Apresentamos um protocolo para transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9, fornecendo uma alternativa eficiente para edição gênica no estudo da diferenciação Th17.
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Artigo de método
Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células T auxiliares que produzem IL-17A, conhecidas como células Th17, desempenham um papel crítico na defesa imunológica e estão implicadas em doenças autoimunes. As células T CD4 podem ser estimuladas com antígenos e coquetéis de citocinas bem definidos in vitro para mimetizar a diferenciação de células Th17 in vivo. A pesquisa foi conduzida extensivamente sobre os mecanismos de regulação da diferenciação Th17 usando o ensaio de polarização Th17 in vitro .
Os métodos convencionais de polarização Th17 normalmente envolvem a obtenção de células T CD4 virgens de camundongos geneticamente modificados para estudar os efeitos de genes específicos na diferenciação e função Th17. Esses métodos podem ser demorados e caros e podem ser influenciados por fatores extrínsecos celulares dos animais nocautes. Assim, um protocolo usando transdução retroviral de RNA guia para introduzir nocaute genético em células T primárias de camundongo knockin CRISPR/Cas9 serve como uma abordagem alternativa muito útil. Este artigo apresenta um protocolo para diferenciar células T primárias virgens em células Th17 após o direcionamento de genes mediado por retrovírus, bem como os métodos subsequentes de análise de citometria de fluxo para testar a infecção e a eficiência de diferenciação.
Introdução
As células Th17, um subconjunto único de células T auxiliares CD4+, são vitais para a erradicação de bactérias e fungos extracelulares e desempenham um papel significativo em várias doenças autoimunes 1,2,3. Evidências emergentes sugerem que as células Th17 exibem heterogeneidade, funcionando em condições patogênicas e não patogênicas, influenciadas por fatores ambientais e genéticos. Elucidar os processos regulatórios que controlam a diferenciação das células Th17, plasticidade e heterogeneidade é crucial para o avanço de estratég....
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Bem-Estar Animal Experimental, Hospital Renji, Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai e estão em conformidade com as diretrizes institucionais.
1. Produção retroviral
- Preparação do construto retroviral
- Use a ferramenta CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) para projetar o sgRNA para nocaute RORγt8. Especifique o genoma de referência como Mouse GRCm38 e escolha a sequência PAM como ....
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Resultados
No estudo, clonamos o alvo de sgRNA para Rorc e sequências codificantes sem direcionamento de sgRNA no vetor pMX-U6-MCS com proteína fluorescente mCherry (Figura 1A, B). A produção de retrovírus foi realizada de acordo com o protocolo descrito na Figura 2. A transfecção foi iniciada no dia 0 e a colheita retroviral ocorreu no dia 2. A eficiência da transfecção pode ser testada pela intensidade de fluores.......
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Discussão
A edição do genoma CRISPR/Cas9 via entrega retroviral é um método robusto para explorar os papéis das células T auxiliares. Este protocolo oferece uma abordagem rápida e eficaz para examinar genes específicos envolvidos na diferenciação e função do Th17. Várias etapas críticas devem ser seguidas cuidadosamente para alcançar os melhores resultados. Primeiro, para aumentar a eficiência do nocaute genético, os gRNAs devem ser cuidadosamente selecionados. Dado o risco de efeitos fora do alvo.......
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Divulgações
Os autores afirmam que não há conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos a Dou Liu, Dongliang Xu e Pinpin Hou, da instalação central do Instituto de Imunoterapia de Xangai, por seu apoio na utilização dos instrumentos. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China Grants 31930038, U21A20199, 32100718 e 32350007 (para Linrong Lu); 32100718 (para Xuexiao Jin); Equipe de pesquisa inovadora de universidades locais de alto nível em Xangai SHSMU-ZLCX 20211600 (para Linrong Lu); Programa de Incubação Interna RJTJ24-QN-076 (para Zejin Cui). A Figura 2 foi preparada com o Figdraw.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | Solarbio | E1170 | |
| Placa de cultura de células e tecidos de 100 mm | BIOFIL | TCD010100 | |
| 1 M Hepes (Ácido livre, estéril) | Solarbio | H1090 | |
| Placa de cultura de células e tecidos de 24 poços | NEST | 702002 | |
| Placa de cultura de células e tecidos de 48 poços | NEST | 748002 | |
| Brefeldin Uma solução (1.000x) | BioLegend | 420601 | |
| Anticorpo CD4 anti-camundongo Brilliant Violet 650 (RM4-5) | BioLegend | 100546 | |
| Anticorpo monoclonal CD3e (145-2C11), Grau funcional, eBioscience | Invitrogen | 16-0031-82 | |
| Anticorpo monoclonal CD44 (IM7), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0441-83 | |
| CD62L (L-Selectin) Anticorpo monoclonal (MEL-14), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0621-82 | |
| Contador de Células | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto 2000 | |
| Cell Strainer (40 μ m) | biosharp | BS-40-CS | |
| Filtro de Células (70 μ m) | biosharp | BS-70-CS | |
| Eppendorf | 5425 Centrífuga R | ||
| eppendorf | 5810 R | ||
| ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix | Vazyme | Q411-02 | |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme | C112 | |
| DH5α Células competentes | Sangon Biotech | B528413 | |
| Direct-zol RNA Miniprep | ZYMO RESEARCH | R2050 | |
| DMEM Medium | BasalMedia | L110KJ | |
| EasySep Mouse CD4 + Kit de isolamento de células T | STEMCELL | 19852 | |
| eBioscience Corante de viabilidade fixável eFluor 660 | Invitrogen | 65-0864-18 | |
| EndoFree Mini Kit de Plasmídeo II | TIANGEN | DP118-02 | |
| ExFect Transfection Reagent | Vazyme | T101-01 | |
| Soro bovino fetal, Premium Plus | Gibco | A5669701 | |
| anti-mouse FITC anti-mouse IL-17A anticorpo (TC11-18H10.1) | BioLegend | 506907 | |
| solução de formaldeído | Macklin | F864792 | |
| HiScript IV RT SuperMix para qPCR? + limpador de gDNA? | Vazyme | R423-01 | |
| Ionomicina | Beyotime | S1672 | |
| Mitomicina C | Maokang Biotecnologia | 7/7/1950 | |
| Mouse GRCm38 | NCBI | RefSeq v.108.20200622 | |
| OPTI-MEM Meio Sérico Reduzido | Gibco | 31985070 | meio sérico reduzido |
| Pacific Blue anticorpo CD4 de camundongo (RM4-5) | BioLegend | ||
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 Anticorpo (PC61) | BioLegend | 102015 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 Anticorpo (GK1.5) | BioLegend | 100422 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| PMA/TPA | Ratos Beyotime | S1819 | |
| R26-CAG-Cas9 | Nº | NM-KI-00120 | |
| Proteína humana recombinante TGF-beta 1 (expressa em CHO), CF | R& D Systems | 11409-BH | |
| Analisador de Células de Pesquisa Recombinante Murine IL-6 | PeproTech | 216-16 | |
| BD Biosciences | BD LSRFortessa | ||
| Classificador de Células de Pesquisa | SONY | MA900 | |
| RPMI 1640 Médio | BasalMedia | L210KJ | |
| SimpliAmp Termociclador Sistema de PCR | Applied Biosystems | A24811 | |
| Solução de piruvato de sódio (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Ultra-LEAF Anticorpo anti-camundongo CD28 purificado (37.51) | BioLegend | 102121 | |
| Ultra-LEAF Purificado anti-camundongo IFN-&gama; Anticorpo (XMG1.2) | BioLegend | 505847 | |
| Anticorpo IL-4 de camundongo purificado por Ultra-LEAF (11B11) | BioLegend | 504135 | |
| Anticorpo anti-camundongo purificado por IL-12/IL-23 p40 (C17.8) | BioLegend | 505309 | |
| β-Mercaptoetanol (50 mM) | Solarbio | M8211 |
Referências
- Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
- Dong, C. Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat R....
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Reimpressões e permissões
