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Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

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DOI:

10.3791/66966

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15 de novembro de 2024

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1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9, fornecendo uma alternativa eficiente para edição gênica no estudo da diferenciação Th17.

Resumo

As células T auxiliares que produzem IL-17A, conhecidas como células Th17, desempenham um papel crítico na defesa imunológica e estão implicadas em doenças autoimunes. As células T CD4 podem ser estimuladas com antígenos e coquetéis de citocinas bem definidos in vitro para mimetizar a diferenciação de células Th17 in vivo. A pesquisa foi conduzida extensivamente sobre os mecanismos de regulação da diferenciação Th17 usando o ensaio de polarização Th17 in vitro .

Os métodos convencionais de polarização Th17 normalmente envolvem a obtenção de células T CD4 virgens de camundongos geneticamente modificados para estudar os efeitos de genes específicos na diferenciação e função Th17. Esses métodos podem ser demorados e caros e podem ser influenciados por fatores extrínsecos celulares dos animais nocautes. Assim, um protocolo usando transdução retroviral de RNA guia para introduzir nocaute genético em células T primárias de camundongo knockin CRISPR/Cas9 serve como uma abordagem alternativa muito útil. Este artigo apresenta um protocolo para diferenciar células T primárias virgens em células Th17 após o direcionamento de genes mediado por retrovírus, bem como os métodos subsequentes de análise de citometria de fluxo para testar a infecção e a eficiência de diferenciação.

Introdução

As células Th17, um subconjunto único de células T auxiliares CD4+, são vitais para a erradicação de bactérias e fungos extracelulares e desempenham um papel significativo em várias doenças autoimunes 1,2,3. Evidências emergentes sugerem que as células Th17 exibem heterogeneidade, funcionando em condições patogênicas e não patogênicas, influenciadas por fatores ambientais e genéticos. Elucidar os processos regulatórios que controlam a diferenciação das células Th17, plasticidade e heterogeneidade é crucial para o avanço de estratégias imunoterapêuticas mais eficazes.

Animais geneticamente modificados têm sido amplamente utilizados para desvendar os principais reguladores da diferenciação e funções das células Th17. O uso de animais geneticamente modificados envolve manipulação completa in vivo, proporcionando autenticidade e estudo sistemático de seu papel em condições fisiológicas ou modelos de doenças. No entanto, a triagem de alto rendimento com essa abordagem é amplamente impraticável. Os ensaios de polarização in vitro fornecem uma alternativa para estudar a diferenciação de células Th17. A interleucina 6 (IL-6) em combinação com o fator de crescimento transformador β1 (TGFβ1) demonstrou promover o desenvolvimento de células Th17 não patogênicas, enquanto IL-6, IL-1β e IL-23 estão implicadas na condução da diferenciação de células Th17 patogênicas (pTh17)4,5.

O surgimento da tecnologia CRISPR/Cas9 facilitou a edição precisa do genoma em bases específicas. Quando combinada com a transdução retroviral, essa abordagem fornece um método genético potente, eficiente e econômico para triagem e estudo funcional de potenciais reguladores em células Th17 6,7. Neste estudo, aprimoramos o procedimento de transdução retroviral dentro do sistema de polarização Th17. Usando um sistema retroviral, infectamos células T virgens ativadas pré-estabelecidas que expressam Cas9 de camundongos. As células foram transduzidas com construções de RNA guia (gRNA) conduzidas pelo promotor U6, juntamente com genes que codificam proteínas repórter fluorescentes sob o controle do promotor EF1a para facilitar o nocaute do gene alvo. Em seguida, as células T transduzidas foram cultivadas sob condições específicas de citocinas para induzir a diferenciação em células Th17. Notavelmente, o nocaute do RoRγt reduziu significativamente a produção de IL-17A em comparação com o grupo controle. A eficácia deste sistema depende da produção otimizada de retrovírus e condições de transdução para células T primárias ativadas, fornecendo uma abordagem rápida e prática para o estudo de genes específicos na diferenciação e função Th17.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Bem-Estar Animal Experimental, Hospital Renji, Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai e estão em conformidade com as diretrizes institucionais.

1. Produção retroviral

  1. Preparação do construto retroviral
    1. Use a ferramenta CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) para projetar o sgRNA para nocaute RORγt8. Especifique o genoma de referência como Mouse GRCm38 e escolha a sequência PAM como NGG (para SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) com base no sistema guia CRISPRko. Valide o nome do gene alvo ou outros formatos de gene alvo e envie a entrada válida para obter candidatos a sgRNA. Definindo outros parâmetros para valores padrão, defina o alvo de sgRNA para RORγt (Rorc, Gene ID: 19885) para perturbar a diferenciação de Th17 e selecione sgRNA não direcionado (abreviação sgNT, sequência: GCGAGGTATTCGGCTCCGCGGGG) das bibliotecas GeCKO v2 do mouse.
      NOTA: Esta ferramenta oferece uma variedade de opções clicáveis para projetar RNAs guia, permitindo uma personalização conveniente para atender a requisitos específicos.
      1. Digite o nome do gene alvo na caixa de pesquisa na coluna Pesquisa rápida de genes. O sistema exibirá o ID do gene e o nome completo do gene alvo para garantir uma seleção precisa.
        NOTA: Opções adicionais estão disponíveis para validar diferentes formatos de genes-alvo.
    2. Escolha um sgRNA direcionado à sequência Rorc (abreviação sgRorc) de acordo com a alta classificação combinada e ordem de escolha para evitar correspondências fora do alvo e aumentar a eficácia no alvo (sequência sgRorc: GTCATCTGGGATCCACTACG). Sintetize dois oligonucleotídeos para sgRorc e sgNT: para o oligo direto, anexe a sequência "gttttagagctagaaaatagcaagttaaaat" ao final 5' de cada sequência guia; Para o oligo reverso, anexar a sequência "tttcgtcctttccaaagatatataaagc" à extremidade 3' de cada sequência guia.
      NOTA: Normalmente, existem várias opções para sequências de sgRNA. É essencial selecionar 2 ou 3 sequências de sgRNA direcionadas ao mesmo genótipo para avaliar sua eficiência de nocaute. Em nossos experimentos preliminares, dois gRNAs direcionados ao Rorc foram selecionados para comparação (sequência de sgRNA1: GTCATCTGGGATCCACTACG; sequência de sgRNA2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Os resultados experimentais indicaram que o gRNA apresentado no método atual (sequência de sgRNA1) apresenta maior eficiência de nocaute entre os dois.
    3. Amplifique as sequências codificadoras sgRorc e sgNT usando DNA polimerase em PCR com os primers acima e clone-as no vetor pMX-U6-MCS (entre as regiões do promotor U6 e o andaime gRNA) no quadro com a proteína fluorescente mCherry, respectivamente9. Configure o sistema de reação (50 μL) conforme a Tabela 1. Esses primers consistem na sequência de sgRNA (3'), que pode inserir o sgRNA no vetor, e um segmento de sequência vetorial (5'), que pode amplificar o fragmento vetorial de comprimento total. Além disso, projete os primers direto e reverso com uma sobreposição de aproximadamente 18 pb dentro da região do sgRNA (mas não totalmente sobrepostos), facilitando a montagem do vetor de clonagem linearizado durante o processo de ligação.
      NOTA: Um fragmento vetorial linearizado no local da sequência de sgRNA com primers por PCR de aproximadamente 5.551 kd deve ser obtido.
    4. Purifique a construção usando um kit de extração de gel e circule-a usando um kit de clonagem. Use os produtos de recombinação para ensaios de transformação.
    5. Escolha os clones únicos das placas e verifique as sequências de codificação sgRorc ou sgNT por meio de sequenciamento de primeira geração, usando o primer do promotor U6 (sequência: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
    6. Selecione o clone único desejado para amplificação no caldo LB. Extraia DNA de plasmídeo de alta qualidade de células bacterianas usando um kit de plasmídeo livre de endotoxinas.
      NOTA: Certifique-se de que a solução de plasmídeo tenha alta qualidade. Recomendamos que a concentração da solução plasmidial seja de pelo menos 1 μg/μL.
  2. Preparação de células de embalagem
    1. Prepare células Platinum-E (Plat-E) usando o seguinte procedimento: cultura de células Plat-E com meio de Eagle modificado de Dulbecco (meio DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades / mL de penicilina e 0,1 mg / mL de estreptomicina em uma placa de cultura de 10 cm. Será referido como o meio de cultura de células a seguir.
      NOTA: Para obter a eficiência de transfecção adequada, recomendamos o uso de células na fase de crescimento logarítmico com menos de 15 números de passagem.
    2. Divida uma placa cheia de células Plat-E de 10 cm (~ 2,6 × 107 células) em uma proporção adequada em uma nova placa de 10 cm 1 dia antes da transfecção para atingir uma confluência celular de aproximadamente 80% no dia seguinte, que é a condição ideal para a transfecção. Realize a passagem celular para um novo prato de 10 cm na proporção de 1:3 (semente ~ 8 × 106 células em um novo prato de 10 cm no dia anterior à transfecção).
      NOTA: A taxa de divisão depende da condição de crescimento das células, com maior eficiência de transfecção alcançável em células que exibem crescimento robusto. Realizamos a passagem celular para um prato de 10 cm na proporção de 1:3. Para diferentes placas de cultura de células, como uma placa de 6 cm, recomendamos que 1,5 × 106 células Plat-E sejam semeadas no dia anterior à transfecção.
  3. Transfecção
    1. Uma hora antes da transfecção, substituir o meio de cultura celular por 8 mL de meio sérico reduzido sem vermelho de fenol com 5% de FBS, mas sem penicilina-estreptomicina, pois pode interferir no reagente de transfecção. Aqueça o meio sérico reduzido a 37 °C antes de usar.
    2. Prepare a mistura de transfecção contendo a mistura 1 e a mistura 2: a mistura 1 inclui 18 μg de DNA de plasmídeo (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry / pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) e 6 μg de vetor retroviral ecotrópico pCL (pCL-Eco) em 1.000 μL de meio de soro reduzido. A mistura 2 contém 48 μL de reagente de transfecção em 1.000 μL de meio de soro reduzido. Adicione a mistura 2 gota a gota na mistura 1 e misture delicada e completamente. Incubar o complexo durante 15-20 min a 20-25 °C.
    3. Pingue cuidadosamente a mistura nas células Plat-E, girando a placa suavemente para garantir uma distribuição uniforme. Incubar as células a 37 °C sob 5% de CO2 durante 6-12 h.
    4. Substitua o meio por 10 ml de meio de cultura de células frescas e continue a incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 h.
    5. Avalie a eficiência da transfecção em células Plat-E detectando a marca do vetor retroviral, servindo como um proxy, por meio de microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo.
      NOTA: Um forte sinal de fluorescência mCherry (a fluorescência positiva excede 80%) foi detectado em uma proporção considerável de células Plat-E transfectadas com o vetor pMX-U6-MCS, indicando transfecção bem-sucedida.
    6. Colha o sobrenadante da cultura contendo vírus e centrifugue a 1.500 × g por 10 min para remover fragmentos de células. Alíquota do sobrenadante do vírus 1 ml por frasco para injetáveis e conservar a -80 °C.
      NOTA: A filtração é um método alternativo para remover detritos celulares. Recomendamos o uso de um filtro de seringa com um tamanho de poro de 0,45 μm e uma membrana de polietersulfona (PES) para minimizar a retenção de partículas virais na membrana do filtro.

2. Infecção retroviral de células T CD4 + ativadas e diferenciação Th17

  1. Preparar e ativar células T CD4+ virgens primárias
    1. Cubra cada alvéolo de uma placa de cultura de células de 24 poços com 2 μg/ml de anti-CD3e e 4 μg/ml de anti-CD28 em PBS estéril de 500 μL, envolva a placa em parafilme para evitar evaporação e contaminação e, em seguida, incube a placa a 4 °C durante a noite (ou 37 °C durante 1-2 horas antes de plaquear as células T CD4+ ) no dia anterior ao isolamento das células T CD4+ virgens.
      NOTA: Esta etapa é necessária para realizar a estimulação ligada à placa para as células T do camundongo antes de realizar a transdução viral.
    2. No dia seguinte, eutanasiar camundongos que expressam Cas9 de 6 a 8 semanas de idade (camundongos R26-CAG-Cas9) por asfixia por CO2 e esterilizá-los com etanol a 70%.
    3. Colha o baço de camundongo e coloque-o em PBS com 2% de FBS e 100 μM de EDTA (tampão FACS).
    4. Triture o baço com vidro fosco esterilizado (lado fosco) no tampão FACS, homogeneize o tecido em uma suspensão unicelular e filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm em um tubo de 50 mL.
      NOTA: Certifique-se de moer o tecido de forma suave e consistente para mantê-lo úmido. A trituração violenta do tecido pode afetar drasticamente a sobrevivência celular.
    5. Gire a suspensão de células esplênicas a 800 × g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Deixe descansar em temperatura ambiente por 5 min e, em seguida, adicione o tampão FACS para atingir um volume total de 15 mL. Centrifugue os esplenócitos a 800 × g por 5 min.
    6. Ressuspender os esplenócitos e filtrá-los através de um filtro de células de 40 μm. Ajuste o volume final para 1 mL para o isolamento de células T CD4+ .
    7. Isole as células T CD4+ usando kits de reagentes comerciais seguindo as instruções do manual.
    8. Rotule as células T CD4+ com uma mistura de anticorpos fluorescentes (CD4, CD25, CD44 e CD62L) a 4 °C por 30 min, lave as células com tampão FACS e isole as células T CD4+ virgens usando um classificador de células de fluxo. Isso resultará na obtenção de células T CD4+CD25-CD62LCD44e baixa virgens.
    9. Remova o sobrenadante de estimulação ligado à placa da placa de cultura de células de 24 poços (preparada na etapa 2.1.1) e enxágue cada poço duas vezes com 500 μL de PBS. Placa 1 x 106 células T CD4+ virgens em 1 mL de meio de cultura de linfócitos em um poço da placa de cultura de células de 24 poços. Incube as células na incubadora de células.
      NOTA: O meio de cultura de linfócitos contém 10% de FBS, 100 unidades / mL de penicilina e 0,1 mg / mL de estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES e 50 μM de β-EM em meio RPMI 1640.
  2. Infecção retroviral
    1. Após 18-24 h, colete cada poço de células ativadas no tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 800 × g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
    2. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de mistura de infecção (10 μg / mL de brometo de hexadimerina, 10 mM de HEPES no sobrenadante do vírus) e adicione 1 mL da mistura a um novo poço de uma placa de cultura de células de 48 poços. Enquanto isso, guarde células suficientes como controle negativo (não transduzido).
      NOTA: É possível ter menos de 1 x 106 células T CD4 + virgens ativadas por poço, mas não é recomendado usar menos de 0,5 x 106 células por poço. Além disso, nenhuma célula deve ser semeada nos poços periféricos da placa de cultura de 48 poços.
    3. Envolva a placa com parafilme e centrifugue a 800 x g por 90 min a 32 °C. Defina acelerar e desacelerar em 3. Após centrifugação, remova o parafilme, incube as células na incubadora por 4 h e prossiga com as etapas de diferenciação.
  3. Diferenciação de células infectadas em células Th17
    1. Prepare as células apresentadoras de antígenos (APC) durante a infecção retroviral. Primeiro, obtenha esplenócitos de camundongos do tipo selvagem seguindo as instruções das etapas 2.1.2 a 2.1.4. Ressuspenda os esplenócitos com 1 mL de meio de cultura de linfócitos com 50 μg / mL de mitomicina em um tubo de 15 mL. Incubar os esplenócitos a 37 °C sob 5% de CO2 durante 1 h.
    2. Uma hora depois, adicione PBS até a marca de 15 mL para lavar os esplenócitos, centrifugue a 800 x g por 5 min, descarte o sobrenadante, ressuspenda os esplenócitos com 1 mL de meio de cultura de linfócitos e conte o número de células. As células APC foram preparadas com sucesso.
    3. Após as 4 h de incubação celular (como na etapa 2.2.3), colete as células T CD4 + transduzidas em tubos de 1,5 mL e centrifugue a 800 x g por 5 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células infectadas em 600 μL de PBS para lavar. Centrifugue a 800 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.
    4. Coloque 0,5 × 106 células T CD4 + transduzidas em 1 mL de meio de cultura de linfócitos com 1,5 x 106 células APC em um poço de uma placa de cultura de células de 24 poços. Suplemento com 2 μg/mL de anti-CD3e, 2 μg/mL de anti-CD28 e coquetel de diferenciação de células Th17, que contém 10 μg/mL de anti-IFNγ, 10 μg/mL anti-IL-12/IL23 p40, 10 μg/mL anti-IL4, 2,5-3 ng/mL de hTGF-β e 20-30 ng/mL de IL-6. Células de cultura por 2 dias.
    5. Colete cada poço de células nos tubos de 1,5 mL, centrifugue a 800 x g por 5 min e descarte o sobrenadante. Atualize 1 mL novo do meio de cultura de linfócitos apenas com 3 ng/mL de TGF-β e 30 ng/mL de IL-6. Coloque as células em um novo poço de placa de cultura de células de 24 poços por um período de cultura prolongado. Analise as células 2 dias após a mudança do meio.

3. Avaliação da eficiência de transdução e resultados de diferenciação

  1. Após dois dias de mudança do meio, recolher as células e centrifugar a 800 × g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante. Trate as células diferenciadas com 50 ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), 500 ng/mL de ionomicina e 5 μg/mL de brefeldina A em 500 μL de meio de cultura de linfócitos em um novo poço de placa de cultura de células de 24 poços a 37 ° C em incubadora por 4 h. Colha metade das células para análise de citometria de fluxo e lise a outra metade das células com tampão de extração de RNA para análise de qPCR.
  2. Para análise de citometria de fluxo
    1. Colete as células em tubos de 1,5 mL. Adicione 1 mL de tampão FACS em tubos e centrifugue a 800 × g por 5 min para lavar as células.
    2. Ressuspenda o pellet celular com uma mistura de anticorpos fluorescentes (CD4 e Fixable Viability Dye em 100 μL de PBS) e core as células a 4 °C por 30 min.
    3. Lave as células com 300 μL de PBS e fixe-as com 300 μL de formaldeído (FA) tamponado com fosfato a 2% a 4 ° C por pelo menos 60 min.
    4. Uma hora depois, lave as células com PBS, ressuspenda-as com 600 μL de tampão de permeabilização 1x e centrifugue a 800 × g por 5 min.
    5. Descarte o sobrenadante e core com anti-IL-17A em 100 μL de tampão de permeabilização 1x por 60 min em temperatura ambiente ou 4 ° C durante a noite.
    6. No dia seguinte, lave as células com tampão de permeabilização 1x e ressuspenda-as em 200 μL de PBS. Analise as células por citometriade fluxo 10. Consulte a seção Resultados representativos.
  3. Para análise de qPCR, extraia RNA seguindo as instruções do kit de extração de RNA. Transcreva o RNA em cDNA para armazenamento ou análise subsequente de qPCR. O design desses primers deve aderir aos princípios gerais de design do primer qPCR, ao mesmo tempo em que visa especificamente a região que abrange o local indel esperado, onde ocorreu a clivagem mediada por gRNA. Qualquer redução na eficiência da amplificação ou perda de sinal neste local pode servir como um indicador de nocaute bem-sucedido. Os primers de qPCR são os seguintes:
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Resultados

No estudo, clonamos o alvo de sgRNA para Rorc e sequências codificantes sem direcionamento de sgRNA no vetor pMX-U6-MCS com proteína fluorescente mCherry (Figura 1A, B). A produção de retrovírus foi realizada de acordo com o protocolo descrito na Figura 2. A transfecção foi iniciada no dia 0 e a colheita retroviral ocorreu no dia 2. A eficiência da transfecção pode ser testada pela intensidade de fluorescência mCherry (Figura 1C). Antes da colheita do vírus, células T CD4 + virgens foram classificadas e ativadas. Essas células T CD4+ ativadas foram então infectadas usando infecção por spin, seguida pela continuação das etapas de diferenciação conforme descrito. Por fim, a eficiência da transdução e os resultados da diferenciação foram avaliados por meio de análise de citometria de fluxo e análise de qPCR.

A Figura 3 ilustra a estratégia de gating aplicada para classificar células T CD4 + virgens. Depois de selecionar a população de células principal e as células singlete (conforme mostrado nas duas primeiras portas da Figura 3), as células FVD-CD4 + foram fechadas para distinguir as células T CD4 em células polarizadas para Th17 daquelas em APCs. Finalmente, a IL-17A produzida por células T CD4 representa a eficiência de diferenciação Th17, o que indicou a eficiência de nocaute. A porcentagem de células positivas para mCherry reflete a eficiência da infecção retroviral, enquanto a eficiência do nocaute é indicada pela porcentagem de células positivas para IL-17A. Para aumentar a viabilidade celular e minimizar a duração da triagem, os esplenócitos foram enriquecidos usando um kit de isolamento de células T CD4+ de camundongo, resultando em uma eficiência de enriquecimento superior a 90%.

A eficiência da infecção por retrovírus, indicada pela presença de células positivas para mCherry, é tipicamente em torno de 40% (Figura 4A). Embora a eficiência da infecção possa ser aumentada por meio da concentração do vírus, essa abordagem ocorre às custas de uma duração experimental prolongada e custos mais altos. Em nossos experimentos, células infectadas cultivadas sem o coquetel de diferenciação celular Th17 serviram como controle negativo de diferenciação Th17, designado como Th0. Um sgRNA não direcionado foi usado como controle positivo, referido como sgNT. Para a edição de genes, empregamos gRNA direcionado ao gene RORγt (sgRNA-Rorc), que reduziu significativamente a eficiência de diferenciação Th17 ( Figura 4A ). Essa intervenção também levou a uma diminuição substancial nos níveis de expressão de Rorc e IL-17a (Figura 4B).

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Figura 1: Exemplo de sgRNA subclonado em um vetor retroviral e eficiência de transfecção. O vetor pMX-U6-MCS foi usado como construção inicial. O andaime de gRNA, juntamente com as sequências de sgRNA (a parte laranja) direcionadas ao local (A) embaralhado e (B) Rorc, foram inseridos a jusante do promotor U6 (a parte verde como uma seção para sequenciamento com primers U6). As localizações dos primers contendo sgRNA e os locais dos primers de sequenciamento são indicados abaixo do vetor circular Os nomes completos das abreviaturas no plasmídeo são os seguintes. Abreviaturas: AmpR = resistência à ampicilina, carpenicilina e antibióticos relacionados; LTR = repetição terminal longa; MMLVψ = sinal de empacotamento do vírus da leucemia murina de Moloney; gag = gene gag truncado do vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV) sem o códon de início. (C) Imagem microscópica de mCherry em células Plat-E transfectadas com DNA plasmidial. Barra de escala: 500 px. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Ilustração esquemática do protocolo. No dia anterior à transfecção, a densidade das células Plat-E precisa ser ajustada para uma faixa adequada. No dia seguinte (dia 0), realizar a transfecção e substituir o meio 12 h depois. No dia 1, classifique e ative as células T virgens de camundongos que expressam Cas9. Subsequentemente (dia 2), colher o sobrenadante de cultura contendo vírus e combinar com as células T ativadas para transdução retroviral. As células infectadas são então diferenciadas em células Th17 por 3 a 4 dias e analisadas usando FACS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Estratégia de bloqueio para classificar as células T CD4 virgens. A coloração superficial foi realizada nas células T CD4 enriquecidas para marcar CD4, CD25, CD44 e CD62L. A estratégia de gating empregada foi a seguinte: inicialmente, os linfócitos foram fechados com base nos parâmetros de dispersão direta e lateral. Posteriormente, células únicas foram identificadas usando FSC-H e FSC-W. As células CD4 + CD25- foram então bloqueadas para excluir células T reguladoras (Tregs). Finalmente, foram identificadas células T CD44CD62Laltas virgens. As células T CD4+ virgens isoladas foram coletadas para experimentos subsequentes. Abreviaturas: FSC = dispersão direta; SSC = dispersão lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Exemplo de transdução bem-sucedida de células T ativadas e diferenciação Th17. (A) A eficiência de diferenciação de Th17 é reduzida significativamente, o que é editado por RORγt gRNA (gating em mCherry + IL-17a + população). (B) Expressão relativa de mRNA de Rorγt e IL-17a em Th0 (células infectadas cultivadas sem coquetel de diferenciação de células Th17), sgNT (sgRNA não direcionado) e sgRNA-Rorc (sgRNA direcionado ao gene RORγt ). p < 0,001 (teste t de Student bicaudal não pareado; os dados são apresentados como média ± EPM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componentes da reação de PCRPrograma de PCR
ComponenteVolume (μL)PassoTemp.HoraCiclo
2 × Phanta Mix (Corante Plus)25195 ºC3 minutos1
ddH2020295 ºC15 s
Primer-F (10 μM)2356 ºC15 s
Primer-R (10 μM)2472 ºC5 min 30 sVá para a Etapa 2
35 ×
Modelo (~ 30 ng)1572 ºC5 min1
612 ºC∞

Tabela 1: Componentes de reação de PCR e programa de PCR para construção de vetores de gRNA.

Discussão

A edição do genoma CRISPR/Cas9 via entrega retroviral é um método robusto para explorar os papéis das células T auxiliares. Este protocolo oferece uma abordagem rápida e eficaz para examinar genes específicos envolvidos na diferenciação e função do Th17. Várias etapas críticas devem ser seguidas cuidadosamente para alcançar os melhores resultados. Primeiro, para aumentar a eficiência do nocaute genético, os gRNAs devem ser cuidadosamente selecionados. Dado o risco de efeitos fora do alvo na edição do gene CRISPR / Cas9, é prudente escolher 2-3 gRNAs com pontuações altas, conforme identificado na seção 1.1.1 do protocolo, para experimentos adicionais11,12. Em segundo lugar, um alto título viral é essencial para uma infecção bem-sucedida. A manutenção adequada da linha celular de empacotamento Plat-E é crucial. As células devem atingir aproximadamente 80% de confluência no dia da transfecção, pois o número de células inadequadas e excessivas comprometerá os títulos do vírus. Se as células Plat-E não estiverem disponíveis, a co-transfecção de células 293T do rim embrionário humano com o vetor pCL-Eco também pode produzir altos títulos virais 13,14. Manter uma alta concentração de plasmídeo de pelo menos 1 μg/μL é importante para alcançar um alto título de vírus. É essencial colher a suspensão do vírus antes que ela fique amarela-limão, pois o vírus apresenta sensibilidade à alteração do pH. Portanto, o pH do meio de cultura deve ser cuidadosamente regulado dentro de uma faixa apropriada. O vírus deve ser armazenado a -80 ºC para manter sua integridade e protegido de ciclos repetidos de congelamento e descongelamento15.

Terceiro, para alcançar alta eficiência de infecção, as células primárias devem ser ativadas adequadamente. A ativação celular inadequada compromete significativamente a eficiência da infecção viral16. Antes da infecção viral, o estado de ativação das células T deve ser confirmado microscopicamente, pois as células ativadas exibem um tamanho notavelmente maior do que as células inativadas. Vale a pena notar que nosso protocolo de diferenciação Th17 foi otimizado especificamente para camundongos C57BL/6, portanto, ajustes podem ser necessários para outras cepas de camundongos. Em quarto lugar, para alcançar os resultados desejados de diferenciação Th17, é crucial manter as condições celulares ideais. Durante a infecção por spin, é importante colocar as células nos poços próximos ao centro para ajudar a manter a viabilidade celular. Após a infecção por spin, incubar as células por 4 h (etapa 2.2.4 do protocolo) é crucial para sua recuperação. Além disso, ao transferir células, a pipetagem suave é importante para manter a viabilidade celular. Diferentes condições de estimulação podem afetar a diferenciação Th17. Neste experimento, a incorporação de células apresentadoras de antígenos no sistema de diferenciação aumentou significativamente a eficiência de diferenciação em comparação com a estimulação ligada a placas anti-CD3e e anti-CD28. Finalmente, é crucial garantir que todas as citocinas usadas permaneçam funcionais durante o transporte e armazenamento. As citocinas podem perder rapidamente a estabilidade em ciclos repetidos de congelamento e descongelamento ou soluções de reconstituição inadequadas. Tratamento a frio e alíquotas iguais são necessários para que as citocinas mantenham funções ao longo dos procedimentos.

Este protocolo para gerar células Th17 nocaute de genes específicos tem várias limitações. Primeiro, é difícil alcançar a eficiência de transdução completa em células T primárias de camundongo. Algumas células podem não sofrer o nocaute genético pretendido durante a diferenciação Th17. Em segundo lugar, as células T primárias têm uma vida útil limitada in vitro. Após aproximadamente uma semana, essas células tendem a morrer, apresentando desafios para experimentos subsequentes. Em terceiro lugar, nosso protocolo depende de camundongos transgênicos Cas9 e, quando tentamos incorporar a sequência Cas9 ao plasmídeo central, isso resultou em uma redução significativa nos títulos virais. Por fim, notamos que este protocolo não é adequado para analisar funções de genes envolvidos nos estágios iniciais da ativação de células T CD4+ virgens, pois essas células devem ser ativadas antes da transdução retroviral.

Apesar de suas limitações, este protocolo tem sido aplicado com sucesso em vários estudos, facilitando a exploração dos principais reguladores genéticos envolvidos na diferenciação de Th17. Ele permite a avaliação de mudanças na eficiência de diferenciação Th17 após o nocaute de genes-alvo em células T ativadas. Além disso, este protocolo é adequado para avaliar outros aspectos da função celular Th17, incluindo proliferação celular, sobrevivência, estabilidade do fator de transcrição, secreção de citocinas e respostas imunes. Além disso, nosso laboratório demonstrou sua eficácia na transdução retroviral e diferenciação de células T reguladoras induzidas (iTregs). Embora nem todos os tipos de células T tenham sido testados, esse protocolo também pode ser aplicável em outros subconjuntos, como células T Th1, Th2 e CD8+ . No geral, essa técnica serve como uma ferramenta valiosa para a realização de nocautes genéticos em células imunológicas, oferecendo um potencial significativo para descobrir sinais genéticos críticos que regulam as funções imunológicas.

Divulgações

Os autores afirmam que não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos a Dou Liu, Dongliang Xu e Pinpin Hou, da instalação central do Instituto de Imunoterapia de Xangai, por seu apoio na utilização dos instrumentos. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China Grants 31930038, U21A20199, 32100718 e 32350007 (para Linrong Lu); 32100718 (para Xuexiao Jin); Equipe de pesquisa inovadora de universidades locais de alto nível em Xangai SHSMU-ZLCX 20211600 (para Linrong Lu); Programa de Incubação Interna RJTJ24-QN-076 (para Zejin Cui). A Figura 2 foi preparada com o Figdraw.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTA (pH 8,0)SolarbioE1170
Placa de cultura de células e tecidos de 100 mmBIOFILTCD010100
1 M Hepes (Ácido livre, estéril)SolarbioH1090
Placa de cultura de células e tecidos de 24 poçosNEST702002
Placa de cultura de células e tecidos de 48 poçosNEST748002
Brefeldin Uma solução (1.000x)BioLegend420601
Anticorpo CD4 anti-camundongo Brilliant Violet 650 (RM4-5)BioLegend100546
Anticorpo monoclonal CD3e (145-2C11), Grau funcional, eBioscienceInvitrogen16-0031-82
Anticorpo monoclonal CD44 (IM7), PE, eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L (L-Selectin) Anticorpo monoclonal (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
Contador de CélulasNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 μ m)biosharpBS-40-CS
Filtro de Células (70 μ m)biosharpBS-70-CS
 Eppendorf5425  Centrífuga R
 eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
ClonExpress II One Step Cloning KitVazymeC112
DH5α Células competentesSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM MediumBasalMediaL110KJ
EasySep Mouse CD4 + Kit de isolamento de células TSTEMCELL19852
eBioscience Corante de viabilidade fixável eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree Mini Kit de Plasmídeo IITIANGENDP118-02
ExFect Transfection ReagentVazymeT101-01
Soro bovino fetal, Premium PlusGibcoA5669701
anti-mouse FITC anti-mouse IL-17A anticorpo (TC11-18H10.1)BioLegend506907
solução de formaldeídoMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix para qPCR? + limpador de gDNA?VazymeR423-01
IonomicinaBeyotimeS1672
Mitomicina CMaokang Biotecnologia7/7/1950
Mouse GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Meio Sérico ReduzidoGibco31985070meio sérico reduzido
Pacific Blue anticorpo CD4 de camundongo (RM4-5)BioLegend
PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 Anticorpo (PC61)BioLegend102015
PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 Anticorpo (GK1.5)BioLegend100422
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
PMA/TPA Ratos BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 NºNM-KI-00120
Proteína humana recombinante TGF-beta 1 (expressa em CHO), CFR& D Systems11409-BH
Analisador de Células de Pesquisa Recombinante Murine IL-6PeproTech216-16
BD BiosciencesBD LSRFortessa
Classificador de Células de PesquisaSONYMA900
RPMI 1640 MédioBasalMediaL210KJ
SimpliAmp Termociclador Sistema de PCRApplied BiosystemsA24811
Solução de piruvato de sódio (100 mM)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Anticorpo anti-camundongo CD28 purificado (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF Purificado anti-camundongo IFN-&gama; Anticorpo (XMG1.2)BioLegend505847
Anticorpo IL-4 de camundongo purificado por Ultra-LEAF (11B11)BioLegend504135
Anticorpo anti-camundongo purificado por IL-12/IL-23 p40 (C17.8)BioLegend505309
β-Mercaptoetanol (50 mM)SolarbioM8211
100531

Referências

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  15. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters. BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).
  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

Reimpressões e permissões

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Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro
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