Imunoensaio de fluxo lateral fluorescente baseado em nanoesferas de pontos quânticos

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB) e a detecção de biomarcadores de doenças usando tiras de imunoensaio de fluxo lateral baseadas em QDNB. Os resultados do teste podem ser avaliados qualitativamente sob iluminação de luz UV e medidos quantitativamente usando um leitor de tiras fluorescentes em 15 minutos.

Resumo

Os pontos quânticos, também conhecidos como nanocristais semicondutores, são novos rótulos fluorescentes para imagens e sensores biológicos. No entanto, conjugados de anticorpo de ponto quântico com pequenas dimensões (~ 10 nm), preparados por meio de procedimentos de purificação trabalhosos, exibem sensibilidade limitada na detecção de certos marcadores de doenças vestigiais usando tiras de imunoensaio de fluxo lateral. Aqui, apresentamos um método para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB) usando um método de evaporação de emulsão de uma etapa. Usando o QDNB preparado, um imunoensaio fluorescente de fluxo lateral foi fabricado para detectar biomarcadores de doenças usando proteína C-reativa (PCR) como exemplo. Ao contrário das nanopartículas de ponto quântico único, os conjugados de nanoesferas de pontos quânticos e anticorpos são mais sensíveis como marcadores de imunoensaio devido à amplificação do sinal, encapsulando centenas de pontos quânticos em uma nanoesfera composta de polímero. Além disso, o tamanho maior dos QDNBs facilita a separação por centrifugação ao conjugar QDNBs com anticorpos. O imunoensaio fluorescente de fluxo lateral baseado em QDNBs foi confeccionado, e a concentração de PCR na amostra foi medida em 15 min. Os resultados do teste podem ser avaliados qualitativamente sob iluminação de luz UV e medidos quantitativamente usando um leitor fluorescente em 15 minutos.

Introdução

As tiras de imunoensaio de fluxo lateral (LFIA) servem como ferramentas cruciais de detecção rápida no local de atendimento ^1,2, particularmente na triagem de doenças durante epidemias. No entanto, as tiras de teste LFIA tradicionais à base de ouro coloidal exibem baixa sensibilidade de detecção e fornecem apenas resultados qualitativos³. Para aumentar a sensibilidade de detecção do LFIA, surgiram várias novas nanopartículas, incluindo látex colorido ^4,5, nanopartículas fluorescentes de conversão ascendente⁶

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital de Doenças de Pele de Xangai (nº 2020-15). Todos os procedimentos experimentais envolvendo amostras de sangue humano foram realizados em laboratório de Biossegurança Nível II. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de nanoesferas de QDs

NOTA: Para a síntese de nanoesferas QD, uma técnica de evaporação de emulsão-solvente foi usada para sintetizar nanoesferas QD, com uma proporção de fase oleosa para fase aquosa de 1:5. A mini emulsão é ....

Resultados

Os procedimentos de preparação do QDNB são ilustrados esquematicamente na Figura 1A. A fase oleosa contendo QDs e polímero em clorofórmio foi misturada com a fase aquosa, e uma mini-emulsão foi obtida por sonicação. A emulsão foi solidificada por evaporação gradual do clorofórmio. A micrografia eletrônica de transmissão (MET) do QDNB é apresentada na Figura 2A. Os QDNBs têm uma morfologia esférica, com diâmetros médios de 96 nm, medidos em 50 QDNBs em imagens ME.......

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB)²⁷ e o uso de QDNB para a preparação de imunoensaios fluorescentes de fluxo lateral (LFIA). A medição qualitativa e quantitativa da PCR em amostras é demonstrada. Este LFIA baseado em QDNB também pode ser aplicado a outros biomarcadores de doenças^25,32, toxinas alimentares^29,30, vírus

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(dimetilamino)propil)-N'-etilcarbodiimida cloridrato	Sigma-Aldrich	03450
Papel de absorbância	Kinbio Biotech	CH37K
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	B2064
Caseína	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS ponto quântico	Suzhou Mesolight Inc.	CdSe / ZnS-625
Choloroform	Sino Pharm	10006818
anticorpo CRP	Hytest Biotech	4C28
Leitor de ensaio de fluxo lateral fluorescente	Suzhou Helmence Precision Instrument	FIC-H1
Almofada de fibra de vidro	Kinbio Biotech	SB06
Cabra anti-coelho IgG	Sangon Biotech	D111018
Membrana de nitrocelulose	Satorious	CN140
Copolímero de poli(estireno-anidrido maleico)	Sigma-Aldrich	S458066
Coelho IgG	Sangon Biotech	D110502
Dodecil sulfato de sódio	Sino Pharm	30166428
Hidróxido de sódio	Sino Pharm	10019718