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Artigo de método

Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico

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DOI:

10.3791/66965

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29 de novembro de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a expressão ectópica mediada por vírus de Neurod1 após acidente vascular cerebral isquêmico cortical. O Neurod1 é administrado (1) usando o sistema Cre-Flex AAV em camundongos do tipo selvagem durante a fase subaguda pós-AVC (7 dias) e (2) usando um único vetor AAV em camundongos repórteres condicionais durante a fase crônica pós-AVC (21 dias).

Resumo

A expressão ectópica de fatores neurogênicos in vivo surgiu como uma abordagem promissora para a substituição de neurônios perdidos em modelos de doenças. O uso de fatores de transcrição de hélice-alça-hélice neural básica (bHLH) por meio de sistemas de partículas semelhantes a vírus não propagados, incluindo retrovírus, lentivírus e vírus adeno-associado (AAV), foi amplamente relatado. Para experimentos in vivo , os AAVs são cada vez mais usados devido à sua baixa patogenicidade e potencial de traduzibilidade. Este protocolo descreve dois sistemas de AAV para investigar a expressão ectópica de fatores de transcrição em células transduzidas pós-acidente vascular cerebral isquêmico. Em ambos os sistemas, a expressão de Neurod1 é controlada pelo promotor GFAP curto (gfaABC(1)D), que é regulado positivamente em astrócitos reativos pós-AVC, bem como em neurônios endógenos quando combinado com a expressão do fator neurogênico. No modelo de AVC isquêmico descrito, a isquemia focal é induzida pela injeção de endotelina-1 (ET-1) no córtex motor de camundongos, criando uma lesão cercada por astrócitos reativos que expressam GFAP e neurônios sobreviventes. Injeções intracerebrais de AAV são realizadas para induzir ectopicamente a expressão de Neurod1 nas fases subaguda (7 dias) e crônica (21 dias) pós-AVC. Semanas após a injeção de AAV, um número significativamente maior de neurônios entre as células transduzidas é identificado em camundongos que expressam ectopicamente Neurod1 em comparação com camundongos que recebem vírus de controle AAV. As estratégias baseadas em AAV usadas replicaram os resultados observados de um número aumentado de neurônios expressando o gene repórter em um modelo de acidente vascular cerebral cortical leve a moderado. Este protocolo estabelece uma plataforma padrão para explorar os efeitos da expressão ectópica de fatores de transcrição administrados com sistemas baseados em AAV, contribuindo para a compreensão da expressão do fator neurogênico no contexto do AVC.

Introdução

O AVC é uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo1. Um derrame acontece quando o fluxo sanguíneo para o cérebro é interrompido. Isso pode ocorrer por meio de um acidente vascular cerebral hemorrágico (~ 15% dos casos), em que um vaso sanguíneo no cérebro se rompe, ou por meio de um acidente vascular cerebral isquêmico, em que o fluxo sanguíneo para o cérebro é bloqueado1. Os AVCs isquêmicos são mais prevalentes e representam ~ 85% dos casos de AVC1. Um derrame reduz o fornecimento de glicose e oxigênio ao cérebro, levando à morte rápida das células neuronais e ao comprometimento da função neural.

O AVC isquêmico leva à perda de células em poucos minutos no núcleo da lesão por meio de mecanismos de excitotoxicidade, estresse oxidativo e nitrosativo, desregulação do cálcio, despolarização do espalhamento cortical, edema, ruptura da barreira hematoencefálica (BHE) e inflamação 2,3. As células nas regiões peri-infarto sofrem morte celular apoptótica em poucas horas e por dias, após o AVC4. O ambiente peri-infarto é exposto a sinais pró e anti-inflamatórios que levam à ativação de micróglias e astrócitos (astrócitos "reativos"), que desempenham papéis diversos após a lesão 5,6,7,8. Os astrócitos reativos sofrem uma série de alterações fenotípicas que incluem a regulação positiva da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e a formação de uma borda ao redor da lesão dentro de dias após o AVC que ajuda a limitar a extensão da lesão, bem como afeta a neuroplasticidade dentro do tecido lesionado 8,9,10.

A reprogramação celular direta permite a conversão de um tipo de célula madura em um tipo de célula madura diferente sem passar por um estado pluripotente11. Transformar células cerebrais residentes em novos neurônios para substituir aqueles perdidos por lesões apresenta um caminho atraente para a restauração do cérebro. O AVC é um alvo ideal para tratamentos baseados em células, dada a necessidade de métodos terapêuticos para substituir os neurônios perdidos, ampliar o período terapêutico e, em última análise, facilitar a recuperação funcional. Para este fim, tem havido muitos artigos demonstrando a reprogramação de astrócitos para neurônios (AtN) in vitro e in vivo, usando uma variedade de fatores de transcrição neurogênicos básicos de hélice-alça-hélice (bHLH), incluindo Ascl1, Neurog2, Neurod1 e, mais recentemente, versões mutantes de Ascl1 (Ascl1-SA6) que demonstraram eficácia de reprogramação aprimorada 11,12,13,14. É importante considerar os muitos fatores de desenho experimental que podem afetar os resultados, a interpretação e as comparações entre os estudos. Ghazale et al. demonstraram que a eficiência de reprogramação de AtN variou entre diferentes cepas de camundongos, sorotipos de AAV e promotores ao usar o mesmo fator de transcrição bHLH14. Outras considerações, como o modelo de lesão, região do cérebro, dosagem viral, tempo de entrega do gene, fator de reprogramação e modo de entrega, afetarão os resultados. Relatórios recentes demonstraram que neurônios transduzidos pré-existentes foram mal interpretados como neurônios reprogramados15,16. Embora os relatórios não neguem necessariamente que a conversão de AtN ocorra, esses estudos destacaram a importância de experimentos bem controlados, e vários artigos apresentaram recomendações para os próximos passos no campo 15,17,18,19. O que é aparente na literatura é que a expressão ectópica de fatores de transcrição bHLH pode melhorar os resultados funcionais em uma variedade de modelos animais de doença/lesão neurodegenerativa 13,20,21,22,23,24.

Aqui, este protocolo Neurod1, um fator de transcrição de interesse, é expresso ectopicamente em células transduzidas13,22. O modelo bem estabelecido de endotelina-1 (ET-1) de acidente vascular cerebral isquêmico para o córtex sensório-motor em camundongos adultos é usado. A injeção de ET-1 leva à vasoconstrição local mimetizando a fisiopatologia do AVC isquêmico, incluindo comprometimento funcional 22,23,25. O promotor GFAP curto comumente empregado (gfaABC(1)D) é usado para conduzir a expressão ectópica de Neurod1 no local da lesão e na região perilesional usando duas estratégias virais: (1) entrega de AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre em camundongos do tipo selvagem e (2) entrega de AAV5-GFAP-Neurod1-Cre em camundongos repórteres tdTom-Cre. Para entender melhor o potencial de expressão ectópica de Neurod1 no cérebro lesionado por AVC, os AAVs foram administrados na fase subaguda (7 dias) ou na fase crônica (21 dias), pós-AVC. Em ambos os paradigmas, significativamente mais neurônios marcados foram encontrados semanas após a expressão ectópica de Neurod1.

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Toronto e segue o Guia para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais (2ª Edição, Conselho Canadense de Cuidados com Animais, 2017). Para este estudo, o repórter tdTom-Cre do tipo selvagem (C57BL/6J) e transgênico (B6. Foram utilizadas linhagens de camundongos Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 . Os camundongos tinham 7-9 semanas de idade e incluíam machos e fêmeas. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cirurgia de AVC com endotelina-1

NOTA: Todos os instrumentos e materiais cirúrgicos são esterilizados em autoclave antes da cirurgia. A estrutura estereotáxica é esterilizada com PREempt. As seringas são esterilizadas com PREempt, álcool 70% e preparadas com PBS estéril antes da cirurgia. A endotelina-1 (ET-1) é armazenada no gelo durante toda a cirurgia.

  1. Antes de iniciar a cirurgia, configure a área de recuperação colocando uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 °C. Alternativamente, se uma lâmpada de aquecimento estiver sendo usada, coloque apenas metade da gaiola sob o calor.
    1. Para anestesiar camundongos com isoflurano, siga o protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais. Coloque o mouse na câmara de indução anestésica e ligue o oxigênio a 1-1,5 L/min, depois ajuste o vaporizador de isoflurano a 3%-5% para iniciar a anestesia.
  2. Remova o animal da câmara quando ele estiver deitado de lado e não puder mais ficar de pé e coloque-o em uma superfície limpa. Certifique-se de que o animal esteja adequadamente anestesiado, confirmando a ausência de reflexo de pinça do dedo do pé antes e durante a cirurgia.
    1. Prenda o cone do nariz estendido da máquina anestésica no animal e ajuste o isoflurano para 1% -2% para manutenção. Minimize a exposição ao isoflurano (5 min a 3%-5% para indução e o tempo restante a 1%-2%), pois o procedimento pode levar até 40 min para ser concluído.
  3. Use aparadores de pêlos de animais para remover o pelo do pescoço/atrás das orelhas até o nariz do animal para expor a pele do crânio para cirurgia.
  4. Pesar o animal e administrar a dose apropriada de analgésico pré-operatório por via subcutânea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) com base no peso.
  5. Aplique pomada lubrificante ocular em cada olho do camundongo para evitar a dessecação da córnea durante a anestesia.
  6. Esterilize a área da pele cortada pelo (etapa 1.3) com etanol a 70%, seguido de álcool clorexidina duas vezes para formar um campo cirúrgico.
  7. Transfira o mouse para uma estrutura estereotáxica do mouse colocando primeiro o nariz no cone do nariz estereotáxico e, em seguida, estabilize o crânio com barras auriculares. Mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 ° C para suporte térmico durante todo o procedimento cirúrgico. Mantenha o isoflurano a 1% -2% para que o camundongo exiba uma frequência respiratória de 1 respiração / s.
  8. Repita a aplicação de lubrificação ocular para evitar a dessecação da córnea durante o procedimento, se necessário. Aplique uma cortina cirúrgica estéril no corpo do camundongo, abaixo das orelhas, para estender o tamanho do campo estéril.
  9. Faça uma incisão vertical paralela ao plano sagital do animal por trás do ponto médio dos olhos até a parte de trás da cabeça (osso parietal) com uma lâmina de bisturi # 10. Exponha o crânio retraindo suavemente a pele para os lados.
  10. Use um cotonete para romper a fáscia do crânio e permitir que o crânio seque para expor o bregma.
  11. Configure os braços manipuladores com o suporte da broca carregando a broca estereotáxica de alta velocidade com uma broca de 0,018".
  12. Faça 3 furos de rebarba (0,018 "de diâmetro) com uma broca estereotáxica de alta velocidade nas coordenadas do córtex sensório-motor direito a 2,25 mm lateral ao bregma e +0,0 mm rostral, +1,0 mm rostral e -1,0 mm caudal ao bregma.
  13. Substitua a broca por uma seringa de 26 G com uma agulha de 0.375" de comprimento.
  14. Carregue 1,5 μL de 400 μM ET-1 dissolvido em PBS estéril na seringa. Para garantir um bom fluxo, libere um pequeno volume de ET-1 até que uma gota possa ser observada na ponta da agulha. Use um cotonete estéril para limpar o excesso antes de realizar uma injeção.
  15. Abaixe a ponta da agulha além do crânio no orifício da rebarba do meio (no córtex sensório-motor direito a + 0,0 anterior e 2,25 mm lateral à bregma) sem perfurar a dura-máter. Uma vez alinhada, abaixe a agulha 1 mm no cérebro.
  16. Injete 1 μL de ET-1 dispensando 0,1 μL de cada vez. Empurre o êmbolo da seringa Hamilton para frente para dispensar 0,1 μL e aguarde um minuto antes de injetar os próximos 0,1 μL, injete até que 1 μL tenha sido dispensado.
    1. Após a dispensação final de 0,1 μL (0,1 μL x 10 injeções = 1 μL no total), mantenha a agulha no lugar por 10 minutos para evitar o refluxo e, em seguida, retire-se lentamente para cima para remover a seringa.
  17. Para garantir que a agulha não fique bloqueada durante a injeção, libere um pequeno volume do ET-1 até que uma gota possa ser observada na ponta da agulha. Use um cotonete estéril para limpar o excesso antes de realizar uma injeção. Esterilize as seringas antes de injetar o próximo animal com PREempt, seguido de álcool a 70% e, em seguida, PBS estéril.
  18. Para fechar a ferida, suture a pele sobrejacente do crânio usando uma sutura estéril de poliéster polissorb 4-0.
  19. Administre pomada antibiótica usando um cotonete na área suturada para prevenir infecções pós-operatórias.
  20. Remova o mouse da estrutura estereotáxica e transfira-o para uma gaiola limpa e pré-aquecida na área de recuperação. Desligue o vaporizador de isoflurano e o oxigênio.
  21. Mantenha a gaiola em cima de uma almofada de aquecimento durante a recuperação da anestesia. Alternativamente, se estiver usando uma lâmpada de aquecimento, coloque o mouse na lateral da gaiola sob a lâmpada para que o mouse possa se mover para o lado frio da gaiola ao acordar da anestesia para evitar superaquecimento. Monitore o mouse à medida que ele sai da anestesia nos próximos 5 a 10 minutos.
  22. Monitore o mouse nos próximos 3 dias (monitoramento de peso), forneça cuidados pós-operatórios (ração úmida para garantir a hidratação) e analgésicos (2 mg/kg de meloxicam, 2x ao dia por via subcutânea, por 2-3 dias) de acordo com os regulamentos estabelecidos pelo comitê local de cuidados com animais.

2. Entrega de Vírus Adeno-Associado (AAV) (7 dias - modelo subagudo ou 21 dias - modelo crônico) pós-AVC

CUIDADO: Consulte as diretrizes institucionais de biossegurança para trabalhar com AAVs. De acordo com as diretrizes da Universidade de Toronto, esta cirurgia é realizada em um Gabinete de Biossegurança de Nível 2 de Contenção.

NOTA: Todos os instrumentos e materiais cirúrgicos são esterilizados em autoclave antes da cirurgia. A estrutura estereotáxica é esterilizada com PREempt. As seringas são esterilizadas com PREempt, álcool 70% e preparadas com PBS estéril. Os AAVs são armazenados no gelo durante toda a cirurgia.

  1. Antes de iniciar a cirurgia, configure a área de recuperação colocando uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 °C. Alternativamente, se uma lâmpada de aquecimento estiver sendo usada, coloque apenas metade da gaiola sob o calor.
    1. Para anestesiar camundongos usando isoflurano, coloque o camundongo na câmara de indução anestésica e ligue o oxigênio a 1-1,5 L/min, depois ajuste o vaporizador de isoflurano a 3%-5% para iniciar a anestesia (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente).
  2. Remova o animal da câmara quando ele estiver deitado de lado e não puder mais ficar em uma superfície limpa. Certifique-se de que o animal esteja adequadamente anestesiado, confirmando a ausência de reflexo de pinça do dedo do pé antes e durante a cirurgia.
    1. Prenda o cone do nariz estendido da máquina anestésica no animal e ajuste o isoflurano para 1% -2% para manutenção. Minimize a exposição ao isoflurano (5 min a 3%-5% para indução e o tempo restante a 1%-2%), pois o procedimento pode levar até 40 min para ser concluído.
  3. Pesar o animal e administrar a dose apropriada de analgésico pré-operatório por via subcutânea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) com base no peso.
  4. Aplique pomada lubrificante ocular em cada olho do camundongo para evitar que a dessecação da córnea esteja sob anestesia.
  5. Esterilize a área da pele cortada com etanol a 70%, seguido de álcool clorexidina duas vezes para formar um campo cirúrgico.
  6. Transfira o mouse para uma estrutura estereotáxica do mouse colocando primeiro o nariz no cone do nariz estereotáxico e, em seguida, estabilize o crânio com barras auriculares. Mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 ° C para suporte térmico durante todo o procedimento cirúrgico. Mantenha o isoflurano em 1% -2% para que o camundongo exiba a frequência respiratória de 1 respiração / s.
  7. Repita a aplicação de lubrificação ocular para evitar a dessecação da córnea durante o procedimento, se necessário. Aplique um campo cirúrgico estéril no corpo do camundongo, abaixo das orelhas, para estender o tamanho do campo estéril.
  8. Se ainda estiver presente, corte as suturas com uma tesoura cirúrgica e remova a crosta com uma pinça. Retraia a pele para expor o crânio.
    NOTA: Para o modelo crônico, pode ser necessário extirpar a pele com lâmina de bisturi # 10.
  9. Use um cotonete estéril para secar o crânio e localizar buracos de rebarbas.
  10. Instale os braços manipuladores do aparelho estereotáxico com um porta-agulha carregando uma seringa de 26 G com uma agulha de 0,375" de comprimento.
  11. Carregue 3,4 μL de AAV (1 x 109 cópias do genoma (GC) / μL para estudo agudo; 1 x 1010 GC / μL para estudo crônico) na seringa. Para garantir que o fluxo seja bom, libere um pequeno volume de AAV até que uma gota possa ser observada na ponta da agulha. Use um cotonete estéril para limpar o excesso antes de realizar uma injeção.
  12. Abaixe a ponta da agulha além do crânio no primeiro orifício de rebarba usado para ET-1 (no córtex sensório-motor direito a + 0,0 anterior e 2,25 mm lateral à bregma) sem perfurar a dura-máter. Uma vez alinhada, abaixe a agulha 1 mm no cérebro. (0 PA, +2,25 ML, −1,0 DV de bregma).
  13. Injete 1 μL de AAV (1 x 109 GC / μL para estudo agudo; 1 x 1010 GC / μL para estudo crônico) dispensando 0,1 μL de cada vez. Empurre o êmbolo da seringa Hamilton para frente para dispensar 0,1 μL e aguarde um minuto antes de injetar os próximos 0,1 μL; injetar até que 1 μL tenha sido dispensado. Após a dispensação final de 0,1 μL (0,1 μL x 10 injeções = 1 μL no total), mantenha a agulha no lugar por 10 minutos para evitar o refluxo e, em seguida, retire-se lentamente para cima para remover a seringa.
  14. Para garantir que a agulha não fique bloqueada durante a injeção, libere um pequeno volume do AAV até que uma gota possa ser observada na ponta da agulha. Use um cotonete estéril para limpar o excesso antes de realizar uma injeção.
  15. Repita as etapas 2.11-2.14 para as injeções de AAV nos dois orifícios de rebarba restantes (no córtex sensório-motor direito em +1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV; e -1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV mm de bregma. Esterilize as seringas antes de injetar o próximo animal com PREempt, seguido de álcool a 70% e, finalmente, PBS estéril.
  16. Para fechar a ferida, suture a pele sobrejacente do crânio usando uma sutura estéril de poliéster polissorb 4-0.
  17. Administre pomada antibiótica usando um cotonete na área suturada para prevenir infecções pós-operatórias.
  18. Remova o mouse da estrutura estereotáxica e transfira-o para uma gaiola limpa e pré-aquecida na área de recuperação. Desligue o vaporizador de isoflurano e o oxigênio.
  19. Mantenha o mouse dentro da gaiola e esterilize a parte externa da gaiola com PREempt e álcool 70% antes de colocá-lo em cima de uma almofada de aquecimento para recuperação da anestesia.
    1. Alternativamente, se estiver usando uma lâmpada de aquecimento, coloque o mouse na lateral da gaiola sob a lâmpada para que o mouse possa se mover para o lado frio da gaiola ao acordar da anestesia para evitar superaquecimento. Monitore o mouse à medida que ele sai da anestesia nos próximos 5 a 10 minutos.
  20. Monitore o mouse nos próximos 3 dias (monitoramento de peso), forneça cuidados pós-operatórios (ração amassada úmida para garantir a hidratação) e analgésicos (2 mg/kg de meloxicam, 2x ao dia por via subcutânea, por 2-3 dias) de acordo com os regulamentos estabelecidos pelo comitê local de cuidados com os animais.

3. Preparação e dissecção do tecido

  1. Para eutanasiar o camundongo, injete intraperitonealmente o camundongo com tribromoetanol (Avertina) (conc. 12,5 mg / mL, 250 mg / BW (kg)) e aguarde 2-3 min para a indução completa. Certifique-se de que o animal esteja adequadamente anestesiado, removendo o mouse da gaiola e confirmando a ausência de reflexo de beliscar o dedo do pé.
  2. Em uma hotte, realizar perfusão transcárdica26 com solução salina seguida de paraformaldeído a 4%. Pulverize a cabeça do animal sacrificado com etanol a 70% até ficar encharcado.
  3. Corte a cabeça na base do crânio usando uma tesoura grande. Corte a pele ao longo da linha média de todo o crânio usando uma tesoura de íris reta de 4-1 / 2 ". Retraia a pele para expor o crânio.
  4. A partir da abertura da cavidade espinhal no pescoço, insira a tesoura da íris e corte o crânio ao longo da sutura sagital e interfrontal.
  5. Em seguida, insira uma tesoura nas duas órbitas oculares e corte a sutura frontal-nasal.
  6. Tome cuidado especial para não danificar o cérebro. Abra as placas do crânio para a esquerda e para a direita até que o cérebro fique exposto.
  7. Transfira o cérebro para um frasco de cintilação com 4% de paraformaldeído. Mantenha o cérebro em paraformaldeído a 4% a 4 ° C por 4 h.
  8. O cérebro é então crioprotegido substituindo 4% de paraformaldeído por 30% de sacarose. Mantenha o cérebro em sacarose a 30% a 4 °C até que o cérebro afunde para o fundo do frasco (~ 12 h).

4. Seccionando cérebros congelados

  1. Defina a temperatura da câmara do criostato entre -20 °C e -26 °C.
  2. Faça um corte coronal no cerebelo e prenda a parte plana e caudal do cérebro em um mandril de criostato com composto de temperatura de corte ideal (OCT).
  3. Coloque o mandril com o cérebro no suporte do disco e alinhe o bulbo olfatório com a lâmina da faca.
  4. Corte o cérebro em fatias coronais com espessura de 20 μm. Para evitar estrias ou linhas de arranhões em fatias de cérebro seccionadas, coloque um pedaço de fita adesiva na plataforma de corte para criar um pequeno espaço entre a placa anti-rolamento e a plataforma. Um pincel pode ser usado para ajustar a orientação da seção antes de capturá-la em uma lâmina de vidro carregada positivamente.
  5. Armazene as lâminas contendo seções cerebrais a -20 °C.

5. Imuno-histoquímica e quantificação

  1. Processar os cortes para imuno-histoquímica usando um anticorpo primário contra NeuN, um marcador pan-neuronal, de acordo com protocolos padrão 22,26.
  2. Descongele seções cerebrais criopreservadas por 5 min em temperatura ambiente. Lave as seções três vezes com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 min cada.
  3. Incube as seções em Triton X-100 a 0,3% em PBS por 20 min em temperatura ambiente para permeabilizar.
  4. Prepare a solução de bloqueio (5% de soro de cabra normal e 0,3% de Triton X-100 em PBS) e incube as seções na solução de bloqueio por 1 h à temperatura ambiente.
  5. Diluir o anticorpo primário, anti-NeuN de coelho, na proporção de 1:500 na solução de bloqueio. Incubar as secções com a solução de anticorpos primários durante a noite a 4 °C.
  6. Lave as seções três vezes com 0,3% de Triton X-100 em PBS, por 5 min cada lavagem.
  7. Diluir o anticorpo secundário, anti-coelho de cabra 568 ou 488, na proporção de 1:1000 em PBS. Incubar as secções com a solução de anticorpos secundários durante 1 h à temperatura ambiente, ao abrigo da luz.
  8. Realize três lavagens com 0,3% de Triton X-100 em PBS, por 5 min cada. Incube as seções com DAPI (1:10.000 em PBS) por 5 min em temperatura ambiente.
  9. Lave as seções mais três vezes com PBS, por 5 min cada. Monte as seções manchadas em uma lâmina de vidro com um meio de montagem de fluorescência e uma lamínula de vidro. Deixe as lâminas montadas secarem durante a noite.
  10. Lâminas coradas com imagem usando uma objetiva de 20x com um microscópio confocal para obter visualizações de células Reporter+ ao redor da lesão de AVC em 3 cortes coronais diferentes (entre as regiões anatômicas do cruzamento do corpo caloso anteriormente e o cruzamento da comissura anterior posteriormente) para cada animal.
    NOTA: A distância da propagação do AAV varia dentro do hemisfério. No entanto, com base em nossa experiência e análise pós-processamento tecidual de células Reporter +, a disseminação do AAV geralmente abrange aproximadamente +3 mm a -3 mm do bregma. As células repórter+ ao redor da lesão de AVC (conforme identificada pela ausência/coloração esparsa de NeuN) na área entre onde o corpo caloso cruza a linha média e a comissura anterior se conecta devem ser quantificadas.
  11. Para quantificação de neurônios transduzidos, realize a análise de colocalização. Conte manualmente o número de células duplamente positivas (Reporter + NeuN +) e o número total de células transduzidas (Reporter +) em fatias de cérebro. Para os resultados deste estudo, >3 campos de visão foram contados ao redor da lesão (medial, lateral e inferior) a partir de 3 cortes coronais por camundongo.

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Resultados

Examinar os resultados celulares da expressão ectópica de Neurod1 conduzida por promotor GFAP curto (gfaABC (1) D) em cepas repórter de tipo selvagem (C57BL / 6J) e em cepas repórter tdTom-Cre transgênicas (especificamente, B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J) 22 dois sistemas baseados em AAV5 foram utilizados em camundongos com lesão por AVC ET-1 ( Figura 1A-C ). Em um modelo subagudo de AVC, o N...

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Discussão

Este protocolo detalha dois sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 no contexto de um modelo de AVC cortical ET-1 leve a moderado. É importante considerar uma série de etapas críticas relacionadas ao AVC do ET-1 para a reprodutibilidade e consistência da lesão. Os furos de rebarbas devem ser cuidadosamente perfurados sem perfurar a dura-máter para evitar lesões cirúrgicas não intencionais. É importante usar pontos de referência consi...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Heart and Stroke Foundation, Instituto de Medicina Regenerativa de Ontário, Canada First Research Excellence Fund (Medicine by Design, MbD) e Connaught Innovation Award (Universidade de Toronto).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Broca #77 (0,018")David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector  Biolabs Sutura
Absorvível com Agulha Polysorb™ Agulha de Poliéster CV-15 3/8 Tamanho 4 - 0 TrançadoCovidienGL-881
Anti-NeuN Anticorpo (coelho) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 CamundongosCharles River027
Solução de ClorexidinaPartnarPCH-020
Contec™   PREempt™ Solução Desinfetante RTUFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Lâminas de Segurança para Pena Lâminas de MicrótomoPena12-631P
Marca Fisher  Óculos de Capa: RetângulosFisher Scientific12-545M 
Meio de Montagem de FluorescênciaAgilent TechnologiesS3023 
Seringa HamiltonHamilton Company7634-01
Broca Estereotáxica de Alta VelocidadeDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Pomada Polyderm USPTARO2181908
SOMNI Scientific™   A Almofada de Aquecimento de TemperaturaFisher Scientific04-777-177
Instrumentos EstereotáxicosDavid Kopf InstrumentsModelo 902
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Referências

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