Artigo de método

Otimizando a coleta de lágrimas em camundongos para análise de mRNA e proteínas

2.8K vistas

⸱

DOI:

10.3791/66955

⸱

19 de julho de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

Neste artigo

Resumo

A identificação de biomarcadores de RNA e proteínas a partir de lágrimas em modelos de camundongos é uma grande promessa para o diagnóstico precoce em várias doenças. Este manuscrito fornece um protocolo abrangente para otimizar a eficácia e eficiência do isolamento de mRNA e proteína de lágrimas de camundongos.

Resumo

O filme lacrimal é um biofluido altamente dinâmico capaz de refletir alterações moleculares associadas à patologia, não apenas na superfície ocular, mas também em outros tecidos e órgãos. A análise molecular desse biofluido oferece uma maneira não invasiva de diagnosticar ou monitorar doenças, avaliar a eficácia do tratamento médico e identificar possíveis biomarcadores. Devido ao volume limitado de amostras, a coleta de amostras de lágrimas requer habilidades específicas e ferramentas apropriadas para garantir alta qualidade e máxima eficiência. Várias metodologias de amostragem de lágrimas foram descritas em estudos em humanos. Neste artigo, é apresentada uma descrição abrangente de um protocolo otimizado, especificamente adaptado para extrair informações de proteínas relacionadas à lágrima de modelos animais experimentais, especialmente camundongos. Este método inclui a estimulação farmacológica da produção de lágrimas em camundongos de 2 meses de idade, seguida da coleta de amostras usando tiras de Schirmer e a avaliação da eficácia e eficiência do protocolo por meio de procedimentos padrão, SDS-PAGE, qPCR e PCR digital (dPCR). Este protocolo pode ser facilmente adaptado para a investigação da assinatura da proteína lacrimal em uma variedade de paradigmas experimentais. Ao estabelecer um protocolo de amostragem de lágrimas acessível, padronizado e otimizado para modelos animais, o objetivo era preencher a lacuna entre a pesquisa em humanos e animais, facilitando estudos translacionais e acelerando os avanços no campo da pesquisa de doenças oculares e sistêmicas.

Introdução

As lágrimas são consideradas um ultrafiltrado plasmático e também foram descritas como um fluido intermediário entre o soro plasmático e o líquido cefalorraquidiano devido a uma sobreposição significativa nas biomoléculas que compartilham1. Foi relatado que as lágrimas humanas contêm proteínas, lipídios lacrimais, metabólitos e eletrólitos2. Recentemente, outras biomoléculas, como mRNAs, miRNAs e vesículas extracelulares, também foram identificadas 3,4,5,6,7.

Nos humanos, as lágrimas basais estão localizadas no filme lacrimal, que consiste em três camadas: a camada lipídica externa, que mantém a superfície da lágrima lisa para nos permitir ver através dela e evitar a evaporação da lágrima; a camada aquosa média, que mantém o olho hidratado, repele bactérias, protege a córnea e constitui 90% do filme lacrimal; e, finalmente, a camada de mucina, uma família de proteínas de alto peso molecular que estão em contato com a córnea e permitem que a lágrima adira ao olho8. A distribuição lacrimal pela superfície ocular começa com a secreção da glândula lacrimal. Esse fluido é então guiado através de dutos lacrimais para passar pela superfície do olho e fluir para os canais de drenagem. Cada piscar permite que as lágrimas se dispersem uniformemente por todo o olho, mantendo-o úmido9.

O filme lacrimal é um biofluido altamente dinâmico capaz de refletir alterações moleculares que ocorrem não apenas na superfície ocular, mas também em outros tecidos e órgãos. A análise da expressão diferencial nesse biofluido representa uma abordagem promissora para a descoberta de biomarcadores em doenças humanas 10,11. A utilização do filme lacrimal como fonte de biomarcadores para o diagnóstico precoce em diversas patologias tem sido muito facilitada pela presença de métodos de coleta não invasivos. O método mais comum para coleta de lágrimas em clínicas humanas e veterinárias envolve o suporte baseado em membrana (tira de Schirmer), que opera com base no princípio da ação capilar, permitindo que a água nas lágrimas viaje ao longo do comprimento de uma tira de teste de papel ou tubos capilares colocados no saco conjuntival inferior do sujeito 12,13,14. Apesar da limitação inerente à obtenção de um pequeno volume de amostra por meio desse método, a análise bioquímica da composição da lágrima usando várias técnicas sensíveis facilitou a identificação de potenciais moléculas biomarcadoras11,15. Protocolos para otimizar e avaliar a eluição de proteínas lacrimais de tiras e capilares de Schirmer em pacientes humanos estão bem documentados16,17. No entanto, descrições completas de protocolos otimizados projetados especificamente para extrair informações moleculares relacionadas a lágrimas de modelos animais experimentais estão disponíveis, mas são escassas. Os métodos existentes, como a indução lacrimal por meio da estimulação direta da glândula lacrimal18, ao mesmo tempo em que permitem a coleta de volumes maiores, são invasivos e podem causar desconforto aos animais. Métodos não invasivos, como a coleta de lágrimas da superfície ocular, têm sido descritos como uma forma de isolar DNA e miRNAs19,21.

Este protocolo visa estabelecer um método econômico e otimizado para coletar e processar lágrimas em camundongos. O método prioriza a não invasividade enquanto obtém volumes lacrimais suficientes adequados para análise molecular por meio de técnicas como SDS-PAGE, qPCR e dPCR. As informações extraídas de proteína e conteúdo de mRNA podem então ser utilizadas para identificar potenciais biomarcadores em modelos experimentais existentes de doenças.

Protocolo

Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Os animais de laboratório foram tratados e manuseados em estrita conformidade com as diretrizes de uso de animais da revista e de acordo com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual. A saúde ocular antes e após os procedimentos foi avaliada por meio da avaliação de secreções oculares, pálpebras inchadas, anormalidades oculares e alterações de comportamento.

1. Animais e preparação de reagentes

  1. Use três camundongos machos C57BL / 6 de 2 meses de idade por repetição para o procedimento, com um peso inicial de ~ 25 g (Figura 1). Processe cada mouse individualmente e coloque-o em uma almofada de aquecimento para manter o calor.
  2. Para induzir a secreção lacrimal, prepare uma solução estoque de pilocarpina a 20 mg / mL usando água estéril.
  3. Corte as tiras de teste de Schirmer em 5 mm de comprimento e dobre cada tira no entalhe em um ângulo de 90°.
  4. Prepare 250 μL de água estéril com um inibidor de protease (1 comprimido para 50 mL, de acordo com as instruções do fabricante).

2. Estimulação e coleta da produção de lágrimas

  1. Pese cada camundongo individualmente para calcular a dosagem apropriada de tratamentos.
  2. Para estimular a produção lacrimal, administrar 30 mg/kg de pilocarpina por via intraperitoneal com uma seringa de insulina de 6 mm (Figura 1B). Aguarde 2 minutos após a injeção do medicamento para que seus efeitos se manifestem.
    NOTA: Os dados de animais não estimulados não puderam ser obtidos devido à disponibilidade limitada de fluido lacrimal.
  3. Colete as lágrimas colocando a extremidade de cada fragmento de tira de Schirmer sobre o centro da pálpebra inferior com uma pinça e mantenha-a no lugar até que a lágrima atinja o limite da tira (Figura 1C). Em seguida, substitua a tira. Coloque sequencialmente 2 tiras de Schirmer em cada olho, com um intervalo de 2 minutos entre as tiras para coleta. O processo de coleta de lágrimas requer cerca de quatro fragmentos de tiras ao longo de 10 minutos por mouse.
  4. Coloque os fragmentos da tira de Schirmer em tubos estéreis no gelo para evitar a degradação dos componentes. Assim que a coleta terminar, inicie o processamento de rasgos.

3. Isolamento de proteínas

  1. Colocar os fragmentos da tira num tubo de microcentrífuga de 600 μL contendo 20 μL de água estéril com um inibidor de protease e centrifugar durante 1 h a 600 x g a 4 °C, como anteriormente indicado17 (Figura 1D).
  2. Fazer uma punção com uma agulha injectora de aço inoxidável de 7,5 cm na ponta do tubo de 600 μL que contém a amostra (figura 1E). Em seguida, transferir esse tubo perfurado para um novo tubo esterilizado de 1,5 mL e centrifugar as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 °C, conforme relatado anteriormente17, para recuperar o volume de lágrimas diluídas. O volume do filme lacrimal (sobrenadante) estará no fundo do tubo.
  3. Crie um pool de proteínas combinando o sobrenadante recuperado de todas as amostras. Neste experimento, foi obtido um volume total de aproximadamente 200 μL.
    NOTA: A produção de lágrimas pode durar mais de 1 hora. Durante esse tempo, as lágrimas ainda podem ser coletadas.
  4. Quantifique o conteúdo total de proteína da poça lacrimal usando o método padrão de Bradford22.

4. Análise SDS-PAGE

  1. Aqueça as amostras de proteína a 99 °C por 4 min para desnaturar as proteínas. Vortex as amostras brevemente para misturar os componentes.
  2. Carregar 30 μg de teor de proteína quantificado de cada amostra num gel SDS-PAGE a 10% (Quadro 1) e executar as amostras a 90 V durante 2 h utilizando um método padrão23.
  3. Após a eletroforese, cubra o gel com solução de coloração (Tabela 1) e incube por 30 min para corar as proteínas.
  4. Enxágue o gel com a solução de descoloração várias vezes até que o fundo fique claro e as faixas de proteína fiquem visíveis.
  5. Adquira imagens com um sistema de documentação em gel.

5. Isolamento de mRNA para qPCR e PCR digital

  1. Coloque as tiras em um tubo de microcentrífuga de 600 μL contendo 20 μL de água estéril. Faça uma punção na ponta do tubo contendo a amostra, coloque-a em um novo tubo esterilizado de 1,5 mL e centrifugue, conforme relatado anteriormente em lágrimas humanas3, por 20 min a 2.000 x g a 4 °C (Figura 1E-H).
  2. Crie um pool de todos os exemplos. O volume recuperado deste experimento foi de aproximadamente 22 μL de sobrenadante para cada camundongo, ou seja, 66 μL de volume total. Coloque os tubos em gelo seco para evitar a degradação da biomolécula.
  3. Adicionar 200 μL de solução monofásica de isotiocianato de fenol e guanidínio (obtido comercialmente) e homogeneizar por pipetagem. Deixe repousar por 5 min em temperatura ambiente. Nesta etapa, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C por várias semanas ou a -70 °C por vários meses.
  4. Adicione 40 μL de clorofórmio e misture em um vórtice por 15 s. Deixe repousar por 2 min em temperatura ambiente. Centrifugue a 10.000 x g por 15 min a 4°C.
  5. Transfira cuidadosamente a fase aquosa (sem tomar a interfase) para um novo tubo de 1,5 ml.
  6. Adicione 0,5 μL de glicogênio (0,05 μg/μL) a 100 μL de isopropanol e misture pipetando. O glicogênio é co-precipitado com o RNA e não interfere nas etapas subsequentes.
  7. Deixe repousar por 10 min a -20 °C. Centrifugue a 10.000 x g por 10 min a 4 °C. Transvase rapidamente o sobrenadante.
  8. Adicione 200 μL de etanol frio a 75% e ressuspenda o pellet de RNA por vórtice. Centrifugue a 8.000 x g por 5 min a 4 °C.
  9. Transvase o etanol. Sem inverter o tubo, deixe secar ao ar por 20-30 min. Adicione 20 μL de água livre de RNase e ressuspenda.
  10. Proceder à leitura da densidade óptica no espectrofotómetro de microvolume a 260 nm e 280 nm para avaliar a pureza do RNA. As amostras devem estar no gelo.
    NOTA: As bandas ribossômicas 28S e 18S não podem ser observadas usando um gel de agarose devido à natureza da amostra. A presença de outros RNAs, como miRNAs ou mRNAs, pode ser analisada por meio de um bioanalisador, como mostrado anteriormente18.
  11. Sintetize o cDNA do RNA das lágrimas usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
    1. Comece com um RNA de entrada em uma faixa de 10 ng-5000 ng; de acordo com o kit utilizado, misture com 1 μL de Oligo (dT) e até 12 μL de água livre de RNase. Centrifugar a 500 x g durante 30 s e incubar a 65 °C durante 5 min.
    2. Adicione ao tubo de mistura 4 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de inibidor de RNase, 2 μL de mistura dNTP e 1 μL de transcriptase reversa.
    3. Gire o tubo a 500 x g por 30 s para puxar a mistura para baixo. Em seguida, incubar o tubo a 42 °C durante 60 min. Termine a reação incubando o tubo a 70 °C por 10 min.
  12. Devido à baixa concentração de mRNA nas lágrimas, recomenda-se o uso de cDNA não diluído para qPCR24. Para este experimento, foram utilizados 150 ng de cDNA. Execute qPCR usando primers DNMT3a :
    Direto: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Reverso: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA e primers GAPDH :
    Avançar: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA, Reverso: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC seguindo as instruções dos fabricantes e procedimentos do equipamento.
    1. Para o ciclo de qPCR, use o seguinte programa: Desnaturação inicial: 95 ° C por 10 min seguido por 45 ciclos de C 95 ° C - 15 s, 60 ° C - 30 s e 72 ° C - 30 s, terminando com uma extensão final a 72 ° C por 5 min.
    2. Realize uma análise da curva de fusão para avaliar a presença de dímeros de primer ou amplicons inespecíficos na reação. A rampa de temperatura começou de 50 °C a 99 °C finais, com uma retenção inicial de 90 s para a primeira etapa e uma retenção de 5 s entre cada etapa.
    3. Para dPCR25, execute diluições seriadas para otimizar a quantidade de cDNA necessária para detectar o mRNA de interesse. Neste experimento, use as seguintes diluições de cDNA em água livre de nuclease: 150 ng, 75 ng, 37,5 ng e 18,75 ng de cDNA. Foram utilizados primers para DNMT3a mencionados anteriormente. Para o ciclo de dPCR, use o seguinte programa: desnaturação inicial: 95 °C por 2 min seguido por 40 ciclos de 95 °C - 15 s e 60 °C - 30 s.

Resultados

O protocolo descrito neste artigo fornece um método fácil e acessível para obter informações moleculares do fluido lacrimal usando técnicas comumente disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular. Além disso, o protocolo pode ser ampliado empregando técnicas altamente sensíveis, como ELISA para detecção de atividade enzimática.

Após esses procedimentos, o rendimento total de proteína foi de aproximadamente 3-4 μg / μL. A análise da página SDS corada com Coomassie de extratos de proteínas totais revela padrões de expressão de proteínas na retina total e nas lágrimas ( Figura 2A ).

O RNA isolado teve uma taxa de absorção UV de 260/280 entre 1,9 e 2,0. O rendimento médio foi de 134,8 ng/μL. qPCR foi realizada usando conjuntos de primers para um gene de limpeza (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, GAPDH)3 e um gene biomarcador putativo (DNA-metil transferase 3a, DNMT3a)26. Uma amostra de cDNA não diluída 1:1 (150 ng) foi usada.

Uma análise da curva de fusão foi realizada e as taxas de Ct foram calculadas no software qPCR. Todos os experimentos foram realizados em duplicata. A análise revelou valores de Ct entre 20 e 24, que é uma faixa adequada da quantidade inicial de mRNA alvo na amostra (Figura 2B). No entanto, a análise da curva de fusão na Figura 2C sugere a baixa presença de mRNA alvo. No entanto, o gel de agarose a 2% confirmou a presença de amplicons no tamanho esperado (Figura 2D).

A dPCR foi realizada usando o mesmo par de conjuntos de primers para DNMT3a. As amostras de cDNA utilizadas foram 1:1 (150 ng), 1:2 (75 ng), 1:4 (37,5 ng), 1:8 (18,75 ng). Todos os experimentos foram realizados em duplicata. A dPCR foi capaz de detectar de 1,33 cópias/μL na amostra não diluída a 0,45 cópias/μL na amostra diluída em 8 vezes (Figura 3A,3B). Assim, a dPCR mostrou uma sensibilidade aumentada ao mRNA alvo presente nas lágrimas em comparação com a qPCR.

figure-results-1
Figura 1: Esquema do protocolo de extração lacrimal de camundongos. (a) Coleta de lágrimas. Foram utilizados três camundongos C57BL/6J de 2 meses de idade. (B) A produção de lágrimas foi induzida farmacologicamente pela administração intraperitoneal de pilocarpina. Fotografia ilustrando a colocação da tira de Schirmer. (c) Processamento de lágrimas. As lágrimas foram então coletadas usando tiras de Schirmer por 10 min e transferidas para tubos de microcentrífuga. (D) As lágrimas coletadas nas tiras de Schirmer foram centrifugadas com água estéril e inibidores de protease ou apenas água estéril. (E, F) Esses tubos foram perfurados na parte inferior e posteriormente transferidos para um novo tubo esterilizado de 1,5 mL para facilitar a ilusão do fluido. (G, H) As lágrimas são coletadas no mL de 1,5 tubo. (I) Fotografia representativa do procedimento de coleta de lágrimas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Análise a jusante do filme lacrimal para aplicações moleculares. (A) SDS-PAGE de lágrimas de camundongo e um extrato de proteína da retina. MW: Marcador de peso molecular; faixa 1: Perfis proteicos da retina (30 μg); Pista 2: perfis proteicos das lágrimas (30 μg). (B) qPCR para GAPDH e DNMT3a em lágrimas de camundongos. A média da TC e do TC são mostradas na Tabela 2. (C) Análise da curva de fusão para produtos de PCR DNMT3a e GAPDH . O eixo y representa a taxa de variação da fluorescência na reação de amplificação (dF/dT) e o eixo x representa a temperatura em °C (D) Análise do amplicon de PCR em eletroforese em gel de agarose a 2% contendo 0,5 μg/mL de brometo de etídio. Pista M: 1 kb mais escada de DNA. Pista 1,2: GAPDH e DNMT3a PCR amplicon, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: PCR digital (dPCR) para expressão de DNMT3a em lágrimas de camundongos. (A) Os resultados de dPCR são exibidos como um gráfico de dispersão 1D mostrando em pontos azuis as cópias de transcrição de DNMT3a . Os pontos pretos são partições sem as cópias de transcrição DNMT3a presentes. (B) Uma série de diluição de cDNA foi gerada para determinar a concentração ideal para quantificar as cópias de transcrição de DNMT3a . As barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome do MaterialDescrição
10% de gel SDSPara um gel de separação: 3,8 mL de H2O destilado; 2,6 mL de Tris; pH 8,8; 1,5 M 3,4 mL de acrilamida; 100 μL 10% SDS; 100 μL 10% APS; 4 μL TEMED.
Para um gel coletor: 2,72 mL de H2O destilado, 0,52 mL de Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,68 mL de acrilamida, 40 μL 10% SDS, 40 μL 10% APS 4 μL TEMED.
Tampão de eletroforese250 mM Base Tris, 2 M Glicina, 1% SDS
Solução de coloraçãoDissolva os seguintes reagentes em 43 mL de água (armazene em temperatura ambiente em frasco âmbar): Coomassie 0,25 g; ácido acético 7 mL; metanol 50 mL
Solução de descoloraçãoDissolva os seguintes reagentes em 63 mL de água (armazene em temperatura ambiente): ácido acético 7 mL; etanol 30 mL

Tabela 1. Configure para a página do SDS.

Nome do geneCT1CT2Média com SDΔCT
GAPDH20.1420.7320.44±0.17
DNMT3a24.5924.9724,78±0,074.35

Tabela 2. Valores de Ct de DNMT3a e GAPDH em lágrimas de camundongos.

Discussão

O fluido lacrimal é facilmente acessível, e a determinação de biomarcadores nas lágrimas pode ser empregada como uma técnica complementar bem-sucedida para o diagnóstico precoce de várias doenças humanas27. Embora a análise bioquímica da composição da lágrima em modelos animais experimentais complemente essa abordagem e prometa um progresso significativo na compreensão da base molecular das doenças, há uma escassez de dados e protocolos disponíveis, o que nos levou a desenvolver um. O método descrito neste relatório é tecnicamente simples de executar e permite a identificação preliminar da expressão diferencial de diferentes moléculas candidatas associadas à doença.

A coleta lacrimal pode ser realizada por meio de vários métodos, como tubos capilares e tiras de Schirmer16,17, swabs28e esponjas29. O método da tira de Schirmer foi preferido devido à sua facilidade de acesso, capacidades quantitativas, adaptabilidade durante a coleta de amostras, custo e simplicidade na extração de componentes lacrimais para processamento laboratorial. Além disso, esse método é econômico, minimamente invasivo e não apresenta risco de lesão ou dano à córnea, graças à composição da tira de papeldo filtro 16,17. As etapas críticas deste protocolo incluem a necessidade de estimulação farmacológica da produção de lágrimas usando pilocarpina e a seleção de um tampão de eluição apropriado.

A pilocarpina é um agonista colinérgico que se liga aos receptores muscarínicos M3 e pode causar estimulação farmacológica das glândulas exócrinas, aumentando a produção lacrimal, a secreção salivar e a micção. Embora estudos em humanos tenham demonstrado que a estimulação lacrimal não altera a osmolaridade do líquido coletado30, ela influencia claramente os perfis proteicos31. O uso da pilocarpina como estimulador farmacológico colinérgico de glândulas exócrinas e intensificador da secreção lacrimal foi relatado com sucesso em coelhos e camundongos 19,32,33, mas o efeito da estimulação no conteúdo proteico não foi avaliado. Para evitar essa limitação e permitir uma comparação precisa dos perfis de rasgo entre as condições experimentais, é crucial considerar as configurações específicas de coleta. Da mesma forma, a introdução de uma etapa de enxágue antes da coleta de lágrimas pode ser benéfica para evitar a contaminação prévia da superfície ocular. Nesse protocolo, foi empregada uma concentração de 30 mg/kg de pilocarpina13. Como os camundongos permaneceram imóveis e calmos após a injeção dessa droga, as lágrimas foram coletadas sem anestesia, facilitando a coleta da amostra.

A escolha de um tampão de eluição apropriado está intimamente relacionada ao método selecionado para analisar a composição bioquímica de uma amostra de lágrima e a taxa de recuperação de material biológico da tira. Por exemplo, em um estudo comparativo com foco na retenção de proteínas das tiras de Schirmer em pacientes, foi estabelecido que um tampão composto por 100 mM de bicarbonato de amônio junto com 0,25% de Nonidet P40 (NP40) produziu resultados superiores para aplicações de proteômica ou análise ELISA multiplex17. Em nossas mãos, o uso de água estéril mostrou-se suficiente para visualizar extratos proteicos totais em SDS-PAGE e detectar o mRNA dos genes de interesse por PCR.

Para avaliar a presença de mRNA de DNMT3a e GAPDH em lágrimas de camundongos, comparamos o desempenho de qPCR e dPCR. A presença de dímeros de primer observada na curva de fusão de qPCR é atribuída à baixa abundância do transcrito DNMT3a . Conforme demonstrado, o dPCR tem sensibilidade e eficácia significativamente maiores na detecção do mRNA alvo nessas amostras em amostras não diluídas e diluídas. Essa capacidade de detecção precisa torna o dPCR o método preferido para análise lacrimal em camundongos, oferecendo aos pesquisadores e médicos uma ferramenta confiável para estudos futuros e possíveis aplicações clínicas.

O desenvolvimento de um protocolo padronizado para coleta de amostras de lágrimas em modelos animais representa um avanço significativo na pesquisa. Este protocolo não só facilita a coleta sistemática e precisa de amostras de lágrimas, mas também abre uma ampla gama de possibilidades para sua aplicação em várias áreas de estudo. A capacidade de obter amostras de lágrimas de modelos animais permite a investigação de um amplo espectro de doenças e condições, bem como a exploração de novos biomarcadores e terapias potenciais. Além disso, ao estabelecer um protocolo padronizado, promove-se a reprodutibilidade dos resultados em diferentes estudos e laboratórios, contribuindo assim para a validade e confiabilidade da pesquisa. Em última análise, esse avanço na metodologia de coleta de amostras lacrimais em modelos animais tem o potencial de impulsionar descobertas importantes e melhorar a compreensão da fisiopatologia de várias doenças, abrindo novos caminhos para diagnóstico, tratamento e prevenção.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela VELUX STIFTUNG [projeto 1852] para M.L. e bolsas de pós-graduação da CONAHCYT para M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) e A.M.F (CVU 1317418). Sinceros agradecimentos a todos os membros do laboratório, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento e Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) por suas contribuições para as discussões estimulantes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-mercaptoetanolGibco1985023
2x tampão LaemmliBio-Rad16-0737
Ácido acéticoQuímica Meyer64-19-7
AcrilamidaSigma-AldrichRolamento A4058
Reagente de BradfordSigma-AldrichB6916
ClorofórmioSigma-Aldrich1003045143
Coomassie Azul R 250Biológico dos EUA6104-59-2
EtanolQuímica Rique64-17-5
GeneRuler 1kb mais escada de DNAThermofisher científicoSM1331
GlicerolBiológico dos EUAG8145
GlicinaSANTA CRUZSC- 29096
GlicogénioRoche10901393001
HclQuímica Rique7647-01-0
Álcool isopropílicoQuímica Rique67-63-0
MetanolQuímica Meyer67-56-1
Microtubos 1,5 mlAxygenMCT-150-C
Micro tubos 600 µ lAxygenMCT-060-C
NaClSigma-AldrichS3014
Tubos de PCR & TirasNovasbioPCR 0104
PilocarpinaSigma-AldrichPág. 6503-10g
Inibidor de proteaseRoche11873580001
Kit de PCR QIAcuity EvaGreen (5mL)Qiagen250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24 poços (10)Qiagen250001
Real qPlus 2x Master Mix VerdeAmpliqonA323402
Kit de Síntese de cDNA RevertAid First StradThermofisher científicoK1622
Tiras de teste de SchirmerLaboratório SantgarSANT1553
SDSSigma-AldrichL3771
TEMEDSigma Aldrich102560430
Reagente TRISigma-AldrichT9424-200MLsolução monofásica de isotiocianato de fenol e guanidínio
TrisBiológico dos EUAT8650
Base TrisQuímica Cruzsc-3715A

Referências

  1. Ravishankar, P., Daily, A. Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood. Appl Sci. 12 (6), 2884(2022).
  2. Masoudi, S. Biochemistry of human tear film: A review. Exp Eye Res. 220, 109101(2022).
  3. Dara, M., et al. Novel RNA extraction method from human tears. Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).
  4. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  5. Arslan, M. A., et al. Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip. Exp Eye Res. 237, 109679(2023).
  6. Liu, R., et al. Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease. PloS one. 12 (4), e0173301(2017).
  7. Cross, T., et al. Rna profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  8. Paranjpe, V., Phung, L., Galor, A. The tear film: Anatomy and physiology. Ocular Fluid Dyn: Anat, Physiol, Imaging Tech, and Math Model. , 329-345 (2019).
  9. Jung, J. H., et al. Proteomic analysis of human lacrimal and tear fluid in dry eye disease. Sci Rep. 7 (1), 13363(2017).
  10. Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers. J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).
  11. Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).
  12. Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).
  13. Shiraki, T., Shigeta, M., Tahara, N., Furukawa, H., Ohtsuka, H. A tear production assessment by using Schirmer tear test strips in mice, rats and dogs. Animal Eye Res. 24 (1-2), 1-5 (2005).
  14. Zhao, J., Nagasaki, T. Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes. Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).
  15. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  16. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  17. Koduri, M. A., et al. Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).
  18. Kakan, S. S., et al. Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism. Front Immunol. 13, 833254(2022).
  19. Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5. Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).
  20. Balafas, E., et al. A noninvasive ocular (tear) sampling method for genetic ascertainment of transgenic mice and research ethics innovation. OMICS. 23 (6), 312-317 (2019).
  21. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals mir-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  23. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  24. RealQPlus2x Master Mix Green without ROX. Ampliqon. , Available from: https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/pcr-enzymes/real-time-pcr/realq-plus-2x-master-mix-green (2023).
  25. Qiagen. Quick-Start Protocol QIAcuity EG PCR Kit. Qiagen. , (2023).
  26. Anier, K., Malinovskaja, K., Aonurm-Helm, A., Zharkovsky, A., Kalda, A. DNA methylation regulates cocaine-induced behavioral sensitization in mice. Neuropsychopharmacology. 35 (12), 2450-2461 (2010).
  27. Hagan, S., Martin, E., Enriquez-De-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive, and personalized medicine. EPMA J. 7 (1), 15(2016).
  28. Gasparini, M. S., et al. Identification of sars-cov-2 on the ocular surface in a cohort of covid-19 patients from Brazil. Exp Biol Med. 246 (23), Maywood. 2495-2501 (2021).
  29. Sebbag, L., Harrington, D. M., Mochel, J. P. Tear fluid collection in dogs and cats using ophthalmic sponges. Vet Ophthalmol. 21, 249-254 (2018).
  30. Abusharha, A. A., et al. Analysis of basal and reflex human tear osmolarity in normal subjects: assessment of tear osmolarity. Ther Adv Ophthal. 10, 2515841418794886(2018).
  31. Fullard, R. J., Snyder, C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Inves Opht Vis Sci. 31 (6), 1119-1126 (1990).
  32. Longwell, A., Birss, S., Keller, N., Moore, D. Effect of topically applied pilocarpine on tear film pH. J Pharm Sci. 65 (11), 1654-1657 (1976).
  33. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Prog Ret Eye Res. 28 (3), 155-177 (2009).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Coleta de L grimas de CamundongoAn lise de Prote nas LacrimaisAn lise de mRNATiras de SchirmerEstimula o Farmacol gicaSDS PAGEPCR DigitalBiomarcadores LacrimaisModelos de Doen as Oculares

Artigos relacionados