Aqui, apresentamos um método otimizado para remover prontamente uma parte dos complexos cumulus-oócitos após a recuperação do óvulo para agilizar o processo de observação da fertilização in vitro, reduzindo o tempo necessário para a remoção das células da granulosa, minimizando a exposição do oócito a elementos externos e não impede o desenvolvimento do embrião, melhorando a eficiência dos procedimentos laboratoriais de fertilização in vitro.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
A remoção parcial imediata de complexos cumulus-oócitos: uma abordagem refinada para observação rápida da fertilização in vitro
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apesar dos rápidos avanços nas tecnologias clínicas e laboratoriais para fertilização in vitro (FIV), uma proporção significativa (10% -15%) dos pacientes continua a apresentar distúrbios de fertilização, levando a baixas taxas de fertilização e à produção de embriões inviáveis. A fertilização de curto prazo envolve a remoção precoce das células da granulosa para observar a extrusão do segundo corpo polar, permitindo a avaliação da fertilização e medidas corretivas precoces para lidar com as baixas taxas de fertilização e a falha completa da fertilização. No entanto, a observação da fertilização de curto prazo na fertilização in vitro é impedida por desafios como aglomerados excessivamente grandes não processados de complexos cumulus-oócitos e adesão entre óvulos, necessitando de procedimentos externos complexos para remoção de células da granulosa e duração prolongada da observação. Para resolver esse problema, este estudo propõe um método de remoção parcial imediata das células da granulosa após a recuperação do óvulo. Essa abordagem agiliza os estágios subsequentes de fertilização de curto prazo e o monitoramento tradicional da fertilização, reduz o tempo necessário para a extrusão do oócito, minimiza a probabilidade de impactos ambientais externos nos oócitos e diminui o risco de perder a janela crítica de observação da fertilização. Consequentemente, o estudo produz novas evidências clínicas destinadas a aumentar a eficiência operacional dos laboratórios embrionários na fertilização in vitro.
Introdução
No campo da fertilização in vitro-transferência de embriões (FIV-ET), a taxa de fertilização típica fica na faixa de 60% a 80%1. No entanto, aproximadamente 4% a 16% dos casos apresentam falha completa na fertilização ou baixas taxas de fertilização, apresentando desafios na previsão 2,3. Para melhorar os resultados clínicos da gravidez e diminuir as ocorrências de não fertilização completa e baixa fertilização, a utilização de fertilização de curto prazo em procedimentos de fertilização in vitro está aumentando4. Essa abordagem envolve a remoção imediata de células da granulosa para monitorar a extrusão do segundo corpo polar, avaliar o status da fertilização e, potencialmente, conduzir a injeção intracitoplasmática corretiva de espermatozóides (ICSI). A ligação entre o complexo celular do cumulus oócito (OCCC) e o oócito é mais forte durante a fertilização de curto prazo em comparação com a fertilização tradicional durante a noite, aumentando assim o desafio da remoção do OCCC5. Fatores como excesso de número de oócitos, grandes complexos OCCC ou aderências entre oócitos podem levar a tempos prolongados de remoção de células da granulosa durante a fertilização de curto prazo, estendendo assim o período em que os óvulos permanecem fora da incubadora4. Para otimizar o período de observação da fertilização, foi desenvolvida uma abordagem modificada pós-recuperação de óvulos, envolvendo a excisão parcial de células da granulosa de oócitos com complexos OCCC significativos. Essa técnica auxilia na retenção das células da granulosa ao redor dos oócitos, preservando a integridade da estrutura inicial do oócito6 e permitindo que essas células continuem fornecendo fatores vitais para a maturação do oócito e subsequente ligação fertilização-embrião7.
Consequentemente, este estudo se concentra em pacientes submetidos a tratamento de fertilização in vitro-ET em um centro de medicina reprodutiva como participantes da pesquisa, com o objetivo de investigar o impacto de um método de excisão mecânica de células da granulosa parcial imediata na duração dos procedimentos para fertilização de curto prazo e monitoramento noturno da fertilização, ao mesmo tempo em que avalia os resultados da fertilização normal e do desenvolvimento em estágio avançado. Esta pesquisa pretende oferecer informações valiosas para melhorar os procedimentos laboratoriais de embriões na fertilização in vitro.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com os procedimentos operacionais padrão do Departamento de Medicina Reprodutiva do Hospital Popular de Meizhou e foram submetidos à revisão pelo Comitê de Ética do mesmo departamento. O consentimento informado por escrito foi obtido de cada casal participante. O estudo incluiu participantes submetidos ao primeiro ciclo de fertilização in vitro com clivagem ou transferência de embriões em estágio de blastocisto, bem como mulheres entre 20 e 45 anos de idade. Os critérios de exclusão incluíram o uso de óvulos/espermatozoides de doadores e condições específicas, como anormalidades uterinas congênitas ou secundárias (por exemplo, útero septado, útero unicorno, didelfos uterinos), adenomiose, miomas submucosos uterinos ou espessura endometrial abaixo de 7 mm no dia da transferência do embrião. Um total de 115 pacientes inscritos entre dezembro de 2023 e fevereiro de 2024 foram estratificados em dois grupos com base na realização da remoção parcial imediata do OCCC.
1. Preparação antes da coleta do oócito
- Coloque os pratos de recolha de ovócitos (Tabela de Materiais) na incubadora a 37 °C durante a noite.
- Incubar 12 mL de meio manipulador de folículo (Tabela de Materiais) em tubos de ensaio redondos de fundo de 14 mL a 37 ° C durante a noite. Transfira os tubos para o suporte de tubo de ensaio pré-aquecido 30 minutos antes da recuperação do oócito.
- Prepare o meio manipulador de folículos: Adicione 9 mL de meio manipulador de folículos a um tubo de ensaio de fundo redondo de 14 mL (Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C durante a noite. No dia da coleta do oócito, transfira 4,5 mL do meio para uma placa de coleta de oócitos pré-incubada (Tabela de Materiais) coberta com 2 mL de óleo de parafina 100%.
- Prepare a solução de lavagem OCCC: Adicione 4,5 mL de meio de fertilização (Tabela de Materiais) a uma placa de coleta de oócitos e incube a 37 ° C durante a noite.
- Prepare o meio de fertilização: Adicione 1 mL de meio de fertilização a um prato de 6 cm coberto com óleo de parafina 100% (Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C durante a noite.
- Prepare as pipetas de vidro Pasteur (Tabela de Materiais): Suavemente embote e arredonde as pontas, queimando-as em uma lâmpada de álcool por cerca de 5 s (Figura 1). Prenda uma cabeça de sucção na ponta das pipetas Pasteur, garantindo que ela possa tocar o fundo do prato sem arranhar. Lave as pipetas de vidro Pasteur e os pratos de 10 cm com um meio de manipulação de folículos.
2. Recuperação de oócitos e remoção parcial imediata de OCCC
NOTA: Use um estereomicroscópio durante os procedimentos de isolamento de oócitos e remoção de OCCC. Para obter os melhores resultados, todos os procedimentos devem ser realizados em uma mesa de aquecimento com controle de temperatura (37 °C) e todos os equipamentos devem ser pré-aquecidos 30 minutos antes da coleta do oócito.
- Colete o fluido folicular pré-ovulatório durante a recuperação do oócito de acordo com as recomendações da ESHRE8.
- Resumidamente, use uma agulha de 17 G para recuperar os oócitos sob orientação de ultrassom transvaginal. A pressão negativa apropriada varia de 120-140 mmHg.
- Despeje o fluido folicular coletado no tubo de ensaio de fundo redondo de 14 mL em um prato de 10 cm (Tabela de Materiais), mantendo uma profundidade de fluido inferior a 0,5 cm. Coloque o prato em uma plataforma de temperatura constante (37 °C).
- Observe o OCCC sob um estereomicroscópio para confirmar a presença de oócitos e avaliar sua maturidade.
NOTA: A maturidade do OOOC é avaliada com base na morfologia das células do cumulus e na visibilidade de certas estruturas do oócito9. - Aspire o OCCC usando uma pipeta Pasteur de ponta romba. Incline o prato de 10 cm cerca de 15 graus e espalhe todo o OCCC grande. Evite aspirar o oócito e as células da granulosa circundantes em um raio de 2500 μm. Corte o excesso de células da granulosa com a pipeta de Pasteur ao longo do eixo longitudinal (Figura 2). As etapas detalhadas são as seguintes:
- Observe a olho nu para ver se há uma massa mucóide translúcida acinzentada no fluido folicular. Se não for encontrado, procure rapidamente a massa mucóide translúcida acinzentada girando no sentido horário de fora para dentro sob um estereomicroscópio, o OCCC.
- Confirme se há oócitos no OCCC e faça uma avaliação preliminar da maturidade do oócito.
- Em seguida, pré-prepare uma pipeta de aspiração de silicone com uma pipeta Pasteur redonda polida por chama, aspire o OCCC e, ao mesmo tempo, levante suavemente o prato de cultura na posição das 9 às 10 horas com o dedo anelar esquerdo da mão segurando o prato de 10 cm, inclinando o prato de cultura ligeiramente cerca de 15° para a esquerda (colocar o dedo anelar sob o prato é aproximadamente o ângulo necessário).
- Enquanto cuspia o OCCC aspirado na posição de 11 horas do prato, alongue-o suavemente horizontalmente para a direita. Em seguida, observe o tamanho das células da granulosa ao redor do OCCC expandido. Em seguida, na posição adequada do OCCC alongado horizontalmente, use a pipeta Pasteur para fazer um corte descendente rápido e suave nas células da granulosa em excesso de cima para baixo.
- Transfira o OCCC cortado para um prato de coleta contendo a solução de lavagem OCCC. Despeje o fluido folicular restante em um recipiente de amostra estéril (Tabela de Materiais). Repita essas etapas até que todos os complexos sejam coletados.
3. Preparação de sêmen e inseminação in vitro
- Colete as amostras de sêmen por ejaculação na manhã da coleta do oócito. Avaliar a concentração, motilidade e morfologia dos espermatozoides sob um microscópio óptico seguindo os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS, 2010)10. Em seguida, transfira o pellet de esperma para um novo tubo de centrífuga e lave-o duas vezes em meio de fertilização11. Incube-os a 6% de CO2 e 37 °C até que seja necessário.
- Inseminar OCCCs com 1 x 105 a 3 x 105 espermatozóides móveis por mililitro em uma única gota aproximadamente 2-3 h após a recuperação na placa de fertilização (Tabela de Materiais). Adicione 6-8 OCCC e 1 mL do meio de fertilização ao prato de fertilização.
NOTA: Após a lavagem do OCCC pegajoso, eles são transferidos para a placa de fertilização usando uma pipeta Pasteur. Solte um OCCC de cada vez, levantando a pipeta suavemente da superfície do líquido antes de liberar a próxima, garantindo que cada OCCC seja colocado individualmente no prato para evitar aglomeração.
4. Remoção de células cumulus
- Para fertilização de curto prazo, siga as etapas descritas abaixo.
- Co-incubar OCCCs com espermatozóides por 4-6 h. Após a incubação, remova mecanicamente as células do cumulus ao redor dos oócitos.
- Aspire os ovócitos usando uma pipeta com um diâmetro interno ligeiramente menor que os oócitos para garantir a remoção completa das células do cumulus.
- Confirme a fertilização observando a presença de dois corpos polares. Oócitos que apresentam um segundo corpo polar são considerados fertilizados.
- Identifique os casos que não mostram o segundo corpo polar como falhas de fertilização, necessitando de ICSI de resgate.
- Para fertilização regular, após 18-20 h de co-incubação, remova as células do cumulus usando as pipetas para avaliação da fertilização.
5. Cultura de embriões
- Cultive e monitore os oócitos fertilizados por 3-5 dias após a coleta do oócito. Avalie a fertilização 20 h após a inseminação para determinar o número de pronúcleos. Posteriormente, cultive cada zigoto individualmente em uma gota média e transfira os embriões pós-fertilização para um meio de clivagem.
NOTA: Um embrião ideal no terceiro dia deve consistir em seis ou mais blastômeros de tamanho igual e exibir uma taxa de fragmentação menor ou igual a 10%12. - A decisão de prosseguir com a cultura de blastocisto depende das preferências do paciente e das circunstâncias específicas, como a quantidade e a qualidade dos embriões obtidos no dia 3. Transfira os embriões do dia 3 para o meio de blastocisto e avalie no dia 5. Use o sistema de pontuação de Gardner para avaliar blastocistos, com blastocistos de alta qualidade com pontuações de ≥ 4 BB13.
6. Medições de resultados e análise estatística
- Relate dados contínuos como a média ± desvio padrão e expresse dados ordinais como proporções. Realize a análise estatística usando o teste t de Student ou o teste qui-quadrado em um software de análise de dados apropriado (aqui, IBM SPSS Statistics). Considerou-se estatisticamente significativo um nível de P < 0,05.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
No grupo submetido a procedimentos curtos de co-incubação, os pacientes que receberam resgate foram excluídos. Das 47 pacientes que receberam inseminação de curto prazo, não foram observadas diferenças significativas em relação à idade das pacientes e ao número de oócitos recuperados (Tabela 1). A remoção parcial imediata do OCCC resultou em um afrouxamento do OCCC remanescente ao redor dos oócitos (Figura 3), facilitando a detecção de um segundo corpo polar. O tempo médio d...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A remoção parcial imediata das células da granulosa pode acelerar o processo de desintegração precoce da fertilização de curto prazo, reduzir o tempo de observação do segundo corpo polar tanto na fertilização de curto prazo quanto na fertilização in vitro convencional e não comprometer o desenvolvimento embrionário subsequente. Atualmente, os laboratórios empregam globalmente várias estratégias para mitigar distúrbios de fertilização e baixas taxas de sucesso. O método preferido envolve ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Agradecimentos
Os autores expressam sua gratidão à equipe do Departamento de Medicina Reprodutiva do Hospital Popular de Meizhou, em Guangdong, China, por sua participação ativa neste estudo.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| G-IVFT PLUS | Vitrolife | 10136 | |
| OVOIL | Vitrolife | 10029 | |
| G-MOPS PLUS | Vitrolife | 10130 | |
| Falcon 3003 prato | Corning | 353003 | |
| Falcon 3001 prato | Corning | 353001 | |
| Falcon 2001 tubo | Corning | 352001 | |
| Falcon 4013 xícara | Corning | 354013 | |
| Falcon 3037 prato | Corning | 351058 | |
| Pasteur pipeta | Darwin | D1150-5P |
Referências
- Chen, C., Kattera, S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h post-insemination in conventional IVF. Hum Reprod. 18 (10), 2118-2121 (2003).
- Barlow, P., et al. Fertilization failure in IVF: why and what next. Hum Reprod. 5 (4), 451-456 (1990).
- Kuczyński, W., et al. Rescue ICSI of unfertilized oocytes after IVF. Hum Reprod. 17 (9), 2423-2427 (2002).
- He, Y., et al. Effect of early cumulus cells removal and early rescue ICSI on pregnancy outcomes in high-risk patients of fertilization failure. Gynecol Endocrinol. 34 (8), 689-693 (2018).
- Turathum, B., Gao, E. M., Chian, R. C. The function of cumulus cells in oocyte growth and maturation and in subsequent ovulation and fertilization. Cells. 10 (9), 2292(2021).
- Bárcena, P., Rodríguez, M., Obradors, A., Vernaeve, V., Vassena, R. Should we worry about the clock? Relationship between time to ICSI and reproductive outcomes in cycles with fresh and vitrified oocytes. Hum Reprod. 31 (6), 1182-1191 (2016).
- Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
- D'Angelo, A., et al. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up. Hum Reprod Open. 2019 (4), hoz025(2019).
- Hu, Y., et al. Transcriptomic profiles reveal the characteristics of oocytes and cumulus cells at GV, MI, and MII in follicles before ovulation. J Ovarian Res. 16 (1), 225(2023).
- Lu, W. H., Gu, Y. Q. Insights into semen analysis: a Chinese perspective on the fifth edition of the WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Asian J Androl. 12 (4), 605-606 (2010).
- Delos Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Hum Reprod. 31 (2015), 685-686 (2016).
- Nagy, Z. P., et al. Pronuclear morphology evaluation with subsequent evaluation of embryo morphology significantly increases implantation rates. Fertil Steril. 80 (1), 67-74 (2003).
- Gardner, D. K., Lane, M., Stevens, J., Schlenker, T., Schoolcraft, W. B. Reprint of: Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer. Fertil Steril. 112 (4), Suppl1 e81-e84 (2019).
- Esfandiari, N., Claessens, E. A., Burjaq, H., Gotlieb, L., Casper, R. F. Ongoing twin pregnancy after rescue intracytoplasmic sperm injection of unfertilized abnormal oocytes. Fertil Steril. 90 (1), e5-e7 (2008).
- Wetzels, A. M., et al. The effects of co-culture with human fibroblasts on human embryo development in vitro and implantation. Hum Reprod. 13 (5), 1325-1330 (1998).
- Kattera, S., Chen, C. Short coincubation of gametes in in vitro fertilization improves implantation and pregnancy rates: a prospective, randomized, controlled study. Fertil Steril. 80 (4), 1017-1021 (2003).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
