Artigo de método

Técnica para administração intranasal de agregados de α-sinucleína

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DOI:

10.3791/66943

⸱

8 de novembro de 2024

 , 
1Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Kyoto University

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve um método para administração intranasal de agregados de α-sinucleína. Este método fornece informações sobre a propagação da α-sinucleína da mucosa olfatória para o bulbo olfatório na doença de Parkinson.

Resumo

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo caracterizado pela presença de corpos de Lewy, que são agregados de α-sinucleína (α-Syn). Recentemente, foi proposto que a doença se desenvolvesse e progredisse através da propagação semelhante a príons de agregados de α-Syn a partir do bulbo olfatório (OB) ou núcleo dorsal do nervo vago. Embora a origem dos agregados de α-Syn no OB permaneça obscura, sua propagação a partir da mucosa olfatória foi recentemente sugerida. Mostramos anteriormente que a administração intranasal de agregados de α-Syn em um modelo de camundongo induziu a patologia α-Syn no BO de camundongos. Neste estudo, apresentamos um método de administração intranasal de agregados de α-Syn que induziu a patologia α-Syn no BO de camundongos. A administração intranasal de agregados de α-Syn é um método muito simples e direto, e acreditamos que será uma ferramenta útil na pesquisa para elucidar a origem da patologia α-Syn no BO e a via de propagação do α-Syn através do sistema olfatório.

Introdução

A doença de Parkinson (DP), caracterizada por sintomas motores como bradicinesia, tremores em repouso e rigidez muscular, é o segundo distúrbio neurodegenerativo maiscomum1. A DP também apresenta sintomas não motores, incluindo disfunção olfatória, comprometimento cognitivo, depressão, alucinações, constipação e hipotensão ortostática. Suas características patológicas são a morte celular dopaminérgica na substância negra e a presença de agregados de α-sinucleína (α-Syn), denominados corpos de Lewy2.

É importante notar que o α-Syn é uma proteína de 140 aminoácidos que existe na forma de um monômero solúvel (ou tetrâmero) em condições normais. No entanto, em condições anormais, o monômero solúvel é convertido em agregados insolúveis de alto peso molecular, incluindo oligômeros e fibrilas. A transição de α-Syn em oligômeros e fibrilas está supostamente envolvida na toxicidade celular3.

Estudos recentes sugeriram a propagação semelhante a príons de agregados α-Syn entre os neurônios. Com base em vários exames post-mortem, Braak et al. propuseram em 2003 a hipótese de que a patologia dos corpos de Lewy se espalha progressivamente no cérebro de maneira um tanto estereotipada (hipótese de Braak)4,5. Em 2008, o exame post-mortem de pacientes com DP que receberam transplantes de mesencéfalo fetal revelou corpos de Lewy em neurônios dopaminérgicos derivados de tecidos fetais 6,7. Esses estudos sugeriram que os agregados de α-Syn poderiam se espalhar do cérebro doente para os enxertos, apoiando a hipótese de Braak.

Após essas observações, experimentos envolvendo culturas neuronais primárias e injeção intracerebral de agregados de α-Syn em camundongos reproduziram a disseminação de agregados semelhantes a corpos de Lewy, fornecendo mais evidências para a propagação de α-Syn de maneira semelhante a príons 8,9.

Braak et al. mostraram que a patologia dos corpos de Lewy na DP inicia-se no bulbo olfatório (BO) e/ou no núcleo dorsal do nervo vago (dmX)4. Com base na hipótese de Braak, vários estudos relataram a administração de agregados de α-Syn ou extratos de corpos de Lewy de cérebros com DP no trato gastrointestinal e gastrointestinal de animais experimentais 10,11,12. Em 2018, um estudo demonstrou que a administração de agregados de α-Syn no BO de camundongos selvagens induziu a propagação da patologia α-Syn ao longo da via olfatória, resultando em disfunção olfatória13. Anteriormente, inoculamos agregados de α-Syn no OB de camundongos transgênicos α-Syn e descobrimos que isso levou à atrofia do hipocampo e comprometimento da memória14.

Em 2022, inoculamos agregados de α-Syn no OB de saguis, um pequeno primata não humano; isso resultou na propagação da patologia α-Syn ao longo da via olfatória, atrofia do OB e hipometabolismo cerebral generalizadoda glicose 10.

No entanto, se a propagação de agregados α-Syn ocorre a partir do OB, surge uma questão crítica: por qual mecanismo os agregados α-Syn aparecem inicialmente? Saito et al. relataram anteriormente a presença de corpos de Lewy na mucosa nasal15. A presença de agregados de α-Syn foi detectada na mucosa nasal de pacientes com DP e atrofia de múltiplos sistemas (AMS) por meio de análise de conversão induzida por tremor em tempo real (RT-QUIC)16. Notavelmente, a análise de amostras de mucosa nasal de pacientes com distúrbio comportamental do sono de movimento rápido dos olhos (RBD), que é considerado um estágio prodrômico da DP, revelou um aumento nos níveis de α-Syn17. Este estudo sugeriu que a patologia α-Syn pode existir na mucosa nasal mesmo na fase prodrômica da DP.

Embora esses achados sugiram uma rota potencial da mucosa nasal para o BO, há evidências experimentais limitadas que apoiam esse cenário. Para resolver essa lacuna, administramos agregados de α-Syn na cavidade nasal de camundongos e investigamos a propagação da patologia α-Syn da mucosa nasal para o OB. Nossa abordagem experimental demonstrou que uma administração intranasal de dose única de agregados de α-Syn em camundongos do tipo selvagem induziu a patologia α-Syn no BO, fornecendo evidências experimentais para a via de propagação da mucosa nasal para o OB.

Protocolo

Camundongos machos C57BL/6J de 2 meses de idade foram utilizados para este estudo. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais. O Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Kyoto concedeu aprovação ética e permissão para este estudo (MedKyo 23.544).

1. Administração intranasal de fibrilas pré-formadas α-Syn

  1. Prepare a solução de fibrilas α-Syn de camundongo em PBS (4 mg / mL) de acordo com os métodos relatados anteriormente11. Enrole o tubo com um filme transparente para evitar contaminação.
  2. Sonicar 200 μL de solução de fibrilas α-Syn para gerar fibrilas pré-formadas α-Syn (PFFs) usando um sonicador do tipo banho-maria (Tabela de Materiais). Encha o banho ultrassônico com água e adicione cubos de gelo para esfriar até 4 °C para sonicação. Sonicar fibrilas por um total de 5 min com cada ciclo consistindo em 30 s de sonicação seguidos por um intervalo de 30 s (um total de cinco ciclos).
    NOTA: Use equipamentos de proteção individual, como luvas descartáveis, máscara e óculos de segurança, para evitar a exposição do α-Syn.
  3. Prepare uma pipeta P10 (Tabela de Materiais) com uma ponta de pipeta de 10 μL. Anestesiar cada camundongo usando uma combinação de cloridrato de medetomidina, midazolam e butorfanol (MMB) por injeção intraperitoneal (ip). O agente anestésico combinado MMB continha midazolam (0,3 mg/kg), medetomidina (4 mg/kg) e tartarato de butorfanol (5 mg/kg). Use 0,005 mL / g por injeção i.p. ao misturar midazolam (1 mg / mL) 0,3 mL, medetomidina (5 mg / mL) 0,8 mL, tartarato de butorfanol (5 mg / mL) 1 mL e solução salina 2,9 mL.
  4. Aguarde 10 minutos para garantir que os ratos estejam completamente anestesiados. A anestesia adequada pode ser confirmada se o camundongo estiver em decúbito lateral e não puder se endireitar. Uma vez anestesiado, aplique pomada oftálmica usando um aplicador de algodão estéril para evitar o ressecamento dos olhos.
    NOTA: Sem anestesia, ao administrar doses nasais, é difícil manter os camundongos em decúbito dorsal e administrar a solução de α-Syn adequadamente enquanto os camundongos espirram. Por essas razões, a sedação foi necessária.
  5. Coloque o mouse anestesiado em decúbito dorsal. Coloque uma toalha de papel ou material similar sob o corpo, garantindo uma leve inclinação da cabeça para baixo (Figura 1A, B). Esse posicionamento evita que a solução de α-Syn administrada flua rapidamente para os pulmões ou esôfago, facilitando sua retenção na cavidade nasal. As narinas são vistas na Figura 1C.
  6. Retire 1 μL de solução de α-Syn (4 mg / mL) em uma pipeta P10 e coloque a ponta da pipeta perto do nariz do camundongo. Forme lentamente uma gota redonda e mantenha-a no final da ponta da pipeta (Figura 1D, seta vermelha). A administração intranasal é realizada para a narina unilateral, use o lado contralateral como lado controle.
  7. Aproxime a gota de um lado das narinas do rato e permita que o rato a inale naturalmente. Observe a inalação e aguarde 30 s a 1 min (Figura 1E).
  8. Repita as etapas 1.6.-1.7. até que seja administrado um volume total de 20 μL de solução de α-Syn. Após todos os procedimentos, descarte as luvas e limpe uma bancada com detergentes comerciais se a superfície estiver contaminada com α-Syn
    NOTA: Todo o procedimento deve ser realizado em um gabinete de segurança para evitar a inalação de fibrilas α-Syn pelo pessoal que realiza o procedimento. Um relatório anterior mostrou que o volume de 25 μL é o mais eficiente para a administração de drogas nariz-cérebro18. Usamos um volume semelhante de 20 μL no presente estudo. Também usamos a mesma concentração de PFFs que a injeção no OB no relatório anterior10, que é próxima aos 400 μM (5,6 mg / mL) dos PFFs19.
  9. Administre atipamezol (3 mg/kg; Tabela de Materiais) por injeção intravenosa para reverter a medetomidina e facilitar a recuperação. Use 0,005 mL / g por injeção i.p. ao misturar atipamezol (5 mg / mL) 0,6 mL e solução salina 4,4 mL.
    NOTA: Forneça analgesia porque não é totalmente compreendido o quão estressante seria a administração intranasal de α-Syn.
  10. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Após a recuperação completa, retorne o mouse para a gaiola.

2. Preparação da amostra

  1. Sacrifique os camundongos tratados em 1, 3, 6 e 12 meses após a administração intranasal de fibrilas pré-formadas α-Syn.
    1. Coloque os camundongos na caixa de indução, administre sevoflurano (>6,5%) e continue até que ocorra a parada respiratória por > 60 s. Remova os camundongos e realize uma exsanguinação rápida por incisão no átrio direito para garantir a eutanásia.
  2. Insira uma agulha 25G (Tabela de Materiais) no ápice do coração. Perfunda o camundongo a 4 mL / min com 15 mL de PBS e, em seguida, 15 mL de PFA a 4% em PBS.
  3. Corte a cabeça com uma tesoura e faça uma incisão de 2 cm no couro cabeludo com um bisturi. Incisar o osso craniano com uma tesoura na parte lateral, da parte inferior até o nariz (Figura 2A, B). Para obter as OBs, remova completamente o osso craniano nas OBs (Figura 2B, círculo amarelo).
  4. Vire a cabeça, corte os nervos cerebrais e, em seguida, remova o cérebro cuidadosamente com uma pinça (Figura 2C, D). Obtenha o cérebro com OBs intactos (Figura 2E). Para obter as OBs intactas, corte cuidadosamente os nervos olfatórios com uma pinça enquanto as OBs se ligam ao osso do crânio (Figura 2D, círculo amarelo).
  5. Coloque as amostras de cérebro no PFA a 4% em PBS durante a noite a 4 ° C. Não deixe as amostras cerebrais por mais de 24 horas.
    NOTA: A fixação excessiva diminuirá a coloração imuno-histoquímica. Se for necessário armazenamento de longo prazo, preserve amostras de cérebro em etanol 70% ou PBS contendo 0,1% de azida sódica para manter a esterilidade.

3. Coloração imuno-histoquímica do OB

  1. Parafinizar as amostras usando um processador automático de tecidos (Tabela de Materiais) conforme descrito abaixo.
    1. Mergulhe em etanol 70% por 120 min, seguido de imersão em etanol 100% por 8x por 60 min. Em seguida, mergulhe em xileno 100% por 3x por 120 min.
    2. Mergulhar em parafina a 60 °C durante 120 min, seguido de imersão em parafina a 60 °C durante 240 min.
  2. Incorpore as amostras em parafina conforme descrito abaixo.
    1. Incorporar as amostras em parafina a 60 °C com um centro modular de inclusão de tecido (Tabela de Materiais). Resfrie-os no gelo.
  3. Corte as amostras em seções de 8 μm de espessura com um micrótomo (Tabela de Materiais) 18 .
  4. Execute a desparafinização conforme descrito abaixo.
    1. Mergulhe em xileno 100% por 2x por 5 min, seguido de imersão em etanol 100% por 2x por 3 min.
    2. Mergulhe em etanol 70% por 3 min. Lave em PBS por 3 min.
  5. Realize a recuperação do antígeno conforme descrito abaixo.
    1. Mergulhe em ácido fórmico 100% por 15 min. Enxágüe em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 2 min.
    2. Autoclave a 120 °C por 10 min. Deixe esfriar naturalmente.
  6. Mergulhe em peróxido de hidrogênio a 1% em metanol por 10 min. Lave em PBS por 5 min.
  7. Adicione 500 μL de leite desnatado a 5% em PBS nas lâminas e incube-as por 30 min em temperatura ambiente.
  8. Colocar os 500 μL de anticorpo α-Syn antifosforilado (p-α-Syn, 1/10000) em PBS nas lâminas e incubá-los durante a noite a 4 °C. Lave 2x com PBS por 5 min cada.
  9. Incubar com polímero universal de imunoperoxidase, anti-Rabbit (Tabela de Materiais) por 1 h a 25 °C. Lave 2x com PBS por 5 min cada.
  10. Desenvolver utilizando o kit de coloração 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Tabela de Materiais) durante 5 min de acordo com as instruções do fabricante.
  11. Mergulhe em solução de hematoxilina por 1 min (Tabela de Materiais). Descolorir em água corrente por 10 min.
  12. Execute a montagem conforme descrito abaixo.
    1. Mergulhe em etanol 70% por 5 min. Mergulhe em etanol 100% por 2x por 5 min.
    2. Mergulhe em xileno 100% por 2x por 5 min. Monte usando um meio de incorporação (Tabela de Materiais). Aplique os 100 μL de um meio de incorporação nas lâminas e cubra com uma lamínula de vidro.
  13. Adquira imagens usando um microscópio All-in-One com ampliação de 20x e 40x (Tabela de Materiais).

Resultados

A Figura 3 mostra vários exemplos de agregados α-Syn no OB. No presente estudo, administramos agregados de α-Syn na narina unilateral. As duas cavidades nasais são separadas pelo septo nasal, e cada OB projeta os neurônios sensoriais olfativos para cada cavidade nasal separadamente. Portanto, o OB no lado contralateral pode ser usado como controle.

A patologia P-α-Syn não foi observada no BO no lado tratado após 1 e 3 meses (Figura 3A, B). Agregados de p-α-Syn semelhantes a neuritos de Lewy foram observados nos glomérulos do lado tratado após 6 e 12 meses. (Figura 3C, D, F, G). Esses agregados não foram observados no OB do lado controle (Figura 3E).

Podemos estimar a patologia α-Syn contando agregados de α-Syn ou examinando o tamanho, etc., usando ImageJ (Tabela de Materiais). Por exemplo, contamos e relatamos anteriormente o número de agregados α-Syn neste modelo20. No OB do lado tratado, os agregados semelhantes a neuritos de Lewy no OB aumentaram significativamente ao longo de 12 meses (ANOVA unidirecional, seguida pelo teste de Dunnett, p < 0,01; Figura 3H). No OB do lado do controle, existem poucos agregados α-Syn.

Um estudo anterior mostrou que os PFFs injetados no cérebro de camundongos foram degradados em uma semana, e o α-Syn endógeno de camundongos foi convertido em agregados de α-Syn19. No presente estudo, o aumento da patologia α-Syn ao longo do tempo indica que a α-Syn endógena de camundongo foi convertida em agregados de α-Syn pela administração intranasal de dose única de PFFs. Esses resultados indicaram que a patologia α-Syn pode se espalhar da mucosa olfatória para a OB.

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Figura 1: Método de administração da cavidade nasal do camundongo. (A) O camundongo é posicionado em decúbito dorsal com a cabeça ligeiramente inclinada para baixo. (B) As narinas do camundongo são indicadas por pontas de setas amarelas. (C, D) A solução de fibrila α-Syn é colocada na narina do camundongo (C, seta vermelha) e rapidamente inalada (D, setas vermelhas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Esboço das etapas para obter os bulbos olfatórios intactos. (A) Usando uma tesoura, faça uma incisão no osso craniano sagital e lateralmente (linha tracejada amarela). (B) Remova completamente o osso craniano dos bulbos olfatórios (OBs). (C) Vire a cabeça e remova cuidadosamente o cérebro. Corte os nervos do cérebro. (D) Corte os nervos olfatórios ligados ao osso craniano. (E) Todo o cérebro com os OBs intactos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Agregados de P-α-Syn nos glomérulos do bulbo olfatório. (A-G) Imuno-histoquímica de P-α-Syn (EP1536Y) do OB no lado tratado 1, 3, 6 e 12 meses (1 m, 3 m, 6 m e 12 m, respectivamente) após a administração intranasal e (E) no lado controle 12 meses após a administração intranasal. (C, D) Agregados de α-Syn semelhantes a neuritos de Lewy aparecem ao redor dos glomérulos. (F, G) Imagens ampliadas são imagens de alta ampliação de p-α-Syn semelhantes a neurite de Lewy 6 e 12 meses após a administração intranasal. (H) A quantidade de deposição de p-α-Syn semelhante a neurite de Lewy no OB nos lados tratado e controle (n = 4-5). Os gráficos mostram a média ± EPM. ANOVA de uma via seguida do teste de Dunnett; **<0,01. Este número foi modificado de um relatório anterior20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Em estudo anterior, a administração de agregados de α-Syn na cavidade nasal de macacos induziu a morte de células dopaminérgicas e a deposição de ferro na substância negra, embora não tenham sido observados agregados de α-Syn21. A administração diária de agregados de α-Syn humano A53T na cavidade nasal de camundongos transgênicos α-Syn promotores de príons (camundongos M83) por 28 dias induziu patologia α-Syn no cérebro e sintomas motores em camundongos19,22. No presente estudo, demonstramos que a administração de uma dose única de agregados de α-Syn na cavidade nasal de camundongos selvagens induziu a patologia α-Syn no OB. Este método simples pode ser considerado valioso para investigar a propagação de α-Syn da mucosa nasal para o BO.

A sonicação suficiente das fibrilas α-Syn neste método é crucial porque relatórios anteriores mostraram que o pequeno tamanho dos agregados fragmentados de α-Syn é o mais eficiente para desencadear a patologia α-Syn 23,24. A sonicação insuficiente das fibrilas α-Syn resultará em pouca propagação para o GO. Como diferentes sonicadores têm poder de sonicação variável, a otimização desse processo é necessária. A postura supina do camundongo quando a solução de α-Syn é administrada nas narinas do camundongo também é crucial. Se a cabeça do camundongo estiver elevada, a solução de α-Syn fluirá para os pulmões e o esôfago. A postura inadequada pode causar morte inesperada ou propagação insuficiente de α-Syn.

No presente estudo, i.p. utilizou um agente anestésico combinado MMB para anestesia. A anestesia combinada MMB foi relatada como proporcionando boa sedação e analgesia, e seu efeito pode ser rapidamente revertido pelo atipamezol23. Como a anestesia inalatória requer a cobertura das narinas com uma máscara para manter a anestesia, é mais difícil administrar a solução de α-Syn por via intranasal. Além disso, o modelo de rotenona tem sido amplamente estudado e é um modelo muito útil25. No entanto, é um modelo induzido por drogas e pode ter mecanismos patológicos diferentes da doença de Parkinson idiopática (DPi)25. Como esse modelo induziu a propagação de α-Syn, acreditamos que ele esteja mais próximo do iPD.

Nosso estudo também sugeriu que agregados exógenos de α-Syn poderiam ser transmitidos através da mucosa nasal. Portanto, quando os pesquisadores estão conduzindo experimentos usando agregados de α-Syn, devem ser tomadas precauções para evitar a inalação de agregados de α-Syn. Por exemplo, aerossóis de α-Syn podem ser gerados durante a etapa de sonicação. Recomendamos o uso de um sonicador do tipo selado ou sonicação dentro de um gabinete de segurança. Além disso, os camundongos podem espirrar, potencialmente gerando aerossóis α-Syn. Para mitigar esse risco, todas as operações devem ser realizadas dentro de um gabinete de segurança. Além disso, os pesquisadores devem usar equipamentos de proteção individual, como luvas descartáveis, máscaras e óculos de segurança, para evitar a exposição ao α-Syn. Após todos os procedimentos, os pesquisadores precisam limpar uma bancada com detergentes comerciais se a superfície estiver contaminada com α-Syn. Relatórios anteriores mostraram que tanto os detergentes comerciais quanto o SDS destacaram agregados de superfícies contaminadas26,27.

Neste estudo, os cortes de parafina foram usados para avaliar a patologia α-Syn no GO, pois a pequena estrutura do BO é melhor preservada em cortes de parafina em comparação com os cortes congelados. Este estudo mostrou que a patologia α-Syn foi induzida no GO; no entanto, a patologia α-Syn observada foi leve e limitada e foi representada principalmente por agregados semelhantes a fios conhecidos como neuritos de Lewy nos glomérulos.

Deve-se notar que mudanças comportamentais aparentes em camundongos experimentais não foram observadas no presente estudo. A patologia α-Syn induzida por este método pode ser insuficiente para induzir alterações no fenótipo de comportamento. Mais investigações são necessárias para elucidar as condições específicas que levam a patologias graves e alterações comportamentais. No futuro, se pudéssemos estabelecer uma maneira mais eficiente de propagação da mucosa nasal para a OB, esse método simples fornece uma maneira alternativa de avaliar a propagação de α-Syn sem técnica cirúrgica.

Além disso, usamos o OB no lado contralateral nos camundongos tratados como controle. No entanto, a propagação retrógrada do núcleo olfatório anterior ou córtex piriforme para o OB contralateral pode ocorrer em um acompanhamento de longo prazo. Nesse caso, camundongos não tratados foram usados como controle.

Embora este método simples forneça informações valiosas sobre a propagação do α-Syn da mucosa nasal para o GO, mais estudos são necessários para entender de forma abrangente os mecanismos subjacentes à DP.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Todos os experimentos foram apoiados por Rie Hikawa. Agradecemos a Yasuko Matsuzawa pela papelada. Este estudo foi apoiado por JSPS KAKENHI (MS, No. JP19K23779, JP20K16493 e JP20H00663).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio de fluorescência tudo-em-um BZ-X710KEYENCEN/AMicroscópio tudo-em-um
Ampicilina Sal de sódioNacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006ASonicbio Sonicador tipo banho-maria.
Tartarato de butorfanolMeiji Seika PharmaWAK-52850
Tubo de celuloseMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPShaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255Célula competente
EntellanSigma-Aldrich107961Meio de montagem rápida para microscopia
Fórceps Graefe Extra Fino Curvo SerrilhadoFST11152-10 fórceps
Tesoura Fina EndurecidaFST14090-09
tesoura Histofine Camundongo de coloração simples MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341Polímero Universal de Imunoperoxidase, anti-Coelho
ImageJ ver 1.52pNANAhttps://imagej.net/
innova4200New Brunswick scientific9105085Incubadora agitador
Isopropil-β- D-tiogalactopiranosídeoNacalai tesque19742-94
LB caldo, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108Centro Modular de Incorporação de Tecidos
Leica TP 1020Leica14 0422 85108Processador Automático de Tecidos 
Micrótomo giratório do micrótomo do microm HM325
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
Tipo novo da hematoxilina Tipo GMuto65-9197-38
Agulha alada normal da solução da hematoxilina para o tipo da veia D, agulha de 25GTERUMONN2332R25G
Optima TLX UltracentrifugeBeckman Couler8043-30-1197Ultracentrifuge
P10 pipetaGilsonFA10002P
ParafinaLeica39601095
paraformaldeídoNacalai tesque30525-89-4
Peroxidase Stain DAB KitNacalai tesque25985-50
Pirece BCA Kits de Ensaio de ProteínaThermo Scientific23225BCA assay
pRK172Addgene#134504Plasmídeo
Q-Sepharose Fast Flow. cytiva17051001resina de troca iônica
do filme 135-17473 de Medetomidine Fuji Thermo científico 902100

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