Medições de Microscopia de Força Atômica de Cartilagem em Membros de Axolote Intactos e em Regeneração

Resumo

Neste protocolo, mostramos como preparar tecido de axolote para microscopia de força atômica (AFM) e realizar medições de indentação na cartilagem intacta e em regeneração.

Resumo

As forças mecânicas fornecem sinais importantes para a função celular normal e a formação de padrões nos tecidos em desenvolvimento, e seu papel tem sido amplamente estudado durante a embriogênese e patogênese. Comparativamente, pouco se sabe sobre esses sinais durante a regeneração animal.

O axolote é um importante organismo modelo para o estudo da regeneração, dada a sua capacidade de restaurar totalmente muitos órgãos e tecidos após a lesão, incluindo cartilagem e osso ausentes. Devido ao seu papel crucial como o principal tecido de suporte no corpo dos vertebrados, recuperar a função esquelética durante a regeneração requer tanto a restauração das estruturas ausentes quanto suas propriedades mecânicas. Este protocolo descreve um método para processar amostras de membros de axolotes para microscopia de força atômica (AFM), que é o padrão-ouro para sondar propriedades mecânicas de células e tecidos em alta resolução espacial.

Aproveitando as capacidades regenerativas do axolote, este estudo mediu a rigidez da cartilagem do membro durante a homeostase e dois estágios de regeneração do membro: histólise tecidual e condensação da cartilagem. Mostramos que o AFM é uma ferramenta valiosa para obter insights sobre a reestruturação dinâmica do tecido e as mudanças mecânicas que ocorrem durante a regeneração.

Introdução

O esqueleto, especialmente cartilagem e ossos, fornece o principal suporte mecânico para os tecidos moles do corpo em vertebrados. Portanto, qualquer dano no sistema esquelético provavelmente comprometerá muito a funcionalidade e até mesmo a sobrevivência. Em humanos, as fraturas ósseas são uma das lesões traumáticas mais comuns¹, a maioria das quais se repara em questão de semanas, mas 5% a 10% delas terão atrasos na cicatrização ou nunca se recuperarão totalmente ^2,3. Além disso, os seres humanos não são capazes de se recuperar de extensa perda óssea ou cartilaginosa ^4,5. Algumas salamandras, no entanto, podem regenerar uma variedade de estruturas corporais, incluindo membros completos⁶, tornando-as um modelo ideal para o estudo da regeneração esquelética.

O axolote (Ambystoma mexicanum) é um tipo de salamandra onde a regeneração de membros tem sido extensivamente estudada. Este processo ocorre em quatro fases sequenciais principais, mas sobrepostas: 1) cicatrização de feridas, 2) inflamação / histolise, 3) formação de blastema e 4) crescimento / diferenciação de blastema (revisado em ^7,8). Após a amputação, os queratinócitos que margeiam o local da lesão migram rapidamente, fechando a ferida e formando o epitélio da ferida (WE). Durante a inflamação e a histólise que se seguiram, os patógenos são eliminados, os detritos e as células danificadas são eliminados e a matriz extracelular (MEC) sob a superfície da amputação é remodelada⁹. A histólise tecidual é essencial para que ocorra a regeneração do membro¹⁰, onde a secreção de enzimas proteolíticas é crucial não apenas para o remodelamento geral da MEC, mas também para liberar as células que dão origem ao blastema e liberar moléculas bioativas sequestradas na própria MEC⁸. De fato, estudos em muitos contextos regenerativos e organismos modelo mostraram que as propriedades únicas do material da ECM durante a histólise são capazes de induzir processos de desdiferenciação ou direcionar a migração de células para o local da lesão (revisado em¹¹). Além disso, a reabsorção do tecido calcificado durante os estágios tardios da histólise tem se mostrado fundamental para a integração adequada dos elementos esqueléticos dos membros^{recém-formados12}. Após o estágio de histólise, o blastema é formado sob o epitélio da ferida (WE) como um acúmulo de progenitores indiferenciados e multi-linhagem resultantes de células de tecido maduro desdiferenciadas ou células-tronco residentes. As células de blastema proliferam e se diferenciam em todos os tipos de células ausentes. Finalmente, ocorre a morfogênese do membro, onde o tecido esquelético é regenerado através da condensação de condroprogenitores derivados de células periskeletais e fibroblastos dérmicos transdiferenciados 13,14,15.

Embora muitas das pistas bioquímicas que regulam as mudanças na identidade celular e na composição da MEC tenham sido identificadas 10,13,14,16,17,18, as propriedades mecânicas dos tecidos durante as diferentes fases da regeneração dos membros, bem como sua influência na regeneração, permaneceram amplamente inexploradas. Muitos estudos mostraram que as células sentem e integram pistas mecânicas que regulam seu destino e comportamento em vários contextos (revisado em^19,20). Portanto, complementar nosso conhecimento celular e molecular da regeneração de membros com medições mecânicas de tecidos melhorará muito nossa compreensão desses processos.

Diferentes técnicas têm sido desenvolvidas que permitem a caracterização mecânica e a manipulação da força de amostras biológicas²¹. Dentre essas técnicas, a microscopia de força atômica (AFM) tornou-se o padrão-ouro em mecanobiologia, na qual as propriedades viscoelásticas de amostras biológicas são sondadas em alta resolução espacial por recuo com um sensor de força ultrassensível, o cantilever^{AFM 22}. Como essa técnica requer contato direto com a amostra, normalmente são geradas fatias de tecido, o que pode ser desafiador em alguns casos. Assim, as condições de preparo precisam ser adaptadas e otimizadas para cada amostra em particular, para que ela possa permanecer o mais próximo possível das condições fisiológicas e artefatos mínimos sejam gerados²³. Este protocolo descreve como medir a rigidez tecidual em membros de axolotes usando AFM, com foco em tecidos cartilaginosos em condições intactas, durante a histólise e nos estágios de condensação da cartilagem (Figura 1 e Figura 2). Este método também pode ser expandido para a medição de outros tipos de tecidos.

Protocolo

Os axolotes (Ambystoma mexicanum) foram cultivados nas instalações de axolotes do Centro de Terapias Regenerativas de Dresden (CRTD) da Universidade de Tecnologia de Dresden (TUD). Uma descrição completa das condições de criação pode ser encontrada em²⁴. Resumidamente, os quartos foram mantidos a 20-22 °C com um ciclo dia/noite de 12/12 h. Todos os procedimentos cirúrgicos e de manipulação foram realizados de acordo com as diretrizes do comitê de ética local e foram aprovados pela Landesdirektion Sachsen, Alemanha.

Este estudo usou axolotes brancos (d / d) para todos os experimentos, uma cepa mutante natural sem pigmentação corporal (poucos ou nenhum melanóforo e xantóforo), com iridóforos apenas na íris dos olhos. Este estudo utilizou axolotes medindo 8-15 cm do focinho à cauda (5-7 meses de idade) sem viés específico do sexo.

1. Preparação

1. Prepare uma solução estoque de benzocaína a 10% (p / v) que será usada para anestesia e eutanásia dos axolotes (veja abaixo). Para isso, misture em uma garrafa volumétrica 50 g de benzocaína com etanol 100% até atingir o limite de 500 mL.
2. Prepare uma solução estoque de benzocaína a 0,03% (p / v).
   1. Para 1 L, misture 50 mL de solução salina 10x Tris-tamponada (TBS) com 30 mL de benzocaína a 10% (p/v) e 5 mL de soluções de Holtfreter a 4000% (p/v) com 915 mL de água destilada e misture durante a noite com uma barra de agitação magnética.
   2. Para 1 L de solução 10x TBS, misture 24,2 g de base Trizma e 90 g de NaCl com 990 mL de água deionizada. Misture bem com uma barra de agitação magnética. Em seguida, adicione aproximadamente 10 mL de HCl concentrado (12 M ou 37%) e ajuste para pH 8.
   3. Para 1 L de solução de Holtfreter a 4000% (p/v), misturar 158,4 g de NaCl, 11,13 g de MgSO₄·7H₂O, 5,36 g de CaCl₂·2H₂O e 2,88 g de KCl com água deionizada até 1 L.
3. Prepare uma diluição de benzocaína a 0,01% (p / v) na água do tanque de retenção para anestesia, diluindo a solução estoque a 0,03% (p / v) 1: 3.
   1. Para 1 L de solução, use 333 mL da solução estoque de benzocaína mais 666 mL de água do tanque de retenção.
4. Prepare uma solução estoque de tartarato de butorfanol 5 mg / mL para analgesia. Para isso, misture 100 mg de sal de butorfanol (+)-tartarato com 20 mL de água ultrapura. Conservar as alíquotas a 4 °C.
5. No dia das amputações, prepare a solução de trabalho de tartarato de butorfanol 0,5 mg/L para diminuir a dor do animal após procedimentos cirúrgicos, diluindo a solução estoque 1:10.000 na água do tanque de retenção.
   1. Para animais com menos de 8 cm de comprimento, misture 20 μL de solução de reserva em 200 mL de água do tanque de retenção.
   2. Para animais maiores, misture 60 μL de solução estoque em 600 mL de água do tanque de retenção.
6. Prepare solução salina estéril tamponada com fosfato anfíbio (APBS), uma solução de PBS a 80% (v/v) e mantenha-a em temperatura ambiente (RT) misturando 800 mL de DPBS com 200 mL de água deionizada.
7. Prepare 1 mg/ml de solução-mãe de insulina. Para isso, misture 250 mg de insulina em pó com 25 mL de HCl 0,1 M e agite lentamente até dissolver. Enquanto agita, adicione 225 mL de APBS até que a solução esteja límpida. Filtro estéril e armazenar alíquotas de 4 ml a -20 °C.
8. Prepare o meio de cultura estéril (todas as % (v / v): 62,5% L15 meio, 10% FBS inativado pelo calor, 1% Penicilina / Estreptomicina, 1% Insulina, 1% L-Glutamina) e mantenha a 4 ° C até o dia do uso. No dia experimental, equilibrar-se ao RT antes da utilização.
   1. Para 400 mL de meio de cultura, use 250 mL de meio L15, 40 mL de FBS inativado por calor, 4 mL de penicilina/estreptomicina, 4 mL de solução de insulina (da Etapa 1.7), 4 mL de L-glutamina e 98 mL de água estéril deionizada. Prepare em condições estéreis e um filtro estéril após misturar todos os componentes. Prepare alíquotas de 15 mL.
9. Preparar 2,5% e 3% (p/v) de baixo ponto de fusão (lmp)-agarose em solução APBS e aquecer a 70 °C para dissolver completamente a agarose. Preparar alíquotas em tubos de 1,5 ml e conservar a 4 °C até ao dia da utilização.
   1. Para 20 ml de lmp-agarose a 2,5% (p/v), misturar 0,5 g de lmp-agarose com 20 ml de APBS num tubo de 50 ml e aquecer em banho-maria a 70 °C até à agave A solução tem de se tornar clara e transparente. Prepare alíquotas ainda quentes.
   2. Para 20 mL de lmp-agarose a 3% (p / v), misture 0,6 g de lmp-agarose com 20 mL de APBS e proceda como acima.
   3. (Opcional): Para 20 mL de lmp-agarose a 1% (p / v), misture 0,2 g de lmp-agarose com 20 mL de APBS e proceda como acima.
      NOTA: O tempo de fusão depende da concentração da lmp-agarose e pode variar aproximadamente de 15 a 40 min.
10. Para amputação e montagem de tecido, use um estereoscópio de campo claro.
11. Monte placas de Petri de plástico de 100 mm de diâmetro, pinças, bisturi e tesouras cirúrgicas para amputações e coleta de tecidos.
12. Preparar placas de Petri de plástico de 35 mm de diâmetro para as medições de indentação.
13. Prepare cilindros de ~ 1 cm de comprimento de ~ 1 cm de diâmetro. Para isso, aqueça um cortador de papelão sob uma chama de bico de Bunsen e corte um tubo de 15 mL com a lâmina aquecida.
14. Corte pequenos 1 cm² quadrados de parafilme e guarde.
15. Prepare um bloco metálico ou frio a -20 °C, deixando-o no freezer por pelo menos 1 h.
16. Prepare pipetas de plástico Pasteur.
17. (Opcional): Prepare a solução de MEMFa fixador (ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico [MOPS] 0,1 M pH 7,4, Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetracético [EGTA] 2 mM, MgSO₄·7H₂O 1 mM, 3,7% formaldeído). Para isso, adicione 10,465 g de MOPS, 0,123 g de MgSO₄·7H₂O, 2 mL de 0,5 M EDTA pH 8,0 e adicione água até 45 mL. Adicione 5 mL de formaldeído a 37% (p / v) a um volume total de 50 mL.

2. Reagentes

1. Consulte a Tabela de Materiais para os reagentes usados para este trabalho, mas outros fornecedores comerciais também podem ser usados.

3. Amputação de axolotes e regeneração de membros

1. Antes de todos os procedimentos experimentais, anestesiar o animal em benzocaína a 0,01% (p/v) diluída em água do tanque de retenção (etapa 1.3) por 20 min, certificando-se de que os animais estejam profundamente anestesiados e sem resposta a estímulos táteis.
2. Remova o axolote da anestesia e coloque-o em cima de uma placa de Petri de 100 mm contendo um lenço de papel umedecido com água contendo anestesia. Oriente o membro perpendicularmente ao eixo do corpo e coloque a placa sob o estereoscópio para melhor visualização.
   NOTA: Um estereoscópio com uma lâmpada compacta de pescoço de ganso foi usado aqui.
3. Amputar o membro com bisturi estéril afiado imediatamente distal à área calcificada da região zeugopodial (rádio/ulna) (Figura 1A).
   NOTA: Aderindo ao princípio de bem-estar animal 3R, recomenda-se usar os membros que foram inicialmente removidos pela amputação como controles intactos.
4. Deixe o animal no prato e cubra-o com um lenço de papel umedecido embebido em água contendo benzocaína por 15 minutos para permitir a coagulação do sangue e o fechamento da ferida.
5. Colocar os animais em causa num tanque contendo água fresca de retenção com analgésicos (tartarato de butorfanol, 0,5 mg/l, a partir do passo 1.5).
6. Mover os animais para o tanque original contendo água fresca de retenção 24 h após o tratamento analgésico pós-operatório.
7. Permita que os animais se regenerem até o estágio desejado de interesse.
   NOTA: Os membros analisados foram coletados no dia da amputação para a fase intacta e 5 dias pós-amputação (dpa) para a fase de histólise em animais com 5 meses de idade. O estágio de condensação da cartilagem foi medido a 21 dpa em animais de 7 meses de idade.

4. Montagem e processamento de tecidos para medições

1. Aqueça os tubos de 1,5 mL contendo 2,5% ou 3% (p / v) lmp-agarose (da etapa 1.9) em um termobloco a 70 ° C até que a agarose derreta completamente. Troque os tubos para um termobloco diferente a 37 °C e deixe a temperatura se equilibrar antes de usar.
   NOTA: Aqui, 2,5% de lmp-agarose foi usado para medir tecidos em regeneração e 3% para tecidos intactos.
2. Cubra um lado dos cilindros de 1 cm de comprimento (a partir do passo 1.13) com uma das peças de parafilme (passo 1.14) para que fiquem completamente selados na parte inferior.
3. Equilibre alíquotas de 15 mL de meio de cultura para RT (da etapa 1.8)
4. Anestesiar os animais imergindo-os em água contendo anestésico (benzocaína a 0,01% (p/v) diluída na água do tanque de retenção) por pelo menos 20 min.
5. Visualize os membros sob um estereoscópio com software que permite medições quantitativas. Meça o comprimento da estrutura de interesse e calcule quanto tecido precisa ser removido da extremidade distal do membro até que a seção de interesse seja alcançada.
6. Para regenerar membros, colete-os cortando com bisturi e/ou tesoura cirúrgica na altura do cotovelo e dissecando o excesso de tecido do membro. Deixe o tecido na solução de APBS enquanto prepara a próxima etapa. Certifique-se de que o corte seja transversal (90°) ao eixo do braço inferior para criar uma superfície uniforme. Para os membros intactos, remova a mão cortando a região do carpo.
7. Eutanásia dos animais expondo-os a uma dose letal de anestesia (benzocaína a 0,1%) por pelo menos 20 min. Para isso, adicione o volume necessário de solução de benzocaína a 10% (p/v) para atingir uma concentração de 0,1% (p/v).
   1. Se os animais foram anestesiados em 100 mL de solução de benzocaína a 0,01% (p/v), adicionar 900 μL da solução de benzocaína a 10% (p/v).
8. Enxágue os membros submergindo-os na solução APBS.
9. Certifique-se de que as pipetas Pasteur e o termobloco (estabilizado a 37 °C com alíquotas de agarose) estejam próximos à estação de trabalho. Retire o bloco frio do congelador a -20 °C e coloque o cilindro com a extremidade coberta com o parafilme voltada para baixo em cima dele.
10. Pegue o membro dissecado e remova suavemente o excesso de líquido com papel de seda. Coloque o membro em um prato limpo, adicione a lmp-agarose derretida por cima e mova brevemente o membro na agarose para deslocar qualquer APBS restante da superfície da pele.
11. Trabalhando rapidamente, coloque o membro dentro do cilindro, garantindo que ele esteja orientado verticalmente, com a área de interesse voltada para cima.
12. Enquanto segura suavemente o membro com uma pinça, adicione lmp-agarose dentro do cilindro até que o tecido esteja totalmente coberto. Remova suavemente a pinça antes que a agarose se solidifique.
13. Remova o cilindro do bloco frio e deixe a agarose solidificar completamente em RT por aproximadamente 30 s.
14. Leve o bloco de agarose contendo tecido imediatamente para a sala de vibratomo, juntamente com alíquotas de meio de cultura estéril e APBS, em RT.
15. Remova o parafilme do fundo do cilindro e prenda a agarose contendo o tecido ao estágio de vibratomo com cola de cianoacrilato. Certifique-se de que a agarose e a amostra estejam coladas ao palco.
16. Mergulhe o estágio no APBS para seccionamento.
    NOTA: Os tecidos intactos incluem o osso/cartilagem mais rígido, enquanto os tecidos em regeneração são mais macios. Portanto, os parâmetros do vibratomo devem ser ajustados de acordo. Este estudo utilizou os seguintes parâmetros: Tecidos íntegros (amplitude de 1,2 mm e velocidade de 0,1 mm/s) e tecidos em regeneração (amplitude de 0,9 mm e velocidade de 0,4 mm/s).
17. Comece a seccionar a agarose em etapas curtas (por exemplo, em etapas de 100 μm) até que a ponta do tecido seja alcançada. Em seguida, corte o bloco de tecido até que a porção distal do tecido (calculada na etapa 4.5) seja removida. Desta forma, uma seção transversal da área de interesse será facilmente acessível.
    NOTA: A seção de tecido removida conterá a superfície imediatamente adjacente à sondada com AFM e pode servir como referência para a estrutura do tecido. Portanto, pode ser usado para análise complementar direta ou fixado para coloração subsequente (consulte a seção 6).
18. Remova cuidadosamente o bloco contendo tecido do estágio de vibratomo com uma lâmina de barbear e remova todos os vestígios de cola. Cole imediatamente o bloco em uma placa de Petri de plástico de 35 mm com cola adesiva de tecido cirúrgico e adicione aproximadamente 2 mL de meio de cultura em RT para garantir que o tecido esteja totalmente coberto.
    NOTA: A superfície do tecido exposto no bloco de agarose é a superfície a ser sondada.

5. Medições com AFM

1. Pelo menos 1 dia antes das medições, prepare o cantilever para as medições.
   NOTA: Para este trabalho, os balanços de silicone sem ponta foram funcionalizados com grânulos de poliestireno (diâmetro de 20 μm), e a ligação cordão-cantilever foi deixada para fortalecer por pelo menos 1 dia antes de ser usada para medições de indentação.
   1. Prenda as contas aos balanços usando cola epóxi com um tempo de processamento de 5 min.
   2. Abaixe rapidamente o cantilever com o mínimo de contato em uma lâmina de vidro revestida com cola para que uma pequena gota de cola se forme em sua extremidade e coloque-a imediatamente em contato com um cordão adequado.
   3. Segure o contato do cordão do balanço por ~ 10 min antes de levantar o cantilever com um cordão amarrado da superfície.
2. Calibre o cantilever antes das medições.
   NOTA: O cantilever modificado foi calibrado antes de cada conjunto de experimentos pelo método de ruído térmico usando procedimentos integrados do software AFM.
3. Insira a placa de Petri com o bloco de tecido (da etapa 4.18) e o meio de cultura no suporte da placa de Petri do AFM e adquira uma imagem geral em microscopia de campo claro (Figura 1B).
   NOTA: Para testes de indentação, é usada uma configuração equipada com um motorstage em cima de um microscópio de luz vertical. Monte a cabeça do AFM e posicione o cantilever sobre o tecido e aproxime-o da superfície.
4. Escolha a região específica de interesse e registre uma matriz de curvas de força-distância (Figura 2A).
   NOTA: Pontos de ajuste de força relativa de 2-25 nN foram usados para atingir profundidades de indentação comparáveis de ~ 1-4 μm para tecidos de rigidez diferente, com uma velocidade de aproximação e retração de 7,5 μm / s, comprimento z de 50 μm, tamanho da grade 70 μm x 70 μm com 3 x 3 pontos.
5. Para cada região sondada, adquira uma imagem de microscopia de campo claro para associar os valores obtidos a cada região específica na seção do membro.
6. Para todas as amostras, sondar pelo menos 3 regiões diferentes por tipo de tecido.
   NOTA: Em todos os casos, este estudo mediu 4 regiões no centro da cartilagem e 3 regiões na periferia da região da cartilagem e manteve o tecido ao microscópio por no máximo 1 h.
7. Assim que as medições de indentação terminarem, descarte ou fixe o tecido para análise posterior.
   NOTA: As amostras foram fixadas após a conclusão das medições, colocando-as em tubos de 2 mL contendo solução de MEMFa e fixadas durante a noite a 4 ° C. MEMFa (etapa 1.17) foi usado, mas a solução de formaldeído a 4% (p / v) em PBS também pode ser usada.

6. (Opcional) Processamento de seções de tecido adjacentes

1. Se as secções de tecido adjacentes forem utilizadas para coloração subsequente, coloque-as imediatamente após a secção num pequeno tubo de 2 ml contendo fixador e fixe-as durante a noite a 4 °C.
   1. Para revelar a arquitetura do tecido através da marcação do citoesqueleto e núcleos de actina, lave 3 vezes com PBS por 5 min cada para remover o fixador e core com uma solução contendo Alexa Fluor 488 conjugada Faloidina (1:250) e Hoechst 33258 (1:10000) em PBS por 1 h em RT em uma plataforma de balanço.
   2. Em seguida, imobilize as amostras coradas em cima de pratos com fundo de vidro usando 1% (p / v) lmp-agarose em APBS estabilizado a 37 ° C (a partir da etapa 1.9). Certifique-se de que a superfície de interesse esteja voltada para o vidro. Assim que a agarose solidificar, cubra as amostras com PBS para evitar a desidratação.
      NOTA: As amostras intactas e de histólise são visualizadas com um microscópio confocal invertido (ampliação de 10x e seções ópticas de 8 μm). As imagens na Figura 1C são projeções máximas de 8 seções ópticas.
2. Se a seção de tecido adjacente for usada para análise imediata a jusante que requer tecido fresco (como extração de RNA, incubação com corantes vivos, etc.), certifique-se de trabalhar rapidamente e usar um meio de cultura de células (da etapa 1.8) para garantir a maior integridade possível do tecido.

7. Análise e exibição de dados

1. Para calcular o módulo de Young aparente, analise as curvas força-distância usando o modelo Hertz/Sneddon (Eq.1) para um penetrador esférico usando o software de processamento de dados JPK/Bruker, assumindo um coeficiente de Poisson de 0,5.
   (Eq.1)
   Onde R: raio do penetrador, E: módulo de elasticidade, ν: razão de Poisson, a: raio da área de contato circular entre o penetrador e a amostra, δ: profundidade de indentação.
2. Para análise viscoelástica, analise as partes de abordagem das curvas de força-indentação no PyJibe 0.15.0 com a extensão "Modelo Hertz corrigido para viscoelasticidade usando Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM)" (escrito por Paul Müller, https://github.com/AFM-analysis/PyJibe)²⁵. A função de ajuste é baseada em um modelo descrito por Abuhattum et ^al.26, integrando elementos do modelo de Kelvin-Voigt-Maxwell.
   1. Pré-processe as curvas de indentação de força para estimar o ponto de contato usando um ajuste por partes com uma linha (linha de base) e uma função de ajuste polinomial para a peça de aproximação.
   2. Ajuste as curvas de força-indentação ao "Modelo Hertz corrigido para viscoelasticidade usando o modelo Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM)". A partir do ajuste, obtenha o módulo de Young não relaxado, o módulo de Young aparente e a viscosidade aparente. O modelo também oferece tempos de relaxamento e recuo de Maxwell.
      NOTA: Em várias curvas de indentação de força analisadas (em particular o tecido intacto), os tempos de relaxamento de Maxwell foram significativamente maiores ou menores do que o tempo de indentação, o que indica um comportamento bastante elástico ou comportamento mecânico de Kelvin-Voigt, respectivamente.
3. Exporte todas as medições para uma planilha e calcule a mediana dos módulos de Young aparentes por tipo de tecido e amostra.
4. Plote e analise estatisticamente os dados com o software apropriado.
   NOTA: O GraphPad Prism é usado aqui e, ao descrever os resultados, o estudo se refere à média ± DP da mediana dos módulos de Young aparentes medianos por amostra (exibidos na Figura 2D-F).
5. Exiba fatias ópticas de imagens confocais projetando-as com a função de projeção máxima de Fiji. Ajuste o brilho e o contraste de cada canal individual para uma visualização ideal de colorações fluorescentes.
6. Gere um painel de figuras com o software apropriado.
   NOTA: O Affinity Designer é usado para gerar os painéis e o modelo na Figura 1A é desenhado usando o Affinity Designer.

Resultados

Usando o protocolo descrito acima, medimos o módulo de Young aparente dos tecidos cartilaginosos dos membros do axolote em condições homeostáticas ("Intactas"), durante a histólise inicial da cartilagem e estágios posteriores de condensação da cartilagem (Figura 1A). Também investigamos as propriedades mecânicas dos elementos esqueléticos em diferentes regiões, incluindo seu centro e periferia, conforme mostrado nas imagens que descrevem a posição do balanço (Figura 1B). Para exibir a arquitetura do tecido e correlacioná-la com as medidas de rigidez, os cortes transversais do tecido ou o bloco de tecido onde as medidas foram realizadas foram fixados e corados para filamentos e núcleos de actina com Alexa Fluor 488 conjugado com Faloidina e Hoechst, respectivamente (Figura 1C). Nos membros íntegros, o rádio é claramente maior que a ulna, mas ambos os elementos esqueléticos cartilaginosos têm morfologia semelhante, com núcleos redondos uniformemente distribuídos no centro, circundados por um anel de núcleos achatados correspondente ao pericôndrio²⁴. Durante a fase de histólise, foram detectadas mudanças dramáticas na arquitetura do tecido, com núcleos desorganizados e menos densamente compactados dentro dos elementos esqueléticos. Na fase posterior de condensação da cartilagem, os núcleos se organizam novamente, com uma delimitação clara entre a cartilagem recém-formada e os tecidos em regeneração circundantes. No entanto, nesta fase, a maioria dos núcleos é achatada e não há diferenças morfológicas claras entre o centro e a periferia.

Quando foram medidos cortes transversais de ambos os elementos esqueléticos presentes na região zeugopodial (rádio e ulna), foram detectados módulos de Young aparentes indistinguíveis em membros íntegros, com valores medianos de 10,95 ± 11,69 kPa e 15,71 ± 6,49 kPa, respectivamente (Figura 2D, esquerda), o que concorda com suas semelhanças anatômicas (Figura 1C). Curiosamente, a análise do centro da cartilagem vs. periferia mostrou que, em condições intactas, os módulos de Young aparentes no centro foram maiores do que na periferia, com valores medianos de 16,48 ± 6,86 kPa vs. 7,53 ± 4,63 kPa, respectivamente (Figura 2E, à esquerda). No 5º dia após a amputação, correspondente à fase de histólise, os módulos de Young aparentes no rádio e na ulna diminuíram consideravelmente (0,03 ± 0,02 kPa e 0,13 ± 0,09 kPa, respectivamente, Figura 2D, à direita), mas também desapareceram as diferenças entre o centro e a periferia, com mediana dos módulos de Young de 0,11 ± 0,07 kPa e 0,27 ± 0,34 kPa, respectivamente (Figura 2E, à direita). Ao analisar as propriedades da cartilagem durante uma fase posterior de regeneração, no momento em que a cartilagem começa a condensar, foi detectado um aumento significativo nos módulos de Young aparentes, atingindo valores intermediários entre as fases intacta e histolítica (0,77 ± 0,29 kPa, Figura 2F).

Como pode ser visto nas curvas de exemplo fornecidas (Figura 2B), a histerese ocorreu entre a maioria dos pares de curvas de aproximação e retração, indicando uma resposta viscoelástica do tecido sob força. Além disso, nos propusemos a analisar as propriedades viscoelásticas dos diferentes tecidos com mais detalhes. Como as medições oscilatórias em múltiplas frequências são demoradas e um tanto críticas no que diz respeito à preservação da integridade do tecido, especialmente durante o mapeamento de várias regiões do tecido, usamos um método publicado anteriormente por Abuhattum et al. que permite ajustar a parte de aproximação das curvas força-distância antes da retração imediata do cantilever²⁶. O modelo é baseado em elementos do modelo de Kelvin-Voigt Maxwell e foi previamente aplicado para a análise das propriedades viscoelásticas de células e hidrogéis²⁶, bem como do tecido pancreático²⁷. Mediana dos módulos não relaxados (Intacto: 23,05 kPa, Histólise: 0,20 kPa e Cartilagem de condensação: 1,60 kPa) e dos módulos de Young aparentes (Intacto: 17,54 kPa, Histólise: 0,07 kPa e Cartilagem de condensação: 1,54 kPa) derivados para tecidos nos diferentes estágios de regeneração revelaram diferenças significativas (Figura 2G-H). No geral, uma resposta predominantemente elástica dos tecidos à deformação foi observada na taxa de deformação escolhida, refletida pela grande semelhança dos módulos elásticos aparentes e não relaxados (Figura 2G,H). Valores medianos de viscosidade aparente significativamente mais baixos foram obtidos para o estágio histolítico (0,72 Pa·s) em comparação com os estágios de cartilagem intacta (2,06 Pa·s) e condensada (2,32 Pa·s) (Figura 2I). Como esperado, os módulos aparentes de Young da análise de PyJjibe (Figura 2H) foram de alta concordância com os valores obtidos pelo software de processamento de dados JPK (Figura 2F).

Em conclusão, a caracterização mecânica reflete a reestruturação dinâmica do tecido durante o processo de regeneração. Essas medidas estão de acordo com as observações anatômicas, onde a rigidez do tecido diminui junto com as alterações observadas na arquitetura do tecido (Figura 1C) e é gradualmente recuperada durante a regeneração.

Figura 1: Medidas de recuo da cartilagem do membro do axolote durante a regeneração. (A) Representação esquemática dos estágios de regeneração. A linha tracejada indica o local aproximado da seção transversal gerada pelo vibratoma onde as medições foram realizadas. (B) Imagens representativas das medidas do centro (superior) e da periferia (inferior) na cartilagem do membro. A ponta preta é o balanço. Barra de escala: 100 μm. (C) Arquitetura tecidual em membros íntegros (esquerda), tecido em histólise (meio) e cartilagem condensada (direita). Verde: núcleos (Hoechst), magenta: filamentos de actina (Faloidina). Barra de escala: 500 μm. C' Região ampliada delineada no painel. Barra de escala: 100 μm. As grades de indentação de 70 μm x 70 μm são indicadas por quadrados pontilhados brancos (centro) e amarelos (periferia). Nos painéis B e C, as letras R e U indicam o Rádio e a Ulna, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Medição da rigidez da cartilagem durante a regeneração do membro do axolote com AFM. (A) Esquemas do experimento de indentação do AFM mostrados como força em função do tempo (acima) e força em função da distância entre o penetrador e a amostra (abaixo). As curvas de aproximação e retração são exibidas em azul e vermelho, respectivamente. O ponto de contato é exibido por uma linha tracejada vertical preta. As curvas de força-indentação foram ajustadas dentro da parte de aproximação da curva, usando o modelo Hertz/Sneddon (software de processamento de dados JPK e Pyjibe) ou a extensão do modelo KVM viscoelástico em Pyjibe. (B) Curvas representativas da força-distância das medidas do AFM em membros intactos e em regeneração durante as fases da histolise e da cartilagem de condensação. A porcentagem de curvas analisáveis (ou seja, sem artefatos) é indicada no canto superior direito de cada curva. (C) Exemplos de artefatos típicos em curvas de força-indentação, por exemplo, devido ao contato inadequado do penetrador com a superfície. Os exemplos mostrados correspondem a membros intactos, mas tipos equivalentes de artefatos foram observados em todas as condições. Para B-C: Curvas representativas de força-distância foram ajustadas e exibidas usando Pyjibe. A curva azul clara representa a parte de aproximação da curva e a curva vermelha clara é a parte de retração. A linha azul mais escura é o Hertz / Sneddon aplicado para um penetrador esférico. Os respetivos resíduos do ajuste são mostrados abaixo para as curvas de força-distância inferiores. Os resíduos plotados representam a diferença entre os valores de ajuste e de força real. (D) Módulos aparentes de Young dos centros de rádio e ulna medidos em membros íntegros e submetidos a (E) Módulos aparentes de Young do centro da cartilagem versus periferia (Peri) em membros íntegros e durante a histólise. (F) Módulos aparentes de Young medidos para o centro da cartilagem nos estágios analisados de regeneração. Para DF: Cada ponto é derivado de uma curva de força-distância analisada com sucesso, e pontos maiores correspondem a valores medianos por amostra. Os módulos aparentes de Young foram obtidos usando o ajuste do modelo Hertz/Sneddon do software JPK Bruker. (G-I) Módulo não relaxado (G), módulo de Young aparente (H) e viscosidade aparente (I) calculados usando PyJibe (extensão KVM) a partir de medições do centro da cartilagem nos estágios analisados de regeneração. Cada ponto é derivado de uma curva de força-distância analisada com sucesso. As linhas correspondem aos valores medianos de todas as medições por condição. Para D-I: Kruskal-Wallis com teste de comparações múltiplas de Dunn. Letras diferentes representam condições estatisticamente diferentes entre si (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, demonstramos uma técnica para a medição da rigidez da cartilagem em membros de axolotes com AFM. No entanto, esse método também pode ser expandido para sondar outros tipos de tecido. Uma etapa fundamental para medições bem-sucedidas de AFM é a preparação da amostra, que provou ser particularmente desafiadora com amostras de axolotes. Descobrimos que sondar a superfície do tecido que ainda estava embutida no bloco de agarose era a melhor maneira de preservar a integridade do tecido. Isso ocorre porque a pele do axolote secreta altos níveis de muco na superfície da epiderme, o que impede a incorporação estável da seção de tecido fatiado na agarose.

Algumas amostras podem trazer desafios adicionais, como alta adesividade. Tivemos esse problema, principalmente em amostras na fase de histólise, que eram relativamente complacentes e adesivas. Nessas amostras, também observamos várias curvas de distância de força em que a parte de indentação tinha uma aparência "irregular", indicando que o cordão estava deformando a superfície da amostra de maneira não contínua (Figura 2C), por exemplo, devido à superfície cedendo sob tensão. Essas curvas de força-distância tiveram que ser descartadas, pois não podiam ser ajustadas ao modelo Hertz-Sneddon. Para reduzir a adesão, a passivação do penetrador pode ser útil²⁸, ou seja, revestindo o cordão do penetrador com agentes que reduzem sua viscosidade, como polietilenoglicol (PEG) ou albumina de soro bovino. Além disso, modelos alternativos para ajustar curvas de força-distância podem ser usados, por exemplo, o modelo JKR (Johnson-Kendall-Roberts)²⁹. Uma vez que os tecidos analisados aqui mostraram variações relativamente grandes nos módulos elásticos de mais de uma ordem de grandeza para as regiões de tecido adjacentes e as diferentes condições testadas, isso tornou a seleção de um único cantilever / penetrador ideal (constante de mola / tamanho do penetrador) desafiadora. As variações bastante grandes na rigidez do tecido também exigiram a adaptação da força de contato aplicada para manter a profundidade de indentação comparável e dentro de uma faixa adequada (cerca de 5% a 25% do diâmetro do penetrador).

Outro parâmetro crítico para preservar as propriedades mecânicas do tecido da forma mais fisiológica possível é manter a máxima integridade do tecido. Isso foi garantido pela medição de amostras frescas que foram processadas imediatamente após a coleta e mantidas a uma temperatura adequada sob um meio de cultura de células com pH estabilizado.

Recentemente, outros grupos realizaram medições de microindentação em elementos esqueléticos de axolotes usando formas alternativas de processamento de amostras³⁰. No entanto, nesses experimentos, o tecido foi congelado de antemão e as peças esqueléticas em regeneração foram dissecadas manualmente de seus tecidos circundantes para medi-las in situ. Até que seja comprovado empiricamente, não está claro se essas manipulações afetam a integridade do tecido cartilaginoso e as propriedades mecânicas. Análises de músculos salamandras e blastemas também foram relatadas^31,32. Nesses casos, no entanto, a pele foi removida e as amostras não foram seccionadas; assim, apenas informações da superfície imediatamente abaixo do epitélio removido foram obtidas. Embora esse tipo de quantificação seja preciso, ele fornece informações sobre a superfície lateral do músculo, desconsiderando as informações mecânicas das camadas musculares internas. Usamos um penetrador de 20 μm, o que significa que as medições não foram em massa, como relatado nas medidas de microindentação 30,31,32, mas sim na escala celular e extracelular. Portanto, obtemos uma resolução que reflete as pistas mecânicas às quais as células estão realmente expostas, além de revelar a heterogeneidade do tecido (Figura 2D-I).

Nas medições, foram detectados valores aparentes mais baixos dos módulos de Young na periferia dos elementos esqueléticos intactos, o que implica que o pericôndrio do axolote é mais complacente do que a cartilagem. No entanto, não podemos descartar que os tecidos adjacentes aos elementos esqueléticos também tenham sido sondados devido à configuração da grade de 70 μm x 70 μm. Durante a fase histolítica, tais diferenças não foram observadas, sugerindo que a histólise em membros em regeneração de axolotes pode progredir de forma equivalente na cartilagem, seu pericôndrio circundante e tecidos vizinhos. O rádio e a ulna compartilham uma estrutura semelhante, mas têm diferenças anatômicas significativas, como o rádio ter um diâmetro maior e a ulna ser mais longa²⁴. No entanto, uma análise comparativa de sua rigidez não foi relatada até o momento, exceto por sua resposta à carga mecânica com fins médicos³³. Aqui, descrevemos as medidas de indentação em seções transversais desses dois elementos esqueléticos em membros intactos e em regeneração. Mostramos que não existem diferenças significativas na rigidez entre os raios e as ulnas nos membros do axolote, o que está de acordo com as densidades minerais ósseas equivalentes detectadas em contrapartes humanas³⁴. No entanto, foi observada uma tendência de menores módulos de Young aparente no rádio, particularmente durante a histólise. Para determinar se essa observação é biologicamente significativa, um número maior de amostras seria preferido. Com base nos dados obtidos neste estudo, propomos um mínimo de 5 amostras por condição. Durante a fase de histólise, ambos os elementos esqueléticos tornam-se mais complacentes, o que está de acordo com o remodelamento da MEC descrito para ocorrer nesta fase⁹. Finalmente, as medidas obtidas neste estudo implicam que a rigidez da cartilagem aumenta gradualmente durante a fase posterior de condensação da cartilagem. Essas observações concordam com as medidas de indentação recentemente relatadas em ossos intactos e cartilagem condensada²⁹, bem como com a avaliação in vivo das propriedades mecânicas da cartilagem com microscopia confocal de Brillouin³⁵.

Junto, este trabalho expande o potencial do AFM como uma ferramenta valiosa para estudar as propriedades mecânicas de membros do axolote. Com esta técnica, pretendemos complementar nosso conhecimento da expressão gênica e das trajetórias de transdiferenciação celular^16,13 para entender melhor como a mecânica dos tecidos está moldando e influenciando o processo regenerativo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Affinity Designer	Afinidade	versão 1.10.4	Para montagem de figuras
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	Para preparação de amostras
Alexa Fluor 488 Faloidina	Invitrogen	A12379	Para manchar tecido
Axiozoom	Zeiss		Para imagem samplea sob o AFM
Benzocaína	Sigma-Aldrich	E1501	Para anestesiar os animais
Butorfanol (+)-tartarato sal	Sigma-Aldrich	B9156	como a seta analgésica
TL1	NanoWorld	modilhão	para a
recuo Cellhesion 200 do AFM equipada com um motorstage	JPK/Bruker		para a entrada
		CellSense	para a imagem latente no estereoscópio Olympus UC90
Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	Para limpar amostras e seção sob vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	versão 2.9.0/1.53t	Para processamento de imagem
GraphPad Prism	GraphPad Software	(versão 8.4.3)	Para representar graficamente e analisar estatisticamente os dados
FBS Gibco		10270-106	inativado por calor Para célula meio de cultura
Cola de histoacrílico (2-butil-cianoacrilato)	Braun		Para colar amostra em placas de Petri
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	Para corar tecido
Insulina	Sigma-Aldrich	I5500	Para meio de cultura de células
Microscópio confocal invertido	Zeiss	780 LSM	Para imagens de seções de tecido
Microscópio confocal invertido	Zeiss	980 LSM	Para obter imagens de seções de tecido
JPK/Bruker software de processamento de dados	JPK/Bruker	SPM 6.4	Para analisar curvas de força-distância
L15 médio (Leibovitz)	Sigma	L1518	Para meio de cultura celular
L-Glutamina	Gibco	25030-024	Para meio de cultura celular
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140-122	Para célula Contas de
poliestireno de cultura média (20 µ m de diâmetro); )	micropartículas		para medições de indentação AFM
Pyjibe	escrito por Paul M & uuml; ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	Para análise viscoelástica
Estereoscópio Olympus SX10	Olympus	SX10	Para amputações de membros e montagem de tecidos
Estereoscópio Olympus UC90	Olympus	UC90	Para imagens
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	Para seccionamento de tecidos