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Extração de RNA de animal único e tubo único para comparação dos níveis relativos de transcrição via qRT-PCR no Tardígrado Hypsibius exemplaris

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DOI:

10.3791/66935

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3 de janeiro de 2025

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1Department of Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Neuroscience Research Institute, University of California, Santa Barbara

Autores correspondentes: Molly J. Kirk <mollyjanekirk@ucsb.edu>

Neste artigo

Resumo

Este trabalho apresenta um método de extração rápida de RNA e comparação de nível de transcrição para análise da expressão gênica no tardígrado Hypsibius exemplaris. Usando lise física, este método de alto rendimento requer um único tardígrado como material de partida e resulta em produção robusta de cDNA para reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR).

Resumo

O tardígrado Hypsibius exemplaris é um organismo modelo emergente conhecido por sua capacidade de sobreviver a extremos ambientais. Para explorar os mecanismos moleculares e a base genética de tal extremotolerância, muitos estudos contam com o sequenciamento de RNA (RNA-seq), que pode ser realizado em populações que variam de grandes coortes a animais individuais. A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) e a interferência de RNA (RNAi) são posteriormente usadas para confirmar os achados de RNA-seq e avaliar os requisitos genéticos para genes candidatos, respectivamente. Tais estudos requerem um método eficiente, preciso e acessível para extração de RNA e medição dos níveis relativos de transcrição por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR). Este trabalho apresenta um método eficiente de extração de RNA de tubo único e tardígrado único (STST) que não apenas isola de forma confiável o RNA de tardígrados individuais, mas também reduz o tempo e o custo necessários para cada extração. Este método de extração de RNA produz quantidades de cDNA que podem ser usadas para amplificar e detectar vários transcritos por PCR quantitativo (qRT-PCR). O método é validado pela análise de mudanças dinâmicas na expressão de genes que codificam duas proteínas reguladas por choque térmico, Heat-Shock Protein 70 β2 (HSP70 β2) e Heat-Shock Protein 90α (HSP90α), possibilitando avaliar seus níveis relativos de expressão em indivíduos expostos ao calor usando qRT-PCR. O STST complementa efetivamente os métodos existentes de extração de RNA tardígrado único e em massa, permitindo o exame rápido e acessível dos níveis transcricionais de tardígrados individuais por qRT-PCR.

Introdução

Os tardígrados são pequenos animais multicelulares conhecidos por sua capacidade de sobreviver a condições extremas que são letais para a maioria das outras formas de vida1. Por exemplo, esses animais podem sobreviver quase 1000 vezes a dose de radiação ionizante que é letal para os humanos 2,3,4,5,6,7,8,9,10, dessecação quase completa 11,12,13,14,15, congelamento na ausência de adição de crioprotetores 16,17,18 e, em seu estado dessecado, até mesmo o vácuo do espaço 19,20. Devido à sua capacidade única de sobrevivência em ambientes extremos, esses animais tornaram-se modelos fundamentais para a compreensão da extrema tolerância em organismos multicelulares complexos 1,21,22,23.

A manipulação genética estável desses animais notáveis, incluindo transgênese e modificação genética da linha germinativa, permaneceu indescritível até recentemente 24,25. Como tal, a maioria dos experimentos para revelar mecanismos moleculares de extremotolerância são realizados por meio de perfis transcricionais via sequenciamento de RNA. Existem muitos conjuntos de dados de sequenciamento de RNA valiosos e informativos para tardígrados sob várias condições extremas, variando de radiação 8,9,26,27,28, estresse térmico29, estresse de congelamento12 e dessecação 27,30,31,32,33. Alguns desses estudos utilizaram métodos de extração e purificação de RNA em massa para iluminar nossa compreensão molecular da extremotolerância. No entanto, a extração em massa de transcritos de RNA de muitos animais impede a análise da variação na expressão gênica entre indivíduos, perdendo assim a riqueza potencial de conjuntos de dados mais refinados. É importante ressaltar que esses estudos geralmente analisam populações heterogêneas de animais que incluem animais que sobrevivem a estressores ambientais e aqueles que não sobrevivem. Como tal, esses estudos são confundidos pela média de dados de expressão de estados de resposta múltiplos e potencialmente dramaticamente diferentes. Para resolver esse problema, Arakawa et al., 201634 desenvolveram um elegante pipeline de RNA-seq de baixa entrada que aplica um kit de extração de RNA seguido por uma etapa de amplificação de PCR linear usando 34,35,36 ou vários 30,37,38 animais como entrada. Esses estudos foram fundamentais para nossa compreensão da extremotolerância ao tardígrado22. Curiosamente, este protocolo também foi aplicado ao qRT-PCR usando sete animais como material de partida24.

Na maioria dos organismos modelo, tendo identificado alvos potenciais via RNA-seq, o qRT-PCR é então realizado para confirmar as alterações transcricionais identificadas pelo RNA-seq e avaliar o curso do tempo de expressão dos genes candidatos de maneira de alta resolução. Para testar a função dos genes identificados, esses estudos são frequentemente seguidos por knockdown mediado por RNAi de alvos moleculares39,40 e análise da capacidade extremotolerante 12,41. A eficácia de cada knockdown de RNAi é normalmente confirmada por qRT-PCR, monitorando diretamente a diminuição na abundância de transcritos. No entanto, o RNAi é um processo trabalhoso em tardígrados, pois cada dsRNA deve ser administrado por meio de microinjeção manual de indivíduos39,40. Devido à natureza de baixo rendimento dessa estratégia, um método de extração de RNA rápido e de baixo custo adaptado para qRT-PCR de animais únicos seria altamente valioso para a pesquisa de tardígrados. Embora métodos anteriores tenham sido desenvolvidos para extrair RNA de tardígrados únicos, esses protocolos não combinaram sua extração com qRT-PCR, em vez disso, confiaram em métodos baseados em densidade óptica 12,40,41. Motivados por esses desafios, procuramos desenvolver um protocolo que produza RNA de forma confiável em quantidade e qualidade que possa ser usado para qRT-PCR a partir de um único H. exemplaris.

Adaptado de um protocolo de extração de RNA de um único animal desenvolvido para Caenorhabditis elegans42, o STST é otimizado para H. exemplaris. O método de extração consiste em seis etapas rápidas de congelamento e descongelamento, interrompendo fisicamente a cutícula, permitindo a extração de RNA e subsequente síntese de cDNA. O método STST diminui o tempo de extração em mais de 24 vezes em comparação com os métodos de extração de RNA em massa, conforme descrito por Boothby, 201843, e em 30% em comparação com os kits de extração de RNA tardígrado único, conforme descrito por Arakawa et al., 201634. Além disso, o número de interações amostra-experimentador é reduzido de 5 para apenas 1 em comparação com as preparações do kit de extração de RNA, reduzindo assim o risco de contaminação por ribonucleases exógenas. Ao consultar genes altamente expressos, o método STST produz cDNA suficiente para 25 reações quantitativas de RT-PCR por tardígrado único, exigindo apenas 1 μL do volume total de 25 μL de cDNA por reação. No entanto, as concentrações do modelo precisam ser determinadas empiricamente para transcritos de menor abundância.

A eficácia do método STST para analisar mudanças dinâmicas na expressão gênica foi avaliada investigando a expressão diferencial dos genes que codificam a proteína de choque térmico-90α (HSP90α) e a proteína de choque térmico 70β2 (HSP70β2) em resposta ao choque térmico de curto prazo a 35°C por 20 minutos. Tanto o HSP70β2 quanto o HSP90α na maioria dos organismos eucarióticos são rapidamente regulados positivamente após a exposição a choques térmicos de curto prazo (20 min) 42 . A análise em H. exemplaris revelou que os RNAs codificadores de HSP70β2 e HSP90α extraídos de tardígrados tratados termicamente mostraram aumentos estatisticamente significativos na expressão após exposição ao calor de curto prazo. Esses achados demonstram que o protocolo STST pode ser usado para analisar mudanças dinâmicas na expressão gênica em animais individuais ao longo do tempo.

O método de extração STST deve complementar os métodos experimentais existentes, como RNA-seq, facilitando a extração rápida e barata de RNA e a subsequente comparação dos níveis de transcrição por qRT-PCR. Este método também será valioso para avaliar a eficiência e penetrância do RNAi em indivíduos injetados manualmente de forma mais quantitativa do que a densidade óptica sozinha. Finalmente, devido às suas estruturas cuticulares e características físicas semelhantes, é provável que esse método também seja eficaz para analisar a expressão gênica em outras espécies de tardígrados44.

Protocolo

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Figura 1: Tubulação de tubo único para extração de RNA de um único tardígrado. (A) Esquema mostrando o protocolo para extração de RNA de um único tardígrado, incluindo seis ciclos de congelamento e descongelamento e subsequente síntese de cDNA. As amostras podem ser posteriormente utilizadas para RT-PCR e qRT-PCR. (B) Imagem do cone da micropipeta usado para remoção de água. Barra de escala: 2 mm. (C) Imagem de campo claro de um tardígrado em um pequeno volume de água (linha pontilhada). A remoção da maior parte da água na medida mostrada é necessária para uma extração bem-sucedida e evita a diluição do tampão de lise. Barra de escala: 50 μm. (D) Imagem mostrando a imersão de amostras em nitrogênio líquido usando pinças longas para congelar e descongelar rapidamente as amostras com segurança. Parte do conteúdo foi criado em BioRender. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: A Figura 1A mostra um esquema do procedimento. Para procedimentos detalhados de cultura de tardígrados e algas, consulte os relatórios publicados anteriormente 45,46,47.

1. Esterilização da água de nascente

  1. Despeje 2 L de água mineral de uma jarra de água de 5 galões (consulte a Tabela de Materiais para Detalhes) em uma garrafa de vidro própria para autoclave de 2 L.
  2. Coloque a tampa no frasco seguro para autoclave e feche com uma pequena quantidade de fita adesiva. Não aperte a garrafa; Coloque a tampa por cima.
  3. Autoclave a água da nascente por 50 min em um ciclo úmido sem etapa de secagem.
  4. Deixe a água atingir a temperatura ambiente (RT) e feche a tampa firmemente antes de armazená-la em RT.

2. Tração de micropipeta de vidro (com extrator de pipeta)

  1. Prenda uma micropipeta de vidro (D.E.: 1 mm, I.D.: 0.58 mm, Comprimento: 10 cm) em um extrator de micropipeta. Evite o contato com o filamento de aquecimento, pois isso alterará o formato da pipeta e danificará o filamento.
    1. Determinar empiricamente a tracção da pipeta para cada filamento e extractor de pipetas. No entanto, para servir como ponto de partida para a otimização, use 78 °C e uma única etapa de tração de peso de tração de 182,2 g.
  2. Deixe o filamento aquecer e a gravidade separar a micropipeta de vidro em duas micropipetas de vidro com pontas afiadas (Figura 1B).
  3. Armazene essas micropipetas de vidro puxado em uma placa de Petri fechada de 100 mm com cera ou argila para mantê-las no lugar e evitar que as pontas afiadas se quebrem.

3. Tração de micropipeta de vidro (sem extrator de pipeta)

  1. Acenda um bico de Bunsen ou outra fonte de chama controlada em uma configuração baixa.
  2. Pegue uma micropipeta de vidro com uma extremidade em cada mão.
  3. Segure o centro da micropipeta de vidro sobre a chama até que o vidro comece a derreter. Em seguida, separe rapidamente as duas extremidades. Isso criará duas pontas afiadas muito delicadas.
  4. Quebre levemente a ponta com uma pinça fina estéril.
  5. Armazene essas micropipetas de vidro puxado em uma placa de Petri fechada de 100 mm com cera ou argila para mantê-las no lugar e evitar que as pontas afiadas se quebrem.

4. Extração de RNA

  1. Obtenha 0,5 L de nitrogênio líquido em um recipiente crio-seguro.
    CUIDADO: O nitrogênio líquido é criogênico e pode causar queimaduras se exposto à pele ou aos olhos. Ao manusear, use roupas de proteção, óculos de proteção, luvas de nitrilo, luvas criogênicas, jaleco e sapatos fechados. Verifique se o recipiente é seguro para nitrogênio líquido antes de transportar o líquido. O uso de um banho de gelo seco com etanol para esta etapa também pode ser possível.
  2. Faça a mistura mestre de síntese de cDNA: uma solução de 10 μL contendo 1 μL de primer hexâmero aleatório, 2 μL de DNase, 4 μL de 5x RT Buffer, 1 μL de Enzyme Mix, 1 μL de H2O e 1 μL de 10 mM dNTPs. Armazene esta solução no gelo.
  3. Prepare o tampão de lise de tardígrados (5 mM Tris (pH = 8), 0,5% (v/v) Detergente 1, 0,5% (v/v) Detergente 2, 0,25 mM EDTA em água estéril sem nuclease).
    NOTA: Esta solução pode ser armazenada na bancada por 6 meses. No entanto, mantenha a esterilidade e evite possíveis fontes de contaminação por RNAse.
  4. Alíquota tampão de lise suficiente para extracções (2 μL/tardígrado).
  5. Adicionar inibidor de RNAse à solução tampão de lise de tardígrados até uma concentração final de 4 U/μL.
  6. Vortex e centrifugar a solução em RT em uma centrífuga de bancada a uma velocidade de 2000 x g por 5 s antes de armazenar a solução no gelo.
  7. Remova quantos tardígrados forem necessários para o experimento da cultura usando uma pipeta P1000 estéril com ponta de filtro e coloque-os em uma placa de Petri estéril de 35 mm.
    NOTA: Qualquer número de tardígrados pode ser processado desta forma. Normalmente, três tardígrados por condição são processados para extração.
  8. Lave os tardígrados três vezes, usando 1 mL de água de nascente estéril autoclavada e uma pipeta P1000 com ponta de filtro estéril. Pipetá-los lentamente para cima e para baixo ajuda a remover contaminantes de algas.
  9. Usando um microscópio de dissecação com aumento de 25x a 50x, transfira um único tardígrado desta cultura lavada para uma nova placa de Petri estéril de 35 mm usando uma pipeta P10 estéril com ponta de filtro.
  10. Use uma pipeta P200 com ponta de filtro estéril para lavar o tardígrado único em 100 μL de água estéril sem nuclease.
    NOTA: Esta etapa de lavagem é usada para remover ainda mais contaminantes, incluindo ribonucleases.
  11. Transfira o tardígrado lavado para o fundo de um tubo de PCR limpo e estéril em 1-2 μL de água estéril sem nuclease usando uma pipeta P10 com ponta de filtro estéril, garantindo cuidadosamente que o tardígrado não grude na lateral da ponta.
  12. Visualize o tardígrado sob um microscópio de dissecação com ampliação de 25x.
  13. Para facilitar a remoção de água, quebre levemente a ponta da micropipeta de vidro puxado fora do tubo. Certifique-se de que o furo seja grande o suficiente para puxar a água, mas não o tardígrado.
  14. Usando a ação capilar de uma micropipeta de vidro puxado, remova a água até que o animal esteja cercado por uma pequena bolha de água com aproximadamente dois comprimentos de tardígrados de diâmetro.
  15. Monitore o processo de remoção de água por meio do escopo de dissecação para garantir que o nível da água seja adequado e o tardígrado permaneça hidratado.
    NOTA: A Figura 1C oferece um exemplo de quanta água remover. Este é um passo crítico. Uma pequena bolha de água envolverá o tardígrado para evitar que seque, mas o máximo de água em excesso possível deve ser removido para evitar a diluição do tampão de lise. Para obter um example dos níveis de água restantes, consulte a Figura 1C.
  16. Imediatamente após a remoção da água, adicione 2 μL de tampão de lise de tardígrados ao fundo do tubo, faça um vórtice breve e centrifugue o tubo em RT por 5 s a 2000 x g em uma centrífuga de mesa.
  17. Coloque imediatamente as amostras contendo os tardígrados em um suporte de tubo de PCR e certifique-se de que estejam firmes pelo rack.
  18. Segure o rack usando um par de pinças longas e grossas e mergulhe suavemente o rack contendo as amostras no nitrogênio líquido até congelar completamente (Figura 1D).
  19. Remova o rack do nitrogênio líquido e coloque-o imediatamente no gelo. Deixe a amostra descongelar (leva ~ 45 s a 1 min). Monitore a amostra a cada 15 s, removendo-a do gelo e inspecionando-a visivelmente. Quando a amostra estiver visivelmente transparente, passe para a próxima etapa.
  20. Repita as etapas 4.18-4.19 mais cinco vezes. Um total de seis ciclos de congelamento e descongelamento são necessários para lise e extração máximas (Figura 2A, B).
  21. Quando o congelamento e descongelamento estiver concluído, coloque as amostras no gelo e avance imediatamente para a próxima etapa. Não congele as amostras neste ponto para armazenamento, pois isso diminuirá o RNA disponível para a preparação do cDNA.

5. Síntese de cDNA

  1. Adicionar 2 μL de mistura principal de síntese de cDNA ao tubo de PCR contendo lisado de tardígrado. Agite brevemente o tubo e gire-o em RT a 2000 x g por 5 s com uma centrífuga de mesa antes de recolocar as amostras no gelo.
  2. Coloque as amostras em um termociclador e incube a 25 ° C por 10 min para recozer primers, a 55 ° C por 30 min para realizar a transcrição reversa e, finalmente, enzimas inativadas pelo calor a 85 ° C por 5 min.
  3. Após a incubação, coloque imediatamente o tubo no gelo e dilua a amostra até um volume total de 25 μL adicionando 21 μL de água estéril sem nuclease. Para transcrições com baixo número de cópias, altere esta etapa de diluição conforme determinado empiricamente.

6. qPCR

  1. Determine a temperatura de recozimento do conjunto de primers usando RNA total preparado a partir de grandes quantidades de tardígrados, por exemplo, o método de extração em massa apresentado em Boothby, 201843.
  2. Execute um gradiente de temperatura de PCR para determinar a temperatura de recozimento ideal antes de executar qRT-PCR (para todas as configurações de PCR usadas neste protocolo, consulte a Tabela 1 e a Tabela 2).
  3. Descongele um tubo de corante indicador, super misture no gelo e isole da luz. Coloque uma placa de qPCR de 96 poços no gelo e coloque 5 μL de super mistura, 2 μL de água, 1 μL de cada primer (10 μM) e 1 μL de produto de cDNA no número de poços desejados.
  4. Sele a placa de PCR com a vedação da placa e execute o qRT-PCR usando uma temperatura de recozimento apropriada para o conjunto de primers (para todas as configurações de qRT-PCR usadas neste artigo, consulte a Tabela 3).

7. Quantificação e interpretação dos resultados

  1. Compare os resultados quantitativamente com um ou mais genes de manutenção de controle, cuja expressão deve ser constante nas condições impostas. Para este estudo, foi utilizado o gene da actina.
  2. Obter e comparar os valores Ct ou o limiar de ciclo de cada alvéolo com os valores Ct das reações genéticas de manutenção de controlo. Calcule a mudança de dobra na expressão gênica usando a seguinte equação:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
    NOTA: A expressão gênica da dobra é plotada para cada transcrito e tardígrado como um 2- (ΔΔCt) 48.
  3. Para obter uma estimativa aproximada do número de transcritos a partir do valorC t, use a seguinte equação:
    figure-protocol-5
    Onde N é o número de transcritos e 2 é a eficiência de PCR assumida ou o aumento de dobras na fluorescência por ciclo de PCR48.

Resultados

Desenvolvimento e otimização da extração de RNA de tardígrado único
Adaptando o protocolo de Ly et al., 201542 para extração de RNA em tardígrados, o sistema STST é otimizado para maximizar a quantidade e a qualidade da preparação (Figura 1A). RT-PCR foi realizado para transcritos de actina, quantificando o rendimento do transcrito amplificando uma região de 527 pb abrangendo os éxons 1 e 2 (as sequências para esses primers podem ser encontradas na Tabela 1). A densidade óptica da banda de actina esperada foi quantificada como intensidade de fluorescência com ImageJ/FIJI. Todas as regiões de interesse quantificadas eram de igual tamanho de área em cada gel.

Primeiramente, foram avaliados os métodos de lise mecânica necessários para romper a cutícula do tardígrado. Em contraste com um protocolo de extração de RNA de um único animal descrito para C. elegans42, que relatou que a lise da proteinase K e um choque térmico foram suficientes para lisar os animais, a extração de tardígrados exigiu um mínimo de seis ciclos de congelamento e descongelamento para obter uma extração de RNA consistente e robusta (Figura 2A, Figura Suplementar 1). Essas amostras foram submetidas a vórtices a 2700 rotações por minuto por 15 s entre cada ciclo de congelamento e descongelamento para promover a lise celular. Para minimizar o tempo e a degradação potencial, o número do ciclo de congelamento e descongelamento foi mantido nesse valor mínimo durante o restante das preparações. Em números mais baixos de ciclos de congelamento e descongelamento (0-5), foram encontrados níveis mais altos de produtos de DNA genômico (gDNA), como evidenciado pelo aparecimento de bandas de migração mais lenta do que o esperado para o cDNA de actina. Isso sugere que o processo de congelamento e descongelamento antes da remoção do dsDNA pela DNase é necessário para a remoção completa do gDNA. O menor número de ciclos de congelamento e descongelamento pode diminuir a probabilidade de que todos os núcleos sejam efetivamente permeabilizados, impedindo assim que a dsDNase degrade todo o gDNA durante o período de incubação de 25 ° C. Em temperaturas mais altas, durante as etapas de transcrição reversa e inativação do calor, o DNA nuclear restante pode ser liberado e servir como modelo durante a PCR subsequente (Figura 2A, Figura Suplementar 1). Em última análise, a consistência do sucesso da extração e o rendimento, medidos pela densidade óptica, aumentaram com o maior número de ciclos de congelamento e descongelamento, com seis ciclos mostrando um aumento de três vezes no rendimento de cDNA em comparação com nenhum ciclo de congelamento e descongelamento ( Figura 2B ).

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Figura 2: Otimização de RT-PCR de tardígrado único usando cDNA de actina como marcador para quantidade de extração. (A) Gel representativo representando os resultados de RT-PCR de tardígrado único extraído usando ciclos de congelamento e descongelamento 4 (pista 2-4), 5 (pista 5-7) e 6 (pista 8-10) para aumentar a lise após tratamento com proteinase K e choque térmico. Amostras completas contendo gel de 1, 2 e 3 ciclos de congelamento e descongelamento são mostradas na Figura Suplementar 1. (B) Quantificação da densidade óptica da coloração de brometo de etídio de actina RT-PCR em vários números de ciclo de congelamento e descongelamento. Os dados representam os valores de densidade óptica das bandas de três extrações individuais e amplificação por PCR de actina via RT-PCR por condição. ANOVA unidirecional, com comparações múltiplas de Tukey post hoc 0 vs. 6, p= 0,020 e 3 vs. 6 p=0,022, as barras de erro representam o desvio padrão (S.D.). (C) Gel representativo mostrando o efeito da remoção de água de nascente residual de tardígrados isolados antes da adição de tampão de lise. Amostras contendo água (pistas 2-4) e amostras onde a água foi removida (pistas 5-7). (D) Gel representativo mostrando o efeito da ordem de lise, com congelamento-descongelamento realizado antes da lise química (pistas 2-4) ou lise química com proteinase K antes da lise de congelamento-descongelamento (pistas 5-7). (E) Pontuações de integridade de RNA relatadas pela estação Agilent High Sensitivity Tape de animais com extratos únicos de tardígrados na ausência de congelamento-descongelamento, na ausência de vórtice e utilizando apenas congelamento-descongelamento sem digestão ou vórtice de proteinase k. Cada ponto de dados representa a pontuação RIN de uma extração de RNA singular. ANOVA unidirecional, com comparações múltiplas de Tukey post hoc, *p = 0,036. (F) Pontuações RIN relatadas a partir de extratos únicos de tardígrados na presença de inibidores de RNAse 4 U/μL, 8 U/μL e 16 U/μL. ANOVA de Brown-Forsythe com teste de comparações múltiplas T3 de Dunnett, ****p = < 0,0001 e *p = 0,0487. (G) Pontuações RIN de extratos únicos de tardígrados descongelados em gelo. (H) Quantidade de RNA em ng/μL medida usando o kit de RNA de alta sensibilidade Qubit. (I) Quantidade de RNA em nanogramas por extrato de tardígrado usando STST. 5 μL de produtos de PCR foram carregados por pista, salvo indicação em contrário. Todas as barras de erro são relatadas como S.D. Parte do conteúdo foi criado em BioRender. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s51 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em seguida, testamos se a remoção quase completa do excesso de água transportada da transferência da amostra era essencial para obter uma lise consistente de tardígrados únicos. O protocolo STST usa um volume mínimo de tampão de lise para maximizar a concentração de RNA. Estávamos preocupados que o excesso de água pudesse diluir o detergente e o EDTA no tampão de lise e, assim, interferir na lise confiável. A Figura 2C e a Figura Suplementar 2 mostram os resultados das extrações individuais de tardígrados triplicados na presença e ausência de água residual da transferência de tardígrados. Esses dados indicam que a remoção do excesso de água é fundamental para o sucesso, pois o produto não foi observado em amostras contendo excesso de água.

Procuramos determinar se a ordem de lise é importante para obter uma extração robusta de RNA e descobrimos que a realização da etapa de congelamento e descongelamento antes da proteinase K e da lise enzimática resultou em pouco ou nenhum RNA detectável por RT-PCR (pistas 2-4 da Figura 2D e Figura Suplementar 3). No entanto, os produtos de PCR foram prontamente obtidos quando a lise química foi realizada antes da etapa de congelamento e descongelamento (pistas 5-7 da Figura 2D e Figura Suplementar 3). Isso sugere que a digestão da cutícula pela proteinase K é necessária antes da lise mecânica ou que a lise prévia por congelamento e descongelamento extrai o RNA, deixando-o exposto à atividade endógena da RNAse durante todo o tratamento com proteinase K.

Para avaliar se a digestão da proteinase K é necessária para o isolamento do RNA de tardígrados únicos, a qualidade do RNA foi avaliada por meio de uma estação de fita de alta sensibilidade. Os animais que experimentaram vórtice após o tratamento com proteinase K mostraram alto fracionamento de RNA, enquanto o ciclo de congelamento e descongelamento após o tratamento com proteinase K resultou em escores de integridade de RNA (RIN) aumentados, mas inconsistentes ( Figura 2 E, Figura Suplementar 4 ). Curiosamente, a extração de RNA na ausência das etapas de proteinase K e vórtice aumentou significativamente a consistência e a qualidade, sugerindo que o tratamento com proteinase K não é necessário nem útil para a extração de RNA de H. exemplaris (Figura 2E, Figura Suplementar 4). A eliminação deste tratamento reduziu significativamente o tempo necessário para este protocolo de 45 min com tratamento com proteinase K para 7 min no protocolo STST aprimorado. Além disso, o aumento da concentração do inibidor de RNAse de 4 U / μL para 8 U / μl ou 16 U / μL resultou em congelamento incompleto dos animais, produzindo resultados inconsistentes a 8U / μL e uma completa falta de congelamento e subsequente lise a 16 U / μL (Figura 2F). Este efeito é provavelmente atribuível à solução de armazenamento de RNAse contendo 50% de glicerol, que atua como um crioprotetor. Além disso, verificou-se que o descongelamento no gelo resultou em escores RIN moderadamente aumentados (Figura 2G).

Finalmente, para avaliar o rendimento total das preparações de STST, a quantidade de RNA por μL foi medida via Qubit de RNA de Alta Sensibilidade. Esta análise revelou um rendimento de 7,11 ± 1,43 ng / μL ( Figura 2H ), sugerindo que a preparação STST produz 14,24 ± 2,88 ng por animal Hypsibius exemplaris (contendo ~ 1400 células) ( Figura 2I ). Este resultado é consistente com os rendimentos observados com C. elegans adultos (~ 3000 células, incluindo células germinativas), que rendem ~ 35 ng por animal42.

Comparação com protocolos de extração de RNA tardígrado existentes
Ao desenvolver o protocolo de extração de RNA STST, este estudo teve como objetivo limitar o tempo necessário para realizar a técnica, o número de interações amostra-experimentador, o custo e o número de animais necessários para a extração robusta de RNA. A Figura 3A, B mostra um esquema contrastando um protocolo de extração de RNA de tardígrado único descrito anteriormente que foi usado para sequenciamento de RNA após amplificação de PCR linear (Figura 3A) e o método de extração de RNA de tubo único e tardígrado único (Figura 3B), destacando cada método em termos desses quatro parâmetros. Anteriormente, os protocolos de extração de RNA de tardígrado único exigiam aproximadamente dez minutos, três tubos e cinco interações do experimentador antes da síntese de cDNA; no entanto, esses métodos ainda não foram avaliados para aplicações de qRT-PCR em animais únicos. Os protocolos atuais de extração de RNA publicados para avaliação de alterações transcricionais por qRT-PCR usam um mínimo de sete tardígrados24. O método STST descrito aqui diminui o tempo para sete minutos com apenas uma interação amostra-experimentador e um único tubo. A remoção das interações amostra-experimentador reduz o potencial de contaminação por RNAse, aumentando assim o potencial de extrações de alta qualidade.

Para comparar a eficácia das extrações STST com o kit de extração de RNA, extrações de tardígrado único foram realizadas usando ambos os métodos e os números de transcritos foram avaliados quantitativamente usando qPCR. Amplificando uma região de 150 pb do gene de manutenção que codifica a actina,o valor de CT, ou seja, o número do ciclo necessário para que o sinal de fluorescência seja detectado acima do fundo, foi usado para indicar a quantidade de cDNA. O valor médio de Ct dos tardígrados simples processados com o protocolo STST foi de 27,86 ± 1,268 (Figura 3C), enquanto os extraídos com o kit de extração de RNA foram de 37,67 ± 3,311 (Figura 3C). Embora ambos os protocolos produzam um sinal acima da fluorescência de fundo obtida de qPCRs de controle executadas sem cDNA modelo, apenas o protocolo STST foi estatisticamente significativo em comparação com os níveis de fundo. Esse achado indica que, embora o RNA estivesse presente nas amostras do kit de extração de RNA, o kit não produziu quantidades suficientes de RNA para ser detectado de forma consistente. Usandoesses valores de CT, este estudo foi capaz de estimar o número de transcritos por microlitro de cDNA: STST rendeu ~ 1760 ± 954,2 transcritos de actina por μL, enquanto o método baseado em RNA Kit rendeu ~ 7,5 ± 12,29 transcritos de actina por microlitro (Figura 3D), sugerindo que, como um método de extração de tardígrado único, o sistema STST é > 200 vezes mais eficiente. Quando quantificado, o protocolo STST produziu significativamente mais transcritos do que o kit de extração de RNA, que foi novamente estatisticamente indistinguível das medições de fundo (Figura 3D). Isso sugere que o método atual baseado em kit de RNA para tardígrados únicos não extrai suficientemente RNA ou perde quantidades significativas de RNA durante todo o processo de purificação, resultando em quantidades indetectáveis de cDNA a jusante. Para visualizar esse efeito, as amostras de qPCR foram executadas em um gel analítico, confirmando a amplificação mínima dos produtos extraídos do kit de RNA (Figura 3E e Figura Suplementar 5, pistas 2-4) e amplificação robusta nas amostras extraídas por STST (Figura 3E e Figura Suplementar 5, pistas 5-8).

Por fim, comparou-se o custo da extração de RNA e da síntese de cDNA usando o kit de extração de RNA com o método STST (Tabela 4). Como o volume de eluição para o kit de RNA foi três vezes maior que o do protocolo STST, ele requer três vezes o material de síntese de cDNA, representando o custo mais alto na síntese de cDNA para cada extrato de tardígrado inteiro antes que as amostras fossem diluídas em volumes iguais de 25 μL. Além disso, conforme determinado anteriormente (Figura 3C, D) que uma etapa de amplificação linear seria necessária para produzir quantidades acima dos valores de Ct de fundo, incluímos essa etapa nas estimativas de custo, conforme descrito diretamente por Arakawa et al. 201634; no entanto, pode haver uma maneira mais econômica de realizar a amplificação linear da qual não temos conhecimento.

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Figura 3: Comparação dos protocolos de extração de RNA. Curso de tempo esquematizado para (A) um kit de extração de RNA à base de isotiocianato de fenol e guanidina existente, exigindo ~ 10 min para extração (a barra de escala é de 30 min) e (B) O protocolo de tubo único e tardígrado único que permite a extração em 7 min e requer um tubo. Os cursos de tempo são desenhados em escala. A barra de escala é de 30 min. (C) Gráfico mostrando os valores de Ct das reações de qRT-PCR de actina executadas em triplicata, onde cada ponto de dados representa os valores médios de Ct de três réplicas técnicas de um extrato de tardígrado individual. As extrações à base de tardígrado único e o controle de fundo revelando fluorescência de fundo de amostras são executadas em qRT-PCR na ausência de um modelo. ANOVA unidirecional, teste de comparações múltiplas de Tukey *** p = 0,0003 e **** p < 0,0001, as barras de erro refletem SD (D) Transcritos estimados por μL de amostra derivados dos valores de Ct representados em (C). Teste de Kruskal-Wallis, teste de comparações múltiplas de Dunn, * p = 0,0165 barras de erro refletem SD (E) Gel representativo mostrando RT-PCR de actina de amostras de cDNA de tardígrado único extraídas usando kit de RNA (pistas 2-4) e pistas STST (5-8). Os géis foram carregados com 6 μL de amostra e 1 kb mais escada de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aplicação do protocolo de extração de um único tardígrado de tubo único para quantificar as respostas ao choque térmico em H. exemplaris
Em seguida, procuramos explorar se este protocolo pode ser aplicado para monitorar efetivamente as mudanças transcricionais em H. exemplaris, voltando-se para a via canônica de resposta ao choque térmico, que resulta na regulação positiva de HSP70β2 e HSP90α (Figura 4A, Figura Suplementar 6) após breve exposição a altas temperaturas42. Os tardígrados em seu estado ativo são altamente sensíveis ao aumento da temperatura29; assim, 35 °C por 20 min foi selecionado como choque térmico, pois isso resultou em letalidade mínima (Figura 4B). Observamos que a resposta segue um padrão semelhante ao observado em outros organismos42. Primeiro, os tardígrados foram expostos à temperatura de criação (23 ° C) ou alta temperatura (35 ° C) por 20 min ( Figura 4 C ). Em seguida, o RNA foi extraído de animais individuais e o cDNA foi gerado usando o método STST por colheita imediata ou 1 h, 2 h, 4 h e 6 h após a exposição ao choque térmico. Posteriormente, os transcritos foram quantificados para HSP70β2 (Figura 4D) e HSP90α (Figura 4E) usando qRT-PCR. Foi observada uma regulação positiva significativa de HSP70β2 (~ 11 vezes) e HSP90α (~ 4 vezes) após 1 h, e a expressão retornou lentamente à linha de base nas horas seguintes. Esses resultados seguem os padrões esperados de respostas ao choque térmico observados em C. elegans42.

Finalmente, para avaliar a qualidade do STST como método de extração para qRT-PCR, compilamos todos os valores de actina Ct em todas as amostras executadas para a Figura 4D,E. Os valores médios de actina Ct para um amplicon de actina de 150 pb e um amplicon de actina de 527 pb não foram estatisticamente diferentes (Figura 4F). Além disso, a comparação da variância (desvio padrão) entre os valores de Ct derivados de triplicatas obtidos de cada extrato individual ficou consistentemente abaixo do corte de qualidade média de 0,5 ciclos por extrato individual49 (Figura 4G).

Todos os dados brutos do gel analítico foram incorporados aos dados suplementares deste manuscrito. As sequências de transcritos foram identificadas por meio de pesquisa Ensembl em: https://metazoa.ensembl.org/Hypsibius_exemplaris_gca002082055v1/Info/Index?db=core HSP70β2 (BV898_04401), HSP90α (BV898_50798) e Actin(BV898_02877).

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Figura 4: Expressão de transcritos HSP-70 e HSP-90. (A) Gel representativo mostrando amplificação de HSP70 de DNA genômico (gDNA; pista 2) e cDNA (pista 3) e HSP90 de gDNA (pista 4) e cDNA (pista 5). A variação nos comprimentos de gDNA e cDNA reflete o design do primer, que abrange um íntron. (B) Sobrevivência do tardígrado pós-exposição a 23 ° C e 35 ° C por 20 minutos. Cada ponto de dados representa a porcentagem de sobrevivência de uma coorte de seis animais. O teste T não encontrou diferença estatística. (C) Condições analisadas. (D) Níveis de expressão relativa de HSP70β2 no tempo indicado após o choque térmico de 20 minutos a 35 °C. Teste de Kruskals-Wallis com análise de comparações múltiplas de Dunn *p = 0,0339 (1 vs. 0), **p = 0,0043 (1 vs. 4), **p = 0,0097 (1 vs. 6). Cada ponto de dados representa os níveis de expressão normalizados de um extrato individual de RNA tardígrado em média em três réplicas técnicas. (E)Níveis de expressão relativa de HSP90α no tempo indicado após o choque térmico de 20 minutos a 35 °C. ANOVA de Brown-Forsythe com teste de comparações múltiplas T3 de Dunnett *p = 0,0382 (1 vs. 0), *p = 0,0421 (1 vs. 4). Cada ponto de dados representa os níveis de expressão normalizados de um extrato individual de RNA tardígrado em média em três réplicas técnicas. (F) Valores brutos de CT para qRT-PCR de actina amplificando um amplicon de 150 pb ou 527 pb de todas as amostras apresentadas nos painéis D e E. Cada ponto de dados representa Ct de um extrato individual de RNA tardígrado em média em três réplicas técnicas; O teste T não encontrou diferença estatística. G) Desvio-padrão dos valores de Ct entre os replicados técnicos para cada extracto representado nos painéis D e E. As reações amplificaram um amplicon de actina de 150 pb ou 527 pb; O teste T não encontrou diferença estatística. Alguns conteúdos foram criados no BioRender. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s51 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Avaliação do número do ciclo de congelamento e descongelamento. Eletroforese em gel de agarose de produtos de PCR de actina de amostras de cDNA que sofreram diferentes números de ciclos de vórtice de congelamento. (A) Amplificação do transcrito de actina por PCR realizada com amostras que foram congeladas-vórtices por 0-3 vezes (n = 3; 0 ciclo: pista 2-4; 1 ciclo: pista 5-7; 2 ciclos: pista 8-10; 3 ciclos: pista 11-13). 1 kb mais escada de DNA é mostrada na primeira pista; (B) Amplificação do transcrito de actina por PCR realizada com amostras que foram congeladas 4-6 vezes (n = 3; 4 ciclos: pista 0-3; 5 ciclos: pista 4-6; 6 ciclos: pista 7-9) 5 μL de 1 kb mais escada de DNA foram carregados na primeira pista. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: A remoção de água é necessária para uma extração bem-sucedida de RNA. Uma imagem de gel mostra os amplicons de actina da PCR realizada em amostras sem (pista 2-4) ou com (pista 5-7) água removida usando uma micropipeta de vidro puxado antes de adicionar o tampão de lise (n = 3). A primeira pista foi carregada com 5 μL de 1 kb mais escada de DNA, e todos os géis foram carregados com 5 μL de produtos de PCR. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3: A ordem de lise química e física determina a qualidade da extração. Eletroforese em gel de produtos de PCR de actina de amostras que foram submetidas primeiro ao vórtice de congelamento (Pista 2-4) versus lise química primeiro (Pista 5-7). A primeira pista foi carregada com 5 μL de 1 kb mais escada de DNA. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: As estações de fita de RNA funcionam com extratos únicos de tardígrados. Exemplo de estação de fita de exemplo de painel (A) executada em RNA extraído de tardígrados únicos usando o método STST. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 5: Análise comparativa da extração de tardígrado único usando STST vs. kit de extração de RNA. Produtos de PCR de actina obtidos de amostras de cDNA de tardígrado único extraídas usando o protocolo de extração de RNA de Arakawa, 2018 (pista 2-4) versus extração usando o método STST (pista 5-8). A primeira pista foi carregada com 6 μL de 1 kb mais escada de DNA. Toda a eletroforese foi realizada com 6 μL de produtos de PCR carregados em uma única pista. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: Eletroforese em gel dos amplicons HSP70 e HSP90. Produtos de PCR de cDNA e gDNA usando os conjuntos de primers He_HSP70B2 e He_HSP90ALPHA. HSP70B2 amplicon do gDNA é mostrado na pista 2 e o amplicon do cDNA na pista 3. O amplicon HSP90 do gDNA é mostrado na pista 4 e o amplicon do cDNA na pista 5. A primeira pista foi carregada com 5 μL de 1 kb mais escada de DNA. Toda a eletroforese foi realizada com 10 μL de produtos de PCR carregados por pista. Clique aqui para baixar este arquivo.

PassoTemp. (°C)DuraçãoNão. de ciclos
Desnaturação inicial9560 s1
Desnaturação9515 s35
RecozimentoTm30 s
Extensão721 minuto
Extensão final725 min1
Segurar4∞-

Tabela 1: Protocolo de termociclagem de PCR para PCR não quantitativo. A tabela descreve o procedimento exato de termociclagem usado para este estudo. Tm é denotado como a temperatura de fusão para uma reação. As temperaturas de fusão específicas para cada reação podem ser encontradas na Tabela 2.

Nome do conjunto de primersSequência FwdSequência de rotaçãoTm
Actina (520bp)CCTCAGAACAGTCGCAATGGCCAGAGTCCAGCACGATAC62
Actina (150 pb)GTCATCAGGGTGTCATGGTCCTTTTCCCTGTTGGCCTTGG62
HSP90CTTCACCATCCAGACGGACACCCAATCGTTAGTGAGGC62
HSP70ACGTGGTGAAGACTTGCTGAAGCCAGCATTGAGA65*
* 72 °C (-2 °C/ciclo) por seis ciclos antes de uma TM a 65 °C para PCR não quantitativa

Tabela 2: Temperatura de fusão e sequências para primers usados neste estudo. A tabela mostra as sequências direta e reversa dos primers usados para este estudo e sua temperatura de fusão otimizada. É importante notar que o HSP70 exigiu um breve protocolo de aterrissagem que consiste em 6 ciclos antes da amplificação para garantir a especificidade.

PassoTemp. (°C)DuraçãoNão. de ciclos
Desnaturação inicial9560 s1
Desnaturação9515 s30
Extensão de recozimentoTm30 s
Desnaturação9510 s1
Análise da curva de fusão65 (+0.5 °C)10 s60

Tabela 3: Condições de termociclagem para qPCR. A tabela mostra as configurações de termociclagem para reações de qPCR usadas neste estudo. As temperaturas de fusão ou Tm's foram idênticas às mostradas na Tabela 2.

RNA KitCusto/PreparaçãoSTSTCusto/Preparação
Kit6.82Detergente 10.00000036
Custo de preparação do CDNA2.07Base Tris0.0002
Kit de PCR de amplificação linear99.32Detergente 20.00000256
EDTA0.00000055
Inibidor de RNAse0.23
Micropipeta de vidro0.07
Custo de preparação do CDNA0.57
Total (em $)Preço: $108.21Total (em $)$0.87

Tabela 4: Detalhamento de custos para extração de RNA. A tabela descreve a divisão de custos para cada método de extração de RNA por animal único. Os preços foram obtidos no site do fornecedor em 30 de setembro de 2024 e estão sujeitos a alterações.

Discussão

Este estudo apresenta um método eficiente para a extração de RNA para qRT-PCR de tardígrado único. A comparação direta da metodologia STST com um kit de extração de RNA tardígrado único existente revelou que a extração de RNA STST produz quantidades >200 vezes maiores de transcritos de RNA de actina, reduz o custo para menos de um dólar por amostra e reduz o tempo necessário para extração em 30%. Para aplicar o STST a uma questão biológica relevante, avaliamos o perfil de expressão da resposta ao choque térmico de curto prazo. Descobrimos que os transcritos para HSP70β2 e HSP90α, como esperado, foram fortemente regulados positivamente 1 h após a exposição ao calor.

Embora o protocolo STST seja uma melhoria substancial em relação aos métodos anteriores, várias limitações apresentam oportunidades de melhoria e avaliação adicional. Primeiro, não avaliamos a capacidade do STST de detectar transcritos expressos em níveis muito baixos. A solução de problemas para a concentração apropriada do modelo pode ser necessária para transcritos expressos em níveis baixos. Em segundo lugar, embora o método STST tenha mostrado uma taxa de sucesso de ~ 80%, definida como a porcentagem de extratos que resultam em valores de actina Ct inferiores a 31, houve ocasiões em que o método não conseguiu obter quantidades utilizáveis de cDNA, talvez por causa da atividade da RNAse ou lise insuficiente. Otimizar a inibição da atividade da RNAse pode ajudar a aumentar a taxa de sucesso. Finalmente, a qualidade do RNA pode ser melhorada usando este método. Assim como neste estudo, medidas podem ser tomadas para contornar os efeitos da degradação e subsequente fragmentação do RNA, bem como para mitigar seu impacto nos resultados da qRT-PCR. Melhorias na qualidade do RNA aumentariam ainda mais a avaliação rápida das alterações transcricionais do RNA, a análise da eficácia do knockdown do RNAi e a capacidade de avaliar a variância entre populações de muitos animais individuais. É importante notar que todos os protocolos para extração de RNA em tardígrados requerem alguma forma de lise mecânica. Os protocolos tradicionais de isotiocianato de fenol e guanidina requerem três ciclos de congelamento e descongelamento43, enquanto o kit de extração de RNA requer ruptura manual com uma pipeta 34,36. Em última análise, diferentes métodos de lise mecânica podem melhorar a qualidade no futuro.

Várias etapas criticamente importantes no método STST foram identificadas. Primeiro, remover a maior parte da água do tubo antes de adicionar o tampão de lise é fundamental: deixamos uma bolha de aproximadamente dois comprimentos de tardígrados de diâmetro ao redor do animal. Embora esse volume minúsculo não tenha sido medido, remover o máximo de água possível melhorará a consistência e o sucesso geral (Figura 1C). Em segundo lugar, a transferência imediata das amostras para uma reação de preparação de cDNA é importante. Nossa preparação não inclui nenhuma purificação de RNA, por isso é imperativo que não se pause o procedimento após a extração. É possível que os extratos possam ser armazenados com sucesso a -80 °C; no entanto, o efeito desse armazenamento na qualidade do qRT-PCR não foi avaliado. Em terceiro lugar, é vital aderir às diretrizes para a realização de qRT-PCR em amostras levemente degradadas, ou seja, analisar amplicons curtos de <200 pb usando vários genes de manutenção para normalizar os dados sempre que possível49,50.

No geral, os resultados deste estudo representam um passo importante no crescente repertório de ferramentas moleculares disponíveis na pesquisa de tardígrados. Este método complementa os métodos de extração de RNA existentes34,36, que forneceram técnicas para quantificação de tardígrados únicos de alterações transcricionais via RNA-seq após uma etapa de amplificação linear. O STST permite a quantificação de transcritos isolados de tardígrados únicos sem a necessidade de uma etapa de aumento de escala. Como a maioria das respostas dos tardígrados a condições extremas, como as desencadeadas pela dessecação, resultam em taxas de sobrevivência de ~ 75% a 80% em H. exemplaris, as amostras em massa contêm populações mistas de tardígrados, incluindo sobreviventes e não sobreviventes. Essa população mista tem o potencial de confundir a análise das alterações transcricionais que ocorrem durante a resposta e a recuperação de estresses extremos. Ao contornar a necessidade de preparação em massa, o STST e o método de RNA-seq tardígrado34,36 evitam os problemas de confusão inerentes a uma população mista e permitem que toda a faixa dinâmica de uma resposta seja quantificada. Prevemos que o STST possa ser usado não apenas para quantificar a gama de respostas transcricionais e avaliar a eficácia dos knockdowns de RNAi, mas também para ser usado em muitas outras aplicações no futuro.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Queremos agradecer a bolsa NIH Ruth Kirschstein # 5F32AG081056-02 e a bolsa de pós-doutorado Errett Fisher, que apoiou a Dra. Molly J. Kirk, a Crowe Family Fellowship, que apoiou Chaoming Xu, e uma bolsa do Senado Acadêmico da Universidade da Califórnia, Santa Bárbara, e bolsas do NIH #R01GM143771 e #2R01HD081266, que apoiaram esses esforços de pesquisa. Os autores também reconhecem o uso do Laboratório de Nanoestruturas Biológicas dentro do Instituto de NanoSistemas da Califórnia, apoiado pela Universidade da Califórnia, Santa Bárbara, e pela Universidade da Califórnia, Gabinete do Presidente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10 µ L Pontas de Barreira Premium de Baixa Ligação, Rack, EstérilGenesee Scientific23-401Referido como Pipeta P 10 Estéril com Ponta de Filtro  Dicas
1000 µ L  Pontas de Pipeta Premium, Baixa Ligação, Rack, EstérilGenesee Scientific23-165RSReferido como Pipeta P 1000 Estéril com Ponta de Filtro  Dicas
200 µ L  Pontas de Barreira Premium de Baixa Ligação, Rack, EstérilGenesee Scientific23-412Referido como Pipeta P 200 Estéril com Ponta de Filtro  Pinça
Ponta Média Forte 4 Estrelas RetaExcelta 00-SA-DCReferido como Long forceps
96-Well PCR Rack com Tampa Sortida, 5 Racks/UnidadeGenesee Scientific27-202AReferido como Rack de PCR
Andwin Scientific  FITA AUTOCLAVE SEM CHUMBO 3M 1"Thermo Fisher Scientific NC0802040referido como fita de autoclave 
Fita AutoclaveThermo Fisher ScientificAB1170Referido como Vedação de Placa PCR Benchling
v8BenchlingN/AReferido como Benchling 
Placa de PCR BioRadHard-Shell de 96 PoçosBioRad HSS9641referido como placa PCR 
Jaleco BULWARK FR: Grainger 26CF64Referido como Jaleco
C1000 Touch Bio-rad Thermocycler BioRad1851148referido como termociclador 
Termociclador C1000 Touch Bio-rad com Módulo Óptico CFX BioRad1845097referido como termociclador qPCR 
Chloroccoccum hypnosporum.   Carolina152091conhecida como Algae
Corning  Garrafas de armazenamento de mídia reutilizáveis PYREXThermo Fisher Scientific06-414-1EReferido como garrafa de vidro autoclave de 2 L
Daigger & Misturador de Laboratório Vortex-Genie 2 da CompanyThermo Fisher Scientific 3030Areferido como Vortexer 
Preparação Micro Direta-zolZymo Research R2060Referido como kit de extração de RNA 
Pinças de Biologia Dumont 5Ferramentas de Ciência Fina 11254-20referido como fórceps fino
EDTA Fisher ScientificS311-500 Referido como EDTA 
FIJI v 2.14.0/1.54f ImageJ,N/AReferido como filamento FIJI/ImageJ
para extrator de pipetas Tritech ResearchPC-10HReferido como Filamento
Fisherbrand Óculos de Impacto Econômico FisherScientific19-181-501Referido como Óculos de Proteção 
Micropipeta de Vidro O.D. 1mm ID 0.58, Comprimento 10 cmTriTech ResearchGD-1 Referido como micropipeta de vidro
Hypsibius exemplaris Z151 Cepa Carolina133960Referido como Tardígrados  ou H. exemplaris 
Nitrogênio Líquido Dewar 1 LAgar Scientific AGB7475Referido como recipiente seguro para crio 
Kit de Síntese de cDNA Maxima H Minus First Strand Thermo Fisher ScientificK1651Referido como Mistura Mestre de Síntese de cDNA 
Micropipeta de Vidro de Duplo Estágio Narishige Pesquisa Tritech  PC-10Referido como extrator de micropipetas 
Luvas de NitriloFisher Scientific17-000-314Referido como Luvas de Nitrilo 
PLACA DE PETRI, PS, 35/10 mm, COM ABERTURASGrenier627102Referido como placa de Petri de 35 mm 
PIPETMAN P10, 1– 10 µ L, Ejetor de MetalGilsonF144055Mreferido como Pipeta P 10
PIPETMAN P1000, 100– 1000 µ L, Ejetor de MetalGilsonF144059Mreferido como Pipeta P 1000
PIPETMAN P200, 20– 200 µ L, Ejetor de MetalGilson F144058Mreferido como P 200 Pipeta
Pound Esta Argila de Modelagem de 4 Cores Excedente da ciência americana  96517P001Referido como Clay 
Prisma v10.0 GraphPadN/Areferia-se a um prisma 
Livre de RNAse, 8 Tiras 0.2 mL Tubos de PCR com tampas InvitrogenAM12230referido como tubo de PCR estéril
RNasin Ribonuclease InhibitorPromega N2111Referido como inibidor de RNAse 
Água de nascenteNestle Pure Life44221229referido como água de nascente
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBIO RAD1725271referido como corante indicador Super mix 
Sistema de Microscópio Estéreo com óptica e iluminação TriTech ResearchSMT1referido como Microscópio de Dissecação
Supertek Scientific  Queimadores TirrillThermo Fisher ScientificS09572Breferido como Queimador de Bunsen 
Centrífuga de MesaQualitron  DW-41-115-NEWReferido como Centrífuga de Mesa 
Escudo Temp Luvas CryoFisher Scientific11-394-305Referido como Luvas Cryo 
Thermo Scientific  Placas de Petri NuncThermo Fisher Scientific08-757-099Referido como placa de Petri de 100 mm 
Base TrisFisher ScientificT395-500 Referido como Tris ou Tris Base 
Triton X-100Fluka 93443Referido como Detergente 1 
TWEEN 20Sigma aldrichP1379-500 Referido como Detergente 2
crescimentoPCPW-0500nuclease certificadas por PCR/RT-PCRcomo água livre de nuclease estéril
de Extrator de Água - Células de sem referidas

Referências

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