Otimizando a coleta de lágrimas em camundongos para análise de mRNA e proteínas

Resumo

A identificação de biomarcadores de RNA e proteínas a partir de lágrimas em modelos de camundongos é uma grande promessa para o diagnóstico precoce em várias doenças. Este manuscrito fornece um protocolo abrangente para otimizar a eficácia e eficiência do isolamento de mRNA e proteína de lágrimas de camundongos.

Resumo

O filme lacrimal é um biofluido altamente dinâmico capaz de refletir alterações moleculares associadas à patologia, não apenas na superfície ocular, mas também em outros tecidos e órgãos. A análise molecular desse biofluido oferece uma maneira não invasiva de diagnosticar ou monitorar doenças, avaliar a eficácia do tratamento médico e identificar possíveis biomarcadores. Devido ao volume limitado de amostras, a coleta de amostras de lágrimas requer habilidades específicas e ferramentas apropriadas para garantir alta qualidade e máxima eficiência. Várias metodologias de amostragem de lágrimas foram descritas em estudos em humanos. Neste artigo, é apresentada uma descrição abrangente de um protocolo otimizado, especificamente adaptado para extrair informações de proteínas relacionadas à lágrima de modelos animais experimentais, especialmente camundongos. Este método inclui a estimulação farmacológica da produção de lágrimas em camundongos de 2 meses de idade, seguida da coleta de amostras usando tiras de Schirmer e a avaliação da eficácia e eficiência do protocolo por meio de procedimentos padrão, SDS-PAGE, qPCR e PCR digital (dPCR). Este protocolo pode ser facilmente adaptado para a investigação da assinatura da proteína lacrimal em uma variedade de paradigmas experimentais. Ao estabelecer um protocolo de amostragem de lágrimas acessível, padronizado e otimizado para modelos animais, o objetivo era preencher a lacuna entre a pesquisa em humanos e animais, facilitando estudos translacionais e acelerando os avanços no campo da pesquisa de doenças oculares e sistêmicas.

Introdução

As lágrimas são consideradas um ultrafiltrado plasmático e também foram descritas como um fluido intermediário entre o soro plasmático e o líquido cefalorraquidiano devido a uma sobreposição significativa nas biomoléculas que compartilham¹. Foi relatado que as lágrimas humanas contêm proteínas, lipídios lacrimais, metabólitos e eletrólitos². Recentemente, outras biomoléculas, como mRNAs, miRNAs e vesículas extracelulares, também foram identificadas 3,4,5,6,7.<....

Protocolo

Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Os animais de laboratório foram tratados e manuseados em estrita conformidade com as diretrizes de uso de animais da revista e de acordo com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual. A saúde ocular antes e após os procedimentos foi avaliada por meio da avaliação de secreções oculares, pálpebras inchadas, anormalidades oculares e alterações de comportamento.

1. Animais e preparação de reagentes

1. Use três camundongos mac....

Resultados

O protocolo descrito neste artigo fornece um método fácil e acessível para obter informações moleculares do fluido lacrimal usando técnicas comumente disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular. Além disso, o protocolo pode ser ampliado empregando técnicas altamente sensíveis, como ELISA para detecção de atividade enzimática.

Após esses procedimentos, o rendimento total de proteína foi de aproximadamente 3-4 μg / μL. A análise da página SDS corada com Coomassie de extratos de.......

Discussão

O fluido lacrimal é facilmente acessível, e a determinação de biomarcadores nas lágrimas pode ser empregada como uma técnica complementar bem-sucedida para o diagnóstico precoce de várias doenças humanas²⁷. Embora a análise bioquímica da composição da lágrima em modelos animais experimentais complemente essa abordagem e prometa um progresso significativo na compreensão da base molecular das doenças, há uma escassez de dados e protocolos disponíveis, o que nos levou a desenvolver um. O método descr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-mercaptoetanol	Gibco	1985023
2x tampão Laemmli	Bio-Rad	16-0737
Ácido acético	Química Meyer	64-19-7
Acrilamida	Sigma-Aldrich	Rolamento A4058
Reagente de Bradford	Sigma-Aldrich	B6916
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	1003045143
Coomassie Azul R 250	Biológico dos EUA	6104-59-2
Etanol	Química Rique	64-17-5
GeneRuler 1kb mais escada de DNA	Thermofisher científico	SM1331
Glicerol	Biológico dos EUA	G8145
Glicina	SANTA CRUZ	SC- 29096
Glicogénio	Roche	10901393001
Hcl	Química Rique	7647-01-0
Álcool isopropílico	Química Rique	67-63-0
Metanol	Química Meyer	67-56-1
Microtubos 1,5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micro tubos 600 µ l	Axygen	MCT-060-C
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Tubos de PCR & Tiras	Novasbio	PCR 0104
Pilocarpina	Sigma-Aldrich	Pág. 6503-10g
Inibidor de protease	Roche	11873580001
Kit de PCR QIAcuity EvaGreen (5mL)	Qiagen	250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24 poços (10)	Qiagen	250001
Real qPlus 2x Master Mix Verde	Ampliqon	A323402
Kit de Síntese de cDNA RevertAid First Strad	Thermofisher científico	K1622
Tiras de teste de Schirmer	Laboratório Santgar	SANT1553
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
TEMED	Sigma Aldrich	102560430
Reagente TRI	Sigma-Aldrich	T9424-200ML	solução monofásica de isotiocianato de fenol e guanidínio
Tris	Biológico dos EUA	T8650
Base Tris	Química Cruz	sc-3715A