Artigo de método

Fotobiomodulação sob controles eletroencefalográficos do sono para estimulação da remoção linfática de toxinas do cérebro de camundongos

DOI:

10.3791/67035

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28 de junho de 2024

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1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

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Este estudo apresenta a tecnologia não invasiva e portátil de fotobiomodulação transcraniana sob controle eletroencefalográfico para estimulação da remoção linfática de toxinas (por exemplo, beta-amiloide solúvel) do cérebro de camundongos machos BALB/c idosos e não anestesiados durante o sono profundo natural.

Resumo

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Os vasos linfáticos meníngeos (MLVs) desempenham um papel importante na remoção de toxinas do cérebro. O desenvolvimento de tecnologias inovadoras para a estimulação das funções do MLV é uma direção promissora no progresso do tratamento de várias doenças cerebrais associadas a anormalidades do MLV, incluindo doenças de Alzheimer e Parkinson, tumores cerebrais, lesões cerebrais traumáticas e hemorragias intracranianas. O sono é um estado natural quando os processos de drenagem do cérebro são mais ativos. Portanto, a estimulação da drenagem cerebral e dos MLVs durante o sono pode ter os efeitos terapêuticos mais pronunciados. No entanto, essas tecnologias comerciais não existem atualmente.

Este estudo apresenta uma nova tecnologia portátil de fotobiomodulação transcraniana (tPBM) sob controle eletroencefalográfico (EEG) do sono, projetada para fotoestimular a remoção de toxinas (por exemplo, beta amilóide solúvel (Aβ)) do cérebro de camundongos BALB/c envelhecidos com a capacidade de comparar a eficácia terapêutica de diferentes recursos ópticos. A tecnologia pode ser usada na condição natural de uma gaiola doméstica sem anestesia, mantendo a atividade motora dos camundongos. Esses dados abrem novas perspectivas para o desenvolvimento de fototecnologias não invasivas e clinicamente promissoras para a correção de alterações relacionadas à idade nas funções do MLV e nos processos de drenagem do cérebro e para a limpeza eficaz dos tecidos cerebrais de metabólitos e toxinas. Esta tecnologia destina-se tanto a estudos pré-clínicos das funções do cérebro adormecido quanto ao desenvolvimento de tratamentos clinicamente relevantes para doenças cerebrais relacionadas ao sono.

Introdução

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Os vasos linfáticos meníngeos (MLVs) desempenham um papel importante na remoção de toxinas e metabólitos dos tecidos cerebrais 1,2,3. O dano dos MLVs em várias doenças cerebrais, incluindo tumores, lesões cerebrais traumáticas, hemorragias e processos neurodegenerativos, é acompanhado por uma diminuição nas funções do MLV, levando à progressão dessas patologias 1,2,3,4,5,6 . Portanto, o desenvolvimento de métodos para a estimulação de MLVs abre novos horizontes no surgimento de tecnologias eficazes para o tratamento de doenças cerebrais. Recentemente, a tecnologia não invasiva para fotobiomodulação transcraniana eficaz (tPBM) foi proposta para estimular MLVs e remover toxinas como sangue e Aβ do cérebro 5,7,8,9,10,11,12. É interessante notar que o sono profundo é um fator natural para a ativação dos processos de drenagem linfática no cérebro 13,14. Com base nesse fato, é lógico supor que o tPBM dos MLVs durante o sono possa ter efeitos terapêuticos mais eficazes do que durante a vigília 9,11,12,15. No entanto, atualmente não existem tecnologias comerciais para tPBM durante o sono16. Além disso, experimentos com animais para estudar os efeitos terapêuticos do tPBM são realizados sob anestesia, o que é necessário para fornecer luz com precisão ao cérebro. No entanto, a anestesia afeta significativamente a drenagem do cérebro, o que reduz a qualidade dos resultados da pesquisa17.

Aβ é um produto metabólico da atividade neural normal18. Como foi estabelecido em neurônios corticais de ratos cultivados, Aβ é liberado deles em altas taxas para o espaço extracelular (2-4 moléculas/neurônio/s para Aβ)19. Há evidências de que a forma dissolvida de Aβ, localizada nos espaços extracelular e perivascular, é mais tóxica para os neurônios e sinapses20. O Aβ solúvel é rapidamente eliminado do cérebro humano durante 1-2,5 h21. Os MLVs são os túneis para a remoção do Aβ solúvel do cérebro 1,7 que diminui com a idade, levando ao acúmulo de Aβ no cérebro envelhecido 1,22. Há evidências de que anormalidades extracelulares dos níveis de Aβ no cérebro se correlacionam com o desempenho cognitivo no envelhecimento e estão associadas ao desenvolvimento da doença de Alzheimer (DA)23,24. Portanto, roedores idosos e idosos são considerados alternativas aos modelos transgênicos para o estudo da amiloidose, incluindo a DA25,26.

Este estudo apresenta uma tecnologia tPBM original e portátil sob controle eletroencefalográfico (EEG) do sono profundo ou de movimento ocular não rápido (NREM) em camundongos BALB/c machos não anestesiados de diferentes idades para estimular a depuração linfática de Aβ do cérebro para o sistema linfático periférico (os linfonodos cervicais profundos, dcLNs).

Protocolo

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Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório", Diretiva 2010/63/UE sobre a Proteção de Animais Usados para Fins Científicos e as diretrizes do Ministério da Ciência e Ensino Superior da Federação Russa (Nº 742 de 13.11.1984), que foram aprovadas pela Comissão de Bioética da Universidade Estadual de Saratov (Protocolo nº 7, 22.09.2022).

1. Montagem de hardware

  1. Corte um pedaço de papel alumínio com 1,5 mm de espessura nas dimensões de 1,5 mm x 2 mm. Esta parte será referida como placa de circuito impresso (PCB) de diodo emissor de luz (LED) (Figura 1C).
  2. Solde um LED a uma placa de circuito impresso, conforme mostrado na Figura 1.
  3. Solde dois fios de cobre trançados nos pinos de um LED e cubra-os com uma luva.
  4. Imprima o modelo 3D do quadro (Figura 1A); coloque um LED (Figura 1B) e ímãs (Figura 1D) na estrutura; coloque uma arruela (Figura 1E) na cabeça do mouse.
  5. Para montar o circuito (Figura 2), siga estas etapas.
    1. Primeiro, conecte o resistor (Figura 2; R1) entre um ânodo de LED e uma porta de 5 V no Arduino.
    2. Em seguida, conecte um cátodo de LED ao transistor de efeito de campo semicondutor de óxido metálico (MOSFET) (Figura 2; Q1) drenar. Em seguida, conecte a fonte MOSFET ao solo.
    3. Conecte o resistor pull-down (Figura 2; R2) entre a porta MOSFET e o solo. Por fim, conecte a porta MOSFET ao pino 3 do Arduino.
  6. Conecte uma blindagem do teclado da tela de cristal líquido (LCD) ao Arduino.
  7. Imprima os modelos 3D do estojo, a placa de cobertura e os botões. Insira a placa Arduino com blindagem do teclado LCD, MOSFET e conector de LED no gabinete, conforme mostrado na Figura 3.

2. Guia de software (Figura 4)

  1. Baixe o esboço do Arduino (arquivo .ino) e abra-o através do ambiente de desenvolvimento integrado (IDE) do Arduino (Arquivo de Codificação Suplementar 1).
  2. Selecione a porta de comunicação (COM) correta e atualize o firmware.
  3. A interface inclui duas colunas. Use os botões Esquerda e Direita para navegar entre essas colunas. O código de seleção está localizado à esquerda da coluna.
  4. A coluna da esquerda na tela é o campo de seleção do ciclo de trabalho de modulação por largura de pulso (PWM). Use os botões Para cima e Para baixo para ajustar o ciclo de trabalho. Atinja a dose de 10/20/30 Dj/cm2 de PBM com um ciclo de trabalho PWM correspondente de 2%/4%/6% em uma sessão de 17 minutos.
  5. A coluna da direita na tela é o campo RUN/Off. Para selecionar esta coluna, pressione o botão direito no teclado e, em seguida, pressione Selecionar. Quando o processo estiver em execução, o indicador de atividade piscará e o texto no botão EXECUTAR mudará para OFF.
    NOTA. Os camundongos são preparados para os experimentos durante um período de 10 dias, incluindo a implantação de eletrodos de EEG, implantação de um cateter crônico no ventrículo lateral direito para injeção de Aβ fluorescente e colocação de uma placa para PBM.

3. Implantação de um sistema de registro de EEG (Figura 5)

  1. Pese o camundongo e anestesieste-o com uma mistura de Zoletil 100 e xilanita (100 mg / kg; 10 mg / kg, respectivamente) por injeção intramuscular na coxa.
  2. Quando os reflexos de retirada do pé traseiro e a resposta de pinçamento da cauda cessarem, coloque o mouse em uma estrutura estereotáxica sobre uma almofada de aquecimento (Figura 5A).
  3. Aplique pomada oftálmica nas pálpebras para evitar o ressecamento dos globos oculares durante a cirurgia. Repita este procedimento sempre que necessário.
  4. Raspe a cabeça na área dos ossos nasais aos ossos occipitais usando uma máquina de barbear e esterilize a pele exposta primeiro com álcool.
  5. Usando uma tesoura de dissecação reta, corte o couro cabeludo, segure-o com uma micropinça, limpe o crânio da fáscia e seque-o com cotonetes. Se necessário, use os agentes hemostáticos.
  6. Usando uma broca com um diâmetro de 1,3 mm, faça 2 furos nos ossos temporais de cada lado ao longo das coordenadas: AP = -1 mm para o primeiro par de parafusos e AP = -3 mm para o segundo par de parafusos.
  7. Coloque os parafusos de EEG com fios condutores em álcool por 5 min. Em seguida, coloque os parafusos de EEG na solução salina.
  8. Coloque quatro parafusos prateados com eletrodos nos orifícios a uma profundidade de 1 mm (Figura 5B).
  9. Fixe os parafusos na superfície do crânio usando acrílico dental de forma que os eletrodos que se estendem deles fiquem localizados em direção ao nariz do animal (Figura 5C). Deixe o acrílico dental endurecer por 15 min.
  10. Conecte um sensor de gravação de EEG ao nariz do animal usando acrílico dental. Deixe o acrílico dental endurecer por 30 min (Figura 5D).
  11. Coloque os eletrodos EMG na parte de trás do músculo orbicular do olho usando uma pinça curva e fixe-os com o acrílico dental. Deixe o acrílico dental endurecer por 15 min (Figura 5E).
  12. Conecte os eletrodos de EEG ao recesso prateado do sensor e solde-os usando uma estação de solda. Em seguida, fixe os eletrodos de EEG usando o acrílico dental (Figura 5F).
  13. Após a cirurgia, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal até que o animal se recupere totalmente da anestesia.
  14. Em seguida, coloque o camundongo em uma gaiola doméstica individual com livre acesso a comida e água com ibuprofeno (40 mg/kg em 200 mL de água) para analgesia após a cirurgia por 10 dias.

4. Implantação de uma placa para PBM

  1. Pese o camundongo e anestesize-o com uma mistura de Zoletil 100 e xilanita (100 mg / kg; 10 mg / kg, respectivamente) por injeção intramuscular na coxa 7 dias após a implantação do sistema de registro de EEG.
  2. Quando os reflexos de retirada do pé traseiro e a resposta de pinça da cauda cessarem, fixe o mouse em um sistema estereotáxico.
  3. Aplique pomada oftálmica nas pálpebras para evitar o ressecamento dos globos oculares durante a cirurgia. Repita este procedimento sempre que necessário.
  4. Fixe uma placa de metal com um diâmetro de 5 mm no osso occipital do crânio usando acrílico dental e pinça Dumont. Deixe o acrílico dental endurecer por 15 min (Figura 6).

5. Preparação de um cateter crônico

  1. Marque na agulha de insulina um segmento a 2 cm do lado da extremidade chanfrada.
  2. Fixe a agulha de insulina no porta-agulha do lado da ponta chanfrada até o segmento marcado.
  3. Coloque um cateter de polietileno PE-2 de 10 cm em todo o comprimento restante da agulha.
  4. Encha o cateter com uma solução salina e cubra-o com uma tampa plástica para selá-lo.

6. Implantação de cateter crônico no ventrículo lateral direito

  1. Após o implante da placa para PBM, fazer um orifício de trepanação nas coordenadas AP = -0,5 mm e ML = 1,2 mm, com diâmetro de 1,5 mm, usando uma broca.
  2. Coloque o cateter de polietileno PE-10 em um suporte estereotáxico e insira-o no crânio do camundongo (VD = 2 mm). Depois, fixe-o usando o acrílico dental. Deixe o acrílico dental endurecer por 15 min (Figura 7).
  3. Após a cirurgia, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal até que o animal se recupere totalmente da anestesia.
  4. Em seguida, coloque o camundongo em uma gaiola doméstica individual com livre acesso a comida e água com ibuprofeno (40 mg/kg em 200 mL de água) para analgesia após a cirurgia por 10 dias.

7. tPBM sob controle de EEG do sono NREM

  1. Conecte qualquer sistema comercial de gravação de EEG ao conector na cabeça do mouse e defina o valor necessário do ciclo de trabalho PWM.
  2. Monitore o sinal de EEG e aguarde a atividade do ritmo delta. Se o sono NREM for observado, inicie o processo de PBM e interrompa o processo se o sono NREM fizer a transição para o sono REM ou vigília de movimento rápido dos olhos. A dose aumenta a cada interação até atingir o valor necessário.
  3. Quando a dose de PBM necessária é obtida, a sessão termina.

8. Imagem confocal da remoção linfática de Aβ do cérebro de camundongo

  1. Conecte um cateter de 10 cm a uma agulha de insulina.
  2. Usando uma seringa Hamilton com uma agulha de 29 G, prepare uma infusão de beta-amilóide fluorescente (FAβ) em um volume de 5 μL no cateter. Deixe o cateter permanecer em uma seringa Hamilton.
  3. Fixe a mão do mouse e conecte o cateter através de uma agulha ao cateter crônico implantado.
  4. Conecte o cateter a um microinjetor. Depois, coloque o mouse em uma caixa individual;
  5. Selecione a taxa de injeção de 0,1 μL/min no menu do microinjetor e pressione o botão Iniciar.
  6. Fazer a injeção de FAβ no ventrículo lateral direito.
  7. Após a administração de FAβ, faça PBM usando um LED por 61 min seguindo o algoritmo: 17 min - luz e 5 min - pausa por 61 min.
  8. Após o PBM, injete por via intravenosa qualquer marcador para rotular os vasos cerebrais através da cauda.
  9. Após a injeção, eutanasiar camundongos usando a câmara de eutanásia CO2 .
  10. Usando uma tesoura afiada e reta, faça uma pequena incisão transversal na pele ao longo da traqueia, segurando a pele com uma pinça reta e não afiada.
  11. Faça uma incisão longitudinal ao longo de todo o comprimento do pescoço usando uma tesoura reta.
  12. Usando uma pinça curva, pegue as glândulas salivares e separe-as cuidadosamente do tecido conjuntivo. Coloque um afastador de ferida na seção aberta da incisão e fixe-o de forma a empurrar para trás os tecidos circundantes.
  13. Examine a área entre a traqueia e o músculo cleidomastóideo usando duas pinças curvas de ambos os lados do pescoço.
  14. Quando o linfonodo cervical profundo (dcLN) for detectado em cada lado, retire os dcLNs usando uma pinça reta com pontas rombas e corte-o do tecido conjuntivo.
  15. Coloque dcLNs em uma placa de Petri com uma solução salina e cubra-os com vidro de cobertura orientado horizontalmente (25 mm × 50 mm × 0,17 mm).
  16. Use qualquer microscópio confocal comercial para obter imagens de dcLNs inteiros.

9. Análise de Aβ nos lisados dos tecidos cerebrais

  1. Preparar as amostras para o ensaio.
    1. Eutanásia de camundongos usando a câmara de eutanásia de CO2 .
    2. Decapite o rato, remova a pele de sua cabeça e remova os músculos do crânio.
    3. Faça duas incisões com uma tesoura reta e afiada do grande forame occipital até o canal auditivo.
    4. Usando uma pinça reta, separe a parte ventral do crânio, o osso occipital e os ossos que formam as cavidades do ouvido médio.
    5. Usando uma pinça, separe o cérebro dos ossos parietal e frontal.
    6. Usando uma tesoura reta, remova a mandíbula superior e corte os bulbos olfatórios.
    7. Coloque o cérebro na solução fisiológica.
    8. Enxágue o cérebro em solução salina tamponada com fosfato frio para remover completamente o excesso de sangue e pese antes da homogeneização.
    9. Preparar um tampão de lise pH 7,2 contendo 1,5 mm de KH2PO4, 8 mm de Na,2HPO4, 3 mm de KCl, 137 mm de NaCl e 0,1% de Tween20, 10 mM de EDTA com uma mistura inibidora de protease recentemente preparada.
    10. Homogeneizar o cérebro em tampão de lise fresco (1 mL de tampão de lise para amostra de tecido de 200-500 mg) com um homogeneizador de vidro em gelo.
    11. Sonicar uma suspensão resultante com um disruptor de células ultrassônico até que a solução seja clarificada.
    12. Centrifugue os homogeneizados a 10.000 × g por 5 min.
    13. Recolher o sobrenadante utilizando uma pipeta mecânica monocanal (100-1000 μl) e dosear imediatamente ou alíquota e conservar a ≤-20 °C.
  2. Prepare os seguintes materiais: leitor de microplacas com filtro de 450 nm ± 10 nm; tubos de microcentrífuga; pipetas monocanal ou multicanal com pontas descartáveis e de alta precisão; papel absorvente para borrar a microplaca; recipiente para solução de lavagem; 0,01 mol/L (ou 1x) solução salina tamponada com fosfato (PBS); e água deionizada ou destilada.
  3. Prepare os reagentes.
    1. Leve os componentes do kit e as amostras à temperatura ambiente (RT; 18-25 °C) antes de usar.
    2. Reconstitua o padrão com 1,0 mL de diluente padrão, mantenha por 10 min em RT e agite suavemente (para não espumar). A solução padrão é de 300 pg/mL. Preparar 5 tubos contendo um volume de 0,6 ml de diluente-padrão e fazer uma série de diluições triplas.
    3. Configure 5 pontos (300 pg/mL, 100 pg/mL, 33,33 pg/mL, 11,11 pg/mL e 3,70 pg/mL) do padrão diluído e os últimos tubos com o branco contendo apenas o diluente padrão (0 pg/mL).
    4. Reduza rapidamente as soluções de estoque do reagente de detecção A e do reagente de detecção B antes de usar. Dilua-os 100 vezes com o diluente de ensaio A e B para preparar a concentração de trabalho.
    5. Diluir 20 mL da solução de lavagem concentrada (30x) com 580 mL de água deionizada ou destilada para fazer 600 mL de solução de lavagem (1x).
    6. Aspire a dose necessária da solução com pontas esterilizadas e não despeje a solução residual no frasco novamente.
  4. Execute o ensaio.
    1. Determine os poços para um padrão diluído, branco e amostra.
    2. Prepare 5 poços para pontos padrão e um poço para blank.
      1. Adicione 50 μL de diluições padrão, em branco e de amostra nos poços correspondentes, respectivamente. Em seguida, adicione 50 μL de reagente de detecção A a cada poço imediatamente.
      2. Agite a placa suavemente (recomenda-se um agitador de microplacas) e cubra-a com um selador de placas. Incubar a placa a 37 °C durante 1 h. O reagente de detecção A pode parecer turvo. Aqueça a solução em RT e misture delicadamente até que fique uniforme.
    3. Aspire a solução e lave cada poço com 350 μL de 1x solução de lavagem com a ajuda de um frasco de esguicho, pipeta multicanal, dispensador de coletor ou lavadora automática. Deixe o prato intacto por 1-2 min. Encaixe a placa em papel absorvente para remover completamente o líquido restante de todos os poços. Repita este procedimento 3 vezes.
    4. Após a última lavagem, aspire ou transvase qualquer tampão de lavagem restante. Assegure a remoção completa da solução de lavagem invertendo a placa e enxugando-a contra o papel absorvente.
    5. Adicione 100 μL de solução de trabalho do reagente de detecção B a cada poço e incube a placa por 30 min a 37 °C após cobri-la com o selador de placas.
    6. Repita as etapas de aspiração/lavagem por um total de 5 min.
    7. Adicione 90 μL de solução de substrato a cada poço e cubra a placa com um novo selador de placas. Incubar durante 10-20 min a 37 °C (não exceder 30 min) protegido da luz. Depois de adicionar a solução de substrato, o líquido ficará azul.
    8. Adicione 50 μL de uma solução de parada a cada poço para encerrar a reação. Adicionar a solução de parada tornará o líquido amarelo. Bata no prato de lado para misturar o líquido. Se a mudança de cor for inconsistente, bata suavemente na placa para garantir uma mistura completa.
    9. Garanta a remoção completa de água e impressões digitais na parte inferior da placa e nenhuma formação de bolhas na superfície do líquido. Em seguida, leia a placa em um leitor de microplacas a 450 nm imediatamente.
  5. Calcule os resultados.
    1. Determine a média das leituras duplicadas para cada padrão, controle e amostra. Traçar uma curva padrão com o log da concentração de Aβ 1-42 no eixo y e da absorvância no eixo x.
    2. Desenhe uma curva de melhor ajuste através dos pontos, que pode ser determinada pela análise de regressão.
    3. Se forem utilizadas amostras diluídas, multiplicar a concentração obtida a partir da curva-padrão pelo factor de diluição.
      NOTA: Para o ELISA, foi utilizado um kit para determinação de Aβ 1-42 neste estudo.

Resultados

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Na primeira etapa, o estudo se concentrou em estabelecer a dose de luz efetiva (um LED de 1050 nm) para estimulação da remoção linfática de Aβ fluorescente do cérebro para dcLNs em camundongos BALB/c machos adultos acordados (2-3 meses de idade, 26-29 g). As doses de luz foram selecionadas aleatoriamente como 10 J/cm2, 20 J/cm2 e 30 J/cm2 com base em nossos estudos anteriores sobre os efeitos do tPBM na remoção de diferentes corantes e glóbulos vermelhos do cérebro 7,8,9,10,11,12. Os resultados da imagem confocal apresentados na Figura 8A-E demonstram claramente os efeitos relacionados à dose do tPBM na remoção linfática de Aβ fluorescente do cérebro para dcLNs. A dose de luz de 30 J/cm2 foi determinada como a mais eficaz em comparação com as doses de luz de 10 J/cm2 e 20 J/cm2 devido a uma maior intensidade de um sinal fluorescente de Aβ em dcLNs.

Na segunda etapa, a pesquisa teve como objetivo encontrar os comprimentos de onda mais eficazes para a eliminação linfática de Aβ fluorescente do cérebro de camundongos machos BALB/c adultos (2-3 meses de idade, 26-29 g) acordados usando as plataformas fotográficas portáteis com os diferentes comprimentos de onda de luz (880 nm, 1050 nm, 1300 nm) e modos (1050 nm em regimes contínuos e de pulso) com uma mesma dose (30 J/cm2). A Figura 9A-E mostra os resultados da imagem confocal dos dcLNs nos grupos testados. Os resultados revelaram que o comprimento de onda da luz de 1050 nm no modo de pulso vs. outros comprimentos de onda testados (880 nm e 1300 nm) e o comprimento de onda de 1050 nm em regime contínuo causaram uma remoção significativamente maior de Aβ fluorescente do cérebro para dcLNs.

Na etapa final, foram estudados os efeitos de um LED de 1050 nm em modo de pulso sobre o nível de Aβ solúvel no cérebro de camundongos idosos antes e após o curso de 10 dias de tPBM sob controle de EEG de NREM e vigília. A análise do imunoensaio revelou que o conteúdo solúvel de Aβ no cérebro foi significativamente maior em camundongos BALB/c machos envelhecidos (16-18 meses de idade, 30-33 g) em comparação com camundongos BALB/c machos adultos (2-3 meses de idade, 26-29 g). O curso de 10 dias de tPBM durante o sono profundo, mas não enquanto acordado, reduziu efetivamente o nível de Aβ solúvel no cérebro de camundongos idosos para o nível de Aβ solúvel no cérebro de camundongos adultos (Figura 10).

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Figura 1: Processo de montagem de hardware. (A) moldura impressa em 3D, (B) LED, (C) placa de circuito impresso LED, (D) ímãs, (E) arruela metálica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Circuito de controle de LED. R1 - resistor de regulação de corrente, R2 - resistor pull-down para a porta MOSFET, Q1 - MOSFET de canal n. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Exibição 3D da caixa. (A) Placa de cobertura impressa em 3D, (B) botões impressos em 3D, (C) Proteção do teclado LCD para Arduino, (D) Arduino, (E) Estojo impresso em 3D, (F) Conector de LED, (G) MOSFET de canal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Software. (A) Botão de seleção, (B) Botão esquerdo , (C) Botão para cima/para baixo , (D) Botão direito , (E) Indicador de seleção, (F) Campo de seleção do ciclo de trabalho PWM, (G) Campo RUN/OFF . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Implantação de um sistema de registro de EEG. (A) Preparo do crânio; (B) Implantação de parafusos; (C) Fixação de parafusos com o acrílico dentário; (D) Fixação do sensor de registro de EEG; (E) Implantação e fixação dos eletrodos EMG na parte posterior do músculo orbicular do olho; (F) Os eletrodos soldados ao recesso prateado do sensor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Fixação de uma placa para PBM no osso occipital do crânio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Implante de um cateter crônico no ventrículo lateral direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Os efeitos de diferentes doses de LED 1050 nm na remoção linfática de Aβ fluorescente do cérebro para dcLNs. (A-D) Imagens representativas de dcLNs do grupo controle (A) e do grupo PBM com (B) 10 J/cm2, (C) 20 J/cm2 e (D) 30 J/cm2; (E) Análise quantitativa do acúmulo de Aβ fluorescente em dcLNs dos grupos testados (n = 8, ANOVA de uma via com teste post hoc de Duncan, ** p < 0,01, * p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Os efeitos de diferentes comprimentos de onda de LED na remoção linfática de Aβ fluorescente do cérebro para dcLNs. (AD) Imagens representativas de dcLNs do grupo PBM com modo de impulso 1050 nm (ImpMode_1050, A), 880 nm (ImpMode_880, B), 1300 nm (ImpMode_1300, C) e modo contínuo 1050 nm (ContMode_1050 nm, D); (E) Análise quantitativa do acúmulo de Aβ fluorescente em dcLNs dos grupos testados (n = 8, ANOVA de uma via com teste post hoc de Duncan, ** p < 0,01). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10: Os efeitos do PBM (LED 1050 nm no modo de impulso, 30 J / cm2) durante o NREM e o estado de vigília no nível de Aβ solúvel (pg / mL) em cérebros de camundongos adultos e idosos. Uma ANOVA de uma via com teste post hoc de Duncan, **p < 0,01, *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Codificação suplementar File 1: lcd1key.ino Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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Os MLVs são um alvo importante para o desenvolvimento de tecnologias inovadoras para modulação da drenagem cerebral e remoção de detritos e resíduos celulares do cérebro, especialmente em idosos cuja função MLV diminui 1,22. Em um estado homeostático, o sono profundo está associado à ativação natural da limpeza do tecido cerebral13,14. Portanto, é óbvio esperar que a estimulação de MLVs durante o sono profundo seja mais eficaz do que durante a vigília15,16. A nova tecnologia não invasiva e portátil de tPBM sob controle de EEG do sono para estimulação da remoção linfática de Aβ solúvel do cérebro de camundongos machos idosos é apresentada aqui.

O pequeno tamanho da plataforma fotográfica (7 mm x 11 mm) e seu peso leve (1 g) permitem que ela seja montada com firmeza e segurança nas cabeças dos camundongos, mantendo sua atividade motora natural. Isso também elimina a necessidade de usar anestesia durante o tPBM. O tPBM durante o sono profundo pode ser realizado usando qualquer dispositivo comercial para um controle de EEG dos estágios do sono. Assim, nossa tecnologia permite realizar o estudo em uma gaiola doméstica, preservando as condições mais naturais para os animais.

Na primeira etapa, um comprimento de onda de LED de 1050 nm foi selecionado aleatoriamente para o estudo da dose efetiva de fotoefeitos na remoção linfática de Aβ fluorescente do cérebro para dcLNs em camundongos adultos acordados (2-3 meses de idade). A escolha deste comprimento de onda está relacionada aos dados anteriores sobre a estimulação efetiva de MLVs com um laser de 1267 nm 8,10,27,28,29,30,31,32,33,34. Esse comprimento de onda promove a geração direta do oxigênio singlete em pequenas quantidades no tecido cerebral e em suas meninges, que é um dos mecanismos subjacentes ao PBM dos MLVs 8,28,34. No entanto, os efeitos biológicos de um laser de 1267 nm e de um LED de 1050 nm estão relacionados à geração de excitação de oxigênio singlete35. De fato, as bandas de um laser de 1267 nm ± 20 nm e um LED de 1065 nm ± 15 nm estão relacionadas à formação do oxigênio singlete a partir do estado fundamental de uma molécula de oxigênio. Uma banda de um laser de 1267 nm bombeia uma molécula de oxigênio diretamente para o primeiro estado singleto excitado, enquanto uma banda de LED de 1065 nm corresponde à energia vibracional adicional, que decai muito rápido, liberando calor para o ambiente. Além disso, a absorção de água no comprimento de onda de 1065 nm é dez vezes menor do que no comprimento de onda de 1267 nm, o que o torna mais favorável para pesquisas biológicas35. Além disso, um LED de 1050 nm está disponível comercialmente no mercado e muito mais barato em comparação com o raro e caro laser de 1267 nm. Observe que a banda de emissão de um LED de 1050 nm usado neste estudo tinha 40 nm de largura e se sobrepõe apenas parcialmente a uma banda singlete de oxigênio. No entanto, demonstramos o efeito significativo do tPBM na remoção linfática de Aβ fluorescente do cérebro para dcLNs usando um LED de 1050 nm (30 J / cm2). A dose de luz de 30 J/cm2 foi determinada como a mais eficaz em comparação com as doses de luz de 10 J/cm2 e 20 J/cm2 com base na maior intensidade de um sinal fluorescente de Aβ em dcLNs. Assim, um LED de 1050 nm pode ser muito útil para a aplicação da técnica tPBM em humanos, o que é consistente com a tendência comum de usar LEDs em vez de lasers para PBM36,37.

Na segunda etapa, a pesquisa teve como objetivo responder à questão de quais comprimentos de onda de luz são mais eficazes para a eliminação linfática de Aβ fluorescente do cérebro de camundongos adultos acordados. Esta etapa do estudo foi realizada utilizando uma plataforma fotográfica portátil com diferentes comprimentos de onda de luz (880 nm, 1050 nm, 1300 nm) e modos (1050 nm em regimes contínuo e de pulso) com a mesma dose (30 J/cm2). Esses comprimentos de onda foram escolhidos devido ao uso generalizado na prática clínica para tPBM (880 nm) e novos LEDs caros (1300 nm), que poderiam ser clinicamente significativos. Além disso, foram comparados os modos pulsado e contínuo apenas para o LED de 1050 nm como recurso luminoso. Esses dados demonstram claramente que apenas um LED de 1050 nm no modo de pulso vs. outros comprimentos de onda e o de 1050 nm no modo contínuo causa uma remoção linfática significativa de Aβ do cérebro para dcLNs. Esses resultados são consistentes com os achados de outros pesquisadores, que também indicam a vantagem de usar um PBM pulsado para alcançar efetivamente efeitos biológicos 38,39,40.

Na etapa final, quando o comprimento de onda, a dose e o modo efetivos foram selecionados, foi realizado o estudo dos efeitos de um LED de 1050 nm no modo de pulso sobre o nível de Aβ solúvel no cérebro de camundongos idosos antes e após o curso de 10 dias de tPBM sob controle de EEG de NREM e vigília. A análise do imunoensaio revelou que o conteúdo solúvel de Aβ no cérebro foi significativamente maior em camundongos idosos (16-18 meses de idade) em comparação com camundongos adultos (2-3 meses de idade). É interessante notar que o curso de 10 dias de tPBM durante o sono profundo, mas não durante a vigília, reduziu efetivamente o nível de Aβ solúvel no cérebro de camundongos idosos para o nível de Aβ solúvel no cérebro de camundongos adultos. Um aumento no conteúdo de Aβ no tecido cerebral de camundongos e ratos saudáveis com a idade também foi observado em outros estudos25,26, o que pode estar associado a uma diminuição relacionada à idade nas funções do MLV, levando à limpeza ineficaz do tecido cerebral dessa proteína tóxica 1,22. O tPBM mais eficaz de remoção de Aβ solúvel do tecido cerebral em camundongos adormecidos em comparação com os acordados pode ser explicado pela ativação natural da drenagem do tecido cerebral durante o sono. A morfologia do MLV muda significativamente com a idade, levando à redução da remoção linfática de metabólitos do cérebro envelhecido22. No entanto, o tPBM durante o sono ajuda a restaurar a remoção linfática de Aβ solúvel do tecido cerebral de camundongos idosos ao nível de animais adultos.

Considerando a dispersão da energia luminosa ao passar pelo crânio, o tPBM limita seus efeitos apenas em MLVs sem penetrar profundamente nos tecidos cerebrais. No entanto, apesar de os vasos linfáticos ainda não terem sido encontrados diretamente nos tecidos cerebrais de humanos e animais, estão surgindo evidências crescentes indicando a presença do sistema linfático cerebral 41,42,43,44. Isso explica os resultados que mostram a remoção de toxinas (sangue e Aβ) das estruturas profundas do cérebro (o sistema ventricular, o hipocampo) para MLVs e mais para a periferia (dcLNs)5,7. Ao longo de um século, o conhecimento se acumulou, indicando uma estreita conexão entre a drenagem do cérebro e o sistema linfático periférico45. Mesmo na ausência de uma rede linfática geralmente reconhecida no sistema nervoso central, há fatos que indicam a remoção linfática de macromoléculas das partes profundas do cérebro para a periferia 1,2,3,4,5,6,7 Isso também explica por que o tPBM, agindo apenas sobre os MLVs, estimula a depuração do sangue e do Aβ do cérebro 5, 7.

Em resumo, este estudo apresenta uma tecnologia portátil de tPBM sob controle de EEG do sono projetada para fotoestimular a remoção de toxinas usando o exemplo do Aβ solúvel do cérebro de camundongos idosos com a capacidade de comparar a eficácia terapêutica de diferentes recursos ópticos. A tecnologia pode ser usada na condição natural de uma gaiola doméstica sem anestesia, mantendo a atividade motora natural dos camundongos. Esses dados abrem novas perspectivas para o desenvolvimento de fototecnologias não invasivas e clinicamente promissoras para corrigir alterações relacionadas à idade nas funções do MLV e nos processos de drenagem do cérebro e para a limpeza eficaz dos tecidos cerebrais de metabólitos e toxinas. A tecnologia proposta para fotoestimulação da drenagem do cérebro e remoção linfática de toxinas do cérebro tem efeitos limitados nos MLVs devido à dispersão da energia luminosa ao passar pelo crânio. Portanto, a tecnologia pode ser usada para desenvolver novos métodos para o tratamento de doenças cerebrais associadas à disfunção do MLV. Os fotoefeitos estimulantes mais pronunciados nos MLVs são observados no sono profundo (NREM), que requer o uso de PBM sob controle de EEG. Isso cria certas dificuldades (técnicas, de programação) para o controle simultâneo do início do sono profundo e do fornecimento de exposição à luz.

Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Fundação Russa de Ciência (nº 23-75-30001).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,1% Tween20Helicon,  RússiaSB-G2009-100ML
CatheterScientific Commodities Inc., EUAPE-10, 0,28 mm ID × 0,61 mm OD
CO2 câmaraBinder, AlemanhaCB-S 170
Microscópico confocalNikon, JapãoA1R MP
Acrílico dentalZermack, Polônia-RússiaVillacryl S, V130V4Z05
DrillForedom, RússiaSR W-0016
Pinça DumontStoelting, EUA52100-07
Evans Blue dyeSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA206334
HamiltonHamilton Bonaduz AG, Suíça29 G agulha
IbuprofenoSintez OJSC, RússiaN/A  Medicamento analgésico
Agulha de insulinaINSUPEN, Itália31 G, pomada antibacteriana Levomekol de 0,25 mm x 6 mm
NizhpharmD06C Para uso externo na dose de 40 mg/g, 1 vez por dia
Micro fórcepsStoelting, EUA52102-02P
MicrocentrífugaGyrozen, Coreia do SulGZ-1312
MicroinjetorStoelting, EUA53311
Pinça não afiadaStoelting, EUA52108-83P
Sistema PINNACLEPinnacle Technology, EUA8400-K3-SLSistema para gravação de EEG (2 canais) e EMG (1 canal) de ratos
Máquina de barbearBraunSeries 3310s
Pipetas monocanal e multicanalEppendorf, ÁustriaEpp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Cloreto de sódioKraspharma, RússiaN/A
Estação de soldaAOYUE, ChinaN/A
Quadro estereotáxicoStoelting, EUA51500
Tesoura de dissecação retaStoelting, EUA52132-10P
TetraciclinaJSC Tatkhimfarmpreparaty, RússiaN/APinça de pomada para os olhos
Stoelting, EUA52100-03
Disruptor celular ultrassônicoBiobase, ChinaUSD-500
Afastador de feridasStoelting, EUA52125
XylanitNita-Farm, RússiaN/ARelaxante muscular
Zoletil 100Virbac Sante Animale, FrançaN/AAnestesia geral

Referências

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