Artigo de método

Sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 em células transduzidas em tempos subagudos e crônicos pós-AVC isquêmico

DOI:

10.3791/66965

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29 de novembro de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve a expressão ectópica mediada por vírus de Neurod1 após acidente vascular cerebral isquêmico cortical. O Neurod1 é administrado (1) usando o sistema Cre-Flex AAV em camundongos do tipo selvagem durante a fase subaguda pós-AVC (7 dias) e (2) usando um único vetor AAV em camundongos repórteres condicionais durante a fase crônica pós-AVC (21 dias).

Resumo

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A expressão ectópica de fatores neurogênicos in vivo surgiu como uma abordagem promissora para a substituição de neurônios perdidos em modelos de doenças. O uso de fatores de transcrição de hélice-alça-hélice neural básica (bHLH) por meio de sistemas de partículas semelhantes a vírus não propagados, incluindo retrovírus, lentivírus e vírus adeno-associado (AAV), foi amplamente relatado. Para experimentos in vivo , os AAVs são cada vez mais usados devido à sua baixa patogenicidade e potencial de traduzibilidade. Este protocolo descreve dois sistemas de AAV para investigar a expressão ectópica de fatores de transcrição em células transduzidas pós-acidente vascular cerebral isquêmico. Em ambos os sistemas, a expressão de Neurod1 é controlada pelo promotor GFAP curto (gfaABC(1)D), que é regulado positivamente em astrócitos reativos pós-AVC, bem como em neurônios endógenos quando combinado com a expressão do fator neurogênico. No modelo de AVC isquêmico descrito, a isquemia focal é induzida pela injeção de endotelina-1 (ET-1) no córtex motor de camundongos, criando uma lesão cercada por astrócitos reativos que expressam GFAP e neurônios sobreviventes. Injeções intracerebrais de AAV são realizadas para induzir ectopicamente a expressão de Neurod1 nas fases subaguda (7 dias) e crônica (21 dias) pós-AVC. Semanas após a injeção de AAV, um número significativamente maior de neurônios entre as células transduzidas é identificado em camundongos que expressam ectopicamente Neurod1 em comparação com camundongos que recebem vírus de controle AAV. As estratégias baseadas em AAV usadas replicaram os resultados observados de um número aumentado de neurônios expressando o gene repórter em um modelo de acidente vascular cerebral cortical leve a moderado. Este protocolo estabelece uma plataforma padrão para explorar os efeitos da expressão ectópica de fatores de transcrição administrados com sistemas baseados em AAV, contribuindo para a compreensão da expressão do fator neurogênico no contexto do AVC.

Introdução

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O AVC é uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo1. Um derrame acontece quando o fluxo sanguíneo para o cérebro é interrompido. Isso pode ocorrer por meio de um acidente vascular cerebral hemorrágico (~ 15% dos casos), em que um vaso sanguíneo no cérebro se rompe, ou por meio de um acidente vascular cerebral isquêmico, em que o fluxo sanguíneo para o cérebro é bloqueado1. Os AVCs isquêmicos são mais prevalentes e representam ~ 85% dos casos de AVC1. Um derrame reduz o fornecimento de glicose e oxigênio ao cérebro, levando à morte rápida das células neuronais e ao comprometimento da função neural.

O AVC isquêmico leva à perda de células em poucos minutos no núcleo da lesão por meio de mecanismos de excitotoxicidade, estresse oxidativo e nitrosativo, desregulação do cálcio, despolarização do espalhamento cortical, edema, ruptura da barreira hematoencefálica (BHE) e inflamação 2,3. As células nas regiões peri-infarto sofrem morte celular apoptótica em poucas horas e por dias, após o AVC4. O ambiente peri-infarto é exposto a sinais pró e anti-inflamatórios que levam à ativação de micróglias e astrócitos (astrócitos "reativos"), que desempenham papéis diversos após a lesão 5,6,7,8. Os astrócitos reativos sofrem uma série de alterações fenotípicas que incluem a regulação positiva da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e a formação de uma borda ao redor da lesão dentro de dias após o AVC que ajuda a limitar a extensão da lesão, bem como afeta a neuroplasticidade dentro do tecido lesionado 8,9,10.

A reprogramação celular direta permite a conversão de um tipo de célula madura em um tipo de célula madura diferente sem passar por um estado pluripotente11. Transformar células cerebrais residentes em novos neurônios para substituir aqueles perdidos por lesões apresenta um caminho atraente para a restauração do cérebro. O AVC é um alvo ideal para tratamentos baseados em células, dada a necessidade de métodos terapêuticos para substituir os neurônios perdidos, ampliar o período terapêutico e, em última análise, facilitar a recuperação funcional. Para este fim, tem havido muitos artigos demonstrando a reprogramação de astrócitos para neurônios (AtN) in vitro e in vivo, usando uma variedade de fatores de transcrição neurogênicos básicos de hélice-alça-hélice (bHLH), incluindo Ascl1, Neurog2, Neurod1 e, mais recentemente, versões mutantes de Ascl1 (Ascl1-SA6) que demonstraram eficácia de reprogramação aprimorada 11,12,13,14. É importante considerar os muitos fatores de desenho experimental que podem afetar os resultados, a interpretação e as comparações entre os estudos. Ghazale et al. demonstraram que a eficiência de reprogramação de AtN variou entre diferentes cepas de camundongos, sorotipos de AAV e promotores ao usar o mesmo fator de transcrição bHLH14. Outras considerações, como o modelo de lesão, região do cérebro, dosagem viral, tempo de entrega do gene, fator de reprogramação e modo de entrega, afetarão os resultados. Relatórios recentes demonstraram que neurônios transduzidos pré-existentes foram mal interpretados como neurônios reprogramados15,16. Embora os relatórios não neguem necessariamente que a conversão de AtN ocorra, esses estudos destacaram a importância de experimentos bem controlados, e vários artigos apresentaram recomendações para os próximos passos no campo 15,17,18,19. O que é aparente na literatura é que a expressão ectópica de fatores de transcrição bHLH pode melhorar os resultados funcionais em uma variedade de modelos animais de doença/lesão neurodegenerativa 13,20,21,22,23,24.

Aqui, este protocolo Neurod1, um fator de transcrição de interesse, é expresso ectopicamente em células transduzidas13,22. O modelo bem estabelecido de endotelina-1 (ET-1) de acidente vascular cerebral isquêmico para o córtex sensório-motor em camundongos adultos é usado. A injeção de ET-1 leva à vasoconstrição local mimetizando a fisiopatologia do AVC isquêmico, incluindo comprometimento funcional 22,23,25. O promotor GFAP curto comumente empregado (gfaABC(1)D) é usado para conduzir a expressão ectópica de Neurod1 no local da lesão e na região perilesional usando duas estratégias virais: (1) entrega de AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre em camundongos do tipo selvagem e (2) entrega de AAV5-GFAP-Neurod1-Cre em camundongos repórteres tdTom-Cre. Para entender melhor o potencial de expressão ectópica de Neurod1 no cérebro lesionado por AVC, os AAVs foram administrados na fase subaguda (7 dias) ou na fase crônica (21 dias), pós-AVC. Em ambos os paradigmas, significativamente mais neurônios marcados foram encontrados semanas após a expressão ectópica de Neurod1.

Protocolo

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Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Toronto e segue o Guia para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais (2ª Edição, Conselho Canadense de Cuidados com Animais, 2017). Para este estudo, o repórter tdTom-Cre do tipo selvagem (C57BL/6J) e transgênico (B6. Foram utilizadas linhagens de camundongos Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 . Os camundongos tinham 7-9 semanas de idade e incluíam machos e fêmeas. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cirurgia de AVC com endotelina-1

NOTA: Todos os instrumentos e materiais cirúrgicos são esterilizados em autoclave antes da cirurgia. A estrutura estereotáxica é esterilizada com PREempt. As seringas são esterilizadas com PREempt, álcool 70% e preparadas com PBS estéril antes da cirurgia. A endotelina-1 (ET-1) é armazenada no gelo durante toda a cirurgia.

  1. Antes de iniciar a cirurgia, configure a área de recuperação colocando uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 °C. Alternativamente, se uma lâmpada de aquecimento estiver sendo usada, coloque apenas metade da gaiola sob o calor.
    1. Para anestesiar camundongos com isoflurano, siga o protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais. Coloque o mouse na câmara de indução anestésica e ligue o oxigênio a 1-1,5 L/min, depois ajuste o vaporizador de isoflurano a 3%-5% para iniciar a anestesia.
  2. Remova o animal da câmara quando ele estiver deitado de lado e não puder mais ficar de pé e coloque-o em uma superfície limpa. Certifique-se de que o animal esteja adequadamente anestesiado, confirmando a ausência de reflexo de pinça do dedo do pé antes e durante a cirurgia.
    1. Prenda o cone do nariz estendido da máquina anestésica no animal e ajuste o isoflurano para 1% -2% para manutenção. Minimize a exposição ao isoflurano (5 min a 3%-5% para indução e o tempo restante a 1%-2%), pois o procedimento pode levar até 40 min para ser concluído.
  3. Use aparadores de pêlos de animais para remover o pelo do pescoço/atrás das orelhas até o nariz do animal para expor a pele do crânio para cirurgia.
  4. Pesar o animal e administrar a dose apropriada de analgésico pré-operatório por via subcutânea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) com base no peso.
  5. Aplique pomada lubrificante ocular em cada olho do camundongo para evitar a dessecação da córnea durante a anestesia.
  6. Esterilize a área da pele cortada pelo (etapa 1.3) com etanol a 70%, seguido de álcool clorexidina duas vezes para formar um campo cirúrgico.
  7. Transfira o mouse para uma estrutura estereotáxica do mouse colocando primeiro o nariz no cone do nariz estereotáxico e, em seguida, estabilize o crânio com barras auriculares. Mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 ° C para suporte térmico durante todo o procedimento cirúrgico. Mantenha o isoflurano a 1% -2% para que o camundongo exiba uma frequência respiratória de 1 respiração / s.
  8. Repita a aplicação de lubrificação ocular para evitar a dessecação da córnea durante o procedimento, se necessário. Aplique uma cortina cirúrgica estéril no corpo do camundongo, abaixo das orelhas, para estender o tamanho do campo estéril.
  9. Faça uma incisão vertical paralela ao plano sagital do animal por trás do ponto médio dos olhos até a parte de trás da cabeça (osso parietal) com uma lâmina de bisturi # 10. Exponha o crânio retraindo suavemente a pele para os lados.
  10. Use um cotonete para romper a fáscia do crânio e permitir que o crânio seque para expor o bregma.
  11. Configure os braços manipuladores com o suporte da broca carregando a broca estereotáxica de alta velocidade com uma broca de 0,018".
  12. Faça 3 furos de rebarba (0,018 "de diâmetro) com uma broca estereotáxica de alta velocidade nas coordenadas do córtex sensório-motor direito a 2,25 mm lateral ao bregma e +0,0 mm rostral, +1,0 mm rostral e -1,0 mm caudal ao bregma.
  13. Substitua a broca por uma seringa de 26 G com uma agulha de 0.375" de comprimento.
  14. Carregue 1,5 μL de 400 μM ET-1 dissolvido em PBS estéril na seringa. Para garantir um bom fluxo, libere um pequeno volume de ET-1 até que uma gota possa ser observada na ponta da agulha. Use um cotonete estéril para limpar o excesso antes de realizar uma injeção.
  15. Abaixe a ponta da agulha além do crânio no orifício da rebarba do meio (no córtex sensório-motor direito a + 0,0 anterior e 2,25 mm lateral à bregma) sem perfurar a dura-máter. Uma vez alinhada, abaixe a agulha 1 mm no cérebro.
  16. Injete 1 μL de ET-1 dispensando 0,1 μL de cada vez. Empurre o êmbolo da seringa Hamilton para frente para dispensar 0,1 μL e aguarde um minuto antes de injetar os próximos 0,1 μL, injete até que 1 μL tenha sido dispensado.
    1. Após a dispensação final de 0,1 μL (0,1 μL x 10 injeções = 1 μL no total), mantenha a agulha no lugar por 10 minutos para evitar o refluxo e, em seguida, retire-se lentamente para cima para remover a seringa.
  17. Para garantir que a agulha não fique bloqueada durante a injeção, libere um pequeno volume do ET-1 até que uma gota possa ser observada na ponta da agulha. Use um cotonete estéril para limpar o excesso antes de realizar uma injeção. Esterilize as seringas antes de injetar o próximo animal com PREempt, seguido de álcool a 70% e, em seguida, PBS estéril.
  18. Para fechar a ferida, suture a pele sobrejacente do crânio usando uma sutura estéril de poliéster polissorb 4-0.
  19. Administre pomada antibiótica usando um cotonete na área suturada para prevenir infecções pós-operatórias.
  20. Remova o mouse da estrutura estereotáxica e transfira-o para uma gaiola limpa e pré-aquecida na área de recuperação. Desligue o vaporizador de isoflurano e o oxigênio.
  21. Mantenha a gaiola em cima de uma almofada de aquecimento durante a recuperação da anestesia. Alternativamente, se estiver usando uma lâmpada de aquecimento, coloque o mouse na lateral da gaiola sob a lâmpada para que o mouse possa se mover para o lado frio da gaiola ao acordar da anestesia para evitar superaquecimento. Monitore o mouse à medida que ele sai da anestesia nos próximos 5 a 10 minutos.
  22. Monitore o mouse nos próximos 3 dias (monitoramento de peso), forneça cuidados pós-operatórios (ração úmida para garantir a hidratação) e analgésicos (2 mg/kg de meloxicam, 2x ao dia por via subcutânea, por 2-3 dias) de acordo com os regulamentos estabelecidos pelo comitê local de cuidados com animais.

2. Entrega de Vírus Adeno-Associado (AAV) (7 dias - modelo subagudo ou 21 dias - modelo crônico) pós-AVC

CUIDADO: Consulte as diretrizes institucionais de biossegurança para trabalhar com AAVs. De acordo com as diretrizes da Universidade de Toronto, esta cirurgia é realizada em um Gabinete de Biossegurança de Nível 2 de Contenção.

NOTA: Todos os instrumentos e materiais cirúrgicos são esterilizados em autoclave antes da cirurgia. A estrutura estereotáxica é esterilizada com PREempt. As seringas são esterilizadas com PREempt, álcool 70% e preparadas com PBS estéril. Os AAVs são armazenados no gelo durante toda a cirurgia.

  1. Antes de iniciar a cirurgia, configure a área de recuperação colocando uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 °C. Alternativamente, se uma lâmpada de aquecimento estiver sendo usada, coloque apenas metade da gaiola sob o calor.
    1. Para anestesiar camundongos usando isoflurano, coloque o camundongo na câmara de indução anestésica e ligue o oxigênio a 1-1,5 L/min, depois ajuste o vaporizador de isoflurano a 3%-5% para iniciar a anestesia (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente).
  2. Remova o animal da câmara quando ele estiver deitado de lado e não puder mais ficar em uma superfície limpa. Certifique-se de que o animal esteja adequadamente anestesiado, confirmando a ausência de reflexo de pinça do dedo do pé antes e durante a cirurgia.
    1. Prenda o cone do nariz estendido da máquina anestésica no animal e ajuste o isoflurano para 1% -2% para manutenção. Minimize a exposição ao isoflurano (5 min a 3%-5% para indução e o tempo restante a 1%-2%), pois o procedimento pode levar até 40 min para ser concluído.
  3. Pesar o animal e administrar a dose apropriada de analgésico pré-operatório por via subcutânea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) com base no peso.
  4. Aplique pomada lubrificante ocular em cada olho do camundongo para evitar que a dessecação da córnea esteja sob anestesia.
  5. Esterilize a área da pele cortada com etanol a 70%, seguido de álcool clorexidina duas vezes para formar um campo cirúrgico.
  6. Transfira o mouse para uma estrutura estereotáxica do mouse colocando primeiro o nariz no cone do nariz estereotáxico e, em seguida, estabilize o crânio com barras auriculares. Mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 ° C para suporte térmico durante todo o procedimento cirúrgico. Mantenha o isoflurano em 1% -2% para que o camundongo exiba a frequência respiratória de 1 respiração / s.
  7. Repita a aplicação de lubrificação ocular para evitar a dessecação da córnea durante o procedimento, se necessário. Aplique um campo cirúrgico estéril no corpo do camundongo, abaixo das orelhas, para estender o tamanho do campo estéril.
  8. Se ainda estiver presente, corte as suturas com uma tesoura cirúrgica e remova a crosta com uma pinça. Retraia a pele para expor o crânio.
    NOTA: Para o modelo crônico, pode ser necessário extirpar a pele com lâmina de bisturi # 10.
  9. Use um cotonete estéril para secar o crânio e localizar buracos de rebarbas.
  10. Instale os braços manipuladores do aparelho estereotáxico com um porta-agulha carregando uma seringa de 26 G com uma agulha de 0,375" de comprimento.
  11. Carregue 3,4 μL de AAV (1 x 109 cópias do genoma (GC) / μL para estudo agudo; 1 x 1010 GC / μL para estudo crônico) na seringa. Para garantir que o fluxo seja bom, libere um pequeno volume de AAV até que uma gota possa ser observada na ponta da agulha. Use um cotonete estéril para limpar o excesso antes de realizar uma injeção.
  12. Abaixe a ponta da agulha além do crânio no primeiro orifício de rebarba usado para ET-1 (no córtex sensório-motor direito a + 0,0 anterior e 2,25 mm lateral à bregma) sem perfurar a dura-máter. Uma vez alinhada, abaixe a agulha 1 mm no cérebro. (0 PA, +2,25 ML, −1,0 DV de bregma).
  13. Injete 1 μL de AAV (1 x 109 GC / μL para estudo agudo; 1 x 1010 GC / μL para estudo crônico) dispensando 0,1 μL de cada vez. Empurre o êmbolo da seringa Hamilton para frente para dispensar 0,1 μL e aguarde um minuto antes de injetar os próximos 0,1 μL; injetar até que 1 μL tenha sido dispensado. Após a dispensação final de 0,1 μL (0,1 μL x 10 injeções = 1 μL no total), mantenha a agulha no lugar por 10 minutos para evitar o refluxo e, em seguida, retire-se lentamente para cima para remover a seringa.
  14. Para garantir que a agulha não fique bloqueada durante a injeção, libere um pequeno volume do AAV até que uma gota possa ser observada na ponta da agulha. Use um cotonete estéril para limpar o excesso antes de realizar uma injeção.
  15. Repita as etapas 2.11-2.14 para as injeções de AAV nos dois orifícios de rebarba restantes (no córtex sensório-motor direito em +1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV; e -1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV mm de bregma. Esterilize as seringas antes de injetar o próximo animal com PREempt, seguido de álcool a 70% e, finalmente, PBS estéril.
  16. Para fechar a ferida, suture a pele sobrejacente do crânio usando uma sutura estéril de poliéster polissorb 4-0.
  17. Administre pomada antibiótica usando um cotonete na área suturada para prevenir infecções pós-operatórias.
  18. Remova o mouse da estrutura estereotáxica e transfira-o para uma gaiola limpa e pré-aquecida na área de recuperação. Desligue o vaporizador de isoflurano e o oxigênio.
  19. Mantenha o mouse dentro da gaiola e esterilize a parte externa da gaiola com PREempt e álcool 70% antes de colocá-lo em cima de uma almofada de aquecimento para recuperação da anestesia.
    1. Alternativamente, se estiver usando uma lâmpada de aquecimento, coloque o mouse na lateral da gaiola sob a lâmpada para que o mouse possa se mover para o lado frio da gaiola ao acordar da anestesia para evitar superaquecimento. Monitore o mouse à medida que ele sai da anestesia nos próximos 5 a 10 minutos.
  20. Monitore o mouse nos próximos 3 dias (monitoramento de peso), forneça cuidados pós-operatórios (ração amassada úmida para garantir a hidratação) e analgésicos (2 mg/kg de meloxicam, 2x ao dia por via subcutânea, por 2-3 dias) de acordo com os regulamentos estabelecidos pelo comitê local de cuidados com os animais.

3. Preparação e dissecção do tecido

  1. Para eutanasiar o camundongo, injete intraperitonealmente o camundongo com tribromoetanol (Avertina) (conc. 12,5 mg / mL, 250 mg / BW (kg)) e aguarde 2-3 min para a indução completa. Certifique-se de que o animal esteja adequadamente anestesiado, removendo o mouse da gaiola e confirmando a ausência de reflexo de beliscar o dedo do pé.
  2. Em uma hotte, realizar perfusão transcárdica26 com solução salina seguida de paraformaldeído a 4%. Pulverize a cabeça do animal sacrificado com etanol a 70% até ficar encharcado.
  3. Corte a cabeça na base do crânio usando uma tesoura grande. Corte a pele ao longo da linha média de todo o crânio usando uma tesoura de íris reta de 4-1 / 2 ". Retraia a pele para expor o crânio.
  4. A partir da abertura da cavidade espinhal no pescoço, insira a tesoura da íris e corte o crânio ao longo da sutura sagital e interfrontal.
  5. Em seguida, insira uma tesoura nas duas órbitas oculares e corte a sutura frontal-nasal.
  6. Tome cuidado especial para não danificar o cérebro. Abra as placas do crânio para a esquerda e para a direita até que o cérebro fique exposto.
  7. Transfira o cérebro para um frasco de cintilação com 4% de paraformaldeído. Mantenha o cérebro em paraformaldeído a 4% a 4 ° C por 4 h.
  8. O cérebro é então crioprotegido substituindo 4% de paraformaldeído por 30% de sacarose. Mantenha o cérebro em sacarose a 30% a 4 °C até que o cérebro afunde para o fundo do frasco (~ 12 h).

4. Seccionando cérebros congelados

  1. Defina a temperatura da câmara do criostato entre -20 °C e -26 °C.
  2. Faça um corte coronal no cerebelo e prenda a parte plana e caudal do cérebro em um mandril de criostato com composto de temperatura de corte ideal (OCT).
  3. Coloque o mandril com o cérebro no suporte do disco e alinhe o bulbo olfatório com a lâmina da faca.
  4. Corte o cérebro em fatias coronais com espessura de 20 μm. Para evitar estrias ou linhas de arranhões em fatias de cérebro seccionadas, coloque um pedaço de fita adesiva na plataforma de corte para criar um pequeno espaço entre a placa anti-rolamento e a plataforma. Um pincel pode ser usado para ajustar a orientação da seção antes de capturá-la em uma lâmina de vidro carregada positivamente.
  5. Armazene as lâminas contendo seções cerebrais a -20 °C.

5. Imuno-histoquímica e quantificação

  1. Processar os cortes para imuno-histoquímica usando um anticorpo primário contra NeuN, um marcador pan-neuronal, de acordo com protocolos padrão 22,26.
  2. Descongele seções cerebrais criopreservadas por 5 min em temperatura ambiente. Lave as seções três vezes com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 min cada.
  3. Incube as seções em Triton X-100 a 0,3% em PBS por 20 min em temperatura ambiente para permeabilizar.
  4. Prepare a solução de bloqueio (5% de soro de cabra normal e 0,3% de Triton X-100 em PBS) e incube as seções na solução de bloqueio por 1 h à temperatura ambiente.
  5. Diluir o anticorpo primário, anti-NeuN de coelho, na proporção de 1:500 na solução de bloqueio. Incubar as secções com a solução de anticorpos primários durante a noite a 4 °C.
  6. Lave as seções três vezes com 0,3% de Triton X-100 em PBS, por 5 min cada lavagem.
  7. Diluir o anticorpo secundário, anti-coelho de cabra 568 ou 488, na proporção de 1:1000 em PBS. Incubar as secções com a solução de anticorpos secundários durante 1 h à temperatura ambiente, ao abrigo da luz.
  8. Realize três lavagens com 0,3% de Triton X-100 em PBS, por 5 min cada. Incube as seções com DAPI (1:10.000 em PBS) por 5 min em temperatura ambiente.
  9. Lave as seções mais três vezes com PBS, por 5 min cada. Monte as seções manchadas em uma lâmina de vidro com um meio de montagem de fluorescência e uma lamínula de vidro. Deixe as lâminas montadas secarem durante a noite.
  10. Lâminas coradas com imagem usando uma objetiva de 20x com um microscópio confocal para obter visualizações de células Reporter+ ao redor da lesão de AVC em 3 cortes coronais diferentes (entre as regiões anatômicas do cruzamento do corpo caloso anteriormente e o cruzamento da comissura anterior posteriormente) para cada animal.
    NOTA: A distância da propagação do AAV varia dentro do hemisfério. No entanto, com base em nossa experiência e análise pós-processamento tecidual de células Reporter +, a disseminação do AAV geralmente abrange aproximadamente +3 mm a -3 mm do bregma. As células repórter+ ao redor da lesão de AVC (conforme identificada pela ausência/coloração esparsa de NeuN) na área entre onde o corpo caloso cruza a linha média e a comissura anterior se conecta devem ser quantificadas.
  11. Para quantificação de neurônios transduzidos, realize a análise de colocalização. Conte manualmente o número de células duplamente positivas (Reporter + NeuN +) e o número total de células transduzidas (Reporter +) em fatias de cérebro. Para os resultados deste estudo, >3 campos de visão foram contados ao redor da lesão (medial, lateral e inferior) a partir de 3 cortes coronais por camundongo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Examinar os resultados celulares da expressão ectópica de Neurod1 conduzida por promotor GFAP curto (gfaABC (1) D) em cepas repórter de tipo selvagem (C57BL / 6J) e em cepas repórter tdTom-Cre transgênicas (especificamente, B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J) 22 dois sistemas baseados em AAV5 foram utilizados em camundongos com lesão por AVC ET-1 ( Figura 1A-C ). Em um modelo subagudo de AVC, o Neurod1 foi empacotado no sistema Cre-Flex AAV e entregue a camundongos do tipo selvagem no dia 7 após o AVC (Figura 1B). O segundo vetor Flex contém a sequência invertida para GFP impulsionada pelo promotor CAG que é flanqueado por locais de recombinação heterotípicos e antiparalelos do tipo loxP (Figura 1B). Ambas as construções virais são injetadas juntas ao mesmo tempo após o AVC. Uma vez que Cre é expresso em células transduzidas, a GFP é invertida e excisada em locais de recombinação, orientando a sequência na direção sensorial, o que permite a expressão de GFP. Portanto, as células que expressam Cre serão GFP positivas, indicando que foram transduzidas pelos vetores Cre-Flex. No modelo subagudo, os camundongos foram sacrificados 21 dias após a transdução (ou seja, 28 dias após o AVC), e o número de células transduzidas (GFP+), bem como o número de células NeuN+GFP+ (células transduzidas expressando células NeuN), foram contados no parênquima dos cérebros lesionados por AVC. Como visto na Figura 2A, os neurônios são perdidos no local da lesão isquêmica. A quantificação de células transduzidas no paradigma subagudo usando o sistema Cre-Flex AAV revela significativamente mais neurônios marcados (células NeuN + GFP + / GFP +) nos camundongos tratados com Neurod1 em comparação com camundongos de controle Stroke-Cre (43,05 +/- 5,50% vs. 18,43 +/- 3,03% de células NeuN + GFP + / GFP +, em Stroke-Neurod1 vs. Camundongos tratados com Stroke-Cre (controle), respectivamente) (p = 0,0172) (Figura 2B, C).

Em um conjunto separado de experimentos, a conversão de AtN foi realizada em um modelo crônico de AVC (Figura 1B, C). O fator de transcrição Neurod1 foi entregue a camundongos repórteres tdTom-Cre com lesão por AVC ET-1 no dia 21 pós-AVC (Figura 1C). Idêntico ao sistema Cre-Flex usado em camundongos do tipo selvagem, a expressão de Neurod1 foi impulsionada pelo promotor GFAP curto. No entanto, neste sistema, uma única construção AAV foi usada com Cre recombinase após Neurod1 (Figura 1B). Assim, as células que expressam GFAP produzirão Cre recombinase, induzindo o repórter tdTom, indicando células que foram transduzidas por AAV. Os camundongos foram sacrificados 77 dias após o AVC (8 semanas pós-AAV) (Figura 1C). Como visto na Figura 3A, uma lesão cortical é observada no dia 77 pós-AVC em camundongos tdTom-Cre. O número de células transduzidas que expressam o marcador neuronal, NeuN+, foi quantificado (porcentagem relativa de células (NeuN+tdTom+/tdTom+) no estágio crônico pós-AVC e descobriu que os camundongos que receberam Stroke-Neurod1 tinham significativamente mais neurônios marcados em comparação com os camundongos de controle Stroke-Cre (74,81 +/- 4,835% vs. 53,05 +/- 5,028% de células NeuN+tdTom+/tdTom+ em Stroke-Neurod1vs. Camundongos tratados com Stroke-Cre (controle), respectivamente) (p = 0,0355) (Figura 3B, C).

No geral, os resultados demonstram a transdução basal de neurônios e um maior número de células transduzidas expressando NeuN + com entrega de Neurod1 nas fases subaguda e crônica pós-AVC em camundongos repórteres do tipo selvagem e tdTom-Cre, com dois sistemas diferentes baseados em AAV.

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Figura 1: Expressão ectópica de Neurod1, vetores e linhas do tempo. (A) Representação gráfica da indução de AVC por injeção de endotelina-1 (ET-1) no córtex motor do camundongo. Vírus Adeno-Associado (AAV) administrado em 3 locais, no local da injeção de ET-1, bem como nos locais ao redor da lesão, 1 mm anterior e posterior. Painel ampliado mostrando células transduzidas com AAV-Neurod1 no córtex motor. (B) Esquema dos dois vetores AAV no sistema Cre-Flex entregues a camundongos do tipo selvagem (painel superior). O vetor AAV5 1 contém o promotor GFAP curto, o fator de transcrição Neurod1 e a sequência Cre recombinase flanqueada por um sítio loxP (triângulo preto) e por um sítio lox2272 (triângulo branco). O vetor AAV5 2 carrega a sequência repórter do gene GFP invertida ladeada por um par de locais loxP e lox2272. A transdução de ambos os vetores nas células resulta em excisão e inversão mediadas por Cre, permitindo que a expressão de GFP rotule as células transduzidas. O Neurod1 também foi entregue a camundongos tdTom-Cre usando um vetor AAV5 (painel inferior). No vetor AAV5 1, o promotor GFAP curto, o fator de transcrição Neurod1 e a sequência Cre recombinase são empacotados. A expressão de Cre em células transduzidas impulsiona a excisão do códon Stop em locais loxP (triângulo preto), permitindo a expressão de tdTomato. (C) O sistema Cre-Flex foi testado em camundongos do tipo selvagem com AAVs injetados no período subagudo pós-AVC (dia 7 pós-AVC). Camundongos do tipo selvagem foram sacrificados 21 dias após a transdução do AAV (28 dias após o AVC). O AAV foi entregue a camundongos tdTom-Cre no período crônico pós-AVC (Dia 21 Pós-AVC), e os camundongos foram sacrificados 56 dias após a transdução de AAV (77 dias após o AVC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: A entrega ectópica de Neurod1 usando AAVs Cre-Flex na fase subaguda pós-AVC leva ao aumento do número de células transduzidas que expressam NeuN. (A) Imunocoloração de seções cerebrais coronais através do córtex motor no dia 28 pós-AVC de camundongos Stroke-Cre control (esquerda) e Stroke-Neurod1 (direita). A perda neuronal é observada no local da lesão (linhas tracejadas brancas). Células transduzidas (GFP+, verde), neurônios (NeuN+, vermelho) e células NeuN+GFP+ (laranja) colocalizadas são vistas no córtex. Barras de escala: 250 μm. (B) Imagens representativas do tecido cerebral de controle Stroke-Cre (superior) e Stroke-Neurod1 (inferior) mostrando neurônios (NeuN+, vermelho) e AAV transduzido GFP+ (verde). As inserções delineadas em branco mostram um close-up das células para cada canal individual. As pontas das setas brancas indicam células transduzidas por AAV (GFP+). As setas brancas indicam células NeuN+GFP+ colocalizadas. Barras de escala: 125 μm. (C) Quantificação de células NeuN + GFP + / GFP + em camundongos Stroke-Cre e Stroke-Neurod1 . N = 3 camundongos por grupo. Os dados são representados como média ± EPM. Teste de Shapiro-Wilk (p = 0,3223). Teste t não pareado, *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: A entrega ectópica de Neurod1 em camundongos repórteres tdTom-Cre na fase crônica pós-AVC leva ao aumento do número de células transduzidas que expressam NeuN. (A) Imunocoloração de seções cerebrais coronais através do córtex motor no dia 77 pós-AVC de camundongos Stroke-Cre control e Stroke-Neurod1 . A perda neuronal é observada no local da lesão isquêmica (linhas tracejadas brancas). As células transduzidas são marcadas com tdTom (vermelho) no peri-infarto. NeuN+tdTom+ (laranja) são células transduzidas que expressam marcadores neuronais. Barras de escala: 250 μm. (B) Imagens representativas do tecido cerebral de controle Stroke-Cre (superior) e Stroke-Neurod1 (inferior) mostrando neurônios (NeuN+, verde) e células transduzidas por AAV (tdTom+, vermelho). As inserções delineadas em branco mostram um close-up das células para cada canal individual. As setas brancas indicam células transduzidas por AAV (tdTom+). As setas brancas indicam células NeuN+tdTom+ colocalizadas. Barras de escala: 125 μm. (C) A quantificação de células NeuN + tdT + / tdTom + no paradigma crônico mostra significativamente mais células transduzidas expressando NeuN + (células NeuN + tdTom + / tdTom +) nos camundongos tratados com Neurod1 . N = 3 camundongos por grupo. Os dados são representados como média ± EPM. Teste de Shapiro-Wilk (p = 0,2044). Teste t não pareado, *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Este protocolo detalha dois sistemas AAV e modelos de camundongos para investigar a expressão ectópica de Neurod1 no contexto de um modelo de AVC cortical ET-1 leve a moderado. É importante considerar uma série de etapas críticas relacionadas ao AVC do ET-1 para a reprodutibilidade e consistência da lesão. Os furos de rebarbas devem ser cuidadosamente perfurados sem perfurar a dura-máter para evitar lesões cirúrgicas não intencionais. É importante usar pontos de referência consistentes, neste caso bregma, para garantir uma região de interesse semelhante (córtex sensório-motor neste estudo). Isso é particularmente importante para estudos que utilizam avaliações comportamentais, uma vez que a localização e o tamanho da lesão afetarão os resultados funcionais 13,22,25,27. Mais importante ainda, a taxa de injeção de ET-1 e a pressão aplicada pelo cirurgião na seringa precisam ser consistentes para resultados reprodutíveis. É importante observar que a agulha da seringa pode ficar entupida e precisa ser limpa entre os animais para garantir a entrega precisa do ET-1. Durante a análise celular do tecido, se uma lesão de AVC não for observada, a agulha provavelmente ficou entupida durante a cirurgia. Se o problema persistir, obtenha um novo lote de endotelina-1 do fabricante, pois problemas de potência dependentes do lote foram observados no passado.

As etapas para o procedimento cirúrgico para fornecer AAV são semelhantes às do protocolo de indução de AVC ET-1. Portanto, as considerações acima mencionadas são críticas. Além disso, o título e o volume viral do AAV devem ser consistentes para garantir que a eficiência da transdução possa ser comparada entre os grupos. Neste protocolo, foi administrado 1 x 109 GC/μL de AAV para o estudo agudo e 1 x 1010 GC/μL de AAV para o estudo crônico. É crucial selecionar uma dose viral que seja baixa o suficiente para minimizar a expressão incorreta de arteffactos e, ao mesmo tempo, alta o suficiente para garantir transdução celular suficiente, permitindo a detecção de diferenças entre os grupos experimentais. A faixa de dose viral ideal para tais estudos foi determinada em 107-10 10 GC/μL13,24. Títulos mais altos de AAV não apenas resultam em extensa marcação de neurônios no grupo de controle, mas também demonstraram induzir astrocitose, romper a barreira hematoencefálica e regular positivamente as respostas inflamatórias28,29. Estudos que investigam a administração do fator de transcrição mediado por vírus pós-AVC usaram diferentes locais de entrega para injeções de AAV. Um estudo descreveu a marcação bem-sucedida de células transduzidas usando uma única injeção de AAV no local da lesão do AVC13. Outros estudos têm como alvo uma a três áreas ao redor da área do infarto30. Aqui, a AAV foi administrada em três locais, com uma injeção nas coordenadas do local da injeção de ET-1 e 2 ao redor do local da lesão (uma injeção a 1,0 mm anterior e uma injeção a 1,0 mm posterior) com o objetivo de transduzir astrócitos reativos na borda glial perilesional9. Durante a análise celular do tecido, se nenhuma ou muito poucas células fluorescentes (1-10 células / seção) forem observadas, a agulha pode ter ficado entupida durante a injeção ou o AAV foi congelado e descongelado muitas vezes, levando à inativação do vírus.

A eficiência da transdução foi examinada em diferentes momentos no modelo de AVC leve a moderado, e os resultados demonstram que significativamente mais neurônios são marcados em cérebros tratados com Neurod1 nos momentos subagudo e crônico pós-AVC. O trabalho mostrado aqui é o primeiro a demonstrar a transdução de Neurod1 na fase crônica pós-AVC e revela neurônios expressando ectopicamente Neurod1 até 8 semanas após o AVC. Embora as descobertas de que um número aumentado de neurônios transduzidos são observados em cérebros com lesão cerebral que receberam Neurod1 versus vetores de controle sejam consistentes com o Neurod1 desempenhando um papel na conversão de AtN, a interpretação dos resultados celulares requer um conhecimento sólido das limitações do paradigma experimental. A grande maioria dos estudos publicados que investigam a conversão de AtN utiliza GFAP como promotor, pois GFAP é regulada positivamente em astrócitos reativos em doenças neurodegenerativas, incluindo acidente vascular cerebral 4,31. No entanto, foi demonstrado que a baixa expressão de GFAP também ocorre em neurônios32. Isso é consistente com os achados relatados aqui, em que uma porcentagem de células transduzidas no grupo controle (Stroke-Cre) são neurônios pré-existentes32. Especificamente, os grupos de controle Stroke-Cre neste protocolo mostraram 18,43 +/- 3,03% e 53,05 +/- 5,028% de marcação de células NeuN + Reporter +, que representa a marcação de neurônios pré-existentes, indicando a expressão impulsionada pelo promotor GFAP em neurônios. De fato, a expressão direcionada de Neurod1 depende de vários fatores, incluindo o tropismo viral. O AAV5 demonstrou transduzir neurônios com diferentes eficiências em diferentes regiões do cérebro, incluindo o córtex sensório-motor, indicando que os sorotipos de AAV têm tropismo celular regional, o que precisa ser considerado em estudos que induzem a expressão ectópica de fatores de transcrição31,33. Cepas de camundongos também podem afetar a transdução de AAV14,34. Um estudo comparando a transdução de AAV no estriado de camundongos selvagens (C57BL/6J) e FVB/N encontrou tropismo celular variável e eficiência de transdução nas duas cepas34.

Uma vantagem do sistema Cre-Flex é que ele pode ser usado para marcação de longo prazo em camundongos do tipo selvagem, o que pode reduzir o problema da expressão não específica de Cre presente nas linhagens de camundongos Cre-repórter 15,35. Uma desvantagem do sistema Cre-Flex é que a expressão do transgene independente de Cre pode ocorrer devido a 0,1% -0,8% das partículas virais terem recombinado locais de LoxP durante a produção viral36. Essas descobertas destacam a importância de experimentos de rastreamento de linhagem, por exemplo, pré-rotular astrócitos antes da administração de AAV usando a linha de camundongos Aldh1l1-CreERT2, para garantir que a conversão de AtN não seja superestimada ao relatar conclusões15. Estudos sugeriram que a ativação do promotor GFAP humano (como usado nesses estudos) por meio da cis-regulação por genes a jusante (como Neurod1) pode resultar na expressão de GFAP em neurônios endógenos, levando a um maior número de neurônios marcados no grupo de tratamento15,32. Juntos, esses estudos e os achados aqui descritos destacam a importância dos experimentos de rastreamento de linhagem, por exemplo, pré-rotular astrócitos ou neurônios antes da administração de AAV, para diferenciar entre neurônios pré-existentes e endógenos durante a análise15.

Ao considerar os próximos passos que poderiam reduzir a transdução neuronal, diferentes sorotipos de AAV e/ou o uso de um promotor específico de astrócitos menos promíscuoseriam úteis 19. Um número crescente de relatórios descrevendo a heterogeneidade dos astrócitos pode afetar ainda mais a especificidade da expressão gênica se diferentes subpopulações de astrócitos forem mais suscetíveis à conversão de AtN em geral 37,38,39,40.

A idade dos animais usados em modelos pré-clínicos de lesão ou doença também é uma consideração importante que pode introduzir resultados variáveis. Por exemplo, no caso de neurotrauma, a idade pode afetar a reatividade dos astrócitos, o que afetaria os resultados do estudo para a conversão de AtN41. Além disso, as linhas de repórter induzidas por credibilidade podem perder a especificidade de expressão ao longo do tempo, o que pode afetar as medidas de resultado42. Até o momento, a reprogramação em animais mais velhos não foi investigada de forma abrangente43.

O protocolo descreve a entrega de AAV em 2 fases pós-AVC: (1) a fase subaguda (aos 7 dias) e (2) a fase crônica (aos 21 dias) pós-AVC isquêmico. A expressão ectópica de Neurod1 em um modelo de AVC crônico não foi examinada; Portanto, a observação de que significativamente mais neurônios são rotulados neste estágio tardio tem implicações importantes para estudos futuros destinados a promover a recuperação do AVC no AVC crônico. Os estudos que examinam o potencial da expressão ectópica de Neurod1 para melhorar os resultados do AVC precisarão incorporar avaliações comportamentais, pois os resultados funcionais após o AVC são as medidas de sucesso clinicamente mais relevantes para uma intervenção terapêutica 13,22,25,27.

Atualmente, não há tratamentos disponíveis para pacientes que sofrem de incapacidades induzidas por AVC nas fases subaguda e crônica pós-AVC, com exceção da reabilitação, que tem benefício limitado. A expressão forçada de genes bHLH neurogênicos na glia demonstrou melhorar os resultados funcionais pós-AVC22,30. Os resultados são consistentes com os estudos de reprogramação de AtN que demonstram que a expressão ectópica de Neurod1 aumenta a transdução neuronal em 3 e 7 semanas após a entrega de AAV em comparação com camundongos que receberam o vetor de controle. Mais importante ainda, vários artigos delinearam recomendações para controles de estudo, design e interpretações no campo de reprogramação de AtN 17,18,19,22. Para este fim, este protocolo descreveu sistemas AAV e modelos de camundongos para expressão ectópica de fatores de transcrição após acidente vascular cerebral, que podem ser usados para informar e avançar em investigações adicionais sobre os mecanismos celulares subjacentes às observações.

Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Heart and Stroke Foundation, Instituto de Medicina Regenerativa de Ontário, Canada First Research Excellence Fund (Medicine by Design, MbD) e Connaught Innovation Award (Universidade de Toronto).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Broca #77 (0,018")David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector  Biolabs Sutura
Absorvível com Agulha Polysorb™ Agulha de Poliéster CV-15 3/8 Tamanho 4 - 0 TrançadoCovidienGL-881
Anti-NeuN Anticorpo (coelho) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 CamundongosCharles River027
Solução de ClorexidinaPartnarPCH-020
Contec™   PREempt™ Solução Desinfetante RTUFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Lâminas de Segurança para Pena Lâminas de MicrótomoPena12-631P
Marca Fisher  Óculos de Capa: RetângulosFisher Scientific12-545M 
Meio de Montagem de FluorescênciaAgilent TechnologiesS3023 
Seringa HamiltonHamilton Company7634-01
Broca Estereotáxica de Alta VelocidadeDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Pomada Polyderm USPTARO2181908
SOMNI Scientific™   A Almofada de Aquecimento de TemperaturaFisher Scientific04-777-177
Instrumentos EstereotáxicosDavid Kopf InstrumentsModelo 902
Superfrost Plus Lâminas de Microscópio, brancoFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice O Laboratório Jackson 007914
V-1 Sistema de Anestesia Animal de Laboratório de MesaVetEquip901806
Animal

Referências

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  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071(2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531(2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490(2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663(2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310(2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).

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