Protocolo otimizado para rolos suíços intestinais e coloração imunofluorescente de tecido embebido em parafina

Resumo

O intestino é vital para a digestão e absorção. Cada região - duodeno, jejuno, íleo, cólon - tem funções distintas devido a estruturas celulares únicas. Estudar a fisiologia intestinal exige uma análise meticulosa do tecido. Este protocolo descreve a fixação e o processamento do tecido usando a técnica do rolo suíço, garantindo uma imunocoloração precisa por meio da preservação e orientação adequadas do tecido.

Resumo

O intestino é um órgão complexo composto pelos intestinos delgado e grosso. O intestino delgado pode ser dividido em duodeno, jejuno e íleo. Cada região anatômica do intestino tem uma função única que se reflete nas diferenças na estrutura celular. Investigar alterações no intestino requer uma análise aprofundada de diferentes regiões teciduais e alterações celulares. Para estudar o intestino e visualizar grandes pedaços de tecido, os pesquisadores costumam usar uma técnica conhecida como rolos suíços intestinais. Nesta técnica, o intestino é dividido em cada região anatômica e fixado em uma orientação plana. Em seguida, o tecido é cuidadosamente enrolado e processado para inclusão em parafina. A fixação e orientação adequadas do tecido são uma técnica laboratorial frequentemente negligenciada, mas são extremamente importantes para a análise a jusante. Além disso, o enrolamento inadequado do tecido intestinal pode danificar o epitélio intestinal frágil, levando à má qualidade do tecido para imunocoloração. Garantir um tecido bem fixado e devidamente orientado com estruturas celulares intactas é uma etapa crucial que garante a visualização ideal das células intestinais. Apresentamos um método simples e econômico para fazer rolos suíços para incluir todas as seções do intestino em um único bloco embebido em parafina. Também descrevemos a coloração otimizada por imunofluorescência do tecido intestinal para estudar vários aspectos do epitélio intestinal. O protocolo a seguir fornece aos pesquisadores um guia abrangente para obter imagens de imunofluorescência de alta qualidade por meio de fixação de tecido intestinal, técnica de rolo suíço e imunocoloração. O emprego dessas abordagens refinadas preserva a intrincada morfologia do epitélio intestinal e promove uma compreensão mais profunda da fisiologia intestinal e da patobiologia.

Introdução

A arquitetura celular do intestino representa um desafio único na manutenção de sua integridade estrutural quando o tecido intestinal está sendo preservado para imunocoloração. O intestino delgado é composto de estruturas alongadas semelhantes a dedos conhecidas como vilosidades¹. Essas vilosidades geralmente ficam malformadas durante os processos de incorporação. Garantir que os pesquisadores tenham técnicas para incorporar adequadamente os intestinos para obter seções transversais, permitindo a visualização de todas as regiões do intestino, bem como das camadas que compõem o intestino (ou seja, muscular própria, mucosa e serosa), é crucial para uma análise experimental robusta². A fixação inadequada, a fixação excessiva e o manuseio inadequado do tecido comprometerão a integridade do tecido, resultando em danos inadvertidos ao epitélio intestinal ^3,4. Danificar o epitélio intestinal durante essas etapas pode diminuir significativamente a qualidade das análises subsequentes, como a imunofluorescência, independentemente da eficácia dos protocolos de imuno-histoquímica e dos anticorpos empregados.

A imunocoloração, como a fixação adequada do tecido, é uma parte importante da pesquisa biomédica. Quando bem feita, a imunocoloração pode iluminar aspectos anteriormente desconhecidos da estrutura e função celular. A coloração por imunofluorescência de cortes de parafina pode ser desafiadora devido a modificações físico-químicas resultantes do processo de fixação e inclusão de parafina⁵. A fixação e a inclusão em parafina resultam em mascaramento de antígenos que podem interferir na detecção de imunofluorescência de epítopos de interesse⁶. A fixação tardia pode induzir degradação proteolítica, o que resulta em coloração enfraquecida ou ausente de epítopos críticos⁷. Além disso, os anticorpos costumam ser imprecisos com altos níveis de fundo. Protocolos de imunocoloração que promovem a ligação consistente e específica de anticorpos e uma alta relação sinal-ruído podem fornecer informações valiosas para os pesquisadores.

Aqui, fornecemos um protocolo abrangente projetado para obter imagens de imunofluorescência de alta qualidade por meio de fixação de tecido intestinal, preparação de rolo suíço⁸ e imunocoloração. Enfatizando diretrizes para preservar a integridade do intestino, o protocolo visa fornecer aos pesquisadores uma metodologia robusta para melhorar a qualidade e a confiabilidade dos estudos de imagem de imunofluorescência. Também procuramos usar recursos econômicos, incluindo papel de filtro e recuperação caseira de antígenos, soluções de bloqueio e diluentes de anticorpos para tornar o protocolo mais acessível a laboratórios que podem ter fundos restritos. Como para todos os protocolos experimentais, os pesquisadores devem otimizar o protocolo atual com base em sua abordagem experimental e áreas de interesse.

Protocolo

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul aprovou todos os cuidados, manutenção e tratamento dos animais. O tecido intestinal foi coletado de camundongos C57BL/6J adultos (machos e fêmeas de 3 a 5 meses de idade, pesando cerca de 30 g) para uso no presente estudo.

1. Fixação do tecido intestinal

1. Disseque cuidadosamente todo o intestino de um camundongo sacrificado e coloque-o em um barco de pesagem ou placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Remova os intestinos do PBS e use uma tesoura para remover suavemente o excesso de gordura e tecido conjuntivo. Cortar o tecido conjuntivo ajuda o tecido a ficar plano durante as etapas subsequentes.
3. Divida o intestino em segmentos individuais usando uma tesoura (ou seja, duodeno, jejuno, íleo, ceco e cólon). Divida os segmentos com base nas características anatômicas e/ou comprimento, sendo aproximadamente 13% do comprimento intestinal duodeno, 58% jejuno, íleo, 6% ceco e cólon 15%⁹. O duodeno segue o estômago e o íleo é a seção terminal do intestino delgado imediatamente antes do ceco.
4. Liberte o cólon cortando onde ele se junta ao ceco usando uma tesoura. Coloque o duodeno, jejuno, íleo e cólon no recipiente de pesagem ou placa de Petri de PBS. Descarte o ceco ou fixe-o de acordo com outros métodos publicados¹⁰.
5. Conecte uma ponta de pipeta P200 a uma seringa de 10 mL cortando a extremidade grande da ponta com uma lâmina de barbear. Encha a seringa com PBS.
6. Insira a ponta da seringa na abertura de um segmento intestinal usando uma pinça. Use a pinça para segurar o segmento intestinal na seringa e lave suavemente a uma taxa de ~ 50 μL / s para remover o conteúdo intestinal. Reúna o conteúdo intestinal em um barco de pesagem vazio ou placa de Petri.
7. Coloque o segmento intestinal úmido em linha reta em uma tira de papel de filtro de celulose rotulado a seco (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que o segmento intestinal esteja úmido o suficiente para aderir adequadamente ao papel de filtro seco. Rotule o papel de filtro com as informações sobre o número do rato, genótipo, grupo experimental, etc. usando um lápis.
   NOTA: Usar uma caneta para rotular o papel de filtro pode resultar na perda de etiquetas durante a fixação.
8. Use uma tesoura de dissecção para cortar o intestino longitudinalmente ao longo da linha mesentérica. Corte ~ 5 mm de cada vez, usando a borda inferior da tesoura ou um par de pinças para colocar o tecido cortado no papel de filtro. Continue até que toda a seção do intestino seja cortada e colocada sobre o papel de filtro. Tome cuidado para cortar o intestino em uma linha o mais reta possível, pois isso facilitará o enrolamento do tecido.
   NOTA: Tesouras com ponta esférica podem ser usadas durante esta etapa para evitar danos aos tecidos.
9. Coloque outro pedaço de papel de filtro em cima do segmento intestinal. Certifique-se de que o papel de filtro ensanduiche o segmento intestinal, evitando que o intestino se enrole ou perca sua forma achatada durante a fixação.
10. Grampeie as bordas do papel de filtro para prender o tecido no lugar. Não grampeie o lenço de papel. Coloque grampos suficientes ao redor do tecido para evitar que o tecido se solte do papel de filtro durante a fixação.
11. Repita as etapas 1.5-1.10 para cada um dos segmentos intestinais (duodeno, jejuno, íleo e cólon).
12. Mergulhe os tecidos em formalina tamponada normal a 10% (ou fixador de escolha, como paraformaldeído a 4%, fixador de Carnoy, etc.) durante a noite a 4 ° C.
    CUIDADO: Certifique-se de que o equipamento de proteção individual correto seja usado, pois fixadores como formalina são tóxicos.

2. Rolamento e processamento do tecido intestinal

CUIDADO: Execute as etapas 2.1-2.6 em um exaustor ventilado.

1. Remova suavemente o pedaço superior de papel de filtro (aquele que toca o lado luminal do intestino). Use uma pinça para retirar cuidadosamente o intestino do pedaço inferior de papel de filtro. Descarte o papel de filtro.
2. Encha três barcos de pesagem com PBS. Lave o tecido em PBS 3x para remover a formalina do tecido.
3. Usando uma pinça de ação reversa (consulte a Tabela de Materiais), pegue um pedaço de intestino ao longo da borda curta com o lado luminal voltado para cima. Gire a pinça para rolar o tecido. Use um par de pinças regulares para ajudar a guiar o tecido enquanto ele é enrolado. Se o tecido for dobrado, desenrole-o e tente novamente.
4. Coloque o tecido em um barco de pesagem seca ou placa de Petri. Segure o tecido no lugar com uma pinça em uma mão. Abra cuidadosamente a pinça de ação reversa e solte o tecido, usando a outra pinça para desalojar o tecido da pinça de ação reversa.
5. Insira um pino de dissecação tamanho 00 ou um pino minuciano no tecido (consulte a Tabela de Materiais). Use um alicate para remover a ponta afiada do alfinete. Coloque o tecido em um grande e, em seguida, coloque o em um recipiente com etanol a 70% até que esteja pronto para o processamento.
6. Repita as etapas 2.1-2.5 com todos os segmentos intestinais (duodeno, jejuno, íleo e cólon), colocando todos os quatro rolos de tecido no mesmo grande (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que o esteja rotulado com um lápis para evitar que o rótulo seja lavado nas soluções de etanol e xileno (consulte a Tabela de Materiais).
7. Depois que todas as amostras forem enroladas, coloque as amostras em um processador de tecidos. Use as seguintes configurações para o tecido intestinal: etanol 70% por 35 min; Etanol 90% por 35 min; Etanol 95% por 35 min; 100% etanol por 35 min, 3x; xileno por 35 min, 3x; parafina por 60 min, 3x. Os podem ser deixados em cera de parafina derretida por longos períodos de tempo.
   CUIDADO: Certifique-se de que o equipamento de proteção adequado seja usado, pois o xileno é um produto químico tóxico.

3. Incorporação de tecido intestinal

1. Pré-aqueça grandes moldes de incorporação para manter a parafina derretida.
2. Retire as do processador de tecidos e coloque-as num copo de parafina derretida.
3. Em uma estação de incorporação, coloque uma pequena quantidade de parafina em um molde. Retire os quatro rolos suíços do e coloque-os todos em um molde, colocando-os o mais plano possível. Adicione mais parafina para preencher o molde.
4. Mova o molde para a placa fria e certifique-se de que todos os rolos suíços estejam planos na parte inferior do molde. Coloque uma pequena parte superior de rotulada (consulte Tabela de Materiais) no molde e adicione mais parafina, se necessário.
5. Assim que a cera solidificar, remova o bloco do molde. O tecido está agora pronto para ser cortado em fatias de 5 μm e flutuado em lâminas de vidro carregadas para imunocoloração¹¹.

4. Aderência do tecido e preparação da lâmina

1. Para garantir que a seção de tecido de parafina de 5 μm preparada adira à lâmina, aqueça as lâminas de vidro em um aquecedor de lâminas ou bloco de calor ajustado para 60 °C por 15-30 min. Os slides também podem ser deixados aquecidos por mais tempo; Esta etapa não é sensível ao tempo.
2. Deixe as lâminas esfriarem até a temperatura ambiente (~15 min).

5. Desparafinização

1. Ao iniciar a desparafinização das lâminas, certifique-se de que o tecido permaneça em uma solução e não seque durante todo o curso da imunocoloração.
2. Use um rack de slides (consulte a Tabela de Materiais) para segurar as lâminas de vidro e coloque-as dentro de um prato resistente a solventes (consulte a Tabela de Materiais) que é preenchido com um reagente de limpeza/desparafinização (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que o reagente cubra completamente o tecido em cada lâmina. Antes de imergir completamente as lâminas no reagente de limpeza, mergulhe ou empurre o rack de lâminas várias vezes na solução de limpeza. Deixe as lâminas submersas por 10 minutos ou mais.
   NOTA: Esta etapa pode precisar ser executada em um exaustor ventilado devido a vapores perigosos, dependendo do agente de limpeza escolhido. A desparafinização do tecido nesta etapa não é sensível ao tempo, se estiver usando um agente de limpeza não tóxico.
3. Remova e agite o rack deslizante para remover o excesso de reagente de limpeza. Em um novo prato resistente a solventes, repita a etapa 5.2.
4. Em um novo prato resistente a solventes, repita a etapa 5.3. Deixe as lâminas submersas por 15 minutos ou mais. Esta etapa não é sensível ao tempo.

6. Reidratação

1. Remova e agite o rack deslizante para remover o excesso de reagente de limpeza. Em um novo prato resistente a solventes cheio de etanol 100%, mergulhe ou empurre o suporte de lâminas várias vezes e deixe as lâminas submersas por 5 min. Esta etapa é sensível ao tempo. Repita 2x.
2. Remova e agite o rack deslizante para remover o excesso de etanol 100%. Em um novo prato resistente a solventes cheio de etanol a 95%, mergulhe ou empurre o rack de lâminas várias vezes e deixe as lâminas submersas por 5 min. Esta etapa é sensível ao tempo. Repita 1x.
3. Remova e agite o rack deslizante para remover o excesso de etanol a 95%. Em um novo prato resistente a solventes cheio de etanol a 70%, mergulhe ou empurre o suporte de lâminas várias vezes e deixe as lâminas submersas por 5 min. Esta etapa é sensível ao tempo.
4. Remova e agite o rack deslizante para remover o excesso de etanol a 70%. Em um novo prato resistente a solventes com 50% de etanol, mergulhe ou empurre o rack de lâminas várias vezes e deixe as lâminas submersas por 5 min. Esta etapa é sensível ao tempo.
5. Remova e agite o rack deslizante para remover o excesso de etanol a 50%. Em um novo prato resistente a solventes cheio de água deionizada (DI), mergulhe ou empurre o rack de lâminas várias vezes e deixe as lâminas submersas por 5 min. Esta etapa é sensível ao tempo.
   1. Para fazer uma pausa aqui, coloque as lâminas em um recipiente com PBS até que a imunocoloração possa ser retomada após a etapa de reidratação com água de 5 minutos.

7. Recuperação de antígenos

1. Encha uma nova cápsula resistente a solventes com um tampão de recuperação de antigénio adequado. Transfira diretamente o rack de slides para esta solução. Certifique-se de que as lâminas estejam totalmente submersas na solução de recuperação de antígeno, cobrindo completamente o tecido.
   NOTA: As soluções ideais de recuperação de antígeno podem variar dependendo do anticorpo específico que está sendo usado. A recuperação de antígenos necessária para anticorpos individuais pode precisar ser determinada pelo pesquisador.
   1. Para fazer 1x tampão de recuperação de antígeno citrato, adicione 2,94 g de citrato de sódio di-hidratado (consulte a Tabela de Materiais) por 1 L de água deionizada. Assim que o citrato de sódio di-hidratado estiver dissolvido, adicione cloreto de hidrogênio (consulte a Tabela de Materiais) até que a solução atinja um pH de 6. Por fim, adicione 500 μL de Tween20 (consulte a Tabela de Materiais) por 1 L de água deionizada.
   2. Para fazer 1x tampão de recuperação do antígeno Tris-EDTA, adicione 1,211 g de Tris Base e 0,292 g de EDTA em 1 L de água deionizada. Depois de dissolvido, ajustar a pH 9.
2. Cubra o prato resistente a solventes contendo a solução de recuperação de antígeno e as lâminas com uma tampa e prenda a tampa com elásticos.
3. Coloque o prato seguro resistente a solventes em uma panela de pressão (consulte a Tabela de Materiais) em cima do rack de metal ou tripé. Certifique-se de que haja água suficiente na panela de pressão para alcançar o rack de metal ou tripé para que a pressão possa aumentar.
4. Coloque a tampa na panela de pressão e gire no sentido horário para travar a tampa no lugar. Gire a válvula limitadora de pressão que está na tampa para a configuração de pressão.
5. Na configuração do menu, selecione alta pressão na panela de pressão e, em seguida, na configuração de tempo, defina a panela de pressão para 30 min. Selecione Iniciar.
6. Após 30 minutos, a panela de pressão emitirá um bipe e será ajustada automaticamente para a configuração manter aquecido. Aguarde até que a pressão seja liberada naturalmente e a tampa se desaperte livremente.
7. Use luvas resistentes ao calor (consulte a Tabela de Materiais) para remover o prato resistente a solventes da panela de pressão e remova o elástico e a tampa. Coloque o prato em um banho de gelo por ~ 30 min para permitir que as lâminas esfriem até a temperatura ambiente. Esta etapa não é sensível ao tempo.
8. Depois de resfriado à temperatura ambiente, remova o suporte deslizante do prato resistente a solventes e coloque-o em um novo prato resistente a solventes cheio de água DI para remover a solução residual de recuperação de antígeno. Certifique-se de que as lâminas estejam totalmente submersas.
9. Remova o rack deslizante da água DI e coloque-o em um novo prato resistente a solventes cheio de PBS por 5 min. Certifique-se de que as lâminas estejam totalmente submersas. Esta etapa não é sensível ao tempo.

8. Bloqueando manchas de fundo inespecíficas

1. Prepare uma câmara umidificada pegando uma grande caixa de slides e removendo a tampa de papelão colada à tampa. Na base da caixa de slides, coloque damp toalhas de papel verticalmente para baixo. Certifique-se de que as toalhas de papel úmidas estejam planas.
2. Remova uma lâmina de cada vez do rack de lâminas submerso em PBS. Limpe cuidadosamente o excesso de PBS na lâmina de vidro, evitando o lenço de papel.
3. Com uma caneta hidrofóbica (consulte a Tabela de Materiais), forme uma barreira que envolve o tecido desenhando uma caixa ao redor do tecido com a caneta hidrofóbica. Tenha cuidado para evitar o tecido e não use a caneta hidrofóbica muito perto do tecido.
4. Coloque a lâmina delineada horizontalmente sobre o damp toalhas de papel. Adicione tampão de bloqueio para cobrir o tecido (~ 100 μL).
   1. Para fazer um tampão de bloqueio, adicione 100 μL de gelatina de pele de peixe de água fria (gelatina de teleostein; consulte a Tabela de Materiais) a 9,85 mL de PBS. Finalmente, adicione 50 μL de Triton X-100 a 20% (consulte a Tabela de Materiais) e misture até dissolver.
5. Repita as etapas 8.2 a 8.4 para cada slide. Feche a câmara umidificada e incube as lâminas em temperatura ambiente por 90 min.

9. Mouse no bloqueio do mouse

1. Ao usar um anticorpo primário de camundongo para imunomarcar o tecido do camundongo, execute uma etapa de bloqueio adicional. Reagentes bloqueadores de mouse contra mouse (bloco de mouse contra mouse; consulte Tabela de Materiais) estão disponíveis comercialmente; Siga as instruções comerciais ao preparar o bloco mouse-on-mouse.
2. Bata suavemente na solução de bloqueio e adicione imediatamente o bloco de mouse com mouse preparado para cobrir o tecido (~ 100 μL). Repita para cada lâmina contendo tecido de camundongo, que será corado usando um anticorpo primário criado em camundongos.
3. Incube seções de tecido na caixa da câmara umidificada em temperatura ambiente por 15 min.
4. Remova as lâminas da câmara umidificada e coloque-as diretamente em um rack de lâminas submerso em PBS. Deixe os slides no PBS por 5 minutos para lavar o bloco do mouse com o mouse.

10. Anticorpos primários

1. Para cada lâmina, selecione anticorpos primários de interesse que são criados em diferentes espécies. Dilua os anticorpos primários em diluente de anticorpos de acordo com as instruções do fabricante. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: E-CADERINA (1:100), MUC2 (1:200), PCNA (1:500), LAMININA (1:200), β-CATENINA (1:200) e LAMP1 (1:50).
   NOTA: Se o fabricante não fornecer as diluições recomendadas, a diluição 1:100 é um bom ponto de partida. Se o anticorpo primário de interesse estiver conjugado a um fluoróforo, consulte a etapa 12.2.
   1. Para fazer o diluente de anticorpos, adicione tampão de bloqueio 1:20 ao PBS, se estiver usando o tampão de bloqueio de gelatina de peixe descrito acima.
2. Remova as lâminas do PBS ou da câmara umidificada, bata suavemente no excesso de solução de bloqueio ou PBS e coloque-as horizontalmente de volta na câmara umidificada. Certifique-se de que a barreira criada com a caneta hidrofóbica na etapa 8.3 permanece; Delineie o tecido novamente, se necessário.
3. Adicione anticorpos primários de interesse adequadamente diluídos para cobrir o tecido (~ 100 μL).
4. Feche a câmara umidificada e incube as lâminas em uma superfície plana a 4 ° C no escuro durante a noite.

11. Lavando os slides

1. Remova as lâminas da câmara umidificada, retire suavemente os anticorpos primários e coloque as lâminas em um suporte de lâminas submerso em PBS por 5 min.
2. Remova o rack deslizante e coloque-o em um novo prato resistente a solventes cheio de PBS por 5 min. Repita a etapa 1x.

12. Anticorpos secundários e contracoloração de núcleos

1. Para cada lâmina, selecione fluoróforos de anticorpos secundários projetados para se ligar às espécies de anticorpos primários. Diluir fluoróforos de anticorpos secundários ou anticorpos primários conjugados em diluente de anticorpos secundários. Os anticorpos secundários utilizados foram anti-burro 488 (1:200), burro anti-coelho cy3 (1:200), burro anti-rato 647 (1:200), burro anti-coelho 647 (1:200) e burro anti-rato cy3 (1:200). O anticorpo primário γ-ACTINA conjugado ao fluoróforo 647 foi usado em uma diluição de 1:100.
   1. Para fazer diluente de anticorpo secundário, adicione tampão de bloqueio 1:100 ao PBS, se estiver usando tampão de bloqueio de gelatina de peixe conforme descrito acima.
2. Remova as lâminas do PBS, retire suavemente o excesso de PBS e coloque-as horizontalmente de volta na câmara umidificada. Certifique-se de que a barreira criada com a caneta hidrofóbica na etapa 8.3 permanece; Delineie o tecido novamente, se necessário.
3. Adicione fluoróforos de anticorpos secundários adequadamente diluídos ou anticorpos primários conjugados de interesse para cobrir o tecido (~ 100 μL).
4. Feche a câmara umidificada e incube as lâminas em temperatura ambiente no escuro por 1 h.
5. Diluir 10 mg/ml de Hoechst (ver Tabela de Materiais) ou DAPI utilizando PBS para uma concentração final de 1 μg/ml de Hoechst ou DAPI utilizando PBS e adicionar diretamente ao tecido (~100 μL). Incube por 5 min em temperatura ambiente no escuro.
6. Remova as lâminas da câmara umidificada e coloque-as em um rack de lâminas submerso em PBS por 5 minutos no escuro.
7. Remova a grade deslizante e coloque em um novo prato resistente a solventes cheio de PBS por 5 min no escuro. Repita a etapa 1x.

13. Montagem e preparação para microscopia

1. Remova uma lâmina de cada vez do rack de lâminas submerso em PBS, mantendo as lâminas restantes submersas em PBS no escuro. Bata suavemente o excesso de PBS e, se necessário, use um pano sem fiapos para limpar cuidadosamente o excesso de PBS na lâmina de vidro, evitando o lenço de papel.
2. Adicione uma a duas gotas de meio de montagem antidesbotamento (consulte a Tabela de Materiais) no centro do tecido.
3. Segure uma lamínula limpa (consulte a Tabela de Materiais ) pelas bordas e abaixe-a lentamente na corrediça em um ângulo de 45°. Certifique-se de que o meio de montagem se espalhe uniformemente sobre o tecido.
4. Começando no centro do tecido, pressione suavemente a lamínula com dois dedos para ajudar a remover as bolhas de ar e o excesso de meio de montagem. Se necessário, continue pressionando em direção às bordas e mantenha uma leve pressão por toda parte.
5. Corte a extremidade menor de uma pipeta P200 não filtrada e conecte-a à ponta de uma pipeta sorológica conectada a um vácuo.
6. Seguindo as bordas da lamínula, use o aspirador para remover o excesso de meio de montagem.
7. Em uma nova caixa de slides, coloque horizontalmente o slide na horizontal e deixe-o secar no escuro em temperatura ambiente.
8. Repita esse processo para cada slide.

Resultados

Foi realizada coloração de hematoxilina e eosina (H&E), conforme descrito anteriormente¹². Usando o método otimizado, os rolos suíços intestinais incluíram todos os três segmentos do intestino delgado e do intestino grosso em uma única lâmina. Ter todo o intestino acomodado em uma lâmina permite que os pesquisadores analisem as alterações em todas as partes do intestino e economize custos com seccionamento e coloração de reagentes (Figura 1). Além disso, expor todos os segmentos intestinais às mesmas soluções simultaneamente durante a imunocoloração ajuda a garantir resultados precisos. A micrografia de H&E demonstra a arquitetura intestinal preservada de todas as porções do intestino delgado e do intestino grosso (Figura 2). A medição das vilosidades duodenais não mostrou diferença significativa na altura das vilosidades no tecido intestinal fechado em comparação com este método de rolo suíço, sugerindo que a abertura do intestino não perturba a arquitetura do tecido (Figura 2D). A imunocoloração de rolos suíços intestinais mostra as várias camadas do intestino, bem como todo o eixo da cripta das vilosidades. As imagens fluorescentes mostram baixos níveis de fundo da coloração de anticorpos primários e secundários e retratam claramente as células individuais presentes no epitélio. A Figura 3 mostra a morfologia dos diferentes segmentos intestinais e a coloração das células caliciformes (células positivas para MUC2)¹³, da membrana apical (γ-ACTINA)¹⁴, da membrana lateral das células epiteliais (E-CADHERIN)¹⁵ e dos núcleos. Este protocolo é adequado para identificar muitos compartimentos celulares diferentes, incluindo células proliferativas (PCNA)¹⁶, interstício (LAMININA; Figura 4A) ¹⁷, o domínio lisossômico (LAMP1)¹⁴ e o epitélio (β-CATENINA; Figura 4B) ¹⁸.

Figura 1: Fluxo de trabalho para preparação e processamento de rolos suíços intestinais. (A) Os segmentos intestinais são lavados com uma seringa contendo PBS e depois lavados em PBS. (B) O tecido intestinal úmido é então colocado em papel de filtro seco. (C) O intestino é aberto longitudinalmente em papel de filtro e (D) suavemente espalhado. (E) Um pedaço de papel de filtro é colocado em cima do intestino aberto, e o intestino é suavemente imprensado entre o papel de filtro e grampeado. Os segmentos intestinais são fixados durante a noite e (F) é enrolado com fórceps. (G) O intestino é suavemente desalojado da pinça de ação reversa e (H) tem uma aparência de roseta. (I, J) O tecido intestinal é fixado e colocado em um grande. (K) Todos os quatro segmentos intestinais são colocados no mesmo para processamento e incorporação de tecidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Coloração de hematoxilina e eosina de todos os quatro segmentos do intestino. (A) A digitalização de ladrilhos demonstra a capacidade de visualizar todo o intestino em uma única lâmina com rolos suíços individuais do duodeno, jejuno, íleo e cólon. (B) Micrografia de um rolo suíço intestinal e (C) inserção de maior ampliação para mostrar a arquitetura das vilosidades e criptas. (D) A quantificação do comprimento das vilosidades do intestino delgado no não mostra diferença significativa entre o tecido enrolado suíço e o tecido fechado. Barras de escala = 1000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Coloração por imunofluorescência de todos os quatro segmentos do intestino. Camundongos controle C57BL/6J adultos foram imunomarcados para núcleos (ciano), o marcador de membrana lateral, E-CADHERIN (verde), células caliciformes identificadas por MUC2 (amarelo) e o marcador de borda em escova apical, γ-ACTIN, (magenta). Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4. Coloração de imunofluorescência do intestino. (A) Uma micrografia representativa da coloração por imunofluorescência do intestino de camundongo destaca núcleos (ciano), células proliferativas, PCNA (verde) e lâmina própria, LAMININA (magenta). (B) Imagem de imunofluorescência identificando núcleos (ciano), o marcador de membrana celular β-CATENINA (verde) e o marcador de lisossomo LAMP1 (magenta) no intestino. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Aqui, apresentamos um método otimizado para fixação tecidual usando a técnica de rolo suíço para preservar a arquitetura intestinal e promover imunocoloração precisa. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para investigar uma ampla variedade de questões de pesquisa envolvendo fisiologia intestinal e biologia celular¹⁹. Vários métodos de laminação suíços otimizados foram publicados e são muito úteis^20,21. Uma vantagem dessa técnica é a facilidade de abrir com precisão o intestino em papel de filtro. Isso permite que o tecido seja fixado de forma plana, evitando que o tecido se enrole para dentro ao rolar, o que é especialmente útil ao analisar o tecido inflamado com muscular espessada. Além disso, é essencial destacar o papel crítico da secção de tecidos na obtenção de resultados confiáveis. A secção adequada garante a preservação da arquitetura do tecido e facilita a imunomarcação precisa, contribuindo para o sucesso das análises a jusante¹¹. A abordagem otimizada é menos difícil em comparação com outros protocolos, produzindo resultados consistentes entre diferentes indivíduos. A técnica apresentada neste artigo também fornece arquitetura de tecido bem preservada, versatilidade e imunocoloração altamente reprodutível usando diversos anticorpos.

Um aspecto crítico deste protocolo é o tempo de fixação e processamento. A fixação e o processamento inadequados do tecido podem prejudicar as análises histoquímicas. O tecido que está superfixado torna-se quebradiço, enquanto o tecido subfixado permanece muito mole. Tanto os tecidos sobrefixados quanto os subfixados são difíceis de seccionar e comprometem a imunocoloração. Uma vez dissecado em papel de filtro, o tecido deve ser imediatamente colocado em formol para reduzir as alterações post-mortem²². Neste protocolo, o tecido murino é fixado em formalina durante a noite. Vários estudos têm utilizado esse tempo de ^{fixação20,23,24}. No entanto, Boenisch et al. mostraram que a imunomarcação é consistente no tecido fixado em formalina por até 4 dias²⁵. A otimização do tempo de fixação e fixador é necessária dependendo das análises desejadas. Por exemplo, o fixador de Carnoy é frequentemente preferido para coloração de muco²⁶. A escolha dos fixadores e a duração do tempo de fixação devem ser otimizadas por cada pesquisador, dependendo de sua abordagem experimental. O uso de um processador de tecidos automatizado é recomendado para garantir tempos de processamento precisos e consistentes. Nosso laboratório usa pequenos pinos para manter o tecido intestinal no lugar como rolos. Sem alfinetes, o tecido pode se desenrolar durante o processamento. Como esses pinos são muito pequenos e afiados, precauções devem ser tomadas. Aconselhamos o uso de alicates para remover a ponta afiada do pino antes do processamento do tecido. Alguns núcleos histológicos não aceitam tecido com pinos; portanto, é melhor verificar antes de usar. Uma abordagem alternativa é usar ágar para ancorar o tecido antes do processamento²⁷ ou esponjas de podem ser usadas em para ajudar a manter os rolos.

A imunocoloração é um protocolo que requer otimização para cada anticorpo. O uso de anticorpos validados por nocaute é recomendado sempre que possível. Este método para fixação e processamento de tecidos resulta em coloração clara, permitindo fácil identificação da ligação de anticorpos em comparação com o sinal de fundo quando anticorpos não validados estão sendo utilizados. A escolha do fixador, a recuperação do antígeno e a diluição do anticorpo podem afetar a especificidade do anticorpo. Recomendamos que os pesquisadores avaliem e otimizem cuidadosamente o protocolo, ajustando a fixação, a recuperação do antígeno e o tempo de incubação para cada anticorpo. Para obter os melhores resultados, os anticorpos devem ser testados em várias diluições para determinar a concentração ideal e em diferentes tampões de recuperação de antígenos. A recuperação de epítopos melhora a imunocoloração quebrando as pontes de metileno formadas durante a fixação. Neste protocolo, a recuperação de epítopos induzida por calor é usada em vez da recuperação de epítopos induzida por proteolíticos porque a digestão enzimática tem maior probabilidade de interromper a morfologia do tecido²⁸. Os tampões de recuperação de epítopos induzidos por calor mais comuns são tampão citrato, tris-HCl e tris-EDTA, sendo o tampão citrato o mais suave na morfologia do tecido²⁹. A escolha do tampão varia e deve ser determinada para cada anticorpo. Muitos tampões de recuperação de antígenos, soluções de bloqueio e diluentes de anticorpos estão disponíveis comercialmente. No entanto, essas soluções podem ser extremamente caras e de custo proibitivo. Fornecemos receitas de soluções comuns de recuperação de antígenos e soluções de bloqueio e diluentes de anticorpos para garantir a relação custo-benefício.

Uma limitação desse método é que a fixação e o processamento podem alterar o tecido e mascarar epítopos. Uma abordagem alternativa é imunocorar o tecido fresco congelado. O tecido fresco congelado é congelado, permitindo evitar a exposição a fixadores tóxicos, preservando a estrutura da proteína e melhorando a acessibilidade de alguns epítopos. No entanto, a arquitetura e a morfologia do tecido são mais pobres do que as do tecido fixo e embebido em parafina. Outros desafios do tecido fresco congelado incluem os materiais e a logística necessários para seccionar e armazenar blocos e lâminas congelados. A análise de rolos suíços versus tiras de tecido intestinal mostra diferenças na altura e largura das vilosidades e diferenças nas células imunes na lâmina própria, conforme descrito em um relatório anterior³⁰. Esses resultados sugerem que os rolos suíços intestinais alteram algumas características intestinais, que devem ser consideradas no planejamento de experimentos. Além disso, a revalidação de anticorpos é necessária, pois muitos anticorpos que se ligam especificamente ao tecido embebido em parafina fixado em formalina não se coram bem em tecido fresco congelado³¹.

A imunocoloração do tecido intestinal pode ser usada para responder a uma ampla variedade de perguntas sobre biologia e fisiologia das células gastrointestinais. Essa técnica é amplamente utilizada para identificar alterações epiteliais no contexto da inflamação intestinal, após infecção bacteriana e durante a progressão do câncer. O método aqui apresentado é ideal para a preservação do tecido intestinal porque é econômico, não é tecnicamente desafiador e altamente reprodutível. Para garantir os melhores resultados, incentivamos a otimização das etapas descritas neste protocolo com base no desenho experimental e na hipótese que está sendo testada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Papel de filtro de celulose	Cytiva	10427804	Papel Whatman grosso
Lâminas de vidro carregadas	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Pinos de dissecação tamanho 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R& D Systems	AF748
Luvas de freezer	Tempshield	UX-09113-02
Bloco de aquecimento	Premiere	XH-2001	Aquecedor de slides
Histo-Clear II	Microscopia eletrônica Sciences	64111-04	Reagente de limpeza
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Ácido clorídrico	Sigma Aldrich	320331
Caneta hidrofóbica	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
grandes	Tissue-Tek	4173
Minutien pinos	Fine Science Tools	NC9679721
Reagente bloqueador de mouse sobre mouse	Vector Laboratories	MKB-2213	Bloco de mouse com mouse
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Tecnologia de Sinalização Celular	2586S
Panela de Pressão	Cuisinart	B000MPA044
ProLong antifade de ouro	Thermo Fisher Scientific	P36934	Meio de montagem
Pinça de ação reversa	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Conjunto de coloração deslizante	Tissue-Tek	62540-01	Pratos resistentes a solventes e estrutura de metal
pequenos	Fisherbrand	15-200-403B
Citrato de sódio di-hidratado	Fisher Bioreagentes	BP327-1
Teleostein Gelatina	Sigma	G7765	Tampão de bloqueio
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Toalhetes Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
	KimTech	34155
Xilenos	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638