Method Article

Montagem de organoides retinianos com microglia

DOI:

10.3791/67016

⸱

July 26th, 2024

 ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microglia é uma célula imune residente única na retina, desempenhando papéis cruciais em várias doenças degenerativas da retina. A geração de um modelo de co-cultura de organoides retinianos com microglia pode facilitar uma melhor compreensão da patogênese e do progresso do desenvolvimento das doenças retinianas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Devido à acessibilidade limitada da retina humana, os organoides retinianos (ROs) são o melhor modelo para estudar doenças retinianas humanas, o que pode revelar o mecanismo de desenvolvimento da retina e a ocorrência de doenças retinianas. A microglia (MG) são macrófagos residentes únicos na retina e no sistema nervoso central (SNC), servindo a funções imunitárias cruciais. No entanto, os organoides retinianos carecem de micróglia, pois sua origem de diferenciação é o saco vitelino. A patogênese específica da microglia nessas doenças da retina permanece obscura; Portanto, o estabelecimento de um modelo organoide retiniano incorporado à microglia revela-se necessário. Aqui, construímos com sucesso um modelo co-cultivado de organoides retinianos com microglia derivada de células-tronco humanas. Neste artigo, diferenciamos a microglia e, em seguida, co-cultivamos em organoides retinianos no estágio inicial. Como incorporação de células imunes, este modelo fornece uma plataforma otimizada para modelagem de doenças da retina e triagem de medicamentos para facilitar pesquisas aprofundadas sobre a patogênese e o tratamento de doenças relacionadas à retina e ao SNC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como fonte limitada da retina humana, a diferenciação de células-tronco humanas em organoides retinianos tridimensionais (3D) representa um modelo in vitro promissor para simular a retina1. Ele contém diferentes tipos de células na retina, incluindo fotorreceptores, células ganglionares da retina, células bipolares, células de Müller, células horizontais e astrócitos2. Este modelo permite a emulação e o estudo dos mecanismos de desenvolvimento da retina e da patogênese das doenças da retina. No entanto, devido ao método de diferenciação direcional, os organoides retinianos foram derivados do neuroectoderma3, faltando muitos outros tipos de células originárias de diferentes camadas germinativas, como a microglia do saco vitelino e as células perivasculares do mesoderma 4,5,6.

Atualmente, muitas doenças da retina, como retinite pigmentosa7, glaucoma8 e retinoblastoma9, provaram estar intimamente relacionadas à microglia dentro da retina. No entanto, devido à falta de modelos de pesquisa adequados, mecanismos específicos que ilustram a relação entre a microglia e essas doenças ainda permanecem obscuros. Embora os camundongos tenham servido como um modelo favorável para o estudo de doenças da retina, estudos recentes destacaram diferenças significativas entre a microglia de camundongos e humanos em termos de expectativa de vida, taxa de proliferação e ausência de genes homólogos humanos10,11. Essas descobertas sugeriram que as conclusões tiradas de modelos de camundongos podem não ser totalmente confiáveis, enfatizando a importância da construção de organoides retinianos humanos contendo microglia.

Nas últimas décadas, vários métodos para a diferenciação 3D de organoides retinianos foram desenvolvidos12,13. Para facilitar a operação de co-cultura da microglia dentro dos organoides da retina, selecionamos um método de diferenciação envolvendo uma transição da cultura aderente para a cultura em suspensão. Essa abordagem permite que a microglia seja incorporada aos organoides da retina, mantendo-os por pelo menos 60 dias14.

Protocol

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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Tongren de Pequim, Capital Medical University. A linhagem celular H9 dos HESCs era do Instituto de Pesquisa WiCell. Pré-aqueça o meio de cultura celular à temperatura ambiente (RT) por 30 min antes do experimento.

1. Geração de micróglia humana

  1. Cultive as hESCs em meio de células-tronco até que a densidade celular atinja 80%-90%. Semeie pelo menos 1 x 106 células em cada poço.
  2. Aspire o meio de células-tronco e enxágue as células com 1x DPBS (1 mL / poço de placa de 6 poços). A próxima etapa requer 2 x 107-1 x 108 células. Se não for suficiente, combine células de 2 a 5 poços para executar as etapas a seguir.
  3. Dissocie as colônias de células-tronco usando a solução de EDTA 0,5 mM por cerca de 5 min em uma incubadora a 37 ° C (1 mL / poço de placa de 6 poços).
  4. Verifique a morfologia da colônia após 5 min. Quando as bordas da colônia estão ligeiramente enroladas com lacunas soltas, as células estão prontas para serem diferenciadas e aspirar o EDTA. Caso contrário, incube as células a 37 °C por mais 1-2 min. Não incube por mais de 8 min.
  5. Enxágue suavemente as células em cada poço usando 6 mL de meio A (Tabela 1) com 6 μL de solução de inibidor de ROCK Y-27632 10 mM. Bata suavemente no fundo do prato para ajudar a enxaguar as células. Defina o dia como dia 0.
    NOTA: Não pipete as células. As células formarão corpos embrióides (EBs) no dia seguinte.
  6. Após 24 h, observe as células ao microscópio para confirmar a formação de EB. Colete os EBs em um tubo centrífugo de 15 mL com uma pipeta de 10 mL e espere que os EBs se assentem no fundo em 5 min.
  7. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os EBs com 6 mL de Medium A fresco e transfira-os para um novo poço de baixa adesão de placa de 6 poços. Cultura em incubadora a 37 °C.
    NOTA: O objetivo da transferência do poço no dia 1 é reduzir a influência de um grande número de células mortas durante o processo de formação de EB, o que pode afetar o estado de crescimento celular.
  8. Atualize o Meio A fresco diariamente até o dia 4 (6 mL / poço de placa de 6 poços).
  9. No dia 4, cubra uma placa de 10 cm com 3 mL de solução de gelatina de peixe a 0,1% por pelo menos 1 h em uma incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C.
    NOTA: Se o tempo de revestimento for inferior a 1 h, é difícil realizar as etapas a seguir.
  10. Colete cuidadosamente os EBs em um tubo centrífugo de 15 mL com uma pipeta de 10 mL e espere que os EBs se assentem no fundo em 5 min.
  11. Remova a solução de gelatina a 0,1% e enxágue o prato de 10 cm uma vez com 5-6 mL de 1x DPBS. Remova o DPBS.
  12. Ressuspenda suavemente os EBs com 15 mL de Meio B (Tabela 1) no tubo centrífugo de 15 mL e transfira-os para o prato revestido de 10 cm. Cultura em incubadora a 37 °C, CO 5%2 por 1 semana.
    NOTA: Nos primeiros 7 dias, não mova o prato.
  13. Refresque com Medium B fresco uma vez por semana até o dia 49 (prato de 15 mL / 10 cm) e examine as células ao microscópio uma vez por semana.
    NOTA: Após o dia 49, várias células secretoras podem ser encontradas no sobrenadante na placa de cultura.
  14. Centrifugar as células sobrenadantes a 200 x g durante 5 min a RT.
  15. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células com 2 mL de meio B fresco e transfira para um novo poço de baixa adesão de placa de 6 poços. Incubar em uma incubadora de CO2, 37 °C a 5%.
    NOTA: Nos próximos 7 dias, não mova a placa. A microglia pode aderir ao fundo do poço de baixa adesão.
  16. No dia 56, substitua por Medium C (Tabela 1) (2 mL / poço de placa de 6 poços). A microglia adere ao fundo do poço de baixa adesão e parecerá ramificada ao microscópio.
    NOTA: Ao trocar o meio C a cada 3 dias (2 mL / poço de placa de 6 poços), a microglia pode ser cultivada em meio C por cerca de 15 dias.

2. Geração de ROs humanos e co-cultura dos ROs com microglia

  1. Cultivei as hESCs em meio de células-tronco até que a densidade celular atinja 80%-90%. Semeie pelo menos 1 x 106 células em cada poço.
  2. Adicione Dispase (1 mL / poço de placa de 6 poços) à célula de cultura. Incubar a 37 °C durante 5 min. Aspire a solução Dispase do poço.
  3. Adicione o Médio D (Tabela 1) (1 mL / poço de placa de 6 poços) ao poço. Corte a célula em pedaços pequenos com uma pipeta de 10 μL.
  4. Recolha cuidadosamente todos os pedaços de células e meios num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  5. Centrifugue a 200 x g durante 5 min e retire o sobrenadante.
  6. Ressuspenda suavemente as células em 200 μL de uma matriz fria. Mova o tubo de microcentrífuga de 1.5 para uma incubadora por 20 min. Opere rápido porque a matriz se solidificará à temperatura ambiente (RT). Após 20 minutos na incubadora, a matriz se solidificará.
  7. Prepare uma placa de 10 cm com 15 mL de Medium D. Ressuspenda a matriz com Medium D e agite a placa de Petri suavemente.
  8. Em seguida, coloque o prato em uma incubadora por 5 dias. Não mova a placa. Defina o dia como dia 0 (ROs). As células irão aderir em 3 dias.
  9. No dia 5 (ROs) e no dia 10 (ROs), atualize o meio com Medium D.
  10. No dia 12 (ROs), remova o meio e adicione 3 mL de Dispase a cada prato por 5 min.
  11. Aspire o Dispase e adicione 15 mL de Medium E (Tabela 1).
  12. Colheita da microglia: No dia 56 (MGs), aspire suavemente o Medium C, adicione Accutase (1 mL / poço de uma placa de 6 poços) e incube a 37 ° C por 3 min.
  13. Colete as células da microglia em um tubo centrífugo de 15 mL com uma pipeta de 5 mL. Centrifugue as células a 200 x g em RT por 5 min.
  14. Aspire suavemente o sobrenadante e suspenda a microglia com 1 mL de Medium E. Adicione microglia às ROs digeridas no dia 12.
    NOTA: No dia 12 (ROs), as células são adesivas. No dia 13 (ROs), as células são encontradas suspensas no meio E. Se o meio mudar de amarelo do dia 12 (ROs) para o dia 19 (ROs), atualize o meio com Medium E.
  15. No dia 19 (ROs), agregue os organoides ao centro do prato, girando suavemente o prato. Aspire suavemente o Medium E e refresque o meio com Medium F.
  16. Transfira os organoides com Medium F para um novo prato de suspensão.
  17. Troque o meio uma vez por semana e selecione organoides para experimentos.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O procedimento para geração de organoides retinianos é descrito em nosso estudo anterior15. Aqui, mostramos os resultados representativos da microglia e da co-cultura de microglia e organoides da retina.

Aqui, demonstramos cada estágio da diferenciação da microglia (Figura 1A). O dia 0 representa o estágio da cultura de células-tronco. Em seguida, as células-tronco foram digeridas e cultivadas para formação de EB. Nos primeiros 4 dias do processo, as células formarão EBs (Figura 1B). Posteriormente, transferimos os EBs suspensos para pratos aderentes de 10 cm. Após aproximadamente 7 dias, as células são semelhantes às mostradas na Figura 1C. À medida que a cultura progride, as células aderentes secretam progenitores hematopoiéticos no sobrenadante (Figura 1D). Esse processo leva aproximadamente 45 dias. Neste ponto, as células podem ser colhidas do sobrenadante e transferidas para placas de 6 poços. Nos próximos 7 dias, a microglia ficará madura (Figura 1E) e pronta para novas experimentações.

No dia 12 da diferenciação do organoide retiniano, as células aderentes são digeridas para cultura em suspensão e o meio E contendo microglia é adicionado aos organoides retinianos. A microglia migrará para os organoides da retina. Para observar claramente a morfologia da microglia, adicionamos a transfecção de EGFP-lentivírus nas hESCs, o que fez com que a microglia diferenciada expressasse GFP com autofluorescência (Verde) (Figura 2A-C). Também examinamos a estrutura tecidual de organoides retinianos co-cultivados com microglia usando o marcador de células fotorreceptoras CRX e o marcador de células microgliais IBA1 por ensaio de imunofluorescência em organoides retinianos co-cultivados com microglia após diferenciação por 50 dias (Figura 2D).

figure-results-1
Figura 1: Diagrama esquemático e linha do tempo da célula da microglia derivada de hESC. (A) O protocolo começa com o descongelamento e passagem de hESCs em uma placa de 6 poços. (B) Os EBs homogêneos formados contendo o meio A. (C) Os EBs são transferidos para uma placa revestida e os progenitores hematopoiéticos são formados nos dias 4-56. (D, E) No dia 56, o sobrenadante com células é coletado (D) e transferido para uma placa de 6 poços de baixa adesão para formar microglia no dia 63 (E). Barra de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Imagens representativas ao longo da linha do tempo durante a co-cultura de microglia e organoides da retina. (A) Imagens representativas de células da microglia derivadas de EGFP-hESC. (B) Co-cultura de microglia EGFP+ com organoides retinianos após diferenciação por 18 dias. (C) Co-cultura de microglia EGFP+ com organoides retinianos após diferenciação por 30 dias. Barra de escala: 300 μm. (D) CRX (marcador de células fotorreceptoras; vermelho) e IBA1 (marcador microglial; verde) foram usados para detectar a estrutura tecidual de organoides retinianos co-cultivados com microglia após 50 dias de diferenciação. DAPI (azul) cora o núcleo. Barra de escala: 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição da mídia utilizada neste estudo. Os componentes necessários para preparar o volume de 500 mL de cada meio estão listados na tabela. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

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Devido à disponibilidade restrita da retina humana, nossa compreensão atual das respostas inflamatórias da retina vem quase de modelos animais. Para superar essa limitação, os organoides retinianos foram diferenciados. O desenvolvimento de modelos organoides retinianos tem sido uma área ativa de pesquisa, com o objetivo de recapitular a complexidade da retina humana para modelagem de doenças e desenvolvimento terapêutico. Vários estudos relataram a geração bem-sucedida de organoides retinianos a partir de células-tronco pluripotentes humanas 1,2,12,13. No entanto, a maioria desses modelos não possui a presença de microglia, que são conhecidas por desempenhar papéis cruciais no desenvolvimento da retina e na patogênese da doença. Estudos recentes tentaram integrar a microglia em organoides retinianos ou modelos organoides cerebrais 16,17,18, mas o método detalhado não é claro. Aqui, fornecemos um protocolo passo a passo detalhado para co-cultura de microglia com organoides retinianos no estágio inicial, ambos derivados da mesma linha hESC. Embora alguns estudos tenham explorado o papel da microglia em doenças da retina usando modelos animais ou sistemas de cultura de células 7,8,9, o modelo de co-cultura apresentado aqui oferece um sistema baseado em humanos fisiologicamente mais relevante para estudar as interações microglia-retina e suas implicações na patogênese da doença.

As etapas críticas são o estado celular das células-tronco humanas e a diferenciação da microglia e dos organoides da retina. Microglia e ROs devem ser diferenciados passo a passo, e reagentes e placas corretos (placa tratada com cultura de tecidos ou placa de suspensão) devem ser usados em diferentes estágios. Este modelo pode nos ajudar a entender o processo de como a microglia contribui para a ocorrência de doenças da retina. Ele tem implicações significativas para futuras triagens de drogas e investigações sobre mecanismos de doenças. No entanto, os métodos que publicamos atualmente ainda têm algumas limitações. Devido ao período prolongado de diferenciação da microglia e à falta de métodos adequados de criopreservação, devemos planejar nosso tempo com sabedoria para a diferenciação da microglia e dos organoides da retina para co-cultura.

Além dos organoides da retina, acreditamos que a integração de células imunes em outros modelos de organoides também pode promover o desenvolvimento de organoides. Portanto, testar outros sistemas organoides é crucial. A integração de vários tipos de células e organoides para formar órgãos completos representa um modelo promissor para o futuro.

Disclosures

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Os autores não estão cientes de quaisquer afiliações, membros, subsídios ou participações financeiras que possam afetar a objetividade deste estudo.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82101145) e pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (Z200014).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcctuaseStemcell Technologies07920
Advanced DMEM/F12Thermo12634-010
Anti-CRX(M02)abnovaH00001406-M02Anticorpo; diluição de acordo com as instruções do fabricante
Anti-IBA1Abcamab5076Anticorpo; diluição de acordo com as instruções do fabricante
B27Life Technologies17105-041
Dispase (1U/mL)Stemcell Technologies07923
DMEM basicGibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
F12Gibco11765-054
FBSBiological Industry04-002-1A
GelatinaSigmaG7041-100GSolid
GlutamaxGibco35050-061
Linha celular H9WiCell Research Institute
IL-3RD Systems 203-IL-050
IL-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco10828028
MatrixCorning356231
M-CSFRD Systems 216-MC-500 
MEM Solução de Aminoácidos Não EssenciaisSigmaM7145
N2Life Technologies17502-048
NeurobasalGibco21103-049
Pen/estreptococoGibco15140-122
Meio de células-tronco Stemcell Technologies5990
TaurinaSigmaT-8691-25G
X-ViVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
β-mercaptoetanolLife Technologies21985-023

References

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