Este protocolo demonstra a combinação de imagem e eletrofisiologia para detectar de forma confiável despolarizações disseminadas em camundongos adultos após uma lesão cerebral traumática leve.
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Artigo de método
Combinando imagem e eletrofisiologia para visualizar e registrar despolarizações de propagação em camundongos
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Neste artigo
Resumo
Resumo
As despolarizações de propagação (SDs) são eventos massivos no cérebro que muitas vezes passam despercebidos devido à sua lenta propagação pela massa cinzenta. Como a detecção de SD pode ser evasiva, ela é confirmada de maneira ideal usando vários métodos. Este protocolo descreve métodos para combinar imagens e eletrofisiologia para detectar SDs de uma maneira que a maioria dos laboratórios pode adotar de forma confiável e fácil. Os DSs ocorrem após lesões cerebrais traumáticas, acidente vascular cerebral, hemorragias subaracnoides, isquemia e aura de enxaqueca. Historicamente, os SDs foram registrados usando amplificadores DC, que podem resolver o deslocamento extracelular lento e a depressão na atividade de alta frequência. No entanto, os amplificadores DC são quase impossíveis de usar para gravações crônicas in vivo. Este protocolo emprega um amplificador CA comum para gravações de eletrofisiologia in vivo para confirmar a depressão de alta frequência, juntamente com imagens não invasivas necessárias para detectar a onda de propagação de SD. Esses métodos podem ser adotados e/ou modificados de forma confiável para a maioria das abordagens experimentais para confirmar a presença ou ausência de DSs após lesão cerebral.
Introdução
As despolarizações disseminadas (SDs) estão associadas a várias condições neurológicas, incluindo traumatismo cranioencefálico (TCE), acidente vascular cerebral, hemorragias subaracnoideas, isquemia e aura de enxaqueca1. Os DSs têm sido implicados na progressão do dano tecidual em acidentes vasculares cerebrais e TCEs2. O mecanismo exato subjacente à progressão da perda tecidual permanece obscuro3,4. No entanto, os SDs ocorrem quando as demandas metabólicas dos neurônios não são atendidas com oxigênio e glicose suficientes, pois a função da bomba de sódio-potássio dependente de ATP torna-se inadequada para manter os gradientes iônicos. Para entender o papel dos DSs na perda tecidual, são necessárias técnicas precisas para medi-los e estudá-los, o que é crucial para o avanço do conhecimento científico. Os SDs são eventos neurológicos significativos que muitas vezes podem passar despercebidos devido a limitações de design experimental e/ou instrumentação.
O papel das despolarizações disseminadoras (SDs) na progressão da lesão está sendo elucidado atualmente, mas seu papel nas lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs) permanece obscuro. Estudos recentes usando as técnicas descritas neste manuscrito mostraram que os SDs são iniciados em modelos de camundongos mTBI de crânio fechado, mesmo quando não há dano tecidual evidente ou sangramento5, 6. Esses estudos sugerem que os DSs podem contribuir para deficiências neurológicas agudas e neuroinflamação. Além disso, a presença de DSs induzidos por mTBI tem sido intimamente associada a déficits comportamentais agudos6,7. Portanto, é provável que os DSs sejam iniciados em todos os modelos de TCE, mas seu papel permanece difícil de determinar sem confirmação. Confirmar a presença de DSs é crucial para avaliar com precisão os resultados dos mTBIs.
As despolarizações de propagação (SDs) são identificadas por uma queda significativa no potencial extracelular, conhecida como "deslocamento DC", e por uma depressão da atividade de alta frequência8. O "deslocamento DC" normalmente leva segundos para ser resolvido (~10 s)9. Para capturar o "deslocamento DC", são necessários um amplificador DC e eletrodos de fio de prata. No entanto, a eletrofisiologia in vivo geralmente é realizada com amplificadores CA, que são projetados para filtrar eventos de baixa frequência para reduzir artefatos de movimento. Infelizmente, essa filtragem de baixa frequência também remove o "deslocamento DC". Além disso, a prata é tóxica e inadequada para gravações crônicas. Os amplificadores CA comumente usados podem detectar a depressão da atividade de alta frequência, mas sem o "deslocamento CC" que o acompanha, confirmar a presença de um SD é um desafio.
As despolarizações de propagação (SDs) também podem ser detectadas usando várias técnicas de imagem. Mais comumente, os SDs são fotografados com imagens de contraste de manchas a laser, que medem o fluxo sanguíneo cerebral através do crânio intacto10. Os SDs influenciam significativamente a vasculatura cerebral e o fluxo sanguíneo. Na maioria das espécies, exceto camundongos, os SDs induzem uma onda de propagação de hiperperfusão que viaja com a borda de ataque da classe SD11. Os SDs também podem ser visualizados usando indicadores fluorescentes de cálcio ou glutamato < sup class = "xref">12, embora isso exija o carregamento de tecido com corantes ou indicadores fluorescentes geneticamente codificados < sup class = "xref" > 12, < sup class = "xref" > 13. Curiosamente, os SDs podem ser observados a olho nu devido aos sinais ópticos intrínsecos (iOS) associados à classe SD14. iOS são sinais complexos compostos de moléculas autofluorescentes como NAD(P)H e FADH15,16, inchaço tecidual17 e possíveis alterações no fluxo sanguíneo cerebral. Apesar de sua complexidade, os sinais do iOS são confiáveis e podem ser capturados em camundongos do tipo selvagem18. Este protocolo descreve o método de imagem iOS porque esta técnica pode ser implementada em qualquer laboratório sem a necessidade de vírus especializados ou animais transgênicos.
O objetivo geral deste método é confirmar experimentalmente a presença ou ausência de uma despolarização disseminada (SD) após uma lesão cerebral traumática leve (mTBI) usando imagens e eletrofisiologia simultâneas. A eletrofisiologia in vivo, facilitada por amplificadores avançados, é uma técnica comumente usada. No entanto, esses amplificadores são incapazes de detectar o característico "deslocamento DC". Portanto, as técnicas de imagem, conforme descrito neste protocolo, são empregadas para confirmar com segurança a presença ou ausência de SDs. A vantagem de combinar imagem e eletrofisiologia é que a imagem pode detectar a propagação do SD, enquanto a eletrofisiologia pode identificar a depressão de alta frequência associada.
No geral, este método é adequado para investigar a presença de despolarizações disseminadas (SDs) após um traumatismo cranioencefálico (TCE). Sua aplicação pode melhorar a compreensão da função da rede cortical após TCE e SDs. Este protocolo pode ser adaptado de um modelo fechado de impacto craniano para outros modelos, como impacto cortical controlado, percussão de fluidos ou perda de peso. A implementação desse protocolo em vários laboratórios pode elucidar o papel dos DSs em diferentes gravidades de TCE. Qualquer modelo de TCE estabelecido pode ser usado, seguido pelos procedimentos de imagem e eletrofisiologia do iOS descritos neste protocolo.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto (IACUC) da Universidade do Novo México. Os camundongos C57BL/6J foram obtidos de uma fonte comercial. Um número igual de camundongos machos e fêmeas foi usado na faixa etária de 8 a 14 semanas. Todos os camundongos pesavam aproximadamente 20 g. Detalhes dos animais, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais. O Arquivo Suplementar 1 contém a lista de abreviações.
1. Preparando o crânio para imagens e eletrofisiologia
- Anestesiar o animal em uma caixa de indução de isoflurano com 2%-3% de isoflurano em oxigênio a 100%, garantindo a profundidade adequada da anestesia sem vacilar com um beliscão da pata.
- Administre analgésicos pré-operatórios (buprenorfina de liberação lenta, 3,25 mg / kg, SQ) antes de colocar o animal em uma estrutura estereotáxica e mantenha a anestesia (isoflurano a 2%).
- Adicione pomada oftálmica e mantenha a temperatura corporal do animal com uma almofada de aquecimento com feedback de temperatura corporal.
- Raspe o cabelo acima do crânio onde ficará a incisão, descendo a linha média da fissura ocular até lambda.
- Remova o cabelo cortado antes de esterilizar a pele com um esfoliante anti-séptico e desinfetante e solução. Finalize com etanol a 70% e repita três vezes para garantir um local cirúrgico estéril.
- Usando uma lâmina de bisturi # 10, faça uma incisão na linha média de rostral para caudal, imediatamente seguida pela aplicação de cola de cianoacrilato de grau médico na incisão. Espalhe a pele lateralmente para expor o crânio.
- Adicione mais uma ou duas gotas de cola de cianoacrilato sobre o crânio para adicionar proteção adicional ao crânio.
NOTA: A aplicação de cola é sensível ao tempo, pois o crânio começará a ficar opaco quando exposto ao ar por mais de 10 s. Isso obscurecerá a visualização do DS por meio de métodos de imagem. - Enquanto a cola está secando, use uma tesoura cirúrgica estéril para aumentar o tamanho da incisão sobre o cerebelo. Assim que a cola estiver firme, comece a implantação dos eletrodos de parafuso do crânio.
- Esterilize os parafusos do crânio com um esterilizador de esferas por 20 a 30 s antes da implantação.
- Colocar os parafusos de crânio em uma região distante do local de iniciação do DS para manter uma janela visual aberta.
NOTA: Para gravações crônicas no córtex visual primário, são usados três parafusos de crânio. O primeiro parafuso é colocado aproximadamente a y = -6,00 mm da bregma, no cerebelo, servindo como eletrodo de referência. Os eletrodos de registro são posicionados em y = -2,79 mm do bregma e x = ±2,5 mm da linha média, nos hemisférios esquerdo e direito. - Com uma broca de 0,8 mm, faça furos piloto no crânio. Para garantir que não haja danos ao tecido subjacente, -0,5 mm em z é o ideal. Use parafusos #00-90 pré-soldados a pinos dourados com fio de aço inoxidável.
- Gire os parafusos para baixo no crânio.1.5-2 voltas completas farão com que o parafuso passe pelo crânio e entre em contato com a superfície cortical.
- Enrole o excesso de fio ao redor do parafuso, permitindo alguma folga no fio para colocação no cabeçote mais tarde.
- Usando os mesmos procedimentos, coloque os outros parafusos do crânio.
- Depois que todos os parafusos de caveira estiverem no lugar, conecte todos os pinos dourados no conector de cabeçote desejado. Segure o conector no lugar usando o braço estereotáxico e segure os pinos do conector acima das cabeças dos parafusos, garantindo que os fios não se toquem.
- Sele toda a área com cola de cianoacrilato, certificando-se de não interromper a área de imagem na frente dos parafusos do crânio.
- Construa cimento dental ao redor da base dos pinos de ouro, garantindo que os pinos de ouro dos parafusos do crânio não estejam conectados aos pinos de ouro no estágio principal.
- Deixe o cimento dentário curar antes de remover o conector do headstage.
- Remova o animal da estrutura estereotáxica e coloque-o de volta na gaiola para se recuperar. Siga os cuidados pós-operatórios padrão e mantenha os animais em uma almofada de aquecimento enquanto se recuperam da anestesia.
NOTA: Após a cirurgia, os animais foram alojados individualmente e monitorados quanto à dor diariamente. Siga as diretrizes institucionais locais para analgesia. Se estiver usando uma buprenorfina de liberação lenta, monitore a dor e, potencialmente, administre uma dose adicional em 72 h.
- Remova quaisquer objetos que possam prender nos eletrodos, incluindo alojamento e enriquecimento. Use roupas de cama padrão com acesso ad libium a alimentos e água.
NOTA: Permita um período de recuperação de dois dias entre a cirurgia e a gravação.
2. Detecção de despolarizações de espalhamento com imagens de sinal óptico intrínseco (iOS) e eletrofisiologia CA
- Anestesiar os animais com isoflurano a 2% em oxigênio a 100%.
NOTA: A parte de imagem deste procedimento deve levar ~ 5 min e a quantidade de exposição ao isoflurano deve ser consistente. - Coloque o animal em uma estrutura estereotáxica. Através do cone do nariz, mantenha 1%-2% de isoflurano em oxigênio.
NOTA: É fundamental manter a profundidade adequada da anestesia, pois o isoflurano é conhecido por reduzir os DSs. Recomenda-se manter 60-70 respirações/min durante todo o experimento. - Coloque o animal embaixo da câmera e certifique-se de que a câmera esteja focada na superfície cortical ajustando o anel de foco.
- Aplique óleo mineral na área de imagem para aumentar a transparência.
- Ligue os computadores, a placa de painel de LED e o equipamento de eletrofisiologia.
NOTA: A placa do painel de LED funciona melhor quando posicionada na frente do animal para iluminar a janela de imagem enquanto as luzes do teto estão apagadas. A luz foi ajustada para ~ 2.400 lux (95% de potência) com uma configuração de temperatura fria de 4000K. - Configuração de carregamento para iOS usando Micro-Manager19,20,21,22.
- Pressione Ao vivo para ver o mouse sob a câmera e centralizar o crânio do animal sob a câmera. Feche a janela "Ao vivo".
- Pressione Multi-D Acq.
- Na janela Aquisição multidimensional, selecione os pontos de tempo desejados.
NOTA: Recomenda-se uma contagem de 750 imagens em um intervalo de 250 ms. - Salve as imagens no caminho do arquivo desejado e no prefixo do nome.
- Conecte os pinos dourados do animal ao conector do headstage e depois ao headstage.
- Configuração de carga para o software Intan.
- Clique no ícone Escolher formato de arquivo e, na janela pop-up, selecione Um arquivo por formato de tipo de sinal. Isso salvará o arquivo como um ".dat" para uso posterior no MATLAB.
- Na guia BW em Largura de banda de hardware, selecione a largura de banda do amplificador de 0,13-500 Hz.
- Em Seletor de exibição de filtro, selecione WIDE para cobrir a mais ampla gama de sinais.
- Para selecionar o caminho do arquivo desejado para salvar, clique no ícone Selecionar nome do arquivo.
- Execute o impacto usando um impactador eletromagnético.
NOTA: As configurações do impactor são velocidade de impacto de 4 m/s e deflexão de 5 mm.- Ligue o impactor e certifique-se de que a ponta se retrai e se estende adequadamente, movendo o botão de 3 direções para retrair a ponta e estender a ponta. A ponta deve ser estendida antes de colocar o animal embaixo da ponta.
- Movendo-se rapidamente, coloque o animal em uma cama de espuma e deslize a cama por baixo da ponta.
- Alinhar a ponta do impactor na linha média e 1 mm rostral de bregma.
- Abaixe a ponta do impactor até que ela esteja firmemente encostada no topo da cabeça do animal.
NOTA: Não empurre a ponta para baixo na cabeça. - Empurre a alavanca para retrair a ponta do impactor e, em seguida, abaixe-a manualmente 5 mm antes de ativar a alavanca de impacto.
- Remova imediatamente o animal da cama de espuma e coloque-o embaixo da câmera para obter imagens dentro de 5 s, pois o SD é iniciado a partir do impacto.
- Inicie a imagem do iOS clicando em Adquirir! na janela Aquisição multidimensional. Imagem por 4 min para capturar todo o SD.
- Inicie a gravação de eletrofisiologia clicando no ícone Gravar no software Intan.
- Retire o animal da almofada de espuma e permita que o animal se recupere em uma arena aberta ou gaiola doméstica.
NOTA: Recomenda-se que a eletrofisiologia seja registrada por pelo menos 1 h para permitir que a função da rede cortical se recupere. - Após a conclusão da gravação, desconecte o animal do cabeçote e do conector e coloque-o de volta em sua gaiola.
NOTA: Recomenda-se permitir 24 horas entre cada impacto e a sessão de gravação. O animal pode permanecer em sua gaiola doméstica o tempo todo fora das sessões de gravação.
3. Visualização e quantificação de imagens iOS
- Em ImageJ19,20,21,22, abra a pilha de imagens clicando na sequência Arquivo > Importar > Imagem.
- Percorra manualmente as imagens para garantir a falta de movimento ou quaisquer outros artefatos.
- Para gerar o gráfico do SD, crie um ROI usando o cursor para desenhar um quadrado.
NOTA: Recomenda-se usar um quadrado de 30 x 30 pixels. Pode-se usar qualquer forma ou tamanho, mas certifique-se de que o tamanho do ROI não mude entre os animais. - Crie um gráfico clicando em Pilhas de > de imagem > Plotar perfil do eixo Z. No gráfico recém-criado, clique no botão ao vivo. Volte para a pilha de imagens do SD e mova o ROI até que o gráfico mostre a curva SD. O gráfico deve se parecer com uma onda de pecado com um aumento inicial seguido por uma queda abaixo da linha de base e um retorno lento à linha de base em alguns minutos.
NOTA: Os gráficos podem ser expressos como unidades arbitrárias (UA) ou como porcentagem de linha de base usando as primeiras imagens como a média da linha de base. - No gráfico gerado, clique em Lista para gerar uma lista de valores que podem ser plotados em outro software de geração de gráficos ou no Matlab.
- Para visualização, transforme a imagem em tons de cinza em uma tabela de pesquisa no ImageJ por Image > Lookup Tables > Fire.
4. Análise eletrofisiológica
NOTA: Recomenda-se que a experiência do laboratório de Buzsaki e seu código gerado pelo MATLAB sejam amplamente utilizados para visualizar e analisar dados de eletrofisiologia. A análise exigirá o download do MATLAB com um código de ativação institucional e o arquivo zip "Buzcode" do laboratório Buzsaki via GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).
- No software de eletrofisiologia Intan, certifique-se de que os dados brutos exportados sejam salvos no formato ".dat".
NOTA: O Matlab pode ser instalado a partir do site da MathWorks. Um código de ativação institucional ou individual é necessário para a compra e uso do Matlab. Alguma experiência anterior com a execução de código no Matlab é necessária para realizar esta análise. - Use a função de bz_LoadBinary de código Buzaki para carregar os dados no Matlab.
NOTA: Exemplo "'data' = bz_LoadBinary ('caminho completo do arquivo de dados', 'frequência', frequência de amostragem, nCanais, número de canais); - Filtre o ruído CA usando um filtro de entalhe centralizado em 60 Hz.
NOTA: Exemplo notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, dados); - Isole a atividade de alta frequência usando um filtro passa-banda com faixa de 0,5-100 Hz, de acordo com as recomendações do grupo COSBID para análise e visualização de despolarizações de espalhamento (SDs).
- Calcule o espectrograma de potência usando o comando pspectrum no MatLab.
- Para visualizar, plote o espectrograma de alta frequência e o espectrograma de potência na mesma escala de tempo e em uma coluna.
NOTA: A partir dos gráficos, haverá uma extensão da depressão de alta frequência e perda de potência.
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Resultados
Figura 1 ilustra uma representação gráfica da montagem experimental. Os parafusos cranianos de gravação são posicionados na córtex visual primária, com um eletrodo em parafuso craniano colocado no verme cerebelar como eletrodo de referência. Os parafusos cranianos e pinos de ouro são fixados ao crânio utilizando cola de cianocrilato e cimento dental. É fundamental limitar o cimento dental à região caudal do crânio para deixar espaço para o impacto e a imagem. A localização do impacto, centra...
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Discussão
A disseminação de despolarizações é crucial em vários modelos de doenças, incluindo traumatismo cranioencefálico (TCE), acidente vascular cerebral e enxaqueca1. A detecção precisa de DSs é essencial para entender seu papel nos déficits comportamentais agudos e/ou na ativação do sistema neuroimune após lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs)23,24. Para mitigar o risco de SDs ausentes ao usar um único método, uma abordagem multimétodo é n...
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Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo NIGMS P20GM109089 e pelo Departamento de Defesa PR200891 subsídios.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #00-90 x .118 Parafuso de Máquina | US Micro Parafuso | 00.90-118-M-SS-P, Amazon | |
| Broca de 0,8 mm de diâmetro | PCB Broca | WYTP21, Amazon | |
| 16-A Headstage | Intan | C3335 | |
| 2.1 mm Broca micro Fresas | Fine Science | 19007-21 | |
| Amplificador AC | Sistema | de gravação Intan RHD Mouses | |
| C57BL/6J | Laboratório Jackson | Jax#000664 | |
| Mightex | TCE-1304-U | ||
| Extensão de lente | Zeikos | ZE-ETN | |
| Ethiqa XR (Buprenorfina de liberação lenta) | Suprimentos Veterinários do Centro-Oeste | Número do Produto 267.10000.3 | |
| Pino do conector de ouro (fêmea) | A-M Systems | 520100 | |
| Pino do conector de ouro (macho) | A-M Systems | 520200 | |
| ImageJ2/Fiji | Image J | NA | |
| Impactor One | Leica | 39463930 | |
| Placa de painel de LED | Supon | L122t | |
| MATLAB | MathWorks | Código | |
| Cola de cianoacrilato de grau médico | MasterBond | MB287 | |
| Micro-Manager Camera Software | Image J | NA | |
| Broca de unhas / polidor | Makartt Broca de unhas Lixa de unha elétrica | JD700 | |
| Conectores Omnetic | Omnetics | A79014-001 | |
| RHX Software de Aquisição de Dados | Intan | NA | |
| Fio de aço inoxidável não revestido (0.005") | A-M Systems | 792800 | |
| Quadro Estereotáxico | Kopf Intruments | 1923-B | |
| Teets 'cura a frio' cimento dental | A-M systems | 525000, 526000 | |
| Lente da câmera XLR | Nikon | NIKKOR 50 mm f/1.8-16 |
Referências
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