Artigo de método

A remoção parcial imediata de complexos cumulus-oócitos: uma abordagem refinada para observação rápida da fertilização in vitro

DOI:

10.3791/66951

⸱

18 de outubro de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Reproductive Medicine, Meizhou People's Hospital, 2Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um método otimizado para remover prontamente uma parte dos complexos cumulus-oócitos após a recuperação do óvulo para agilizar o processo de observação da fertilização in vitro, reduzindo o tempo necessário para a remoção das células da granulosa, minimizando a exposição do oócito a elementos externos e não impede o desenvolvimento do embrião, melhorando a eficiência dos procedimentos laboratoriais de fertilização in vitro.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apesar dos rápidos avanços nas tecnologias clínicas e laboratoriais para fertilização in vitro (FIV), uma proporção significativa (10% -15%) dos pacientes continua a apresentar distúrbios de fertilização, levando a baixas taxas de fertilização e à produção de embriões inviáveis. A fertilização de curto prazo envolve a remoção precoce das células da granulosa para observar a extrusão do segundo corpo polar, permitindo a avaliação da fertilização e medidas corretivas precoces para lidar com as baixas taxas de fertilização e a falha completa da fertilização. No entanto, a observação da fertilização de curto prazo na fertilização in vitro é impedida por desafios como aglomerados excessivamente grandes não processados de complexos cumulus-oócitos e adesão entre óvulos, necessitando de procedimentos externos complexos para remoção de células da granulosa e duração prolongada da observação. Para resolver esse problema, este estudo propõe um método de remoção parcial imediata das células da granulosa após a recuperação do óvulo. Essa abordagem agiliza os estágios subsequentes de fertilização de curto prazo e o monitoramento tradicional da fertilização, reduz o tempo necessário para a extrusão do oócito, minimiza a probabilidade de impactos ambientais externos nos oócitos e diminui o risco de perder a janela crítica de observação da fertilização. Consequentemente, o estudo produz novas evidências clínicas destinadas a aumentar a eficiência operacional dos laboratórios embrionários na fertilização in vitro.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No campo da fertilização in vitro-transferência de embriões (FIV-ET), a taxa de fertilização típica fica na faixa de 60% a 80%1. No entanto, aproximadamente 4% a 16% dos casos apresentam falha completa na fertilização ou baixas taxas de fertilização, apresentando desafios na previsão 2,3. Para melhorar os resultados clínicos da gravidez e diminuir as ocorrências de não fertilização completa e baixa fertilização, a utilização de fertilização de curto prazo em procedimentos de fertilização in vitro está aumentando4. Essa abordagem envolve a remoção imediata de células da granulosa para monitorar a extrusão do segundo corpo polar, avaliar o status da fertilização e, potencialmente, conduzir a injeção intracitoplasmática corretiva de espermatozóides (ICSI). A ligação entre o complexo celular do cumulus oócito (OCCC) e o oócito é mais forte durante a fertilização de curto prazo em comparação com a fertilização tradicional durante a noite, aumentando assim o desafio da remoção do OCCC5. Fatores como excesso de número de oócitos, grandes complexos OCCC ou aderências entre oócitos podem levar a tempos prolongados de remoção de células da granulosa durante a fertilização de curto prazo, estendendo assim o período em que os óvulos permanecem fora da incubadora4. Para otimizar o período de observação da fertilização, foi desenvolvida uma abordagem modificada pós-recuperação de óvulos, envolvendo a excisão parcial de células da granulosa de oócitos com complexos OCCC significativos. Essa técnica auxilia na retenção das células da granulosa ao redor dos oócitos, preservando a integridade da estrutura inicial do oócito6 e permitindo que essas células continuem fornecendo fatores vitais para a maturação do oócito e subsequente ligação fertilização-embrião7.

Consequentemente, este estudo se concentra em pacientes submetidos a tratamento de fertilização in vitro-ET em um centro de medicina reprodutiva como participantes da pesquisa, com o objetivo de investigar o impacto de um método de excisão mecânica de células da granulosa parcial imediata na duração dos procedimentos para fertilização de curto prazo e monitoramento noturno da fertilização, ao mesmo tempo em que avalia os resultados da fertilização normal e do desenvolvimento em estágio avançado. Esta pesquisa pretende oferecer informações valiosas para melhorar os procedimentos laboratoriais de embriões na fertilização in vitro.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com os procedimentos operacionais padrão do Departamento de Medicina Reprodutiva do Hospital Popular de Meizhou e foram submetidos à revisão pelo Comitê de Ética do mesmo departamento. O consentimento informado por escrito foi obtido de cada casal participante. O estudo incluiu participantes submetidos ao primeiro ciclo de fertilização in vitro com clivagem ou transferência de embriões em estágio de blastocisto, bem como mulheres entre 20 e 45 anos de idade. Os critérios de exclusão incluíram o uso de óvulos/espermatozoides de doadores e condições específicas, como anormalidades uterinas congênitas ou secundárias (por exemplo, útero septado, útero unicorno, didelfos uterinos), adenomiose, miomas submucosos uterinos ou espessura endometrial abaixo de 7 mm no dia da transferência do embrião. Um total de 115 pacientes inscritos entre dezembro de 2023 e fevereiro de 2024 foram estratificados em dois grupos com base na realização da remoção parcial imediata do OCCC.

1. Preparação antes da coleta do oócito

  1. Coloque os pratos de recolha de ovócitos (Tabela de Materiais) na incubadora a 37 °C durante a noite.
  2. Incubar 12 mL de meio manipulador de folículo (Tabela de Materiais) em tubos de ensaio redondos de fundo de 14 mL a 37 ° C durante a noite. Transfira os tubos para o suporte de tubo de ensaio pré-aquecido 30 minutos antes da recuperação do oócito.
  3. Prepare o meio manipulador de folículos: Adicione 9 mL de meio manipulador de folículos a um tubo de ensaio de fundo redondo de 14 mL (Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C durante a noite. No dia da coleta do oócito, transfira 4,5 mL do meio para uma placa de coleta de oócitos pré-incubada (Tabela de Materiais) coberta com 2 mL de óleo de parafina 100%.
  4. Prepare a solução de lavagem OCCC: Adicione 4,5 mL de meio de fertilização (Tabela de Materiais) a uma placa de coleta de oócitos e incube a 37 ° C durante a noite.
  5. Prepare o meio de fertilização: Adicione 1 mL de meio de fertilização a um prato de 6 cm coberto com óleo de parafina 100% (Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C durante a noite.
  6. Prepare as pipetas de vidro Pasteur (Tabela de Materiais): Suavemente embote e arredonde as pontas, queimando-as em uma lâmpada de álcool por cerca de 5 s (Figura 1). Prenda uma cabeça de sucção na ponta das pipetas Pasteur, garantindo que ela possa tocar o fundo do prato sem arranhar. Lave as pipetas de vidro Pasteur e os pratos de 10 cm com um meio de manipulação de folículos.

2. Recuperação de oócitos e remoção parcial imediata de OCCC

NOTA: Use um estereomicroscópio durante os procedimentos de isolamento de oócitos e remoção de OCCC. Para obter os melhores resultados, todos os procedimentos devem ser realizados em uma mesa de aquecimento com controle de temperatura (37 °C) e todos os equipamentos devem ser pré-aquecidos 30 minutos antes da coleta do oócito.

  1. Colete o fluido folicular pré-ovulatório durante a recuperação do oócito de acordo com as recomendações da ESHRE8.
    1. Resumidamente, use uma agulha de 17 G para recuperar os oócitos sob orientação de ultrassom transvaginal. A pressão negativa apropriada varia de 120-140 mmHg.
    2. Despeje o fluido folicular coletado no tubo de ensaio de fundo redondo de 14 mL em um prato de 10 cm (Tabela de Materiais), mantendo uma profundidade de fluido inferior a 0,5 cm. Coloque o prato em uma plataforma de temperatura constante (37 °C).
  2. Observe o OCCC sob um estereomicroscópio para confirmar a presença de oócitos e avaliar sua maturidade.
    NOTA: A maturidade do OOOC é avaliada com base na morfologia das células do cumulus e na visibilidade de certas estruturas do oócito9.
  3. Aspire o OCCC usando uma pipeta Pasteur de ponta romba. Incline o prato de 10 cm cerca de 15 graus e espalhe todo o OCCC grande. Evite aspirar o oócito e as células da granulosa circundantes em um raio de 2500 μm. Corte o excesso de células da granulosa com a pipeta de Pasteur ao longo do eixo longitudinal (Figura 2). As etapas detalhadas são as seguintes:
    1. Observe a olho nu para ver se há uma massa mucóide translúcida acinzentada no fluido folicular. Se não for encontrado, procure rapidamente a massa mucóide translúcida acinzentada girando no sentido horário de fora para dentro sob um estereomicroscópio, o OCCC.
    2. Confirme se há oócitos no OCCC e faça uma avaliação preliminar da maturidade do oócito.
    3. Em seguida, pré-prepare uma pipeta de aspiração de silicone com uma pipeta Pasteur redonda polida por chama, aspire o OCCC e, ao mesmo tempo, levante suavemente o prato de cultura na posição das 9 às 10 horas com o dedo anelar esquerdo da mão segurando o prato de 10 cm, inclinando o prato de cultura ligeiramente cerca de 15° para a esquerda (colocar o dedo anelar sob o prato é aproximadamente o ângulo necessário).
    4. Enquanto cuspia o OCCC aspirado na posição de 11 horas do prato, alongue-o suavemente horizontalmente para a direita. Em seguida, observe o tamanho das células da granulosa ao redor do OCCC expandido. Em seguida, na posição adequada do OCCC alongado horizontalmente, use a pipeta Pasteur para fazer um corte descendente rápido e suave nas células da granulosa em excesso de cima para baixo.
  4. Transfira o OCCC cortado para um prato de coleta contendo a solução de lavagem OCCC. Despeje o fluido folicular restante em um recipiente de amostra estéril (Tabela de Materiais). Repita essas etapas até que todos os complexos sejam coletados.

3. Preparação de sêmen e inseminação in vitro

  1. Colete as amostras de sêmen por ejaculação na manhã da coleta do oócito. Avaliar a concentração, motilidade e morfologia dos espermatozoides sob um microscópio óptico seguindo os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS, 2010)10. Em seguida, transfira o pellet de esperma para um novo tubo de centrífuga e lave-o duas vezes em meio de fertilização11. Incube-os a 6% de CO2 e 37 °C até que seja necessário.
  2. Inseminar OCCCs com 1 x 105 a 3 x 105 espermatozóides móveis por mililitro em uma única gota aproximadamente 2-3 h após a recuperação na placa de fertilização (Tabela de Materiais). Adicione 6-8 OCCC e 1 mL do meio de fertilização ao prato de fertilização.
    NOTA: Após a lavagem do OCCC pegajoso, eles são transferidos para a placa de fertilização usando uma pipeta Pasteur. Solte um OCCC de cada vez, levantando a pipeta suavemente da superfície do líquido antes de liberar a próxima, garantindo que cada OCCC seja colocado individualmente no prato para evitar aglomeração.

4. Remoção de células cumulus

  1. Para fertilização de curto prazo, siga as etapas descritas abaixo.
    1. Co-incubar OCCCs com espermatozóides por 4-6 h. Após a incubação, remova mecanicamente as células do cumulus ao redor dos oócitos.
    2. Aspire os ovócitos usando uma pipeta com um diâmetro interno ligeiramente menor que os oócitos para garantir a remoção completa das células do cumulus.
    3. Confirme a fertilização observando a presença de dois corpos polares. Oócitos que apresentam um segundo corpo polar são considerados fertilizados.
    4. Identifique os casos que não mostram o segundo corpo polar como falhas de fertilização, necessitando de ICSI de resgate.
  2. Para fertilização regular, após 18-20 h de co-incubação, remova as células do cumulus usando as pipetas para avaliação da fertilização.

5. Cultura de embriões

  1. Cultive e monitore os oócitos fertilizados por 3-5 dias após a coleta do oócito. Avalie a fertilização 20 h após a inseminação para determinar o número de pronúcleos. Posteriormente, cultive cada zigoto individualmente em uma gota média e transfira os embriões pós-fertilização para um meio de clivagem.
    NOTA: Um embrião ideal no terceiro dia deve consistir em seis ou mais blastômeros de tamanho igual e exibir uma taxa de fragmentação menor ou igual a 10%12.
  2. A decisão de prosseguir com a cultura de blastocisto depende das preferências do paciente e das circunstâncias específicas, como a quantidade e a qualidade dos embriões obtidos no dia 3. Transfira os embriões do dia 3 para o meio de blastocisto e avalie no dia 5. Use o sistema de pontuação de Gardner para avaliar blastocistos, com blastocistos de alta qualidade com pontuações de ≥ 4 BB13.

6. Medições de resultados e análise estatística

  1. Relate dados contínuos como a média ± desvio padrão e expresse dados ordinais como proporções. Realize a análise estatística usando o teste t de Student ou o teste qui-quadrado em um software de análise de dados apropriado (aqui, IBM SPSS Statistics). Considerou-se estatisticamente significativo um nível de P < 0,05.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No grupo submetido a procedimentos curtos de co-incubação, os pacientes que receberam resgate foram excluídos. Das 47 pacientes que receberam inseminação de curto prazo, não foram observadas diferenças significativas em relação à idade das pacientes e ao número de oócitos recuperados (Tabela 1). A remoção parcial imediata do OCCC resultou em um afrouxamento do OCCC remanescente ao redor dos oócitos (Figura 3), facilitando a detecção de um segundo corpo polar. O tempo médio do procedimento foi significativamente menor no grupo de remoção parcial do CCOC (4,42 ± 1,68 min vs. 9,29 ± 5,04 min, P < 0,001) em comparação com o grupo controle, apesar de não terem sido encontradas diferenças significativas na taxa de clivagem, taxa ideal de embriões e taxa ideal de blastocisto.

Em outra coorte de 68 pacientes submetidas à fertilização in vitro tradicional (FIV), onde as verificações de fertilização foram realizadas 18-20 h após a inseminação, foram observadas semelhanças na idade das pacientes e no número de oócitos recuperados entre os dois grupos (Tabela 2). Um aumento da frouxidão na estrutura das células da granulosa ao redor do oócito foi observado em pacientes submetidas à remoção parcial imediata do OCCC durante a coleta do óvulo (Figura 4). Embora tenha sido observado um tempo médio de operação ligeiramente menor na remoção parcial do grupo CCO (4,93 ± 0,80 min vs. 6,54 ± 7,77 min, P = 0,207), nenhuma diferença estatisticamente significativa foi evidente. Embora aderências apertadas em alguns casos possam levar a procedimentos de observação prolongados superiores a 40 minutos, as aderências geralmente soltas de OCCC na maioria dos casos após o armazenamento noturno podem ser responsáveis pela falta de variação estatística nos tempos de operação entre os dois grupos. Como no grupo anterior, não foram identificadas discrepâncias significativas na taxa de clivagem, taxa ideal de embriões e taxa ideal de blastocisto.

No geral, os resultados representativos indicam que a remoção parcial imediata do OCCC reduz significativamente os tempos de operação em procedimentos de inseminação de curto prazo sem comprometer os principais resultados da fertilização in vitro, como taxa de clivagem, taxa ideal de embriões e taxa ideal de blastocisto. Essa técnica facilita a detecção do segundo corpo polar, afrouxando o OCCC restante ao redor dos oócitos, o que provavelmente contribui para reduzir os tempos de operação. No contexto dos procedimentos tradicionais de fertilização in vitro, embora tenha sido observada uma tendência para tempos de operação mais curtos com a remoção parcial imediata do OCCC, a diferença não foi estatisticamente significativa, potencialmente devido à variabilidade inerente na adesão das células do cumulus após o armazenamento noturno. Essas descobertas sugerem que, embora a remoção parcial imediata do OCCC possa aumentar a eficiência do procedimento, particularmente em contextos de inseminação de curto prazo, seu impacto nos cronogramas tradicionais de fertilização in vitro pode ser menos pronunciado.

figure-results-1
Figura 1: Preparação da pipeta Pasteur usando um queimador de álcool. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagem típica do OCCC que precisa ser processada. Os oócitos típicos com diâmetro superior a 2,5 mm de (A e B) de duas pacientes foram removidos parcialmente ao longo da linha tracejada vermelha delineada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Micrografias típicas que descrevem as características morfológicas da fertilização 4-6 h após a co-incubação com espermatozóides. Oócito típico (A) com ou (B) sem remoção parcial de OCCC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Micrografias típicas que descrevem as características morfológicas da avaliação dos pronúcleos 18-20 h após a co-incubação com espermatozóides. Oócito típico (A) com ou (B) sem remoção parcial de OCCC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Remoção parcial do grupo OCCCGrupo controleValor de p
Pacientes (n)2621
Idade (y)32.04 ± 4.1133,33 ± 3,410.193
Não. de oócitos recuperados12.85 ± 9.0211.38 ± 5.320.493
4 h tempo de procedimento (min)4,42 ± 1,689.29 ± 5.04<0,001
Taxa de clivagem, n (%)98,89 ± 0,04, 24100.00 ± 0.00, 190.221
Taxa ideal de embriões, n (%)71.38 ± 35.46, 2472,14 ± 35,72, 190.945
Taxa ideal de blastócitos, n (%)58.13 ± 28.29, 1965.18 ± 28.09, 120.504

Tabela 1: Comparação dos resultados da fertilização entre os dois grupos com ou sem a remoção parcial imediata de OCCC submetidos a procedimentos curtos de co-incubação.

Remoção parcial do grupo OCCCGrupo controleValor de p
Pacientes (n)2939
Idade (y)32.21 ± 4.1132.72 ± 4.250.619
Não. de oócitos recuperados12.93 ± 7.0012.44 ± 7.260.777
20 h tempo de operação (min)4,93 ± 0,806,54 ± 7,770.207
Taxa de clivagem, n (%)98,81 ± 0,04, 2895,93 ± 0,17,370.39
Taxa ideal de embriões, n (%)72.07 ± 36.75, 2872.62 ± 30.01,360.948
Taxa ideal de blastócitos, n (%)62.93 ± 28.30, 2163.36 ± 24.61, 280.955

Tabela 2: Comparação dos resultados da fertilização entre os dois grupos com ou sem a remoção parcial imediata de OCCC submetida à fertilização in vitro tradicional (FIV).

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A remoção parcial imediata das células da granulosa pode acelerar o processo de desintegração precoce da fertilização de curto prazo, reduzir o tempo de observação do segundo corpo polar tanto na fertilização de curto prazo quanto na fertilização in vitro convencional e não comprometer o desenvolvimento embrionário subsequente. Atualmente, os laboratórios empregam globalmente várias estratégias para mitigar distúrbios de fertilização e baixas taxas de sucesso. O método preferido envolve a remoção de células da granulosa para observar o segundo corpo polar 4-6 h após a fertilização de curto prazo14. Os desafios surgem devido à forte adesão entre os oócitos e as células do cumulus circundantes, dificultando a remoção mecânica com pipeta. A coleta e o corte imediatos de oócitos podem mitigar esse problema, reduzindo a adesão e o volume de OCCC, consequentemente encurtando o tempo de observação. Uma etapa crítica no protocolo é a remoção parcial imediata do OCCC após a recuperação do óvulo, auxiliando no afrouxamento das células remanescentes do cumulus ao redor dos oócitos para facilitar a detecção do segundo corpo polar, o que é crucial para avaliar o sucesso da fertilização. A remoção imediata reduz significativamente o tempo de operação sem comprometer a taxa de clivagem, a taxa ideal de embriões ou a taxa ideal de blastocisto.

As modificações sugeridas e a solução de problemas da técnica de corte são as seguintes: (i) A fixação da agulha é considerada desnecessária, pois levaria a um tempo extracorpóreo prolongado. Na prática, representa uma abordagem de corte conveniente. (ii) Concentrando-se no OCCC, recomenda-se reter 3-4 células da granulosa de cada lado que correspondam ao diâmetro do oócito. Para OCCC bilateral, ambos os lados precisam ser cortados; para OCCC unilateral, corte o lado com o OCCC. Pode-se lutar pela simetria, embora não necessariamente perfeita. (iii) Para evitar que os folículos se enrolem e interrompam o estado de espalhamento, o fluido folicular sobre o prato deve ser suficientemente fino durante o corte para evitar a flutuação do OCCC. (iv) O fluido folicular geralmente contém componentes sanguíneos durante a recuperação do oócito. Após o corte, deve-se transferir imediatamente os folículos para uma placa de lavagem para mitigar o impacto da contaminação do sangue e continuar a lavagem após a coleta do oócito.

A retenção de células do cumulus após a remoção parcial garante que os oócitos recebam substâncias essenciais para o desenvolvimento embrionário inicial, como fatores de crescimento e aminoácidos, promovendo o desenvolvimento embrionário15. Estudos anteriores mostraram que a co-cultura de longo prazo pode gerar uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS), levando ao endurecimento da zona pelúcida embrionária e prejudicando o potencial dos embriões. A remoção parcial imediata das células da granulosa, mantendo as células necessárias do cumulus granulosa, reduz as ERO pelas células da granulosa e o consumo de energia nos meios de cultura16. Atualmente, não há um consenso unificado sobre o momento e a proporção de remoção das células da granulosa para fertilização de curto prazo na fertilização in vitro. Os dados obtidos neste estudo sugerem que a remoção imediata de oócitos selecionados para um diâmetro de aproximadamente 2500 μm de CCOCC não impede o desenvolvimento embrionário subsequente ou o processo de observação para fertilização in vitro convencional e de curto prazo.

Uma limitação significativa dessa técnica é o potencial de variabilidade no grau de adesão entre os oócitos e as células do cumulus, o que pode afetar a consistência dos resultados. Além disso, embora a abordagem de remoção parcial imediata reduza os tempos de observação, ela requer uma execução precisa para evitar danos ao oócito ou comprometer o desenvolvimento embrionário subsequente. Mais experimentos são necessários para determinar a quantidade ideal de OCCC restante após o corte. Por exemplo, investigar se manter cerca de 2000 μm de OCCC e pré-marcar uma escala no prato de separação poderia melhorar a avaliação uniforme do tamanho e da faixa de corte do OCCC.

Em conclusão, esta técnica refinada não demonstra efeitos adversos significativos na fertilização ou no desenvolvimento embrionário, tornando-a um método valioso para endossar.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores expressam sua gratidão à equipe do Departamento de Medicina Reprodutiva do Hospital Popular de Meizhou, em Guangdong, China, por sua participação ativa neste estudo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
G-IVFT PLUSVitrolife10136
OVOILVitrolife10029
G-MOPS PLUSVitrolife10130
Falcon 3003 pratoCorning353003
Falcon 3001 pratoCorning353001
Falcon 2001 tuboCorning352001
Falcon 4013 xícaraCorning354013
Falcon 3037 pratoCorning351058
Pasteur pipetaDarwinD1150-5P

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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