Eletroporação Baseada em Substrato Poroso com Monitoramento de Impedância Elétrica Transepitelial

Resumo

A eletroporação de substrato poroso (PSEP) combina entrega consistente e de alto rendimento com alta viabilidade celular. A introdução de medições de impedância elétrica transepitelial (TEEI) fornece informações sobre os processos intermediários do PSEP e permite a entrega sem rótulos. Este artigo discute um método para realizar experimentos de entrega de PSEP e análise de medição TEEI simultaneamente.

Resumo

A eletroporação de substrato poroso (PSEP) é um método emergente de eletroporação que fornece alto rendimento e entrega consistente. Como muitos outros tipos de entrega intracelular, o PSEP depende muito de marcadores fluorescentes e microscopia fluorescente para determinar o sucesso da entrega. Para obter informações sobre as etapas intermediárias do processo de eletroporação, foi desenvolvida uma plataforma PSEP com monitoramento integrado de impedância elétrica transepitelial (TEEI). As células são cultivadas em inserções disponíveis comercialmente com membranas porosas. Após um período de incubação de 12 h para permitir a formação de uma monocamada celular totalmente confluente, as inserções são colocadas em meios de transfecção localizados nos poços do dispositivo PSEP. As monocamadas celulares são então submetidas a uma forma de onda definida pelo usuário e a eficiência de entrega é confirmada por microscopia fluorescente. Esse fluxo de trabalho pode ser significativamente aprimorado com medições TEEI entre microscopia pulsante e fluorescente para coletar dados adicionais sobre o processo PSEP, e esses dados TEEI adicionais estão correlacionados com métricas de entrega, como eficiência e viabilidade de entrega. Este artigo descreve um protocolo para a realização de PSEP com medidas TEEI.

Introdução

A eletroporação é uma técnica na qual as células são expostas a um campo elétrico, criando poros temporários na membrana celular através dos quais cargas, incluindo proteínas, RNA e DNA, podem passar ^1,2. A versão mais utilizada é a eletroporação em massa (BEP). A BEP é realizada enchendo uma cubeta com um eletrólito contendo milhões de células, expondo o eletrólito a alta voltagem e permitindo que a carga entre nas células por difusão ou endocitose¹. Há muitas vantagens no BEP, incluindo alto rendimento e vários sistemas disponíveis comercialmente. No entanto, há limitações para a entrega do BEP. O posicionamento inconsistente da célula em relação aos eletrodos e à blindagem do campo elétrico das células adjacentes causa variabilidade significativa na exposição ao campo elétrico durante o BEP ^3,4. A alta voltagem necessária para BEP também tem um impacto negativo significativo na viabilidade celular⁵. Desde a sua criação em 2011⁶, tem havido um interesse crescente em um método de eletroporação chamado eletroporação por substrato poroso (PSEP), embora às vezes seja referido por outros nomes, incluindo eletroporação localizada e nano ou microeletroporação ^1,7,8. Em contraste com a suspensão celular do BEP, o PSEP é conduzido em células aderentes a um substrato poroso. Não apenas um estado aderente é preferido para a maioria das linhagens celulares humanas⁹, mas os poros do substrato também se concentram na corrente elétrica, localizando o potencial elétrico transmembrana (TMP) em regiões específicas da membrana celular^10,11. Essa localização permite uma redução significativa na tensão aplicada, diminuindo os danos e aumentando a viabilidade celular. Essa combinação de efeitos ajuda a controlar o desenvolvimento dos poros da membrana celular, resultando em uma entrega mais consistente e eficiente ^1,5,12.

Um estudo recente introduziu um dispositivo PSEP com um feixe de eletrodos banhados a ouro de seis poços para segurar inserções de membrana porosa disponíveis comercialmente¹³ (Figura 1A, B), uma prática que foi introduzida pela primeira vez por Vindis et al.14. O dispositivo pode aplicar pulsos e medir a impedância elétrica através da monocamada da célula, conhecida como impedância elétrica transepitelial (TEEI), em tempo real¹³. A interface do usuário do dispositivo permite controle completo sobre a forma de onda e polaridade do eletroporation. É importante ressaltar que as medições de impedância em tempo real podem ser usadas para prever os resultados da entrega sem a necessidade de reagentes caros ou marcadores fluorescentes, um conceito conhecido como entrega sem rótulo¹⁵.

A plataforma PSEP consiste em dois componentes elétricos personalizados principais: o corpo principal do dispositivo, que abriga o gerador de pulsos e o equipamento de medição TEEI, e o feixe de eletrodos, onde os substratos porosos são inseridos e ocorre a eletroporação. Diagramas para todos os componentes eletrônicos personalizados e impressos em 3D podem ser encontrados no GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Além da eletrônica personalizada, também é necessário um computador para que a plataforma funcione corretamente. O software personalizado requer o MATLAB (versão 2021a ou posterior) para ser executado e o Microsoft Excel para armazenar e acessar dados para análise. O programa controla a eletrônica personalizada e fornece a interface gráfica do usuário (GUI) para ajustar as configurações. Esses programas também foram disponibilizados no GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.

Dados preliminares sugerem que esse processo é possível para diferentes tipos de células aderentes (Figura 1C), mas este artigo discutirá apenas a preparação de células A431 usando parâmetros que foram considerados ideais para essa linhagem celular por Brooks et ^al.13. Além disso, como a carga de iodeto de propídio (PI) é citotóxica, dois experimentos são realizados, o primeiro com um meio de transfecção de PI de alta concentração para quantificar a eficiência de entrega e o segundo apenas com meios de cultura de células para medir o TEEI em escalas de tempo mais longas. Esses experimentos usam formas de onda de eletroporação idênticas, permitindo que os resultados sejam correlacionados (Figura 1D).

Figura 1: Diagrama de montagem do feixe de eletrodos e dados fundamentais. (A) Modelo CAD de um inserto dentro de um poço do feixe de eletrodos. (B) Modelo CAD do feixe de eletrodos. (C) Aumento da impedância devido ao PSEP para linhagens celulares selecionadas, n = 3 por linhagem celular. Barra de erro: erro padrão da média. (D) Eficiência de entrega vs. TEEI aumenta os dados de correlação. A eficiência de entrega foi calculada dividindo o número de células marcadas nas imagens de PI e calceína dos experimentos de entrega pelo número total de células identificadas com Hoechst. A contagem de células foi determinada usando um pipeline personalizado do CellProfiler, n = 6 por tensão. Barra de erro: (eixos x e y) erro padrão da média. Esta figura é reproduzida de Brooks et ^al.13 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de reagentes e cultura celular

1. Prepare o meio de cultura celular adicionando 50 mL de soro fetal bovino (FBS) e 5 mL de penicilina-estreptomicina a um recipiente de 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Produzir onze alíquotas de 50 ml para reduzir o risco de contaminação e refrigerar a 4 °C.
2. Crie 1 mL de 25 μg/mL de fibronectina plasmática humana em solução salina tamponada com fosfato (PBS) de acordo com as instruções do fabricante.
3. Crie 15 mL de iodeto de propídio 0,1 mg / mL em solução estoque de DMEM para permitir experimentos com concentrações de carga variadas.
4. Cultivar células A431 num balão T75 contendo 12 ml do meio de cultura celular preparado. As células foram passadas a cada 1-2 dias para manter 50% de confluência.

2. Preparação da amostra

1. Revestimento de fibronectina
   1. Selecione doze pastilhas e duas placas de 24 poços. Coloque as inserções em uma placa de poço, criando duas fileiras de seis. Deixe a segunda placa de poço de lado até mais tarde.
   2. Crie 1.300 μL de solução de fibronectina de 1 μg/mL misturando 52 μL de solução estoque de fibronectina e 1.248 μL de PBS em um tubo de 1,5 mL.
   3. Distribua 100 μL da solução de fibronectina em cada inserção. Incubar as pastilhas na placa do poço a 37 °C durante 3 h.
2. Ajustando a concentração celular para otimizar a densidade celular
   1. Cerca de 1 h antes da conclusão da incubação da fibronectina, remova o frasco T75 de células A431 da incubadora para extração celular.
   2. Remova o meio no frasco com um aspirador e lave com 5 mL de PBS. Remova o PBS da mesma maneira e adicione 3 mL de tripsina. Incube por 3-4 min antes de bater na lateral do frasco para separar completamente as células.
   3. Adicione 6 mL de meio de cultura de células ao frasco, misturando vigorosamente com uma pipeta para separar as células restantes, e transfira o conteúdo para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue a 100 x g e 20 °C por 5 min.
   4. Remova o meio de cultura celular e a tripsina do tubo de centrífuga usando um aspirador, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. Adicione 1 mL de meio ao tubo de centrífuga e pipete para frente e para trás (sem produzir bolhas) para quebrar o pellet celular e ressuspender as células.
   5. Pipete 10 μL da suspensão celular, 40 μL de meio de cultura celular e 50 μL de corante azul de tripano em um tubo de 200 μL, usando uma pipeta para misturar bem.
   6. Remova 10 μL da mistura de corante e injete-a em um hemocitômetro. Conte as células usando a diluição de 10% da mistura de corantes para estimar a contagem total de células no tubo de centrífuga de 15 mL.
      NOTA: Para este protocolo, assuma uma concentração de 5.000.000 células/mL.
   7. Multiplique a densidade de semeadura desejada pela área de superfície da membrana do inserto, divida pelas células contadas/mL na suspensão e multiplique por 1.000 para calcular os microlitros necessários de suspensão celular por inserto.
      1. Para encontrar a quantidade total de suspensão celular necessária, multiplique esse número por 10 (para garantir células suficientes para 9 amostras, pois 3 das 12 inserções serão controles livres de células) e arredonde para o número inteiro mais próximo. Neste caso, um total de 135 μL da suspensão celular é necessário para este experimento.
   8. Crie 2.000 μL de solução celular ajustada misturando os 135 μL da suspensão celular previamente calculados com 1.865 μL de meio de cultura celular em um tubo de centrífuga separado de 15 mL.
3. Semeando células
   1. Remova o excesso de fibronectina de cada inserção assim que a incubação da fibronectina estiver completa.
   2. Lave as inserções duas vezes adicionando 100 μL de água destilada estéril a cada inserção. Remova a água seguindo a mesma ordem em que foi adicionada para garantir um tempo de lavagem consistente entre as inserções.
   3. Lave novamente a pastilha adicionando 100 μL de meio de cultura celular a cada inserção. Remova a mídia seguindo a mesma ordem em que foi adicionada para garantir um tempo de lavagem consistente entre as inserções.
   4. Inserções de amostra de célula
      1. Células de sementes pipetando 200 μL de solução celular ajustada em cada inserção. Para garantir uma confluência consistente entre os insertos, misture a solução celular no tubo de centrífuga antes da distribuição e misture novamente dentro de cada inserto após a distribuição.
   5. Insertos de controle negativo
      1. Pipetar 200 μL de meio de cultura celular em cada inserção. Para permanecer consistente com as inserções de amostra de células, use a pipeta para misturar os meios de cultura de células dentro de cada inserção.
4. Rotulagem e incubação
   1. Desenhe uma linha dividindo a segunda placa de poço em duas colunas com três poços de largura (para condições executadas em triplicado) usando um marcador permanente. Separe cada coluna em linhas. Rotule cada região na grade com parâmetros relevantes.
   2. Adicione 1 mL de meio de cultura celular a cada poço para receber uma inserção para o experimento. Transferir as inserções da placa do alvéolo de preparação para o local adequado na placa do alvéolo rotulado e incubar a 37 °C durante pelo menos 12 h.

3. Procedimento experimental

1. Experiência de entrega
   1. Pipetar 1,5 ml da solução de 0,1 mg/ml de PI em cada alvéolo do feixe de elétrodos. Coloque um inserto em cada poço do feixe de eletrodos, encaixando os pés do inserto nas ranhuras de alinhamento de modo que o inserto fique nivelado com a superfície superior do poço (Figura 1A, B).
   2. Aparafuse a placa de circuito impresso (PCB) do eletrodo superior na parte superior dos poços do feixe de eletrodos e conecte o feixe de eletrodos ao dispositivo PSEP.
   3. Coloque o feixe de eletrodos na incubadora de 37 °C por pelo menos 1 h para permitir que a temperatura se equilibre.
   4. Clique no menu suspenso ao lado de "Membrana" no canto superior esquerdo da GUI e clique em GBO de 400 nm. Repita esta etapa para "Eletrólito", "Células", "Densidade de semeadura celular" e "Duração da célula", selecionando DMEM, A431, 200 e 12, respectivamente.
      NOTA: Esses valores são apenas para fins de manutenção de registros e não afetam a função do dispositivo. Certifique-se de ajustar esses valores conforme necessário para o rastreamento correto dos dados.
   5. Digite 1 no campo de edição Duração do tempo pós-pulso (min) no lado direito da GUI para alterar o tempo de medição pós-pulso padrão para 1 min. Deixe todas as outras configurações no estado padrão.
      NOTA: Os parâmetros de pulso padrão criam uma forma de onda quadrada com 30 volts, 20 Hz, duração de 1 ms e 200 pulsos. Os parâmetros de medição TEEI padrão são 0,5 volts e 100 Hz, 1.000 Hz, 10.000 Hz e 100.000 Hz.
   6. Clique no botão Executar e insira os nomes apropriados para os poços 1-3 e 4-6 quando solicitado. Clique em OK para iniciar o experimento.
   7. Remova o feixe de eletrodos da incubadora e transfira as pastilhas de volta para os locais originais na placa do poço do experimento quando o programa terminar de ser executado.
   8. Misture 2 μL de Hoechst 33342 e 5 μL de calceína AM com 123 μL de meio de cultura celular em um tubo de 200 μL.
   9. Pipete suavemente 10 μL da solução corante em cada inserto pós-pulso e coloque os insertos de volta na incubadora por 5 min.
   10. Transfira a placa do poço para o suporte da placa de um microscópio fluorescente com uma objetiva de ampliação de 5x. Imagem usando campo claro e a fluorescência de cada mancha. Centralize a inserção sobre a objetiva antes de acionar a câmera.
       NOTA: Os comprimentos de onda de excitação para PI, calceína AM e Hoechst 33342 são 558 nm, 495 nm e 353 nm, respectivamente. Os comprimentos de onda de emissão são 575 nm, 519 nm e 465 nm, respectivamente.
2. Experiência de medição TEEI
   1. Pipete 1,5 mL do meio de cultura celular em cada poço no feixe de eletrodos. Coloque as inserções de amostra de célula nos poços 1-3 e as pastilhas de controle nos poços 4-6, encaixando os pés da pastilha nas ranhuras de alinhamento de modo que a pastilha fique nivelada com a superfície superior do poço.
   2. Aparafuse a placa de circuito impresso do eletrodo superior na parte superior dos poços do feixe de eletrodos e conecte o conjunto de eletrodos ao dispositivo PSEP.
   3. Coloque o feixe de eletrodos na incubadora de 37 °C por pelo menos 1 h para permitir que a temperatura se equilibre.
   4. Clique no menu suspenso ao lado de "Membrana" no canto superior esquerdo da GUI e clique em 400 nm GBO. Repita esta etapa para "Eletrólito", "Células", "Densidade de semeadura celular" e "Duração da célula", selecionando DMEM, A431, 200 e 12, respectivamente.
      NOTA: Esses valores são apenas para fins de manutenção de registros e não afetam a função do dispositivo. Certifique-se de ajustar esses valores conforme necessário para o rastreamento correto dos dados.
   5. Deixe todas as configurações restantes no estado padrão.
      NOTA: Os parâmetros de pulso padrão criam uma forma de onda quadrada com 30 volts, 20 Hz, duração de 1 ms e 200 pulsos. Os parâmetros de medição TEEI padrão são 0,5 volts e 100 Hz, 1.000 Hz, 10.000 Hz e 100.000 Hz.
   6. Clique no botão Executar e insira os nomes apropriados para os poços 1-3 e 4-6 quando solicitado. Clique em OK para iniciar o experimento.
   7. Remova o feixe de eletrodos da incubadora e transfira as pastilhas de volta para os locais originais na placa do poço do experimento quando o programa terminar de ser executado.
   8. Misture 2 μL de Hoechst 33342, 5 μL de calceína AM e 10 μL de PI com 113 μL de meio de cultura celular em um tubo de reação de 200 μL.
   9. Pipete 10 μL da solução corante em cada inserto pós-pulso e coloque os insertos de volta na incubadora por 5 min.
   10. Transfira a placa do poço para o suporte da placa de um microscópio de imagem fluorescente com uma lente objetiva de 5x. Imagem usando campo claro e a fluorescência de cada mancha. Centralize a inserção sobre a lente antes de acionar a câmera.
       NOTA: Os comprimentos de onda de excitação para PI, calceína AM e Hoechst 33342 são 558 nm, 495 nm e 353 nm, respectivamente. Os comprimentos de onda de emissão são 575 nm, 519 nm e 465 nm, respectivamente.

4. Análise dos dados

1. Analisando dados de imagem com o pipeline do CellProfiler
   1. Use o fluxo de trabalho personalizado do CellProfiler fornecido em GitHub:https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI para processar as imagens do experimento de medição de entrega e TEEI.
2. Análise – TEEI
   1. Clique na guia Análise na GUI.
   2. Alterne o indicador de tipo de impedância para TEEI na parte inferior da GUI.
   3. Clique na seta na caixa superior esquerda para mostrar todos os nomes dos experimentos no arquivo de dados. Selecione todos os dados de amostra de célula do experimento de medição TEEI.
   4. Clique na seta na próxima caixa à direita para mostrar todos os nomes de experimentos no arquivo de dados. Selecione todos os dados de inserção de controle da medição TEEI.
   5. Clique em Executar. Uma figura básica contendo dados de amostra de células selecionadas na frequência de medição mais baixa aparecerá.
   6. Na caixa de opções de exemplo no lado direito da GUI, clique na seta para mostrar todos os dados de inserção selecionados. Os valores discrepantes podem ser removidos selecionando os dados apropriados e clicando em Remover abaixo.
      NOTA: Todos os dados que foram removidos da análise pelo último clique do botão Remover podem ser recuperados pelo botão Desfazer .
   7. Clique em Concluído para passar para a próxima figura quando os dados desejados forem mostrados na figura.
   8. Repita as etapas 4.2.6 e 4.2.7 para os dados de amostra de célula restantes e dados de controle. Quando o conjunto de dados final for confirmado clicando em "Concluído", a figura completa da análise aparecerá.
   9. Gravar a figura de análise.

Resultados

O protocolo fornecido estabelece um método para usar medições TEEI para examinar os processos intermediários de eletroporação e fazer previsões de entrega, especificamente para a linha celular A431 e carga PI. Embora a modificação deste protocolo seja discutida mais adiante no artigo, é importante observar agora que, embora os valores específicos possam mudar, as tendências gerais na resposta permanecem consistentes. Por exemplo, os dados TEEI que caem abaixo da linha de base inicial correspondem à morte celular, enquanto o aumento máximo no valor TEEI acima do mínimo corresponde à eficiência de entrega¹³. Essas tendências gerais e suas implicações são exploradas abaixo.

Conforme mostrado na Figura 2A, uma variedade de tendências de medição TEEI e imagem celular pode surgir durante o uso da plataforma PSEP. O resultado ideal deste protocolo é produzir uma curva semelhante aos dados saudáveis otimizados mostrados na Figura 2Ai. Isso é caracterizado como o resultado ideal, pois não há queda abaixo da linha de base, indicando muito pouca ou nenhuma morte celular. Além disso, a curva saudável otimizada tem o maior aumento no TEEI do mínimo, indicando um alto grau de eficiência de entrega¹³. Essas inferências são apoiadas pela imagem pós-PSEP da monocamada celular, que revela morte celular insignificante e uma monocamada celular saudável e totalmente confluente (Figura 2Aiii). Além disso, um experimento de entrega bem-sucedido usando formas de onda PSEP idênticas pode ser caracterizado pelas imagens mostradas na Figura 2B. A aplicação adequada da forma de onda de eletroporação e a concentração de carga resultam em um alto grau de consistência de entrega e viabilidade celular.

A saúde e a confluência da monocamada celular são críticas para a aplicação bem-sucedida das previsões de entrega baseadas em TEEI^16,17. Mesmo com uma forma de onda otimizada, uma monocamada celular não saudável ou incompleta resulta em uma resposta TEEI diminuída, conforme ilustrado pelos dados não saudáveis otimizados na Figura 2Aii. No entanto, note-se que as imagens para esse desfecho (Figura 2Avi) ainda correspondem à interpretação da resposta TEEI dada por Brooks et ^al.13. Não há queda abaixo da linha de base, indicando morte celular próxima de zero (Figura 2C, D). Além disso, o aumento reduzido do mínimo corresponde a um impacto negativo na eficiência de entrega, pois menos células na monocamada reduzem a entrega total de IP (Figura 2C, D).

Se uma forma de onda não otimizada for aplicada, é possível ver reduções ainda mais significativas na resposta TEEI. Dependendo da energia total e do período de tempo em que é aplicada, as formas de onda não otimizadas podem produzir resultados que variam de diminuição da eficiência à aniquilação quase total da monocamada celular (Figura 2Ai, iii, v). Ambas as curvas não otimizadas e muito não otimizadas mostram uma diminuição significativa da linha de base, indicando morte celular substancial. No entanto, formas de onda cada vez mais não otimizadas impedem a recuperação celular, resultando em menor eficiência de entrega.

A eficiência de entrega foi calculada dividindo o número de células marcadas nas imagens de PI e calceína dos experimentos de entrega pelo número total de células identificadas com Hoechst. A morte foi calculada tomando as células marcadas com PI em experimentos de medição TEEI e dividindo pelo número total de células identificadas com Hoechst. A contagem de células foi determinada usando um pipeline personalizado do CellProfiler para ambas as métricas.

Figura 2: Curvas de resposta TEEI e imagens para condições comuns. (A) (i) Dados de resposta TEEI ilustrando a variação percentual de TEEI para condições otimizadas e não otimizadas. (ii) Comparação da resposta TEEI entre monocamadas saudáveis e não saudáveis sob condições de forma de onda otimizadas. (iii-v) Imagens representativas de resultados potenciais para condições de forma de onda otimizadas e não otimizadas mostrando morte celular (vermelho) e células vivas (verde). (vi) Imagem representativa de monocamada não saudável após a aplicação de condições de forma de onda otimizadas mostrando células vivas de morte celular (vermelho) (verde). (B) Imagens mostrando a entrega bem-sucedida de IP (vermelho), células vivas (verde) e localizações de núcleos (azul). Todas as imagens foram iluminadas para maior clareza. Barras de escala: 1000 μm. (C) Diminuição do TEEI da linha de base pré-PSEP para o mínimo pós-PSEP e aumento do mínimo pós-PSEP para o pico pós-PSEP para determinadas tensões. (D) Eficiência de entrega e porcentagens de morte celular para determinadas tensões. As barras de erro representam o SEM (n = 6). (C,D) reproduzido de Brooks et ^al.13 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A Figura 2C demonstra que os aumentos de TEEI do mínimo e as diminuições da linha de base são plotados para cada tensão da forma de onda PSEP. O aumento do TEEI cria um arco parabólico, atingindo um pico de cerca de 20 volts antes de reduzir, enquanto a diminuição do TEEI da linha de base aumenta exponencialmente à medida que a tensão aumenta. A eficiência de entrega e as porcentagens de morte na Figura 2D refletem essas tendências, com a eficiência de entrega em arco parabolicamente, atingindo um pico de cerca de 30 volts, e a morte aumentando exponencialmente à medida que a tensão da forma de onda aumenta.

Uma hipótese para o mecanismo subjacente que causa o aumento do TEEI é a eletro-osmose através dos microcanais de substrato carregados negativamente, um fenômeno causado pela aplicação de um campo elétrico^18,19. Se a resposta TEEI é devido ao estímulo mecânico do inchaço celular devido ao fluxo de fluido eletro-osmótico, um fator conhecido por ocorrer com a eletroporação²⁰, ou devido ao estímulo elétrico da própria forma de onda, é claro que a saúde e a integridade da monocamada são fundamentais para alcançar a queda de tensão adequada através da membrana celular necessária para a eletroporação. Por esse motivo, as etapas mais críticas desse método são as relacionadas à semeadura celular e à garantia da formação adequada da monocamada celular. Isso pode ser confirmado por imagens da monocamada celular e pelo valor TEEI basal. Para as células A431, o TEEI médio é de cerca de 7 Ω·cm², enquanto as células HEK293T têm uma média ligeiramente inferior a 5 Ω·cm² (Figura 2Aii), provavelmente devido a diferenças morfológicas que causam diferenças na área de junção célula-célula.

Devido ao campo elétrico necessário para a eletroporação do substrato poroso, ocorrerá eletrólise, causando corrosão dos eletrodos^12,21. Isso foi especialmente evidente para o eletrodo inferior, pois foi carregado positivamente neste experimento para fornecer PI carregado positivamente. Por meio de experimentação, foi determinado que o PCB inferior poderia ser usado aproximadamente 20 vezes antes que efeitos negativos significativos exigissem substituição¹³. Para limpar o feixe de eletrodos para reutilização, remova a cultura de células restante ou o meio de transfecção das câmaras usando um aspirador. Encha cada câmara com três quartos do caminho com etanol a 70% e coloque a placa de circuito impresso do eletrodo superior no conjunto de eletrodos para que os eletrodos superiores fiquem submersos. Deixe o etanol no feixe de eletrodos por pelo menos 10 minutos antes de remover o etanol e colocar o conjunto de eletrodos de lado para secar.

É possível reutilizar as inserções adquiridas removendo os substratos, esterilizando a pastilha e substituindo o substrato por um retirado de outra fonte. Insertos de 6 poços com a mesma densidade e diâmetro de poros estão disponíveis comercialmente e podem ser usados para colher quatro substratos de substituição do tamanho de um inserto de 24 poços. Uma vez que as inserções usadas anteriormente sejam esterilizadas, adicione 10 μL de epóxi curado por luz ultravioleta a uma placa de Petri fresca. Mergulhe o lado do substrato do inserto na poça de epóxi para revestir a superfície inferior e coloque cuidadosamente um novo substrato sobre o orifício no inserto. Verifique visualmente se o epóxi faz um anel completo para garantir que não haja lacunas na conexão. Catalise sob luz ultravioleta por 30 s e armazene as inserções recondicionadas em uma placa limpa de 24 poços para evitar danos aos novos substratos antes da reutilização.

Como afirmado anteriormente, embora seja hipotetizado que o aumento observado do TEEI ocorrerá em vários tipos de células, ele só foi demonstrado com as linhagens celulares A431 e HEK293T¹³ (Figura 1C), ambas células aderentes. O método pode ser modificado selecionando diferentes linhagens celulares, selecionando membranas com diferentes características de poros, substituindo o revestimento de fibronectina por outra proteína da matriz extracelular, ajustando a concentração ou alterando a carga. No entanto, se alguma alteração for feita na configuração do experimento, pode ser necessário reotimizar a forma de onda. Para otimizar a forma de onda, um experimento de medição TEEI pode ser conduzido no qual apenas um parâmetro de forma de onda, como tensão, é alterado entre cada grupo de três amostras. Selecione a tensão ideal identificando o maior aumento no TEEI em pelo menos nove amostras saudáveis. Repita esse processo para cada parâmetro de forma de onda, usando os valores recém-otimizados ao passar para o próximo. Lembre-se de que pode haver vários ótimos locais para os parâmetros da forma de onda (ou seja, a tensão ideal para uma duração de pulso pode não ser a tensão ideal para outra duração de pulso e assim por diante).

Os benefícios da eletroporação de substrato poroso são amplos. Embora outros métodos de administração intracelular existam há um tempo considerável, poucos combinaram alto rendimento com alto grau de controle que o PSEP possui ^1,13. Além disso, o uso de medições TEEI pela plataforma fornece um vislumbre das etapas intermediárias do processo de eletroporação. As leituras do TEEI informam a condição das células, orientam a seleção dos parâmetros de eletroporação e permitem uma visão mais aprofundada dos comportamentos e mecanismos celulares específicos^13,17. Por meio das medições TEEI, a plataforma também é capaz de entrega sem rótulo¹³, o que permite uma otimização rápida com uma menor necessidade de biomarcadores e reagentes caros toda vez que um experimento é realizado. Essas contribuições para a área de entrega intracelular tornam este um excelente candidato como plataforma de entrega para pesquisa biológica fundamental e aplicações biomédicas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de centrífuga cônico de 15 mL	Thermo Scientific	339651
Hemocitômetro descartável de 2 chips	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2	fisherbrand	FB012937
A431 Células	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
Gabinete de Biossegurança Tipo II Tipo A2	Labgard	NU-543-600
Componentes Personalizados	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Tubo de Centrífuga Descartável (50 mL)	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
Soro Bovino Fetal	Gibco	A5670401
Fluidos	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Fibronectina de Plasma Humano	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
Microscópio Fluorescente Invertido	Zeiss	491916-0001-000
Microscópio	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
Tubo de PCR 200 µ L	Sarstedt	72.737
Penicilina / Estreptomicina	Gibco	15140148
Pipeta (0.2-2 µ L)	de FBE00002		Elite da marca Fisherbrand
(100-1000 µ L)	Elite FBE01000		da marca Fisherbrand
(20-200 µ L)	fisherbrand Elite	FBE00200
Pipeta (2-20 µ L)	fisherbrand Elite	FBE00020
Tubo de Reação de Iodeto de Propídio	Invitro	P1304MP
1.5 mL	Sarstedt	72.690.300
Centrífuga Sorvall ST 16R	Thermo Scientific	75004240
Thincert (24 poços)	Greiner Bio-One	662 641	0,4 µ m diâmetro dos poros, 2x106 cm-2 densidade dos poros,
transparente Placa de cultura de tecidos PET (24 poços)	fisherbrand	FB012929
Solução azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
Tripsina	Gibco	15090046