilidade celular indicada pela coloração Ki67 após ciclos de passagem direta e congelamento e descongelamento. Além disso, a coloração HE foi realizada na 10ª geração de organoides, e os resultados mostraram que a estrutura organoide pode ser mantida intacta (ver Figura 3E). Além disso, os resultados de qPCR indicaram que Nanog, Sox2 e Oct4 foram expressos em níveis comparáveis aos da geração P1 (Figura 3F). Essa descoberta sugere o potencial para a cultura de organoides a longo prazo dentro do sistema atual.

Nosso estudo realizou uma investigação preliminar sobre a resposta de estruturas uterinas de ratos a E2 e P4. A coloração por imunofluorescência na Figura 4A revelou a presença de receptores de estrogênio e progesterona. Após a suplementação de E2 , esses organoides passaram por uma transição de uma forma esférica oca para um padrão de crescimento interno mais densamente povoado ( Figura 4C ). A exposição subsequente ao P4 levou à diminuição da permeabilidade das estruturas densas, resultando em sua desintegração ( Figura 4B ). Esses achados sugerem que o E2 potencialmente impulsiona uma maior diferenciação de estruturas semelhantes ao útero de ratos, enquanto o P4 pode desencadear vias apoptóticas.

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Figura 1: Procedimentos usados para estabelecer células-tronco epiteliais endometriais de rato e organoides de útero de rato. Abreviatura: SD = Sprague-Dawley. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Geração e cultura a longo prazo de células-tronco epiteliais endometriais de rato in vitro. (A) Análise de citometria de fluxo mostrando a proporção de células positivas no endométrio de rato. (B) Coloração violeta cristalina de clones em REEM com ou sem A8301, Y27632 ou CHIR99021, respectivamente. Barras de escala = 1 cm. (C) Os números de clones em REEM com ou sem fatores. As barras de erro representam o desvio padrão; n = 3 doadores (***, p<0,001). (D) Imagens de microscopia de luz de células-tronco epiteliais endometriais de rato P1 com e sem coloração violeta de cristal. (E) Análises CCK-8 de células-tronco epiteliais endometriais de rato na passagem 1, passagem 7 e passagem 14. As barras de erro representam o desvio padrão, n = 3. (F) Análises de imunofluorescência demonstrando a expressão de citoqueratina e SSEA-1. Abreviatura: REEM = meio de expansão reESCs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Geração e cultura de longo prazo de organoides endometriais de ratos in vitro. (A) Imagens de microscopia óptica de organoides endometriais de ratos P1. (B) Coloração H & E para organoides P1 de células-tronco epiteliais endometriais de ratos. (C) Análises de imunofluorescência demonstrando a expressão de citoqueratina e SSEA-1. (D) Análises de imunofluorescência demonstrando a expressão de Ki67 e SSEA-1. (E) Coloração H & E para organoides de ratos P 10. (F) Análises de qPCR para a expressão de Nanog, Sox2 e Oct-4 em organoides endometriais de ratos P1 e P10. Expressão normalizada para GAPDH (n = 3, teste t não pareado bicaudal, n.s. = não significativo). Abreviatura: H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Cultura sequencial de organoides com E2 e P4. (A) Análises de imunofluorescência demonstrando a expressão do receptor de estrogênio, receptor de progestogênio e SSEA-1. (B) Visão geral das imagens de microscopia de luz de organoides de ratos cultivados em E2 e P4. (C) Imagens de microscopia de luz demonstram a transformação de uma esfera oca em densa dentro da cavidade interna de organoides após serem cultivadas 7 dias em E2. Abreviaturas: ER = receptor de estrogênio; PR = receptor de progestogênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Neste estudo, descrevemos um método simples para isolar e cultivar células-tronco epiteliais endometriais de ratos (reESCs) e refinamos o sistema ex vivo previamente estabelecido para células-tronco epiteliais endometriais humanas8. Nossa abordagem utiliza um meio de cultura de moléculas pequenas contendo Y27632, A8301 e CHIR99021 como componentes principais para permitir uma cultura ex vivo estável e de longo prazo. Além disso, geramos com sucesso organoides endometriais de ratos em tempo real usando reESCs. Este novo sistema simplifica os métodos atuais de cultura de organoides endometriais, que normalmente dependem de blocos de tecido, proporcionando assim maior clareza em relação à linhagem celular10. É importante ressaltar que nosso sistema facilita a edição de genes e outras manipulações no nível celular para gerar organoides que expressam genes específicos. Além disso, esse sistema organoide permite o nocaute direcionado ou a superexpressão de genes específicos no endométrio de ratos, permitindo a triagem e o cultivo de células-tronco epiteliais endometriais para produzir organoides endometriais. Esta abordagem de pesquisa abrangente elucida funções genéticas específicas de perspectivas in vivo e ex vivo , abrindo caminho para a investigação de doenças relacionadas ao epitélio endometrial.

A triagem de drogas é uma aplicação crítica de organoides. No entanto, as fontes atuais e os métodos de preparação de organoides são complexos, levando a uma variabilidade significativa entre os lotes que podem impactar os resultados dos estudos de triagem de medicamentos11,12. Nosso sistema demonstra que organoides derivados de linhagens celulares cultivadas ex vivo estáveis podem efetivamente minimizar as diferenças entre os organoides formados, aumentando a uniformidade em configurações experimentais. Além disso, organoides de ratos formados por reESCs demonstraram a capacidade de responder à estimulação estrogênica in vitro, levando a alterações morfológicas, sugerindo que eles podem ser usados como uma ferramenta para triagem de drogas ex vivo. As reESCs podem ser facilmente isoladas do tecido endometrial e expandidas ex vivo com menos moléculas pequenas em comparação com as células-tronco epiteliais endometriais humanas. Essa característica é particularmente valiosa para investigar propriedades de células-tronco, células precursoras, processos de diferenciação e interações de microambientes. É importante ressaltar que essa abordagem pode ser extrapolada para outras espécies de mamíferos, como macacos, porcos e cães, permitindo o estabelecimento de sistemas de cultura organoide endometrial que servem como modelos fisiologicamente mais relevantes para estudar a biologia, função, doenças e respostas a medicamentos endometriais. Apesar de suas vantagens, essa técnica apresenta limitações. Uma grande limitação é a dependência do Matrigel, uma matriz extracelular complexa e variável que pode introduzir inconsistências entre os experimentos. Além disso, embora os modelos de ratos forneçam informações valiosas, ainda existem diferenças entre espécies e os resultados podem não se traduzir totalmente na fisiologia e patologias endometriais humanas. Estudos futuros devem ter como objetivo abordar essas limitações, potencialmente por meio do desenvolvimento de matrizes extracelulares mais definidas e consistentes e explorando a aplicabilidade desse modelo em outras espécies.

Apesar de suas vantagens, essa técnica apresenta limitações. Uma grande limitação é a dependência do Matrigel, uma matriz extracelular complexa e variável que pode introduzir inconsistências entre os experimentos. Portanto, uma técnica chave neste estudo é a remoção de Matrigel. O uso de um digestor de gel de matriz suave, garantindo operações no gelo e tempo de digestão suficiente são essenciais para o sucesso. Devido ao maior diâmetro da pipeta Pasteur, o uso da aspiração da pipeta Pasteur pode reduzir os danos aos organoides e acelerar a digestão do gel da matriz. Pesquisas subsequentes podem comparar diferentes métodos de cultura em gel de matriz extracelular para otimizar ainda mais os sistemas de cultura e digestão de organoides. Estudos futuros devem ter como objetivo abordar essas limitações, potencialmente por meio do desenvolvimento de matrizes extracelulares mais definidas e consistentes e explorando a aplicabilidade desse modelo em outras espécies.

Embora a literatura existente tenha descrito técnicas para cultivo ex vivo de organoides epiteliais, este estudo apresenta um sistema novo, direto e prontamente reprodutível para cultivar e expandir organoides endometriais de ratos provenientes de células claras. Esse avanço está prestes a aumentar o ritmo da pesquisa no campo da biologia reprodutiva das mulheres.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de GuangDong (2023A1515110760).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti-CD15 (SSEA-1)Abcamab135377Coelho, 1:200 (IHC)
Receptor Anti-Estrogênio alfaAbcamab32063Coelho, 1:200 (IHC)
Anti-pan CitoqueratinaAbcamab7753Camundongo, 1:250 (IHC)
Receptor Anti-ProgesteronaAbcamab101688Coelho, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67Abcamab279653Mouse, 1:250 (IHC)
A8301TargetMol909910-43-6
β-EstradiolMerckE8875
Kit de Contagem de Células-8BeyotimeC0038
CD9BioLegend1098191:20 (FC), Azul Pacífico
CD24BioLegend1018061:20 (FC), FITC
CD31BioLegend3031201:20 (FC), APC
CD45BioLegend3017031:20 (FC), PE
CHIR99021TargetMolCT99021
Cultrex Solução de colheita de organoidesR& D Systems3700-100-01
Cy3 TSA Kit de Sistema de FluorescênciaAPExBIOK1051
Cy5 TSA Kit de Sistema de FluorescênciaAPExBIOK1052
DAPISigmaD95421 μ g / mL
DMEM / F-12Invitrogen11330032
EpCAMBioLegend3698031:20 (FC),
PerCP Fluoresceína TSA Kit de sistema de fluorescênciaAPExBIOK1050
IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500
IgG anti-rato de cabra, Alexa Fluor 555InvitrogenA-214221:500
Anticorpo anti-coelho IgG/HRP de cabraAPExBIObs-0295G-HRP
Substituição do soro knockoutInvitrogen10828028
MatrigelCorning356234
PrimeScript RT Master MixTakaraRR063A
ProgesteronaMerck57-83-0
Sprague-Dawley rat Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China
SSEA-1BioLegend3230471:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR820A
TriZOLInvitrogen15596026CNExtração de RNA
u-Slide 8 placas de poçosIbidi80827
Y27632TargetMol146986-50-7
qPCR fortes de genes-alvo 
GenesCompanySequences
rat GAPDH FSangon biotechGACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH RSangon biotechAGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog FSangon biotechGACTAGCAACGGCCTGACTCA
rato Nanog R Sangon biotechCTGCAATGGATGCTGGGATA
rat Sox2 FSangon biotechATTACCCGCAGCAAAATGAC
rat Sox2 RSangon biotechATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
rat Oct4 FSangon biotechCCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
rat Oct4 RSangon biotechACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA
GG

Referências

  1. Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
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  4. Mulaudzi, P. E., Abrahamse, H., Crous, A. Insights on three dimensional organoid studies for stem cell therapy in regenerative medicine. Stem Cell Rev Rep. 20 (2), 509-523 (2024).
  5. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  6. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol. 19 (5), 568-577 (2017).
  7. Tempest, N., Maclean, A., Hapangama, D. K. Endometrial stem cell markers: current concepts and unresolved questions. Int J Mol Sci. 19 (10), 3240(2018).
  8. He, W., et al. Long-term maintenance of human endometrial epithelial stem cells and their therapeutic effects on intrauterine adhesion. Cell Biosci. 12 (1), 175(2022).
  9. Katsuda, T., et al. Conversion of terminally committed hepatocytes to culturable bipotent progenitor cells with regenerative capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
  10. Murphy, A. R., Campo, H., Kim, J. J. Strategies for modelling endometrial diseases. Nat Rev Endocrinol. 18 (12), 727-743 (2022).
  11. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  12. Esfandiari, F., et al. Endometriosis organoids: prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 45 (1), 5-9 (2022).

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