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Artigo de método

Microscopia Eletrônica e de Luz Correlativa de Duas Cores para a Visualização de Interações entre Mitocôndrias e Lisossomos

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⸱

DOI:

10.3791/67020

⸱

27 de setembro de 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um mecanismo para usar microscopia de luz e eletrônica correlativa para visualizar a interação de mitocôndrias e lisossomos marcados com mEosEM e APEX2, respectivamente.

Resumo

Organelas celulares, como mitocôndrias e lisossomos, exibem estruturas dinâmicas. Apesar da maior resolução da microscopia eletrônica de transmissão para análise estrutural, a microscopia de luz é essencial para a visualização de organelas dinâmicas por marcação alvo-específica. O protocolo a seguir descreve um método que combina luz correlativa de duas cores e microscopia eletrônica (CLEM) para observar as interações entre mitocôndrias e lisossomos. Neste estudo, as mitocôndrias foram marcadas com mEosEM (Mito-mEosEM) e os lisossomos com TMEM192-V5-APEX2. Os resultados obtidos a partir de imagens CLEM nos permitem observar as mudanças nas interações entre mitocôndrias e lisossomos sob condições de estresse externo. O tratamento com bafilomicina (BFA), que inibe a função lisossômica, resultou em um aumento no contato entre as mitocôndrias e os lisossomos, levando à formação de mitocôndrias fragmentadas presas dentro dos lisossomos. Por outro lado, o tratamento com U18666A, que inibe a exportação de colesterol dos lisossomos, fez com que os lisossomos fossem cercados por mitocôndrias, indicando uma forma distinta de interação. Este estudo apresenta um método eficaz para observar as interações entre mitocôndrias e lisossomos em células fixas. Além disso, a imagem CLEM com sondas de duas cores oferece uma ferramenta poderosa para futuras investigações da dinâmica das organelas e suas implicações para a função e patologia celular.

Introdução

As mitocôndrias e os lisossomos são as principais organelas ligadas à membrana que são essenciais para a manutenção da homeostase celular. As mitocôndrias são organelas celulares altamente dinâmicas moduladas por eventos de fissão e fusão1. Em geral, as mitocôndrias são referidas como a força motriz da célula e são conhecidas por seu importante papel na fosforilação oxidativa, produção de ATP e armazenamento de metabólitos, como cálcio2. Além de seu papel no metabolismo energético, as mitocôndrias estão envolvidas em vários outros processos de sinalização celular, incluindo apoptose3,4, sinalização de cálcio5,6 e metabolismo lipídico7,8. Da mesma forma, os lisossomos são organelas celulares altamente dinâmicas que desempenham vários papéis como centros de reciclagem celular para manter a limpeza celular por meio da degradação de proteínas, autofagia, endocitose e fagocitose9. Além de seu papel na degradação, os lisossomos também desempenham papéis na fisiologia celular, como detecção de nutrientes, homeostase10, metabolismo lipídico11 e desdiferenciação celular12.

Apesar da existência de numerosos estudos sobre as funções de organelas celulares individuais, nossa pesquisa recente concentrou-se na interferência menos compreendida entre mitocôndrias e lisossomos, que demonstrou influenciar tanto a fisiologia celular quanto a patologia. Contatos entre mitocôndrias e lisossomos foram observados em vários tipos de células, incluindo células cancerígenas, neurônios e células derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)13, e são observados principalmente sob estresse celular ou em doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson13,14 e doença de Charcot-Marie-Tooth15. O contato entre mitocôndrias e lisossomos desempenha um papel importante na manutenção da homeostase metabólica por meio da troca de íons (por exemplo, Ca2+)16, cholesterol17 e iron18 entre as duas organelas. Além disso, o contato entre mitocôndrias e lisossomos desempenha um papel crucial no controle de qualidade das organelas celulares. Por exemplo, as mitocôndrias danificadas podem ser alvo de degradação por meio do processo de mitofagia, no qual são engolidas por autofagossomos e entregues aos lisossomos para degradação. Consequentemente, a remoção de mitocôndrias disfuncionais pode ser facilitada antes que causem mais danos à célula ou às mitocôndrias normais. Essa interação entre mitocôndrias e lisossomos é crucial para manter a homeostase celular e prevenir o acúmulo de organelas disfuncionais. Assim, apenas as mitocôndrias danificadas são removidas seletivamente, permitindo que as mitocôndrias saudáveis funcionem de maneira ideal dentro da célula.

A microscopia eletrônica e de luz correlativa (CLEM) é uma técnica de imagem que recentemente recebeu atenção como método de pesquisa, combinando as vantagens da microscopia de luz (LM) e da microscopia eletrônica (EM) para fornecer informações estruturais detalhadas em diferentes escalas. No CLEM, uma amostra é primeiro fotografada usando LM para identificar regiões específicas de interesse, seguida por etapas de preparação de amostra EM, como fixação, desidratação e incorporação. A mesma amostra é então observada em um microscópio eletrônico. Embora os métodos CLEM de células vivas tenham sido relatados recentemente19,20,21,22, continua sendo um desafio combinar com precisão imagens ópticas de amostras biológicas altamente dinâmicas com imagens de microscopia eletrônica de células fixas em um único plano. Para organelas altamente dinâmicas, como mitocôndrias e lisossomos, sua localização precisa pode mudar à medida que são observadas ao vivo sob o microscópio óptico e continuam a se mover mesmo durante o curto tempo de atraso necessário para a fixação.

Portanto, neste protocolo, duas marcas moleculares diferentes que permanecem ativas mesmo dentro de soluções fixadoras foram empregadas para visualizar a interação entre mitocôndrias e lisossomos, que desempenham um papel importante na manutenção da homeostase metabólica por meio da troca de íons (por exemplo, Ca2+)16, cholesterol17 e iron18 entre essas organelas. Os construtos TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM foram usados para observar as interações de mitocôndrias e lisossomos em células cultivadas nos níveis EM e LM. Para mitocôndrias, a tag mEosEM foi selecionada por sua capacidade de preservar o sinal de fluorescência durante a preparação da amostra EM em uma solução fixadora e OsO423. Para lisossomos, a tag APEX2, uma proteína de aproximadamente 28 kDa, foi usada para estudar a localização de uma proteína específica nos níveis EM e LM24. Na presença de peróxido de hidrogênio, o substrato do APEX2, Amplex-Red, forma um polímero insolúvel que pode ser observado por microscopia confocal no local alvo da etiqueta. Neste protocolo, o CLEM de duas cores foi usado para visualizar a estrutura das interações entre lisossomos e mitocôndrias em células fixas.

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Protocolo

O fluxo de trabalho passo a passo para a preparação da amostra é mostrado em Figura 1.

1. Cultura celular e transfecção

  1. Cultivar células HeLa a uma densidade de 1 × 105 células em placas de cultura de vidro de 35 mm com fundo de grelha contendo DMEM com 10% de soro fetal bovino e 100 U/ml de penicilina e estreptomicina a 37 °C.
  2. No dia seguinte à semeadura das células, co-transfecte as células em confluência de 30% a 40% com plasmídeos TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM usando o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante (1 μg de DNA de plasmídeo TMEM192-V5-APEX2 e Mito-mEosEM com 3 μL de reagente de transfecção). Após a transfecção, trate as células com DMSO ou U18666A (2 μg/mL) e Bafilomicina A1 (100 nM) por 18 h.

2. Imagem microscópica confocal

  1. Depois de tratar as células com Bafilomicina e U18666A por 18 h, remova o meio de cultura e adicione imediatamente 250 μL de solução fixadora quente (30 ° C-37 ° C) (2,5% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em solução de cacodilato de sódio 0,1 M [pH 7,0]) por pipetagem suave. Remova imediatamente o fixador, substitua-o por 1,5 mL de fixador fresco e incube no gelo por 30 min. Em seguida, lave as células por 3 x 10 min em 1 mL de tampão de cacodilato de sódio 0,1 M gelado.
    NOTA: Os vapores de aldeído são tóxicos. Todos os experimentos devem ser conduzidos em uma capela ventilada.
  2. Adicione 1 mL de solução fria de glicina a 20 mM para extinguir o aldeído e incube no gelo por 10 min. Lave 3 x 10 min em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M frio.
  3. Preparar uma solução nova contendo 300 μM de Amplex-Red adicionando 10 mM de H2O2 a uma solução de cacodilato 0,1 M. Adicione 500 μL de solução Amplex-Red ao prato de amostra e incube por 5 min no gelo.
  4. Remova a solução Amplex-Red e enxágue 3 x 10 min com tampão de cacodilato de sódio 0,1 M.
  5. Após a coloração Amplex-Red, use um microscópio confocal para obter imagens da área ao redor das células de interesse no modo de varredura 3 x 3. Capture o contraste de interferência diferencial (DIC) e o sinal de fluorescência para identificar e registrar a grade e as letras na antena parabólica usando uma objetiva de 40x (ou 60x).
    NOTA: Essas imagens de visão geral servem como um mapa para identificar células-alvo específicas nas amostras incorporadas em plástico.
  6. Visualize as células-alvo em alta ampliação usando uma objetiva de 40x (ou 60x) e adquira uma imagem de pilha Z.
    NOTA: Esta imagem de alta ampliação é sobreposta a uma imagem de microscópio eletrônico para criar uma imagem correlativa.

3. Preparação de amostras para o bloco EM

  1. Após a imagem da LM, adicione 1 mL de tetróxido de ósmio reduzido a 1% (preparado contendo ferrocianeto de potássio a 3% em tampão cacodilato 0,3 M com um volume igual de tetróxido de ósmio aquoso a 2%) para pós-fixação a 4 ° C por 1 h e, em seguida, enxágue por 3 x 10 min com água destilada a 4 ° C.
    NOTA: Os vapores de tetróxido de ósmio são tóxicos. Todos os experimentos devem ser realizados em uma capela ventilada.
  2. Enxágue 3 x 10 min com água destilada à temperatura ambiente e, em seguida, desidrate em uma série graduada de etanol por 15 min de cada vez (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% e 100%) em temperatura ambiente.
  3. Misture etanol com resina epóxi em proporções de volume de 3:1, 1:1 e 1:3, preparando um total de 300 μL de cada mistura. Despeje cada resina epóxi no prato, deixando-o incubar em temperatura ambiente por 1 h. Em seguida, use a resina 100% epóxi para impregnação durante a noite.
  4. Prepare a cápsula de incorporação ou tubo de PCR enchendo-o com resina epóxi fresca, coloque o tubo ou cápsula de cabeça para baixo na região de interesse e coloque-o em um forno a 60 ° C por 48 h para polimerizar.

4. Seccionamento e imagem TEM

  1. Depois que a resina epóxi estiver completamente polimerizada, separe o vidro inferior do bloco de polímero imergindo-o em nitrogênio líquido.
  2. Coloque o bloco de amostra no suporte de amostra do ultramicrótomo e coloque-o no bloco de corte. Use uma lâmina de barbear para aparar a resina em uma forma trapezoidal ou retangular ao redor do objeto de interesse.
  3. Coloque o bloco de amostra aparado no porta-amostras e ajuste a lâmina diamantada. Certifique-se de que a borda de ataque do bloco de amostra esteja perfeitamente paralela à borda da lâmina de diamante.
  4. Usando um ultramicrótomo, corte seções ultrafinas a aproximadamente 60-70 nm das células embutidas planas. Recolha as seções seriais em uma grade de ranhura revestida de formvar e seque-as em uma placa quente.
  5. Manchar a seção com a mancha de contraste por 2 min e citrato de chumbo por 1 min.
  6. Colocar a grelha no suporte de amostras MET para observação. Identifique a célula-alvo de interesse com base na imagem DIC do microscópio óptico. Crie imagens de toda a área da célula usando imagens lado a lado e sobrepostas com ampliação de 1.700x.

5. Costura de imagem usando imageJ Fiji.

  1. Para iniciar a costura da imagem, inicie imageJ Fiji25 e clique em Arquivo | Novo | TrakEM2 (em branco) | Selecione a pasta de armazenamento para criar um novo projeto TrakEM226 (Figura 2A1).
  2. Abra o conjunto de dados da imagem do bloco arrastando e soltando os dados brutos da imagem do bloco no espaço de trabalho (Figura 2A2).
  3. Clique com o botão direito do mouse e selecione Alinhar | Montagem de todas as imagens nesta camada | elástico (correspondências de bloco não lineares) e, em seguida, clique em OK para aceitar os parâmetros restantes dos valores padrão (Figura 2A3).
  4. Clique com o botão direito do mouse e selecione Exportar | Criar imagem plana para criar uma imagem costurada e clique em Arquivo | Salvar como para salvar a imagem.

6. Redimensionando a imagem de fluorescência

  1. Abra o software de ampliação de fotos (consulte Tabela de materiais). Clique em Arquivo | Abra e selecione a imagem de fluorescência.
  2. Insira a largura e a altura para serem do mesmo tamanho da imagem do microscópio eletrônico e selecione o algoritmo a ser aplicado no método de redimensionamento (Figura 2B1).
  3. Clique em Arquivo | Salvar COMO para salvar a imagem redimensionada.

7. Registro de imagem baseado em ponto de referência com o plug-in Big Warp

  1. Abra o ImageJ Fiji e arraste e solte a micrografia de fluorescência redimensionada (imagem FM) e a micrografia eletrônica costurada (imagem EM).
  2. Clique em Plugins | Visualizador de BigData | Big Wrap para iniciar o registro e, em seguida, clique no menu suspenso para selecionar a imagem FM como a imagem em movimento e a imagem EM como a imagem de destino (Figura 2C1).
    NOTA: Cada imagem FM e EM terá três novas janelas pop-up (imagem em movimento do BigWrap, imagem fixa do BigWrap e pontos de referência) para exibir pontos de referência.
  3. Compare as imagens FM e EM usando funções como zoom (roda do mouse), rotação da imagem (mover o mouse enquanto mantém pressionado o botão esquerdo) e mover (mover o mouse enquanto mantém pressionado o botão direito) e, em seguida, pressione a barra de espaço no teclado para ativar o modo Ponto de referência e pressione o botão esquerdo do mouse para marcar pelo menos três pontos de referência identificados nas imagens FM e EM ( Figura 2C2, pontos rosa e seta vermelha).
  4. Depois de marcar todos os pontos de referência identificados, vá para Arquivo | Exportar imagem em movimento | OK e uma nova janela pop-up aparecerá com a imagem FM transformada (Figura 2C3).
    NOTA: A janela pop-up recém-criada é uma imagem FM transformada com base no ponto de referência. Revise o alinhamento e faça ajustes, se necessário, adicionando ou modificando pontos de referência e recalculando a transformação.
  5. Clique em Arquivo | Salvar como para salvar a imagem FM transformada.

8. Sobreposição de imagens CLEM

  1. No ImageJ, arraste e solte a imagem FM transformada e a imagem EM unida.
  2. Clique na imagem | Tipo | Cor de 8 bits para definir o mesmo tipo de imagem para as imagens LM e EM (Figura 2D1).
    NOTA: A imagem EM deve ser convertida duas vezes na seguinte ordem: 8 bits -> Cor RGB -> Cor de 8 bits.
  3. Clique na imagem | Cor >| Mesclar canais para combinar as imagens em uma imagem composta selecionando as imagens FM e EM no menu suspenso, respectivamente (Figura 2D2).
  4. Clique em Arquivo | Salvar como para salvar a imagem CLEM.

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Resultados

Para visualizar as interações entre mitocôndrias e lisossomos usando este protocolo de CLEM de dupla cor, empregamos Mito-mEosEM e TMEM192-V5-APEX2. Primeiramente, células fixadas foram analisadas usando um microscópio óptico, seguido de amostragem e imagem em microscopia eletrônica. Os resultados das imagens correlacionadas são mostrados na Figura 3A,B e na Figura 4A. Após seguir o protocolo descrito acima, verificamos se poderíamos observar al...

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Discussão

Este protocolo descreve o CLEM de duas cores para observar a interação de mitocôndrias e lisossomos em células fixas usando tags mEosEM e APEX2 geneticamente codificadas. Nas últimas décadas, os avanços na microscopia melhoraram muito a capacidade de observar mudanças nas redes de organelas 32,33, e o estudo das interações de organelas tornou-se cada vez mais interessante. A microscopia de super-resolução tem sido usada para observar mudanças nos contatos altamen...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa básica KBRI através do Korea Brain Research Institute, financiado pelo Ministério da Ciência e TIC (24-BR-01-03). TMEM192-V5-APEX2 plasmídeos foram gentilmente cedidos por Hyun-Woo Rhee (Universidade Nacional de Seul). Os dados TEM foram adquiridos nas Instalações Centrais de Pesquisa do Cérebro em KBRI.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produtos químicos e reagentes
Microscopia Eletrônicade Glutaraldeído16200vapores de aldeído são extremamente tóxicos. Utilizar apenas em hottes.
Solução de peróxido de hidrogênio a 30%Merck107210
Solução de paraformaldeído a 4%BiosesangPC2031-100-00Os vapores de ldeído são extremamente tóxicos. Utilizar apenas em hottes.
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812Microscopia Eletrônica Ciências14120
EtanolMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Transfecção de plasmídeo
GlicinaSIGMAG8898
Citrato de chumbo 3%Microscopia eletrônica Ciências22410
Tetróxido de ósmio 4% solução aquosaMicroscopia eletrônica Ciências16320Muito tóxico. Utilizar apenas em hottes.
Hexacianoferrato de potássio (II) trihidratado SIGMAP3289
Cacodilato de sódio trihidratadoSigma-AldrichC0250-500G
Acetato de uranilaMicroscopia eletrônica Ciências22400
UranyLess EM manchaMicroscopia eletrônica Ciências22409
Construção de plasmídeo
Mito-mEosEMaddgene132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  et al.N/ADOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0.22 um filtro de seringaSartorius16534
35 mm Prato de lamínula grelhadoMattekP35G-1.5-14-CGRD
BEEM Cápsulas de incorporaçãoTed Pella130
Formvar suportado Grade de cobre de slot únicoTed Pella01705
Faca dediamante DiATOMEDU4530
Ultra-micrótomoLeicaARTOS 3D
Microscópios
Inverted microscopia confocalNikonA1 Rsi/Ti-E
Microscopia eletrônica de transmissãoFEITecnai G2
Software e Algoritmos
Fiji/Image JNIH / pacote dehttps://imagej.nih.gov/ij/
aberto NIH / https://imagej.net/plugins/bigwarp de código
Photozoom Pro 8 BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

Software alternativo
Image Resizer : https://imageresizer.com/
Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 redimensionar : https://www.on1.com/products/resize-ai/
25% de Ciências Os software ImageJ BigWarp de código aberto

Referências

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