Avanços na tecnologia de organoides bovinos usando interfaces de monocamada de intestino delgado e grosso

A cultura de células-tronco epiteliais intestinais em culturas tridimensionais (3D), conhecidas como organoides intestinais, marca um avanço significativo na tecnologia in vitro para investigar funções intestinais, nutrição e interações com patógenos ^1,2. Esses organoides imitam a estrutura complexa do epitélio intestinal in vivo, auto-replicando-se e organizando-se em formações 3D que abrangem várias linhagens de células intestinais³. Esse recurso destaca seu considerável potencial para impulsionar a compreensão da biologia intestinal.

O crescente interesse na aplicação da tecnologia organoide intestinal em animais de fazenda requer o refinamento das técnicas de cultura e manutenção ^4,5. A relevância dessa tecnologia é ressaltada por seu impacto potencial no estudo da saúde intestinal de animais de fazenda, que desempenha um papel crítico em sua produtividade e, consequentemente, na economia da indústria de alimentos e animais, influenciando o bem-estar animal e os custos operacionais ^6,7. Especificamente, o emprego de culturas organoides intestinais para explorar a função intestinal do gado é de suma importância, dado seu papel como reservatórios de patógenos entéricos zoonóticos, como Salmonella spp. e Escherichia coli (E. coli) O157: H7⁸. Esses patógenos estão localizados em segmentos específicos do intestino, tornando essencial diferenciar os métodos de cultura organoide intestinal por segmento intestinal para aumentar a precisão nos estudos⁹.

Um obstáculo significativo no estudo dos organoides intestinais é o acesso restrito à superfície apical da célula epitelial¹⁰. Quando cultivadas dentro de uma matriz extracelular (MEC), as células naturalmente se orientam para que a superfície basal fique voltada para fora e a superfície apical seja direcionada para dentro¹⁰. Para enfrentar esse desafio, são apresentados métodos que envolvem a dissociação de organoides 3D em células únicas e a semeadura em inserções de cultura de células semipermeáveis. Esta configuração estabelece uma interface entre a superfície apical e um compartimento basolateral. Este protocolo demonstra que células derivadas de organoides intestinais bovinos podem formar uma monocamada 2D coerente, como evidenciado por medições de resistência elétrica transepitelial (TEER) e ensaios de permeabilidade paracelular. Além disso, o desenvolvimento da polaridade celular com bordas em escova e junções apertadas nas células de monocamada 2D derivadas de organoides é confirmado por imunofluorescência e microscopia eletrônica, refletindo as propriedades do epitélio intestinal in vivo .

Neste estudo, o íleo representa o trato intestinal delgado e o reto significa o trato intestinal grosso. Essas seleções são baseadas em patógenos entéricos relevantes, como Salmonella spp., que pode translocar o íleo¹¹, e E. coli O157: H7, conhecida por colonizar principalmente o reto⁹ em bovinos. A seleção desses segmentos intestinais específicos destaca a necessidade de adaptar os métodos de cultura organoide intestinal à região intestinal para precisão na pesquisa. Esses métodos detalham o procedimento para cultivar efetivamente uma interface de monocamada 2D derivada de organoides desses segmentos intestinais, fornecendo um modelo robusto para explorar a saúde intestinal do gado, infecções por patógenos e interações entre o microbioma intestinal e o hospedeiro.

As criptas intestinais foram obtidas a partir de amostras intestinais excedentes provenientes de um matadouro local, e a sinalização dos doadores é fornecida na Tabela Suplementar 1. Os organoides foram gerados usando tecidos derivados de animais que foram sacrificados humanamente em um matadouro, e os animais não foram adquiridos apenas para esta pesquisa; portanto, este estudo está isento da revisão da IACUC e uma declaração de ética não é aplicável.

1. Revestimento ECM em insertos de cultura de células para cultura de monocamada 2D derivada de organoides

NOTA: Todos os procedimentos são realizados com recurso a materiais esterilizados e técnicas assépticas em cabine de biossegurança. Todos os reagentes são mantidos em gelo durante todo o procedimento, salvo indicação em contrário.

1. Prepare 100 μL de ECM para revestir cada inserto de cultura de^{células 2} de 0,33 cm misturando meio basal com hidrogel à base de ECM a 2% (v/v) em um microtubo completamente.
2. Remova o inserto de cultura de células individual da embalagem com uma pinça esterilizada e coloque individualmente nos poços de uma placa de cultura de células de fundo plano transparente de 24 poços.
3. Aplique 100 μL de revestimento de ECM preparado na etapa 1.1 na câmara apical de cada inserto de cultura de células preparado na etapa 1.2.
4. Volte a colocar a tampa e incubar a placa de cultura celular que contém a(s) inserção(ões) de cultura celular revestida(s) numa incubadora humidificada a 37 °C e 5% de CO₂ durante 1 h.
   1. Para células organoides ileais, o inserto está pronto para uso após 1 h de incubação. Para células organoides retais, após 1 h de incubação, substitua o revestimento de ECM por meio de cultura de monocamada retal e incube durante a noite (Tabela 1). Prepare insertos de cultura de células extras para controles em branco, se destinados a realizar medições TEER.

Tabela 1: Resumo do protocolo otimizado para criação de monocamadas 2D derivadas de organoides ileais e retais bovinos adultos.

2. Semeadura de células organoides ileais e/ou retais bovinas e cultura de monocamada 2D

NOTA: O protocolo descrito nesta seção utiliza organoides ileais e retais bovinos, que foram cultivados e mantidos em placas de 48 poços usando as técnicas descritas⁵. Para obter os melhores resultados, é aconselhável usar organoides mantidos de forma estável que tenham sido passados mais de 3x após o estabelecimento inicial e tenham sido cultivados por mais de 3 dias após a passagem mais recente.

1. Sem perturbar a cúpula de hidrogel à base de ECM contendo organoides maduros, remova o meio de cultura organoide usando uma pipeta de Pasteur de vidro descartável conectada a um sistema de vácuo e adicione 300 μL de solução de despolimerização de ECM gelada por poço. Incubar durante, pelo menos, 1 h a 4 °C.
   NOTA: Alternativamente, interrompa mecanicamente a cúpula de hidrogel à base de ECM contendo organoide após a adição da solução de despolimerização ECM e colete a suspensão em um tubo cônico de 15 mL antes de incubar a 4 ° C. Este método é recomendado quando organoides que não se destinam a ser usados para cultura de monocamada 2D são cultivados simultaneamente na mesma placa. A densidade das culturas organoides influencia significativamente o número de poços de cultura organoide necessários para a semeadura ideal em inserções de cultura de células.
   1. Para culturas organoides de alta densidade (Figura Suplementar 1A), as pastilhas de cultura de células retais usam uma proporção de semeadura na faixa de 1:1 a 1:2, o que significa que um poço de cultura pode semear de um a dois poços. Para íleo, mantenha a proporção em 1:1. Em contraste, culturas de baixa densidade (Figura Suplementar 1B) requerem mais poços de cultura; Use 3-4 poços de cultura de organoides retais para um inserto de cultura de células retais (proporção de 3-4:1) e 4-5 percursos de cultura de organoides ileais para um inserto de cultura de células ileais (proporção de 4-5:1).
2. Inspecione visualmente a dissolução completa do hidrogel à base de ECM e colete a suspensão organoide em um tubo cônico de 15 mL.
3. Organoides de pellets por centrifugação a 200 x g e 4 °C durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 1 mL de solução enzimática de dissociação celular recombinante suplementada com 10 μM de Y-27632.
4. Incubar a suspensão organoide em banho-maria a 37 °C por 10 min com agitação intermitente de 3-5 s com um vórtice a cada 2-3 min para facilitar a dissociação efetiva do organoide.
5. Após a digestão enzimática, adicione 5 mL de meio basal e pipete agressivamente com uma micropipeta P1000 para interromper ainda mais os organoides em células individuais. Inspecione a suspensão em busca de aglomerados organoides e, se ainda for visualmente apreciável, repita a pipetagem para aumentar a dissociação de uma única célula.
6. Prepare um tubo cônico de 50 mL com um filtro de células de 70 μm. Umedeça previamente o filtro aplicando 1-2 mL de meio basal.
7. Filtre a suspensão da célula através do filtro para remover detritos residuais de hidrogel à base de ECM e grandes aglomerados de células. Enxágue o tubo original de 15 mL e o filtro de células de 70 μm com mais 10 mL de meio basal.
   NOTA: Se a suspensão celular não passar facilmente por um filtro, pode ser uma indicação de dissociação organoide incompleta. Pode-se tentar repassar a suspensão celular coletada através do mesmo filtro de células de 70 μm. Pode ser necessária uma interrupção enzimática ou mecânica adicional.
8. Suspensão monocelular de pellets por centrifugação a 200 x g e 4 °C durante 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células com um volume apropriado de meio basal para realizar a contagem de células.
9. Conte as células viáveis com um hemocitômetro após a coloração com azul de tripano para calcular o número total de células coletadas.
10. Suspensão monocelular de pellets por centrifugação a 200 x g e 4 °C durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células até à densidade de propagação adequada no respectivo meio de cultura monocamada (Quadro 1).
    1. Para células organoides ileais, ressuspenda as células até a concentração de 2,5 x 10⁶ células/mL para atingir uma densidade de semeadura de 5 x 10⁵ células por inserção de cultura de células em 200 μL de meio de cultura de monocamada ileal, que é o meio de cultura organoide suplementado com 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632 e 20% de soro bovino fetal (FBS).
    2. Para células organoides retais, ressuspenda as células à concentração de 1,5 x 10⁶ células/mL para atingir uma densidade de semeadura de 3 x 10⁵ células por inserção de cultura celular em 200 μL de meio de cultura monocamada retal, que é o meio de cultura organoide suplementado com 100 nM CHIR99021, 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632, e 20% FBS.
11. Recupere a placa de cultura de células de 24 poços com inserto de cultura de células revestido com ECM e esvazie a câmara apical do inserto de cultura de células com sucção a vácuo cuidadosa para não romper o revestimento.
12. Aplique suavemente 200 μL de suspensão unicelular preparada na etapa 2.10 na câmara apical do inserto de cultura celular. Para o controle em branco, adicione 200 μL de meio de cultura sem células na câmara apical. Para o controle em branco, adicione 200 μL de meio de cultura sem células na câmara apical.
13. Aplique 500 μL de meio de cultura monocamada adequadamente suplementado (dependendo das células ileais versus retais) na câmara basolateral de cada poço.
14. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO₂ para facilitar a adesão e o crescimento celular para formar uma monocamada 2D confluente no inserto de cultura de células.
15. Troque os meios de cultura nas câmaras apicais e basolaterais em dias alternados, começando 48 h após a semeadura celular. Garanta o mesmo tempo de incubação para o controle em branco e a inserção que contém a célula.

3. Medição TEER

NOTA: O método descrito aqui usa um sistema de medição TEER manual disponível comercialmente conhecido como voltohímetro epitelial com um par de eletrodos Ag / AgCl (Figura 1A). A determinação de TEER em uma monocamada 2D requer a medição de poços em branco. Certifique-se de que a leitura em branco seja feita da mesma maneira que a amostra.

1. Recupere a placa contendo inserções de cultura de células com monocamada(s) 2D derivada de organoide e branco da incubadora. Deixe o prato atingir a temperatura ambiente por aproximadamente 10 min.
2. Desinfete os eletrodos com etanol 70% e deixe-os secar completamente.
3. Introduza cuidadosamente os eletrodos com a extremidade curta na câmara apical e a extremidade longa na câmara basolateral (Figura 1A).
   NOTA: Recomenda-se cuidado extra para não romper a monocamada da célula.
4. Permita que a leitura se equilibre e registre o valor em ohm quando ela se estabilizar.
   NOTA: A sensibilidade do voltohímetro é tal que ocorrerão flutuações do valor do ohm durante a medição da resistência elétrica. Uma leitura confiável é obtida quando as medições se estabilizam e pairam consistentemente em torno de um valor de platô.
5. Determine o TEER da monocamada 2D com a seguinte fórmula:
   TEER (Ω x cm²) = área de superfície dos insertos de cultura de células (cm²) x resistência elétrica líquida
   Onde a resistência elétrica líquida é igual à resistência medida do inserto monocamada da célula menos a resistência medida do inserto em branco. Os insertos de cultura celular para placas de 24 poços têm uma área de superfície de 0,33 cm².

Figura 1: Avaliação da integridade da barreira epitelial de monocamada 2D derivada de organoide intestinal bovino. (A) Esquema do posicionamento apropriado dos eletrodos dentro das câmaras apicais e basolaterais de um inserto de cultura de células para medições TEER. O eletrodo curto é inserido na câmara apical e o eletrodo longo é colocado na câmara basolateral com cuidado para evitar o contato com a membrana. (B) Esquema do processo de ensaio de permeabilidade. As câmaras de cultura de células são lavadas 2x com PBS aquecido e o marcador FITC-dextrano de 0,5 mg/mL 4 kDa dissolvido em PBS é aplicado à câmara apical. Alíquotas repetidas de 50 μL da câmara basolateral são amostradas com a substituição de um volume igual de PBS para manter o volume total na câmara basolateral durante todo o período de incubação. A intensidade de fluorescência da alíquota é medida usando um leitor de microplacas para quantificar a difusão do traçador FITC-dextrano de 4 kDa através da monocamada da célula. (C) O desenvolvimento dinâmico da integridade da barreira dentro das monocamadas ileais e retais ao longo do tempo foi avaliado utilizando medições TEER (representadas por círculos fechados para o íleo e quadrados fechados para o reto) e ensaios de permeabilidade (denotados por círculos abertos para o íleo e quadrados abertos para o reto) com um traçador FITC-dextrano de 4 kDa. No dia 3 de cultivo, ambos os tipos de monocamadas exibiram o estabelecimento de barreiras epiteliais estáveis e funcionais, como evidenciado por seus respectivos perfis de TEER e permeabilidade. Os resultados são a média de pelo menos dois experimentos independentes com duas réplicas técnicas. As barras de erro representam o SEM das medições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Ensaio de permeabilidade paracelular

NOTA: Este ensaio envolve a determinação da intensidade de fluorescência resultante da difusão de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano da câmara apical para a câmara basolateral através de monocamadas 2D durante 120 min (Figura 1B). Para obter os melhores resultados, é aconselhável minimizar a exposição à luz durante o ensaio e fazer medições em um leitor de microplacas imediatamente após cada amostragem para evitar qualquer diminuição ou extinção da fluorescência. Cada poço só pode ser usado uma vez e não pode ser reutilizado em ensaios subsequentes. Prepare pelo menos 2 poços para servir como réplicas técnicas para cada ensaio. Por exemplo, um total de 6 poços são necessários para obter os resultados apresentados na Figura 1C, onde os ensaios foram executados em duplicata em 3 pontos de tempo diferentes (dias 1, 3 e 5 de cultura).

1. Preparar séries de diluição da curva padrão com 4 kDa FITC-dextrano em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Para cada diluição, pipetar 50 μL para uma placa de 96 poços em triplicata.
   NOTA: Recomenda-se criar uma série de 5-7 diluições variando de 0 a 0,5 mg / mL.
2. Determinar a intensidade de fluorescência dos padrões num leitor de microplacas pré-calibrado com um comprimento de onda de excitação de 495 nm e um comprimento de onda de emissão de 535 nm.
3. Calcule a regressão linear com resultados de intensidade de fluorescência para criar uma curva padrão.
4. Recupere a placa contendo inserções de cultura de células com monocamadas(ões) 2D derivadas de organoides da incubadora. Remover os meios de cultura em monocamada da câmara apical e basolateral da pastilha de cultura celular que contém a monocamada 2D derivada de organoides a avaliar.
5. Lave suavemente cada câmara 2x com 200 μL (câmara apical) e 500 μL (câmara basolateral) de PBS pré-aquecido, respectivamente.
6. Remova a solução de lavagem da câmara apical e aplique 200 μL de 0,5 mg / mL 4 kDa marcador FITC-dextrano em PBS na câmara apical do inserto de cultura de células.
7. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO₂ por 20 min.
8. Amostra de 50 μL da câmara basolateral da placa incubada de 24 poços e transferência para uma placa de 96 poços compatível com o leitor de microplacas.
9. Substituir 50 μL de PBS fresco na câmara basolateral do poço amostrado.
10. Faça imediatamente a medição da intensidade de fluorescência em um leitor de microplacas pré-calibrado em um comprimento de onda de excitação de 495 nm e comprimento de onda de emissão de 535 nm.
11. Repita as etapas 4.6-4.10 a cada 20 minutos até 120 minutos. No final do ensaio, se a preservação da monocamada 2D for desejada, enxágue a câmara apical e basolateral com PBS 2x fresco, substitua por meio de cultura monocamada fresco e incuba.
    NOTA: Uma avaliação adicional das monocamadas 2D pode ser realizada, ou seja, medições TEER, coloração de imunofluorescência, etc.; no entanto, não é recomendado, pois o traçador fluorescente residual é provável e pode afetar a análise.
12. Determine o coeficiente de permeabilidade aparente (P_app) com a seguinte fórmula:
    
    ΔQ / Δt = concentração do traçador fluorescente que passou a monocamada para a câmara basolateral do inserto de cultura celular durante o período de tempo específico, medido pela intensidade de fluorescência e extrapolado para μg/mL através da curva padrão
    A = área de superfície das inserções de cultura de células
    C_o = concentração do marcador fluorescente adicionado à câmara apical do inserto da cultura celular em μg/ml

5. Coloração de imunofluorescência de monocamada 2D derivada de organoide

1. Remova o meio de cultura monocamada do inserto de cultura de células com sucção a vácuo e adicione 200 μL de paraformaldeído a 4% (PFA). Incube em temperatura ambiente por 15-30 min para fixação celular.
2. Remova o PFA com sucção a vácuo e lave com 100 μL de PBS 2x.
3. Permeabilize as células com 100 μL de Triton X-100 a 0,3% em albumina de soro bovino (BSA) a 2% em PBS, incubando em temperatura ambiente por 10 min.
4. Remova o sobrenadante com sucção a vácuo e lave com 100 μL de PBS 2x.
5. Remova o sobrenadante e substitua por 2% de BSA em PBS e incube em temperatura ambiente por 1 h para bloqueio.
6. Remova o sobrenadante, aplique 100 μL de anticorpo primário diluído em 2% BSA em PBS e incube em temperatura ambiente por 1 h ou durante a noite a 4 ° C.
   NOTA: As concentrações de anticorpos primários usados estão na Tabela de Materiais. A menos que especificado, as recomendações do fabricante são seguidas.
7. Remova o sobrenadante e lave com 100 μL de PBS 3x.
8. Aplique 100 μL de anticorpo secundário diluído em 2% de BSA em PBS e incube em temperatura ambiente por 1 h ou durante a noite a 4 ° C.
   NOTA: Esta etapa pode ser ignorada se o anticorpo primário usado for conjugado com uma sonda de fluorescência. As concentrações de anticorpos secundários usados estão na Tabela de Materiais. A menos que especificado, as recomendações do fabricante são seguidas.
9. Remova o sobrenadante e lave com 100 μL de PBS 3x.
10. Opcional: Para contracoloração de F-actina e núcleos (DAPI), prepare misturando ambas as sondas na diluição apropriada (por recomendação do fabricante) em PBS, aplique 100 μL e incube em temperatura ambiente por 30 min. Remova o sobrenadante e lave com 100 μL de PBS 3x.
11. Corte cuidadosamente a membrana de inserção de cultura de células com uma lâmina de bisturi e monte em uma lâmina de vidro com uma solução de montagem. Coloque uma lamínula e observe.

Este protocolo gera de forma confiável monocamadas 2D derivadas de organoides intestinais bovinos robustos do trato intestinal delgado e grosso, emulando a complexidade do epitélio intestinal in vivo . Este método utiliza organoides maduros desenvolvidos a partir de espécimes de cripta intestinal de bovinos saudáveis cultivados com condições otimizadas. Curiosamente, as condições bem-sucedidas e repetíveis para as monocamadas 2D derivadas de organoides são exclusivas do segmento do intestino (Tabela 1). Isso reforça a importância de ter técnicas de cultura otimizadas para o segmento intestinal de interesse.

Um dia após a semeadura de organoides maduros dissociados em uma inserção de cultura de células, uma monocamada 2D pareceu se formar (Figura 2A). No entanto, apesar dessa aparência inicial, as medições de TEER para monocamadas ileais e retais permaneceram baixas nesta fase (Figura 1C). Além disso, um ensaio de permeabilidade paracelular revelou que a monocamada, após apenas 1 dia de cultura, permitiu a passagem de um traçador FITC-dextrano de 4 kDa através da camada celular (Figura 1C). No3º dia de cultivo, ambos os tipos de monocamadas 2D derivadas de organoides apresentaram maturação significativa, evidenciada pelo aumento dos valores de TEER e resistência ao traçador FITC-dextrano de 4 kDa, tendência que continuou até o 5º dia de cultivo.

Particularmente notável é a variabilidade interespécies, onde, apesar dos valores mais baixos de TEER de culturas de monocamada 2D derivadas de organoides bovinos em relação às contrapartes humanas e caninas sob condições semelhantes 12,13,14,15, a integridade da membrana permanece intacta. Esta conclusão é tirada da resposta apropriada das monocamadas em ensaios de permeabilidade, sugerindo que baixos valores de TEER em amostras bovinas não refletem necessariamente a falta de função de barreira. Essa integridade é crucial para uma barreira epitelial funcional e é efetivamente demonstrada por meio da interpretação cuidadosa dos resultados do ensaio de permeabilidade juntamente com as medições TEER.

Visualização da demarcação celular e microvilosidades bem desenvolvidas na superfície apical das monocamadas 2D com microscopia eletrônica de varredura, exibindo estruturas microanatômicas especializadas, reforçou ainda mais a maturação das monocamadas 2D derivadas de organoides ileais e retais (Figura 2B). Além disso, a coloração por imunofluorescência das monocamadas 2D confirmou a presença de borda em escova apical, junções de aderência basolateral e células caliciformes produtoras de muco em monocamadas 2D derivadas de organoides ileais (Figura 3A) e retais (Figura 3B). Esses resultados reforçam que a monocamada 2D desenvolvida é complexa em composição e formação, não apenas expressando características-chave de um epitélio intestinal intacto, mas sendo composta por uma população celular de várias linhagens.

O desenvolvimento bem-sucedido da monocamada 2D depende da adesão das células à ECM e do crescimento à confluência para criar uma camada epitelial intacta. Notavelmente, uma distribuição desigual de ECM ou condições abaixo do ideal durante a incubação no inserto da cultura de células podem resultar no descolamento parcial da camada de células, particularmente perceptível ao longo de suas bordas ( Figura 4Ai ). Esse problema é ainda mais agravado se as células forem semeadas em densidade acima do ideal ou se as células de semeadura não forem distribuídas uniformemente pela superfície da cultura, um cenário geralmente decorrente da dissociação incompleta de organoides em uma única suspensão celular. Essa distribuição desigual pode levar à formação de lacunas dentro da monocamada e / ou morfogênese 3D em uma inserção de cultura de células ( Figura 4Aii ). Em contraste, a subssemeadura das células também pode resultar em desenvolvimento de monocamada malsucedido ou atrasado durante o período de cultura esperado, o que inadvertidamente afeta a eficiência de estudos subsequentes utilizando o sistema de monocamada 2D ( Figura 4Aiii ). Além disso, a contaminação do sistema de cultura também pode levar à formação de lacunas dentro da monocamada, interrompendo a monocamada confluente uma vez formada em um estágio posterior da cultura (Figura 4Aiv). Os valores sustentados de TEER e a resposta de permeabilidade paracelular podem ser afetados por distúrbios na camada celular devido a técnicas agressivas de lavagem ou manuseio, mesmo quando as causas potenciais de falha acima mencionadas não foram encontradas antes desses ensaios ( Figura 4B ). Assim, o manuseio cuidadoso das células e a avaliação da formação ou ruptura de monocamadas são fundamentais para o desenvolvimento bem-sucedido de monocamadas 2D derivadas de organoides por meio da aplicação eficaz de estratégias de solução de problemas.

Figura 2: Caracterização microscópica das monocamadas 2D derivadas de organoides ileais e retais bovinos. (A) Imagens representativas de microscopia de contraste de fase de monocamadas 2D no dia 1 e no dia 3 (D1 e D3) da cultura em um inserto de cultura de células. Barra de escala = 100 μm. (B) Imagens representativas de microscopia eletrônica de varredura de monocamadas 2D com ampliações mais baixas (esquerda) e mais altas (direita). A estrutura detalhada da superfície celular, incluindo microvilosidades, pode ser apreciada em monocamadas ileais (superior) e retais (inferiores). Barra de escala esquerda = 10 μm, barra de escala direita = 2 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Caracterização por imunofluorescência de monocamadas 2D derivadas de organoides ileais e retais. (A, B) O painel (A) mostra ileal e o painel (B) mostra organoides retais. À esquerda, as fibras de F-actina são destacadas com Faloidina (vermelho), ilustrando a arquitetura do citoesqueleto e a formação da borda em escova apical. A imagem do meio captura a localização basolateral das junções aderentes, marcadas por E-caderina (verde), indicativa de adesão célula-célula e integridade da monocamada. À direita, a presença de células caliciformes produtoras de mucina é identificada por SNA (verde), com uma imagem z-stack representando a secreção apical de mucina na monocamada ileal. Os núcleos em todas as imagens foram contracorados com DAPI (azul). Além disso, a imagem z-stack em todas as imagens demonstra ainda mais a formação de uma única camada de células dentro do inserto da cultura. Barra de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Caracterização da formação de monocamada 2D abaixo do ideal. (A) Imagens representativas de contraste de fase demonstrando (i) o descolamento parcial da monocamada ao longo da borda do inserto de cultura de células; (ii) o desenvolvimento do crescimento 3D e a formação de lacunas dentro da monocamada; (iii) formação incompleta ou tardia de monocamada devido à densidade de semeadura inferior à ideal, observada como aderência irregular das células; e (iv) formação de lacunas dentro da monocamada 2D uma vez formada em estágio posterior, provavelmente resultante de suspeita de contaminação. Barras de escala = 100 μm. (B) O declínio das medições de TEER juntamente com o aumento dos perfis de permeabilidade após o dia 3 indica uma falha no estabelecimento de barreiras epiteliais estáveis e funcionais. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) de um único experimento com duas repetições técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Variações de densidade em culturas organoides intestinais bovinas em hidrogel à base de MEC. Organoides intestinais bovinos cultivados em hidrogel à base de MEC; (A) alta densidade e (B) baixa densidade. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Sinalizações resumidas do doador de tecido. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.