Artigo de método

Cirurgia de transferência de embriões por laparotomia em leitoas

1.9K vistas

⸱

DOI:

10.3791/66984

⸱

18 de outubro de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Estudos sobre o Genoma Humano e Células-Tronco, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, 2Instituto do Coração (Incor), Hospital das Clínicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 3Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a aplicação da técnica cirúrgica utilizada para transferência de embriões clonados de suínos via laparotomia em leitoas.

Resumo

Este protocolo tem como objetivo demonstrar a técnica cirúrgica de transferência de embriões de suínos clonados para o oviduto, método amplamente utilizado na produção de suínos geneticamente modificados para pesquisa biomédica. Nove leitoas foram submetidas à sincronização hormonal e laparotomia para transferência de embriões clonados produzidos por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) em estágios de até 4 células no dia 2 para o oviduto. O diagnóstico gestacional foi realizado por meio de exame ultrassonográfico 30 dias após a cirurgia de transferência. Seis das nove leitoas operadas exibiram sinais de gravidez no exame de ultrassom. No entanto, como não houve progressão no desenvolvimento fetal avaliado pela ecografia, as leitoas foram submetidas à necropsia aos 60 dias para coleta de material biológico e avaliação do sistema reprodutivo. Aderências foram observadas nos cornos uterinos, ovários e ovidutos. A partir do lúmen uterino de duas das leitoas eutanasiadas, foram obtidas uma e quatro estruturas embrionárias com idades gestacionais variando entre 12 a 20 dias. Apesar da ausência de leitões vivos, provavelmente atribuída à baixa taxa de eficiência de transferência de embriões clonados de suínos, que é influenciada por vários fatores, incluindo o número e a qualidade dos embriões transferidos, a técnica cirúrgica apresentada mostrou-se rápida e segura.

Introdução

Os porcos são um excelente modelo experimental para pesquisa biomédica devido às suas semelhanças anatômicas, fisiológicas e genéticas com os humanos1. Esses animais têm sido frequentemente utilizados em pesquisas relacionadas ao xenotransplante, com a intenção de produzir órgãos, células ou tecidos que promovam um baixo risco de rejeição quando transplantados para humanos. A pesquisa em xenotransplante visa aumentar a oferta de órgãos para transplante humano, reduzindo assim a lista de espera de pacientes2.

A produção de suínos para xenotransplante envolve várias etapas, incluindo a produção de clones a partir de células suínas geneticamente editadas. Após a produção in vitro de embriões clonados geneticamente modificados, os embriões são transferidos para o sistema reprodutivo de uma porca com ciclo estral sincronizado para preparar a fisiologia uterina para a recepção e gestação do novo concepto3.

A transferência de embriões em suínos pode ser realizada por métodos não invasivos ou invasivos4. Entre os métodos não invasivos está a transferência transcervical, que não requer nenhuma intervenção cirúrgica. No entanto, esse método é restrito à transferência de embriões em estágios posteriores de desenvolvimento (ou seja, estágios de mórula ou blastocisto) e não permite a determinação precisa do local de inserção do cateter ou deposição do embrião5. A laparoscopia e a laparotomia são consideradas métodos invasivos de transferência de embriões. A laparoscopia é menos invasiva, mas requer equipamentos específicos e caros, e sua eficiência varia consideravelmente (de menos de 20% a mais de 80%) devido a vários fatores, como dificuldade de manipulação das estruturas reprodutivas e o tipo de cateter utilizado 4,6. Portanto, a transferência por laparoscopia ainda é menos eficiente em comparação com os métodos de transferência cirúrgica por laparotomia4.

A cirurgia de transferência de embriões em porcas por laparotomia é um procedimento relativamente simples e rápido, geralmente levando cerca de 30 minutos. No entanto, deve ser realizada em centro cirúrgico equipado com aparelho de anestesia inalatória e equipe especializada. Para linhagens comerciais de suínos (como Landrace, Large White ou seus cruzamentos), equipamentos especiais como guinchos para levantar marrãs e uma mesa cirúrgica larga e robusta são necessários devido ao peso considerável dos animais (cerca de 130-150 kg).

Para que a cirurgia seja bem-sucedida, os embriões devem ser previamente avaliados quanto ao seu estágio de desenvolvimento. Embriões de até 4 células são recomendados para serem transferidos para a tuba uterina. Embriões em estágios além de 4 células, como mórulas e blastocistos, devem ser transferidos para o corno uterino 7,8.

Embora grupos de pesquisa em todo o mundo estejam realizando a produção e transferência cirúrgica de embriões de suínos clonados geneticamente modificados, ainda não existem protocolos bem definidos que demonstrem esse procedimento por meio de vídeos. Essa abordagem é crucial para o sucesso da gestação, pois a técnica requer deposição precisa dos embriões na localização exata do oviduto, envolvendo a localização do óstio tubário e a introdução da pipeta contendo os embriões. Essa técnica pode ser melhor compreendida por meio de vídeos explicativos de todo o procedimento. Portanto, este artigo tem como objetivo demonstrar a cirurgia de laparotomia para transferência de embriões clonados para o oviduto de marrãs, um pré-requisito essencial para a futura produção de suínos geneticamente modificados para serem utilizados em xenotransplante ou outros fins relacionados.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, protocolo número 6088030523. Foram utilizadas nove leitoas de sete meses de idade da suinocultura do núcleo Água Branca, localizada na cidade de Itu, estado de São Paulo, Brasil, logo após a detecção do segundo estro9. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

  1. Jejuar os animais por 12 h e restringir o acesso à água por 4 h antes do procedimento cirúrgico.
  2. Usando uma agulha de 40 mm x 12 mm, retire 10 mg/kg de cetamina e 0,2 mg/kg de midazolam na mesma seringa de 50 mL. Conecte a seringa a um conjunto de administração intravenosa para facilitar a administração do medicamento, mantendo uma distância segura do animal e permitindo que ele se mova livremente.
  3. Administrar a medicação pré-anestésica por injeção intramuscular no músculo trapézio, caudal ao canal auditivo externo.
  4. Canular a veia auricular com cateter 20 G e conectá-la a um conjunto de administração de macrogotejamento para fluidoterapia intraoperatória com solução de NaCl a 0,9% a uma velocidade de 10 mL/kg/h.
  5. Induzir anestesia com 4 mg/kg de propofol por via intravenosa (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
  6. Realizar a intubação orotraqueal do animal com laringoscópio e tubo orotraqueal tamanho 9 com manguito10.
  7. Mantenha a anestesia com inalação de isoflurano a 1.5% a 2%. Além disso, monitore a anestesia avaliando parâmetros fisiológicos como frequência cardíaca, que deve ser mantida entre 100 e 120 batimentos por minuto, saturação de oxigênio, que deve ser mantida entre 99% e 100%, relaxamento muscular, ausência de movimento e avaliação dos reflexos.
    NOTA: A temperatura corporal também deve ser monitorada e controlada, ficando entre 37,5-38,5 °C. Quando necessário, além do isoflurano, o propofol pode ser usado para manter o controle dos parâmetros. O cloridrato de fentanil deve ser administrado como analgésico na dose de 0,02 mg/kg a cada 20 minutos. Todos os parâmetros devem ser registrados a cada 5 minutos.
  8. Administre analgesia perioperatória com uma dose única de 0,002 mg / kg de fentanil por via intravenosa e 4 mg / kg de cloridrato de tramadol por via intramuscular no músculo glúteo ou trapézio.
  9. Coloque eletrodos cardíacos na região torácica para monitoramento intraoperatório da frequência cardíaca. Registre a frequência cardíaca, a temperatura retal e a saturação de oxigênio a cada 5 minutos.

2. Procedimento cirúrgico

  1. Posicione a marrã na mesa cirúrgica em decúbito dorsal.
  2. Cubra as pernas do animal com luvas de procedimento para minimizar a contaminação do campo cirúrgico.
  3. Realize a depilação abdominal caudal ventral entre o penúltimo par de glândulas mamárias usando um aparador cirúrgico.
  4. Realize a antissepsia da pele pré-operatória com uma escova antisséptica impregnada com clorexidina, fazendo movimentos circulares da região da cicatriz umbilical até o último par de glândulas mamárias. Remova a clorexidina com uma compressa limpa e umedecida.
  5. Certifique-se de que o cirurgião e o assistente realizem a antissepsia cirúrgica e usem aventais e luvas cirúrgicas estéreis para a cirurgia.
    NOTA: O animal deve ser preparado para a cirurgia em uma área de preparação separada do local da cirurgia.
  6. Prepare a mesa cirúrgica com os instrumentos apropriados e previamente esterilizados listados na Tabela de Materiais.
  7. Realizar antissepsia final do campo cirúrgico com gaze estéril e antisséptico clorexidina, limpando a região em padrão espinha de peixe, iniciando no local da incisão e expandindo lateralmente.
  8. Repita este procedimento três vezes com anti-séptico de clorexidina e, em seguida, repita o procedimento com clorexidina alcoólica.
  9. Cubra completamente o animal com um campo cirúrgico estéril e, usando uma tesoura, crie uma abertura retangular no campo cirúrgico, de aproximadamente 10 x 20 cm², se o campo não estiver fenestrado.
  10. Posicione o campo cirúrgico sobre o penúltimo par de glândulas mamárias inguinais. Coloque 4 grampos Backhaus para prender o campo cirúrgico sobre a pele do animal.
  11. Incisar a pele com bisturi, criando uma incisão de aproximadamente 10 cm de comprimento.
  12. Obter hemostasia de vasos subcutâneos com pinça hemostática e/ou sutura absorvível tamanho 2.
  13. Dissecar o tecido subcutâneo com os dedos ou com o auxílio de tesouras de ponta fina, aprofundando a incisão para alcançar a linha alba na musculatura abdominal.
    NOTA: Palpe a linha média do abdômen para sentir a linha alba como uma área mais rígida e fibrosa; observar a separação dos músculos retos abdominais e observar a mudança na consistência do tecido durante a dissecação para identificar a linha alba com precisão11.
  14. Com a pinça Allis, segure a musculatura e levante-a para fazer uma incisão na linha alba com um bisturi.
  15. Insira o dedo indicador na incisão para avaliar a presença de aderências. Estenda a incisão sobre a linha alba caudal e cranialmente com uma tesoura romba/romba ou fina/romba cuidadosamente para evitar ferir outros órgãos e estruturas subjacentes.
  16. Faça uma incisão de comprimento suficiente para que uma mão do cirurgião possa ser inserida na cavidade abdominal para localizar e exteriorizar os cornos uterinos e/ou ovários. Um afastador de Gosset pode ser usado para facilitar a entrada na cavidade abdominal e a sutura da musculatura em uma única camada no final do procedimento.
  17. Se um dos cornos uterinos estiver localizado antes dos ovários, siga-o suavemente até chegar à ponta do corno uterino e ao ovário ipsilateral. Durante esse procedimento, avalie a presença de líquido no interior do útero, o que pode comprometer a gestação.
  18. Depois de localizar o ovário, puxe-o suavemente e exponha-o com cuidado. Avalie a presença de folículos pré-ovulatórios, corpos lúteos hemorrágicos, corpos lúteos cíclicos e corpo albicans para avaliar se a sincronização da leitoa é a esperada.
  19. Remova suavemente as fímbrias da tuba uterina que cobre o ovário, everte sua mucosa e localize o óstio da tuba uterina.
    NOTA: Se o cirurgião tiver dificuldade em identificar o óstio das fímbrias, pode-se fazer uma bolsa na ampola do oviduto com uma agulha de sutura de corpo redondo, evitando punção dos vasos sanguíneos, para inserir o cateter Tomcat contendo os embriões.
  20. Insira cuidadosamente um cateter Tomcat contendo os embriões no óstio das fímbrias até atingir a região da ampola da tuba uterina.
  21. Conecte uma seringa de 1 mL ao cateter Tomcat para empurrar o fluido contendo embriões para dentro da trompa uterina. Cubra o ovário com as fímbrias e devolva-o à cavidade abdominal.
  22. Localize o corno uterino e o ovário contralaterais e repita as etapas 2.17-2.21.
  23. Reposicionar as estruturas dentro da cavidade abdominal e adicionar 1 L de solução salina ou solução de lactato de Ringer aquecida (39 °C) para evitar aderências antes de iniciar a abdominorrafia.
  24. Suturar a musculatura abdominal com sutura absorvível tamanho 2 em "X" pontos (Sultão) interrompidos.
  25. Aproxime o tecido subcutâneo com uma sutura contínua em colchão usando sutura absorvível tamanho 2.
  26. Feche a pele com sutura de náilon tamanho 2 em pontos simples interrompidos, grampos cirúrgicos ou adesivo de etil-cianoacrilato. Nesse procedimento, optou-se pelo uso de adesivo.
  27. Limpe a ferida cirúrgica com gaze embebida em peróxido de hidrogênio e seque com uma compressa para melhorar a fixação do adesivo cirúrgico na ferida cirúrgica. Aplique rifamicina ou pomada de Pearson, cubra com gaze e, por fim, aplique adesivo cirúrgico.
    NOTA: A ferida deve permanecer fechada com curativo por 5 dias.

3. Cuidados pós-operatórios

  1. Avaliar os animais quanto a sinais de dor clínica característica por pelo menos os próximos 3 dias consecutivos, de acordo com a escala proposta por Luna et al.12.
    NOTA: Esta escala é baseada em diferentes comportamentos exibidos por porcos ao experimentar diferentes níveis de dor, como postura, interação e interesse pelo ambiente, atividade, apetite e atenção à área afetada. A pontuação varia de 0 a 3, dependendo do tipo de comportamento exibido, para cada parâmetro avaliado. Ao final da avaliação, a soma de todos os escores reflete a intensidade da dor experimentada pelo animal, onde 0 representa ausência de dor e 18 representa dor muito intensa12.
  2. Administrar uma dose única de 15 mg/kg de amoxicilina e 0,4 mg/kg de meloxicam a 2% por via intramuscular (no músculo glúteo ou cervical) uma vez por dia durante 3 dias como cuidados pós-operatórios para prevenir dor, processos inflamatórios e infeções.
    NOTA: Se o escore de dor for igual ou superior a 6 na escala de dor utilizada (escore de 0 a 18), administrar 5.000 mg/animal de dipirona sódica por via intramuscular (no músculo glúteo ou cervical) uma vez ao dia, além do anti-inflamatório e antibiótico. Como alternativa, realize analgesia conforme descrito nas diretrizes locais da IACUC.
  3. No 6º dia de pós-operatório, retirar o adesivo cirúrgico para limpeza da ferida com gaze embebida em solução alcoólica de clorexidina a 2% e aplicar pomada tópica de Pearson até o 10º dia, quando se recomenda a retirada da sutura ou remoção dos grampos cirúrgicos, se utilizados.

4. Diagnóstico gestacional ultrassonográfico da gravidez

  1. Realize a avaliação ultrassonográfica da gravidez transabdominal com um aparelho de ultrassom (faixa de frequência de 4,5 a 8,5 MHz) 30 dias após a cirurgia de transferência de embriões.
  2. Aplique gel de ultrassom na sonda e posicione-a perto da região abdominal inguinal, voltada para medialmente.
    NOTA: A visualização de vesículas embrionárias anecoicas arredondadas, devido ao líquido no lúmen uterino, indica gestação. A não visualização do líquido intrauterino, ou a presença de líquido intrauterino sem delineamento das vesículas embrionárias, sugere a ausência de gestação.

5. Eutanásia dos animais

NOTA: Eutanasiar as leitoas que não apresentaram fetos de tamanho e aparência correspondentes à idade gestacional no exame ultrassonográfico.

  1. Com agulha de 40 mm x 12 mm, aspirar 15 mg/kg de cetamina e 2 mg/kg de midazolam na mesma seringa de 50 mL acoplada a um aparelho de administração intravenosa e administrar por via intramuscular no músculo trapézio na região cervical caudal ao meato acústico externo, como medicação pré-anestésica.
  2. Canular a veia auricular com cateter 20 G e induzir anestesia com 4 mg/kg de propofol por via intravenosa em bolus até que ocorra bradicardia (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
  3. Em seguida, administrar 10 a 20 mL de cloreto de potássio a 19,1% por via intravenosa. Confirme a parada cardiorrespiratória observando a ausência de movimentos respiratórios, membranas mucosas pálidas, perda do reflexo da córnea e ausência de batimentos cardíacos, colocando um estetoscópio sobre a região cardíaca.
  4. Coletar qualquer tipo de conteúdo intrauterino (tecido embrionário, líquido ou secreções mucosas) de fêmeas necropsiadas13 e encaminhá-lo para análise microbiológica para detecção de possíveis patógenos e também para caracterização genotípica dos clones (se necessário). Verifique visualmente a presença ou ausência de corpos lúteos, cistos ovarianos, secreções anormais e a ocorrência de aderências no útero, ovários e ovidutos14.

Resultados

Este artigo tem como objetivo demonstrar a cirurgia de laparotomia para transferência de embriões clonados para o oviduto de leitoas. Todos os animais permaneceram em plano anestésico adequado, sem incidentes ou complicações intraoperatórias durante a recuperação anestésica. As leitoas levaram, em média, 2-3 h para se levantar após o término da cirurgia.

Todos os procedimentos cirúrgicos duraram, em média, 44 min. Nove leitoas foram submetidas à cirurgia, com uma média de 185 embriões clonados transferidos por leitoa, totalizando 1.664 embriões transferidos bilateralmente (Tabela 1). A localização dos ovários, sua exteriorização e a introdução do cateter Tomcat contendo os embriões no óstio do oviduto corresponderam aos momentos mais delicados da cirurgia. Os ovários de todas as leitoas foram inspecionados durante a cirurgia, e todos apresentaram folículos hemorrágicos recém-ovulados, condizente com o esperado para o protocolo de sincronização do estro realizado, que teve como objetivo realizar transferências embrionárias logo após a ocorrência da ovulação. Todos os procedimentos ocorreram sem incidentes intraoperatórios.

Nenhum animal apresentou sinais de dor intensa após a cirurgia, com escore médio de dor de 0,33, 0,33, 3,67, 1,33, 0,33, 1,33, 4,67, 2,00 e 0,33 na escala de dor (variando de 0 a 18) realizada nos 3 dias de pós-operatório para cada uma das leitoas operadas (Tabela 2). Apenas 1 das leitoas operadas apresentou acúmulo de líquido subcutâneo (seroma) no12º dia de pós-operatório, com sinais de infecção e inflamação localizados próximos à ferida operatória. Após drenar o líquido com agulha de 40 mm x 1,6 mm guiada por ultrassom, aplicar compressas frias na área inflamada por 30 minutos diários por 7 dias, administrar ceftiofur (3 injeções intramusculares, com intervalo de 72 h entre as injeções) e meloxicam a 2% (0,4 mg/kg SID, por via intramuscular, por 3 dias), a ferida fistulou e drenou o conteúdo mucopurulento remanescente, resultando em melhoria completa do animal. As demais leitoas operadas permaneceram com o curativo cirúrgico por 5 dias sem a necessidade de troca ou retirada para limpeza da ferida, que só foi realizada do6º ao 10º dia de pós-operatório.

Nas leitoas 2, 8 e 9, não foi observado acúmulo de líquido e formação de vesículas embrionárias no lúmen uterino (Figura 1A). Portanto, o diagnóstico gestacional desses animais foi considerado negativo. As demais leitoas apresentaram acúmulo de líquido intrauterino e formação de vesículas embrionárias visualizadas como estruturas arredondadas anecoicas bem definidas (Figura 1B-D). Foi possível identificar, em duas das leitoas receptoras, uma região hiperecogênica em relação à estrutura embrionária na fase inicial de desenvolvimento no interior das vesículas embrionárias no32º dia de gestação (Figura 1E,F).

Após diagnóstico gestacional negativo ou não progressão da gestação, as leitoas foram eutanasiadas e o sistema reprodutor foi analisado. Aderências em regiões de ovários, ovidutos e cornos uterinos em menor ou maior grau foram observadas nas leitoas 1, 2, 3 e 4, e cistos ovarianos foram observados na leitoa 8 (Figura 2). Quatro estruturas embrionárias, com idade gestacional compatível com aproximadamente 12 a 20 dias de gestação, foram obtidas do útero da leitoa 3, e uma estrutura foi obtida da leitoa 7 (Figura 3). A análise de fragmentos de tecido embrionário resultou em resultados negativos para a detecção de Parvovírus, Leptospira sp., Erysipelothrix rhusiopathiae e Circovírus Suíno tipos 2 e 3 (PCV2/PCV3), que podem causar morte embrionária ou abortos.

Sequência de ultrassom, análise da estrutura renal, imagens médicas, procedimento diagnóstico, estudo renal.
Figura 1: Imagens ultrassonográficas do útero de leitoas receptoras de embriões 30 dias após o procedimento cirúrgico. (A) O útero da leitoa 2 sem a presença de líquido em seu interior, caracterizando um diagnóstico gestacional negativo. O útero gravídico da marrã 1 (B), marrã 3 (C) e marrã 4 (D) contendo vesículas embrionárias com fluido no interior (asteriscos). O útero gravídico da leitoa 3 (E) e da leitoa 7 (F) apresentando uma estrutura hiperecogênica (seta) no interior da vesícula embrionária, indicando formação fetal na fase inicial aos 32 dias de gestação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Processo de dissecação, estudo anatômico, segmentos de espécimes marcados, diagrama de pesquisa educacional.
Figura 2: Análise do sistema reprodutivo. Imagens de úteros, ovários e ovidutos após a necropsia da leitoa 1 (A), leitoa 2 (B), leitoa 3 (C), leitoa 4 (D), leitoa 5 (E), leitoa 6 (F), leitoa 7 (G), marrã 8 (H) e marrã 9 (I). As setas destacam aderências nos cornos uterinos, ovários e ovidutos, e as pontas das setas destacam os cistos ovarianos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagens de dissecção mostrando amostras de tecido biológico e amostra em placa de Petri para estudo anatômico.
Figura 3: Diagnóstico gestacional. Embriões em estágio inicial removidos da leitoa 3 (A-D) e da leitoa 7 (E) apresentam diagnóstico gestacional positivo e estruturas hiperecogênicas no interior das vesículas embrionárias ao exame ultrassonográfico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Número e tipo de embriões transferidos por leitoa, gestações diagnosticadas e número de embriões obtidos após necropsia das leitoas operadas. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Valores atribuídos a cada uma das leitoas operadas quanto à apresentação dos sinais de dor. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

O método cirúrgico descrito já foi realizado anteriormente por outros grupos de pesquisa que trabalham com a produção de suínos clonados ou suínos clonados geneticamente modificados, com relatos de nascimentos após a implementação dessa técnica 15,16,17,18,19,20. As taxas de gravidez e nascimento de embriões SCNT produzidos a partir de várias linhagens celulares variam em torno de 20% a 30% (de 264 transferências desde 2017), com uma média de 3,2 ± 0,4 leitões nascidos por ninhada 3,21. Vários fatores estão relacionados à baixa eficiência dessa técnica, incluindo o protocolo de sincronização utilizado para porcas receptoras, a sincronização entre a porca receptora e o estágio dos embriões transferidos, o local de deposição dos embriões, a qualidade dos oócitos utilizados para TNCS e embriões produzidos, a qualidade e o estágio celular das células somáticas doadoras do núcleo e o número de embriões transferidos21.

De acordo com o presente estudo, a cirurgia descrita mostrou-se eficaz, rápida e segura para a realização da transferência cirúrgica de embriões clonados (até 4 células) em leitoas, resultando em diagnósticos gestacionais ultrassonográficos positivos e visualização de estruturas embrionárias no interior da luz uterina após a necropsia, com idade gestacional aproximadamente entre 12-20 dias de gestação22. Outro método menos invasivo para transferir embriões de TNCS para o oviduto de porcas inclui a laparoscopia. No entanto, a eficiência dessa técnica varia consideravelmente de menos de 20% a mais de 80% devido a vários fatores, como a anatomia das estruturas, o tipo de cateter utilizado e o local de deposição do embrião 4,6,23,24,25,26,27. Ao transferir 2-4 embriões de suínos blastômeros por laparoscopia via infundíbulo para 6 porcas, Wieczorek et al.4 não obtiveram gestações positivas aos 28-31 dias após o procedimento, e esse resultado foi relacionado a dificuldades na inserção do cateter no oviduto, inserção rasa do cateter no oviduto e ocorrência de perfuração do infundíbulo com o cateter. Portanto, o método de transferência de embriões via laparotomia para o oviduto de porcas ainda parece ser o mais eficiente.

O risco cirúrgico associado ao procedimento de laparotomia para transferência de embriões em porcas é pequeno; no entanto, é importante ressaltar a possibilidade de hipertermia maligna durante a anestesia, que é comumente observada em suínos comerciais das raças Landrace e Large White28. Neste caso, nenhuma das leitoas operadas apresentou sinais clínicos de hipertermia maligna durante a anestesia. Há também o risco de sangramento local menor de vasos maiores na região subcutânea, que pode ser facilmente interrompido com pinça hemostática ou sutura com sutura absorvível. Também pode ocorrer a possibilidade de incisão acidental de qualquer órgão da cavidade abdominal, como a bexiga ou alças intestinais, durante a incisão com bisturi em facada e incisão de extensão na linha alba com tesoura. Nesse caso, o cirurgião deve prestar muita atenção durante a incisão da linha alba e a sutura dos músculos abdominais para evitar cortar ou lacerar as estruturas subjacentes.

A destreza manual do cirurgião é essencial para a manipulação adequada dos ovários e exteriorização cuidadosa, evitando a ruptura dos vasos do pedículo ovariano. Quando há dificuldade em localizar o(s) ovário(s), é possível iniciar o procedimento localizando um dos cornos uterinos e seguindo sua extensão até chegar à ponta do corno uterino na junção útero-tubária próxima ao ovário. Deve-se tomar cuidado para evitar aderências ovarianas e uterinas devido à manipulação excessiva desses órgãos. Hidratar essas estruturas com solução de Ringer com lactato ou solução salina a 39 °C durante a cirurgia pode ajudar a prevenir a formação de aderências29. A manipulação da tuba uterina, principalmente na região das fímbrias, deve ser realizada com muita delicadeza para evitar alongamento e ruptura. Embora a transferência unilateral de embriões, apenas para uma das tubas uterinas, possa ser realizada para evitar a manipulação excessiva do útero e reduzir o tempo cirúrgico, a transferência bilateral pode ser mais segura e vantajosa, principalmente nos casos em que há ruptura acidental de uma das tubas uterinas ou dúvidas sobre a deposição do embrião no local correto. Além disso, a transferência bilateral é mais recomendada, pois promove maiores taxas de prenhez e número de leitões nascidos quando comparada à transferência unilateral16,30. A presença de cistos está associada ao retorno regular ou irregular ao estro, com até 10% das fêmeas com cistos ovarianos permanecendo no anestro. Está relacionada a várias causas, como estresse, uso de protocolos hormonais ou herança genética31,32. Em nosso caso, os cistos foliculares ocorreram apesar de seguir a dose e o tempo de administração recomendados pelo fabricante do hormônio para sincronização de calor.

Saber localizar o óstio da tuba uterina pela abertura das fímbrias é de fundamental importância para a correta deposição dos embriões no local adequado. Para evitar erros quanto à localização da deposição embrionária, recomenda-se que seja realizado treinamento prévio na passagem do cateter Tomcat cheio de solução (por exemplo, água) através do óstio da tuba uterina em espécimes de matadouro. Quando a pipeta é introduzida no local correto, é possível observar um aumento no volume da tuba uterina ao injetar a solução. Vale ressaltar que quanto menor a quantidade de líquido transferido junto com os embriões, maiores as chances de gravidez33. Se o cirurgião achar muito difícil encontrar o óstio da tuba uterina, é possível fazer uma bolsa no oviduto e inserir o cateter através dele. Embora este último método seja mais rápido e envolva menos manipulação do oviduto, o cirurgião precisa evitar vasos sanguíneos e certificar-se de que o cateter foi inserido corretamente dentro do lúmen do oviduto.

Embora o risco de infecções pós-operatórias decorrentes desse procedimento cirúrgico seja baixo, ele pode ocorrer devido a fatores como o nível de limpeza da área onde os animais estão alojados, a duração do procedimento cirúrgico, a manutenção do curativo por tempo adequado e a prescrição correta de medicamentos, como antibioticoterapia preventiva e anti-inflamatórios. A hipótese mais plausível para a ocorrência da infecção observada em uma das leitoas operadas está relacionada à queda do curativo logo após o animal se levantar após a anestesia. Embora a limpeza diária da ferida operatória dessa leitoa tenha sido realizada com gaze embebida em soro fisiológico e aplicação tópica de pomada de Pearson, tal procedimento não foi suficiente para evitar a contaminação ascendente, necessitando de aplicação de água fria no local, drenagem, antibioticoterapia sistêmica e mais 3 dias de tratamento anti-inflamatório. Mesmo com a ocorrência de infecção subcutânea, esta leitoa apresentava sinais de gravidez ao exame ultrassonográfico.

Após o uso de fios de náilon e grampos cirúrgicos para fechamento da pele em cirurgias anteriores, optamos pelo uso de adesivo de etil-cianoacrilato para reduzir o estresse na remoção dos pontos e evitar fios ou grampos remanescentes. A presença de fios ou grampos promove pequena inflamação local com formação de pústula. O adesivo etil-cianoacrilato já foi utilizado com segurança em procedimentos cirúrgicos, mostrando-se eficaz, atóxico e bactericida 34,35. Todos os animais apresentaram excelente cicatrização da ferida, sem complicações, com exceção da leitoa, que teve o curativo caído logo após o procedimento cirúrgico.

Divulgações

Nenhum dos autores divulga qualquer conflito de interesses

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Hospital Veterinário Equino e ao Hospital Veterinário de Ruminantes da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de São Paulo (FMVZ/USP), São Paulo, Brasil, FAPESP (processo 2022/11459-3, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), EMS Pharma, CNPq (processo 405254/2022-9) e Suinocultura Água Branca, Itu, São Paulo, Brasil.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25 mL de canudogenérico-Material cirúrgico
Seringa de 1 mLDescarpack341001Material cirúrgico
Seringa de 10 mLDescarpack324601Material cirúrgico
Seringa de 20 mLDescarpack324801Material cirúrgico
Seringa de 3 mLDescarpack324201Material cirúrgico
Seringa de 5 mLDescarpack324401Material cirúrgico
Seringa de 60 mLDescarpack323201Material cirúrgico
Tubo endotraqueal de 9 mmRusch112482-000090Material cirúrgico
Allis fórcepsgenérico-Instrumentocirúrgico
Amox LAJA Saú de AnimalRegistro MAPA: 8.781/2004Medicamento farmacêutico
Fórceps Bakhausgenérico-Instrumentocirúrgico
Cateter 20GDescarpack362401Cateter para acesso intravenoso
CetaminaAgener Uniã oRegistro no MAPA: SP-000292-5.000011 anestésico
Gel clínico condutorRMCRegistro ANVISA: 80122200013Material cirúrgico
Dipirona D-500ZoetisRegistro MAPA: SP0000728-46Medicamento farmacêutico
Bisturi descartável n. 22WiltexRegistro ANVISA: 10150470565Instrumento cirúrgico
Escova-esponja estéril descartávelRioquimica7.89778E+12Assepsia cirúrgica
Easy-Scan:GoIMVESCG01Ultrassom
Endozime AW PlusRuhof34514Detergente para instrumentos cirúrgicos
Fentanil (Fentanest)Cristá liaRegistro ANVISA: 1029800810159Anestésico
Afastador Gossetgenérico-Instrumentocirúrgico
Halstead-mosquito pinça hemostáticagenérico-Instrumentocirúrgico
Pomada cicatrizante - Unguento PearsonPearson SARegistro MAPA: SP0000094-16Medicamento farmacêutico
solução de peróxido de hidrogênioRioquimicaRegistro na ANVISA: 218690015Material cirúrgico
IsofluoranoBioquímicoRegistro na ANVISA: 100630222Anestésico
IV Conjunto de gotejamento extensorgenérico-Fluidoterapia
IV Conjunto de gotejamentomacro Descarpack410301Fluidoterapia
Lactofur (ceftiofur)Ourofino SARegistro MAPA: SP0000051-50Laringoscópio de medicamento farmacêutico
--Instrumento cirúrgico
Maxicam 2%Ourofino SARegistro MAPA: SP0000051-69Medicamento farmacêutico
Adesivo microporo 5 cm x 10 cm genérico1530Material cirúrgico
MidazolamHipolaborRegistro ANVISA: 1134301430035
Conjunto de Infusão IV MultidirecionalAnestésico Descarpack413201Agulha de Fluidoterapia
40 mm x 1,2 mmDescarpack353601Agulha estéril para aplicação de medicamentos e anestésicos.
Agulha 40 mm x 1,6 mmRegistroWiltex ANVISA: 10150470664Agulha estéril para aplicação de medicamentos e anestésicos.
Porta-agulhagenérico-Instrumentocirúrgico
Nylon 2 sutura trheadShalon MedicalN502CTI40Material cirúrgico
Caneta comumgenérico-Canetaregular para fazer anotações
Solução fisiológica 0,9% saco de 500 mLJP FarmaMS:1.0491.0070Fluidoterapia
Ácido poliglicólico 2 fio de suturaAtramatG4099-75HMaterial cirúrgico
Cloreto de potássioSamtecRegistro ANVISA: 1559200010139Medicamento parenteral
Luvas de procedimentoDescarpack122401Equipamento de Proteção Individual (EPI)
Propofol (Provive)Uniã o Quí micaRegistro ANVISA: 1049714490057Anestésico
Ringer solução de lactato 500 mL sacoJP FarmaMS:1.0491.0061Fluidoterapia
Riohex 0,5% clorexidina álcool soluçãoRioquimica218690356Assepsia cirúrgica
Riohex 2% solução de clorexidina com surfactanteRioquimica218690356Assepsia cirúrgica
Couro cabeludo 21 GDescarpack421201Material cirúrgico
Capas de sapatogenérico-Equipamentode Proteção Individual (EPI)
Compressas estéreisCremerRegistro ANVISA: 10071150065Material cirúrgico
Compressa estéril CompressaProcitexRegistro ANVISA: 80245210083Material cirúrgico
Campos cirúrgicos estéreis 140 cm x 90 cm Venkuri7010003Material cirúrgico
Campos cirúrgicos estéreis 150 cm x 190 cm PolarFixF00208Material cirúrgico
Luvas cirúrgicas estéreisMucamboCA: 39.317Equipamento de Proteção Individual (EPI)
Estetoscópiogenérico-Equipamento cirúrgico
Touca cirúrgicaDescarpack93201Equipamento de Proteção Individual (EPI)
Bata cirúrgicaDescarpack231101Equipamento de Proteção Individual (EPI)
Máscara cirúrgicaDescarpack110701Equipamento de Proteção Individual (EPI)
Tesoura cirúrgica sem cortegenérico-Instrumento cirúrgico
Tesoura cirúrgica afiada-afiadagenérica-Instrumentocirúrgico
Grampeador cirúrgicoTradevet-Materialcirúrgico
Super colaTekbond TekBond 78072720030Material cirúrgico
Termômetrogenérico-Equipamentocirúrgico
Torneira de três viasSolidor374Material cirúrgico
Tramadol hidrocloritoAgener Uniã oRegistro MAPA: SP-000292-5.000002Anestésico
Curativo de filme transparenteSkinupperRegistro ANVISA: 82307460014Material cirúrgico
Adesivo impermeável 10 cm x 4,5 cm 364828genéricos Material cirúrgico

Referências

  1. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), 5758(2021).
  2. Xi, J., et al. Genetically engineered pigs for xenotransplantation: Hopes and challenges. Front Cell Dev Biol. 10, 1093534(2023).
  3. Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim Sci. 3, 826324(2022).
  4. Wieczorek, J., et al. Laparoscopic embryo transfer in pigs - comparison of different variants and efficiencies of the method. Pol J Vet Sci. 26 (2), 295-306 (2023).
  5. Martinez, E. A., et al. Design, development, and application of a non-surgical deep uterine embryo transfer technique in pigs. Anim Front. 3 (4), 40-47 (2013).
  6. Wieczorek, J., et al. A new concept in minimally invasive embryo transfer. Ann Anim Sci. 20 (4), 1289-1308 (2020).
  7. Brussow, K. P., Torner, H., Kanitz, W., Ratky, J. In vitro technologies related to pig embryo transfer. Reprod Nutr Dev. 40 (5), 469-480 (2000).
  8. Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim. Sci. 3, 826324(2022).
  9. Langendijk, P., vanden Brand, H., Soede, N. M., Kemp, B. Effect of boar contact on follicular development and on estrus expression after weaning in primiparous sows. Theriogenology. 54 (8), 1295-1303 (2000).
  10. Costea, R., Ene, I., Pavel, R. Pig sedation and anesthesia for medical research. Animals. 13, 3807(2023).
  11. Vierstraete, M., Der Vekens, N. V. an, Beckers, R., Renard, Y., Muysoms, F. Descriptive anatomy of the porcine ventral abdominal wall as a basis for training ventral hernia repair techniques. J Abdom Wall Surg. 3, (2024).
  12. Luna, S. P. L., et al. Validation of the UNESP-Botucatu pig composite acute pain scale (UPAPS). PLoS One. 15 (6), e0233552(2020).
  13. Arruda, P. H. E., Gauger, P. Optimizing sample selection, collection, and submission to optimize diagnostic value. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 98-111 (2019).
  14. Althouse, G. C., Kauffold, J., Rossow, S. Diseases of the reproductive system. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 373-392 (2019).
  15. Hao, Y., et al. Porcine skin-derived stem cells can serve as donor cells for nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 101-109 (2010).
  16. Rim, C. H., et al. The effect of the number of transferred embryos, the interval between nuclear transfer and embryo transfer, and the transfer pattern on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 143 (1-4), 91-96 (2013).
  17. Choi, K., et al. Production of heterozygous alpha 1,3-galactosyltransferase (GGTA1) knock-out transgenic miniature pigs expressing human CD39. Transgenic Res. 26 (2), 209-224 (2017).
  18. Shim, J., et al. Human immune reactivity of GGTA1/CMAH/A3GALT2 triple knockout Yucatan miniature pigs. Transgenic Res. 30 (5), 619-634 (2021).
  19. Glanzner, W. G., Rissi, V. B., Bordignon, V. Somatic cell nuclear transfer in pigs. Methods Mol Biol. 2647, 197-210 (2023).
  20. Kim, J. H., et al. Analysis of production efficiency of cloned transgenic Yucatan miniature pigs according to recipient breeds with embryo transfer conditions. Theriogenology. 218, 193-199 (2024).
  21. Navarro-Serna, S., Piñeiro-Silva, C., Romar, R., Parrington, J., Gadea, J. Generation of Gene Edited Pigs. , 71-130 (2022).
  22. Geisert, R. D., et al. Rapid conceptus elongation in the pig: An interleukin 1 beta 2 and estrogen-regulated phenomenon. Mol Reprod Dev. 84 (9), 760-774 (2017).
  23. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
  24. Hazeleger, W., Kemp, B. Recent developments in pig embryo transfer. Theriogenology. 56 (8), 1321-1331 (2001).
  25. Youngs, C. R. Factors influencing the success of embryo transfer in the pig. Theriogenology. 56 (8), 1311-1320 (2001).
  26. Wieczorek, J., Koseniuk, J., Mandryk, I., Poniedziałek-Kempny, K. Piglets born after intrauterine laparoscopic embryo transfer. Pol J Vet Sci. 18 (2), 425-431 (2015).
  27. Brüssow, K. P., Rátky, J., Antosik, P., Kempisty, B., Jaśkowski, J. M. Embryo transfer in swine - an indispensable key for the application of reproduction techniques. Electron J Pol Agric Univ. 21 (3), (2018).
  28. Cadwallader, J. A., Alley, M. R. Malignant hyperthermia in a crossbred landrace-large white pig. N Z Vet J. 23 (9), 207-211 (1975).
  29. Fatehi Hassanabad, A., et al. Prevention of postoperative adhesions: A comprehensive review of present and emerging strategies. Biomolecules. 11 (7), 1027(2021).
  30. Shi, J., et al. Influence of embryo handling and transfer method on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 154, 121-127 (2015).
  31. Castagna, C. D., et al. Ovarian cysts and their consequences on the reproductive performance of swine herds. Anim Reprod Sci. 81 (1-2), 115-123 (2004).
  32. Knox, R. V. Factors influencing follicle development in gilts and sows and management strategies used to regulate growth for control of estrus and ovulation. J Anim Sci. 97 (4), 1433-1445 (2019).
  33. Galvin, J. M., Killian, D. B., Stewart, A. N. V. A procedure for successful nonsurgical embryo transfer in swine. Theriogenology. 41 (6), 1279-1289 (1994).
  34. Lins, R. D. A. U., et al. Use of cyanoacrylate in the coaptation of edges of surgical wounds. An Bras Dermatol. 87 (6), 871-876 (2012).
  35. Horvath-Pereira, B. deO., et al. Case report: An innovative non-invasive technique to manage shell injuries in C. carbonarius. Front Vet Sci. 9, 930419(2022).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Cirurgia de LaparotomiaEmbri es de Porco ClonadosTransfer ncia Nuclear de C lulas Som ticasSincroniza o de CerdasTransfer ncia para o OvidutoDiagn stico GestacionalAdes es Cir rgicasCuidados P s operat riosCornos Uterinos

Artigos relacionados