Combinando imagem e eletrofisiologia para visualizar e registrar despolarizações de propagação em camundongos

Resumo

Este protocolo demonstra a combinação de imagem e eletrofisiologia para detectar de forma confiável despolarizações disseminadas em camundongos adultos após uma lesão cerebral traumática leve.

Resumo

As despolarizações de propagação (SDs) são eventos massivos no cérebro que muitas vezes passam despercebidos devido à sua lenta propagação pela massa cinzenta. Como a detecção de SD pode ser evasiva, ela é confirmada de maneira ideal usando vários métodos. Este protocolo descreve métodos para combinar imagens e eletrofisiologia para detectar SDs de uma maneira que a maioria dos laboratórios pode adotar de forma confiável e fácil. Os DSs ocorrem após lesões cerebrais traumáticas, acidente vascular cerebral, hemorragias subaracnoides, isquemia e aura de enxaqueca. Historicamente, os SDs foram registrados usando amplificadores DC, que podem resolver o deslocamento extracelular lento e a depressão na atividade de alta frequência. No entanto, os amplificadores DC são quase impossíveis de usar para gravações crônicas in vivo. Este protocolo emprega um amplificador CA comum para gravações de eletrofisiologia in vivo para confirmar a depressão de alta frequência, juntamente com imagens não invasivas necessárias para detectar a onda de propagação de SD. Esses métodos podem ser adotados e/ou modificados de forma confiável para a maioria das abordagens experimentais para confirmar a presença ou ausência de DSs após lesão cerebral.

Introdução

As despolarizações disseminadas (SDs) estão associadas a várias condições neurológicas, incluindo traumatismo cranioencefálico (TCE), acidente vascular cerebral, hemorragias subaracnoideas, isquemia e aura de enxaqueca¹. Os DSs têm sido implicados na progressão do dano tecidual em acidentes vasculares cerebrais e TCEs². O mecanismo exato subjacente à progressão da perda tecidual permanece obscuro^3,4. No entanto, os SDs ocorrem quando as demandas metabólicas dos neurônios não são atendidas com oxigênio e glicose suficientes, pois a função da bomba de sódio-potássio dependente de ATP torna-se inadequada para manter os gradientes iônicos. Para entender o papel dos DSs na perda tecidual, são necessárias técnicas precisas para medi-los e estudá-los, o que é crucial para o avanço do conhecimento científico. Os SDs são eventos neurológicos significativos que muitas vezes podem passar despercebidos devido a limitações de design experimental e/ou instrumentação.

O papel das despolarizações disseminadoras (SDs) na progressão da lesão está sendo elucidado atualmente, mas seu papel nas lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs) permanece obscuro. Estudos recentes usando as técnicas descritas neste manuscrito mostraram que os SDs são iniciados em modelos de camundongos mTBI de crânio fechado, mesmo quando não há dano tecidual evidente ou sangramento^{5, 6}. Esses estudos sugerem que os DSs podem contribuir para deficiências neurológicas agudas e neuroinflamação. Além disso, a presença de DSs induzidos por mTBI tem sido intimamente associada a déficits comportamentais agudos^6,7. Portanto, é provável que os DSs sejam iniciados em todos os modelos de TCE, mas seu papel permanece difícil de determinar sem confirmação. Confirmar a presença de DSs é crucial para avaliar com precisão os resultados dos mTBIs.

As despolarizações de propagação (SDs) são identificadas por uma queda significativa no potencial extracelular, conhecida como "deslocamento DC", e por uma depressão da atividade de alta frequência⁸. O "deslocamento DC" normalmente leva segundos para ser resolvido (~10 s)⁹. Para capturar o "deslocamento DC", são necessários um amplificador DC e eletrodos de fio de prata. No entanto, a eletrofisiologia in vivo geralmente é realizada com amplificadores CA, que são projetados para filtrar eventos de baixa frequência para reduzir artefatos de movimento. Infelizmente, essa filtragem de baixa frequência também remove o "deslocamento DC". Além disso, a prata é tóxica e inadequada para gravações crônicas. Os amplificadores CA comumente usados podem detectar a depressão da atividade de alta frequência, mas sem o "deslocamento CC" que o acompanha, confirmar a presença de um SD é um desafio.

As despolarizações de propagação (SDs) também podem ser detectadas usando várias técnicas de imagem. Mais comumente, os SDs são fotografados com imagens de contraste de manchas a laser, que medem o fluxo sanguíneo cerebral através do crânio intacto¹⁰. Os SDs influenciam significativamente a vasculatura cerebral e o fluxo sanguíneo. Na maioria das espécies, exceto camundongos, os SDs induzem uma onda de propagação de hiperperfusão que viaja com a borda de ataque da classe SD¹¹. Os SDs também podem ser visualizados usando indicadores fluorescentes de cálcio ou glutamato < sup class = "xref">12, embora isso exija o carregamento de tecido com corantes ou indicadores fluorescentes geneticamente codificados < sup class = "xref" > 12^, < sup class = "xref" > 13. Curiosamente, os SDs podem ser observados a olho nu devido aos sinais ópticos intrínsecos (iOS) associados à classe SD¹⁴. iOS são sinais complexos compostos de moléculas autofluorescentes como NAD(P)H e FADH^15,16, inchaço tecidual¹⁷ e possíveis alterações no fluxo sanguíneo cerebral. Apesar de sua complexidade, os sinais do iOS são confiáveis e podem ser capturados em camundongos do tipo selvagem¹⁸. Este protocolo descreve o método de imagem iOS porque esta técnica pode ser implementada em qualquer laboratório sem a necessidade de vírus especializados ou animais transgênicos.

O objetivo geral deste método é confirmar experimentalmente a presença ou ausência de uma despolarização disseminada (SD) após uma lesão cerebral traumática leve (mTBI) usando imagens e eletrofisiologia simultâneas. A eletrofisiologia in vivo, facilitada por amplificadores avançados, é uma técnica comumente usada. No entanto, esses amplificadores são incapazes de detectar o característico "deslocamento DC". Portanto, as técnicas de imagem, conforme descrito neste protocolo, são empregadas para confirmar com segurança a presença ou ausência de SDs. A vantagem de combinar imagem e eletrofisiologia é que a imagem pode detectar a propagação do SD, enquanto a eletrofisiologia pode identificar a depressão de alta frequência associada.

No geral, este método é adequado para investigar a presença de despolarizações disseminadas (SDs) após um traumatismo cranioencefálico (TCE). Sua aplicação pode melhorar a compreensão da função da rede cortical após TCE e SDs. Este protocolo pode ser adaptado de um modelo fechado de impacto craniano para outros modelos, como impacto cortical controlado, percussão de fluidos ou perda de peso. A implementação desse protocolo em vários laboratórios pode elucidar o papel dos DSs em diferentes gravidades de TCE. Qualquer modelo de TCE estabelecido pode ser usado, seguido pelos procedimentos de imagem e eletrofisiologia do iOS descritos neste protocolo.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto (IACUC) da Universidade do Novo México. Os camundongos C57BL/6J foram obtidos de uma fonte comercial. Um número igual de camundongos machos e fêmeas foi usado na faixa etária de 8 a 14 semanas. Todos os camundongos pesavam aproximadamente 20 g. Detalhes dos animais, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais. O Arquivo Suplementar 1 contém a lista de abreviações.

1. Preparando o crânio para imagens e eletrofisiologia

1. Anestesiar o animal em uma caixa de indução de isoflurano com 2%-3% de isoflurano em oxigênio a 100%, garantindo a profundidade adequada da anestesia sem vacilar com um beliscão da pata.
2. Administre analgésicos pré-operatórios (buprenorfina de liberação lenta, 3,25 mg / kg, SQ) antes de colocar o animal em uma estrutura estereotáxica e mantenha a anestesia (isoflurano a 2%).
3. Adicione pomada oftálmica e mantenha a temperatura corporal do animal com uma almofada de aquecimento com feedback de temperatura corporal.
4. Raspe o cabelo acima do crânio onde ficará a incisão, descendo a linha média da fissura ocular até lambda.
5. Remova o cabelo cortado antes de esterilizar a pele com um esfoliante anti-séptico e desinfetante e solução. Finalize com etanol a 70% e repita três vezes para garantir um local cirúrgico estéril.
6. Usando uma lâmina de bisturi # 10, faça uma incisão na linha média de rostral para caudal, imediatamente seguida pela aplicação de cola de cianoacrilato de grau médico na incisão. Espalhe a pele lateralmente para expor o crânio.
7. Adicione mais uma ou duas gotas de cola de cianoacrilato sobre o crânio para adicionar proteção adicional ao crânio.
   NOTA: A aplicação de cola é sensível ao tempo, pois o crânio começará a ficar opaco quando exposto ao ar por mais de 10 s. Isso obscurecerá a visualização do DS por meio de métodos de imagem.
8. Enquanto a cola está secando, use uma tesoura cirúrgica estéril para aumentar o tamanho da incisão sobre o cerebelo. Assim que a cola estiver firme, comece a implantação dos eletrodos de parafuso do crânio.
   1. Esterilize os parafusos do crânio com um esterilizador de esferas por 20 a 30 s antes da implantação.
   2. Colocar os parafusos de crânio em uma região distante do local de iniciação do DS para manter uma janela visual aberta.
      NOTA: Para gravações crônicas no córtex visual primário, são usados três parafusos de crânio. O primeiro parafuso é colocado aproximadamente a y = -6,00 mm da bregma, no cerebelo, servindo como eletrodo de referência. Os eletrodos de registro são posicionados em y = -2,79 mm do bregma e x = ±2,5 mm da linha média, nos hemisférios esquerdo e direito.
   3. Com uma broca de 0,8 mm, faça furos piloto no crânio. Para garantir que não haja danos ao tecido subjacente, -0,5 mm em z é o ideal. Use parafusos #00-90 pré-soldados a pinos dourados com fio de aço inoxidável.
   4. Gire os parafusos para baixo no crânio.1.5-2 voltas completas farão com que o parafuso passe pelo crânio e entre em contato com a superfície cortical.
   5. Enrole o excesso de fio ao redor do parafuso, permitindo alguma folga no fio para colocação no cabeçote mais tarde.
   6. Usando os mesmos procedimentos, coloque os outros parafusos do crânio.
   7. Depois que todos os parafusos de caveira estiverem no lugar, conecte todos os pinos dourados no conector de cabeçote desejado. Segure o conector no lugar usando o braço estereotáxico e segure os pinos do conector acima das cabeças dos parafusos, garantindo que os fios não se toquem.
   8. Sele toda a área com cola de cianoacrilato, certificando-se de não interromper a área de imagem na frente dos parafusos do crânio.
   9. Construa cimento dental ao redor da base dos pinos de ouro, garantindo que os pinos de ouro dos parafusos do crânio não estejam conectados aos pinos de ouro no estágio principal.
   10. Deixe o cimento dentário curar antes de remover o conector do headstage.
   11. Remova o animal da estrutura estereotáxica e coloque-o de volta na gaiola para se recuperar. Siga os cuidados pós-operatórios padrão e mantenha os animais em uma almofada de aquecimento enquanto se recuperam da anestesia.
       NOTA: Após a cirurgia, os animais foram alojados individualmente e monitorados quanto à dor diariamente. Siga as diretrizes institucionais locais para analgesia. Se estiver usando uma buprenorfina de liberação lenta, monitore a dor e, potencialmente, administre uma dose adicional em 72 h.
9. Remova quaisquer objetos que possam prender nos eletrodos, incluindo alojamento e enriquecimento. Use roupas de cama padrão com acesso ad libium a alimentos e água.
   NOTA: Permita um período de recuperação de dois dias entre a cirurgia e a gravação.

2. Detecção de despolarizações de espalhamento com imagens de sinal óptico intrínseco (iOS) e eletrofisiologia CA

1. Anestesiar os animais com isoflurano a 2% em oxigênio a 100%.
   NOTA: A parte de imagem deste procedimento deve levar ~ 5 min e a quantidade de exposição ao isoflurano deve ser consistente.
2. Coloque o animal em uma estrutura estereotáxica. Através do cone do nariz, mantenha 1%-2% de isoflurano em oxigênio.
   NOTA: É fundamental manter a profundidade adequada da anestesia, pois o isoflurano é conhecido por reduzir os DSs. Recomenda-se manter 60-70 respirações/min durante todo o experimento.
3. Coloque o animal embaixo da câmera e certifique-se de que a câmera esteja focada na superfície cortical ajustando o anel de foco.
4. Aplique óleo mineral na área de imagem para aumentar a transparência.
5. Ligue os computadores, a placa de painel de LED e o equipamento de eletrofisiologia.
   NOTA: A placa do painel de LED funciona melhor quando posicionada na frente do animal para iluminar a janela de imagem enquanto as luzes do teto estão apagadas. A luz foi ajustada para ~ 2.400 lux (95% de potência) com uma configuração de temperatura fria de 4000K.
6. Configuração de carregamento para iOS usando Micro-Manager^19,20,21,22.
   1. Pressione Ao vivo para ver o mouse sob a câmera e centralizar o crânio do animal sob a câmera. Feche a janela "Ao vivo".
   2. Pressione Multi-D Acq.
   3. Na janela Aquisição multidimensional, selecione os pontos de tempo desejados.
      NOTA: Recomenda-se uma contagem de 750 imagens em um intervalo de 250 ms.
   4. Salve as imagens no caminho do arquivo desejado e no prefixo do nome.
7. Conecte os pinos dourados do animal ao conector do headstage e depois ao headstage.
8. Configuração de carga para o software Intan.
   1. Clique no ícone Escolher formato de arquivo e, na janela pop-up, selecione Um arquivo por formato de tipo de sinal. Isso salvará o arquivo como um ".dat" para uso posterior no MATLAB.
   2. Na guia BW em Largura de banda de hardware, selecione a largura de banda do amplificador de 0,13-500 Hz.
   3. Em Seletor de exibição de filtro, selecione WIDE para cobrir a mais ampla gama de sinais.
   4. Para selecionar o caminho do arquivo desejado para salvar, clique no ícone Selecionar nome do arquivo.
9. Execute o impacto usando um impactador eletromagnético.
   NOTA: As configurações do impactor são velocidade de impacto de 4 m/s e deflexão de 5 mm.
   1. Ligue o impactor e certifique-se de que a ponta se retrai e se estende adequadamente, movendo o botão de 3 direções para retrair a ponta e estender a ponta. A ponta deve ser estendida antes de colocar o animal embaixo da ponta.
   2. Movendo-se rapidamente, coloque o animal em uma cama de espuma e deslize a cama por baixo da ponta.
   3. Alinhar a ponta do impactor na linha média e 1 mm rostral de bregma.
   4. Abaixe a ponta do impactor até que ela esteja firmemente encostada no topo da cabeça do animal.
      NOTA: Não empurre a ponta para baixo na cabeça.
   5. Empurre a alavanca para retrair a ponta do impactor e, em seguida, abaixe-a manualmente 5 mm antes de ativar a alavanca de impacto.
   6. Remova imediatamente o animal da cama de espuma e coloque-o embaixo da câmera para obter imagens dentro de 5 s, pois o SD é iniciado a partir do impacto.
10. Inicie a imagem do iOS clicando em Adquirir! na janela Aquisição multidimensional. Imagem por 4 min para capturar todo o SD.
11. Inicie a gravação de eletrofisiologia clicando no ícone Gravar no software Intan.
12. Retire o animal da almofada de espuma e permita que o animal se recupere em uma arena aberta ou gaiola doméstica.
    NOTA: Recomenda-se que a eletrofisiologia seja registrada por pelo menos 1 h para permitir que a função da rede cortical se recupere.
13. Após a conclusão da gravação, desconecte o animal do cabeçote e do conector e coloque-o de volta em sua gaiola.
    NOTA: Recomenda-se permitir 24 horas entre cada impacto e a sessão de gravação. O animal pode permanecer em sua gaiola doméstica o tempo todo fora das sessões de gravação.

3. Visualização e quantificação de imagens iOS

1. Em ImageJ^19,20,21,22, abra a pilha de imagens clicando na sequência Arquivo > Importar > Imagem.
2. Percorra manualmente as imagens para garantir a falta de movimento ou quaisquer outros artefatos.
3. Para gerar o gráfico do SD, crie um ROI usando o cursor para desenhar um quadrado.
   NOTA: Recomenda-se usar um quadrado de 30 x 30 pixels. Pode-se usar qualquer forma ou tamanho, mas certifique-se de que o tamanho do ROI não mude entre os animais.
4. Crie um gráfico clicando em Pilhas de > de imagem > Plotar perfil do eixo Z. No gráfico recém-criado, clique no botão ao vivo. Volte para a pilha de imagens do SD e mova o ROI até que o gráfico mostre a curva SD. O gráfico deve se parecer com uma onda de pecado com um aumento inicial seguido por uma queda abaixo da linha de base e um retorno lento à linha de base em alguns minutos.
   NOTA: Os gráficos podem ser expressos como unidades arbitrárias (UA) ou como porcentagem de linha de base usando as primeiras imagens como a média da linha de base.
5. No gráfico gerado, clique em Lista para gerar uma lista de valores que podem ser plotados em outro software de geração de gráficos ou no Matlab.
6. Para visualização, transforme a imagem em tons de cinza em uma tabela de pesquisa no ImageJ por Image > Lookup Tables > Fire.

4. Análise eletrofisiológica

NOTA: Recomenda-se que a experiência do laboratório de Buzsaki e seu código gerado pelo MATLAB sejam amplamente utilizados para visualizar e analisar dados de eletrofisiologia. A análise exigirá o download do MATLAB com um código de ativação institucional e o arquivo zip "Buzcode" do laboratório Buzsaki via GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).

1. No software de eletrofisiologia Intan, certifique-se de que os dados brutos exportados sejam salvos no formato ".dat".
   NOTA: O Matlab pode ser instalado a partir do site da MathWorks. Um código de ativação institucional ou individual é necessário para a compra e uso do Matlab. Alguma experiência anterior com a execução de código no Matlab é necessária para realizar esta análise.
2. Use a função de bz_LoadBinary de código Buzaki para carregar os dados no Matlab.
   NOTA: Exemplo "'data' = bz_LoadBinary ('caminho completo do arquivo de dados', 'frequência', frequência de amostragem, nCanais, número de canais);
3. Filtre o ruído CA usando um filtro de entalhe centralizado em 60 Hz.
   NOTA: Exemplo notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, dados);
4. Isole a atividade de alta frequência usando um filtro passa-banda com faixa de 0,5-100 Hz, de acordo com as recomendações do grupo COSBID para análise e visualização de despolarizações de espalhamento (SDs).
5. Calcule o espectrograma de potência usando o comando pspectrum no MatLab.
6. Para visualizar, plote o espectrograma de alta frequência e o espectrograma de potência na mesma escala de tempo e em uma coluna.
   NOTA: A partir dos gráficos, haverá uma extensão da depressão de alta frequência e perda de potência.

Resultados

A Figura 1 ilustra uma representação gráfica da configuração experimental. Os parafusos de registro do crânio são posicionados no córtex visual primário, com um eletrodo de parafuso do crânio colocado no vérmis cerebelar como um eletrodo de aterramento. Os parafusos do crânio e os pinos de ouro são fixados ao crânio usando cola de cianoacrilato e cimento dentário. É crucial limitar o cimento dentário à parte caudal do crânio para deixar espaço para impacto e imagem. A localização do impacto, centrada na linha média e aproximadamente 1 mm rostral à bregma, é indicada em Figura 1.

Imagens representativas de sinais ópticos intrínsecos (iOS) são mostradas em Figura 2A. As imagens em tons de cinza são convertidas usando uma Tabela de Pesquisa de Incêndio para aprimorar a visualização de despolarizações de propagação (SDs). O iOS engloba vários sinais, incluindo NAD(P)H, FADH e refletância tecidual, tornando a interpretação e a comparação desses sinais desafiadoras. Os vasos grandes devem ser claramente visíveis através da janela de supercola (indicada com setas), enquanto a linha tracejada em Figura 2A marca a onda de propagação do SD. Embora os SDs sejam difíceis de observar em tempo real, eles se tornam mais aparentes quando as imagens são aceleradas (veja o Vídeo Suplementar 1). Alguns pequenos ramos podem parecer "desaparecer" devido à vasoconstrição (Figura 2A). Uma pequena região de interesse (ROI) extraída da pilha de imagens deve produzir um gráfico do eixo Z semelhante a Figura 2B. A partir dos registros de eletrofisiologia, o sinal de alta frequência extraído deve se assemelhar aos painéis superiores de Figura 2C,D. Esses registros foram iniciados imediatamente após o traumatismo cranioencefálico leve (mTBI), com os animais permanecendo sob anestesia com isoflurano durante os 4 minutos de imagem do iOS. Após a remoção do isoflurano, a atividade de alta frequência deve retornar rapidamente dentro de um minuto em animais simulados, conforme mostrado em Figura 2C (caixa vermelha). Por outro lado, se ocorresse um DS, a atividade de alta frequência permaneceria deprimida por vários minutos antes da recuperação (Figura 2D, caixa vermelha). Os painéis inferiores de Figura 2C,D exibem a potência calculada (V²) para cada gráfico de alta frequência. Esses gráficos de potência ajudam a identificar a supressão e recuperação da atividade de alta frequência pelo rápido aumento da potência (indicado pela borda direita das caixas vermelhas).

Figura 1: Configuração experimental e localização dos parafusos de impacto e crânio. A superfície dorsal do crânio é exposta através de uma incisão na pele. O crânio e a pele são selados com cola de cianoacrilato para aumentar a transparência. Um furo de rebarba para o solo é perfurado em y = -6,00 e x = 0 de bregma. Os orifícios de rebarba para registrar eletrodos são colocados em y = -2,79 e x = ±2,5 de bregma. Os parafusos de aço inoxidável são rosqueados através do crânio e soldados a pinos de ouro com fio de aço inoxidável não revestido. Toma-se cuidado para evitar a cobertura excessiva da superfície do crânio com cimento dentário para garantir espaço adequado para impacto e imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas do iOS e gravações AC. (A) Imagens representativas do iOS com setas indicando vasos sanguíneos. As imagens em tons de cinza são convertidas na tabela de pesquisa Fire no ImageJ para melhorar a visualização. A linha preta pontilhada denota a propagação do SD, visualizada como uma onda de maior intensidade no iOS. O SD é claramente visível ao rolar rapidamente por toda a pilha de imagens. O sinal iOS reflete várias alterações fisiológicas e metabólicas associadas ao DS, incluindo produção mitocondrial de NAD(P)H e FADH e edema neuronal. A caixa preta destaca a região de interesse (ROI) usada para gerar o traço em (B). Barra de escala: 1 mm. (B) Traço representativo do SD iOS expresso como uma porcentagem da linha de base. O sinal do iOS sobe e retorna perto da linha de base em aproximadamente 60 s. Embora as alterações nos sinais do iOS sejam pequenas (cerca de 10%), elas são suficientes para identificar o SD. Nos registros AC para animais simulados (C) e SD (D), os traços superiores mostram atividade de alta frequência e os traços inferiores representam potência (V²). As caixas azuis indicam períodos de anestesia com isoflurano, enquanto a caixa vermelha denota o período de recuperação da atividade de alta frequência do isoflurano e SD. A depressão prolongada induzida pela DS é contrastada com a rápida recuperação da atividade após o isoflurano isolado (simulação). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo Suplementar 1: Propagação da visualização de ondas. O arquivo de vídeo é acelerado até aproximadamente 8x a velocidade para facilitar a identificação visual da onda de propagação. A imagem em tons de cinza foi convertida na tabela de pesquisa do Fire e salva como um arquivo .AVI no ImageJ. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Lista de abreviaturas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A disseminação de despolarizações é crucial em vários modelos de doenças, incluindo traumatismo cranioencefálico (TCE), acidente vascular cerebral e enxaqueca¹. A detecção precisa de DSs é essencial para entender seu papel nos déficits comportamentais agudos e/ou na ativação do sistema neuroimune após lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs)^23,24. Para mitigar o risco de SDs ausentes ao usar um único método, uma abordagem multimétodo é necessária para visualização e registro eficazes de SDs.

Embora a combinação de técnicas permita a confirmação de despolarizações de propagação (SDs), cada técnica pode ter armadilhas potenciais. As técnicas de imagem descritas neste protocolo são acessíveis à maioria dos laboratórios e são detalhadas por Zepeda e colegas²⁵. A preparação da janela craniana é crucial, pois janelas opacas podem levar a imagens inconclusivas²⁶. Esse problema pode ser mitigado minimizando a exposição do crânio ao ar antes de aplicar cola de cianoacrilato. Além disso, a transparência da janela pode ser melhorada com uma gota de óleo mineral antes da imagem. Artefatos de movimento também podem complicar a confirmação de SD, portanto, minimizar esses artefatos é essencial para obter um vídeo nítido. Para isso, é importante manter o animal em uso de isoflurano durante todo o processo de imagem²⁷. A utilização de um cone nasal facilita a transferência eficiente do animal entre o impactor e a configuração de registo. É fundamental colocar rapidamente o animal de volta sob o cone do nariz após o impacto para capturar o máximo possível da propagação do SD. Neste modelo de lesão cerebral traumática leve (mTBI), o registro por aproximadamente 4 minutos geralmente é suficiente para capturar todo o SD. No entanto, em TCEs mais graves, DSs espontâneas podem ser geradas por dano tecidual²⁸. A imagem contínua pode detectar essas DSs espontâneas, mas a anestesia prolongada com isoflurano pode dificultar a observação da depressão de alta frequência. SDs espontâneas podem ser detectadas com eletrofisiologia por depressões adicionais na atividade de alta frequência, mas confirmar a relação entre depressão e DS é difícil sem imagens.

Com o desenvolvimento de amplificadores Open-Ephys e Intan, a eletrofisiologia in vivo agora está acessível a muitos laboratórios. Todos os registros eletrofisiológicos requerem o implante de parafusos e/ou eletrodos cranianos. Neste protocolo, há um período de latência de dois dias entre o implante dos parafusos cranianos e o registro para apoiar a recuperação. Embora esse período possa não ser suficiente para o cérebro se recuperar totalmente da implantação, deve haver danos mínimos, pois os parafusos do crânio não penetram no tecido cerebral. Além disso, a transparência do crânio selado com cianoacrilato diminui com o tempo, portanto, a imagem deve ser realizada o mais rápido possível para obter a transparência ideal. Para eletrofisiologia, é crucial minimizar o ruído de 60 Hz. Certifique-se de que a área experimental esteja isolada da alimentação CA e devidamente aterrada no Intan ampmais vivo. Embora os artefatos de movimento não possam ser completamente eliminados, os acelerômetros no estágio principal podem ajudar a identificar e remover períodos de movimento durante o pós-processamento. No geral, essas técnicas podem fornecer informações valiosas sobre a recuperação do SD e a função da rede cortical após lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs).

Uma limitação dessas técnicas é que os animais estão sob anestesia durante a imagem. No entanto, a maioria dos modelos de TCE requer anestesia, e é improvável que a anestesia estendida afete significativamente o projeto experimental. O isoflurano reduz significativamente a atividade de alta frequência²⁷. Se a exposição ao isoflurano se estender além do período de imagem, isso pode complicar a detecção da recuperação da atividade de alta frequência após o SD. Portanto, é fundamental incluir um grupo simulado ou isolado de isoflurano no desenho experimental para comparar a recuperação da atividade de alta frequência, conforme mostrado na Figura 2. Outra limitação é que os registros eletrofisiológicos não detectam o deslocamento DC. A amplitude e a duração do deslocamento DC são indicadores da saúde do tecido e da recuperação do DP²⁸. No entanto, a confirmação de SDs com essas técnicas ainda fornecerá informações valiosas sobre a pesquisa de TCE.

Todos os pesquisadores de TCE se beneficiariam das técnicas descritas aqui, pois é altamente provável que todos os modelos de TCE produzam despolarizações de espalhamento (SDs). O campo do TCE ganharia significativamente com a compreensão do papel dos DSs na lesão, progressão da lesão, ativação neuroimune e recuperação. Pesquisas recentes sugerem que os DSs contribuem para déficits comportamentais e podem ser um mecanismo subjacente de comprometimento neurológico ^5,7. As técnicas descritas neste protocolo ajudarão a elucidar a conexão entre TCE e DS. Aplicações futuras dessas técnicas podem se estender a outros campos de pesquisa, incluindo acidente vascular cerebral, epilepsia e enxaqueca.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#00-90 x .118 Parafuso de Máquina	US Micro Parafuso	00.90-118-M-SS-P, Amazon
Broca de 0,8 mm de diâmetro	PCB Broca	WYTP21, Amazon
16-A Headstage	Intan	C3335
2.1 mm Broca micro Fresas	Fine Science	19007-21
Amplificador AC	Sistema	de gravação Intan RHD Mouses
C57BL/6J	Laboratório Jackson	Jax#000664
	Mightex	TCE-1304-U
Extensão de lente	Zeikos	ZE-ETN
Ethiqa XR (Buprenorfina de liberação lenta)	Suprimentos Veterinários do Centro-Oeste	Número do Produto 267.10000.3
Pino do conector de ouro (fêmea)	A-M Systems	520100
Pino do conector de ouro (macho)	A-M Systems	520200
ImageJ2/Fiji	Image J	NA
Impactor One	Leica	39463930
Placa de painel de LED	Supon	L122t
MATLAB	MathWorks	Código
Cola de cianoacrilato de grau médico	MasterBond	MB287
Micro-Manager Camera Software	Image J	NA
Broca de unhas / polidor	Makartt Broca de unhas Lixa de unha elétrica	JD700
Conectores Omnetic	Omnetics	A79014-001
RHX Software de Aquisição de Dados	Intan	NA
Fio de aço inoxidável não revestido (0.005")	A-M Systems	792800
Quadro Estereotáxico	Kopf Intruments	1923-B
Teets 'cura a frio' cimento dental	A-M systems	525000, 526000
Lente da câmera XLR	Nikon	NIKKOR 50 mm f/1.8-16