Metodologia para Estudo das Interações dos Receptores de Membrana da Vitamina A e da Proteína Opsina com seus Ligantes na Geração da Proteína Retinilideno

Resumo

Aqui, descrevemos dois métodos quantitativos para estudar as interações proteína-ligante dos receptores de membrana da vitamina A e da opsina fotorreceptora com seus respectivos ligantes fisiológicos.

Resumo

A distribuição de vitamina A / retinol totalmente trans (ROL) em todo o corpo é fundamental para manter a função retinóide nos tecidos periféricos e gerar a proteína retinilideno para a função visual. RBP4-ROL é o complexo de ROL com a proteína de ligação ao retinol 4 (RBP4), que está presente no sangue. Dois receptores de membrana, o receptor 2 da proteína de ligação ao retinol 4 (RBPR2) no fígado e estimulado pelo retinol 6 retinol (STRA6) no olho, ligam-se ao RBP4 circulatório e esse mecanismo é crítico para internalizar o ROL nas células. O estabelecimento de métodos para investigar a cinética receptor-ligante é essencial para entender a função fisiológica dos receptores de vitamina A para a homeostase retinóide. Usando ensaios de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR), podemos analisar as afinidades de ligação e os parâmetros cinéticos dos receptores de membrana da vitamina A com seu ligante fisiológico RBP4.

Essas metodologias podem revelar novas informações estruturais e bioquímicas dos motivos de ligação a RBP4 em RBPR2 e STRA6, que são críticos para a compreensão dos estados patológicos de deficiência de vitamina A. No olho, o ROL internalizado é metabolizado em retinal 11-cis, o cromóforo visual que se liga à opsina nos fotorreceptores para formar a proteína retinilideno, rodopsina. A absorbância da luz causa a isomerização cis-para-trans da retina 11-cis, induzindo alterações conformacionais na rodopsina e a subsequente ativação da cascata de fototransdução. A diminuição das concentrações de ROL sérico e ocular pode afetar a formação da proteína retinilideno, que por sua vez pode causar localização incorreta da rodopsina, acúmulo de apoproteína opsina, cegueira noturna e degeneração do segmento externo dos fotorreceptores, levando à retinite pigmentosa ou amaurose congênita de Leber.

Portanto, metodologias espectrofotométricas para quantificar o complexo retiniano opsina-11-cis acoplado ao receptor acoplado à proteína G na retina são críticas para a compreensão dos mecanismos de degeneração das células da retina nos estados patológicos acima mencionados. Com essas metodologias abrangentes, os investigadores poderão avaliar melhor o suprimento de vitamina A na dieta na manutenção da homeostase retinóide sistêmica e ocular, que é crítica para gerar e manter as concentrações de proteína retinilideno nos fotorreceptores, o que é crítico para sustentar a função visual em humanos.

Introdução

A vitamina A / retinol totalmente trans / ROL obtido na dieta é um componente importante que desempenha um papel na função visual ^1,2. O cromóforo 11-cis retinal, um metabólito da vitamina A da dieta, liga-se à opsina do receptor acoplado à proteína G (GPCR) para gerar a proteína retinilideno, rodopsina, nos fotorreceptores. Quando a luz incide sobre o olho, a configuração da rodopsina sofre uma mudança fundamental por meio da conversão de seu componente 11-cis-retinal para o totalmente trans-retiniano. Essa mudança de configuração desencadeia uma cascata de fototransdução dentro dos fotorreceptores dos bastonetes, convertendo a luz em um sinal elétrico, que é transmitido ao córtex visual no cérebro através do nervo óptico 3,4,5,6,7,8,9,10 . Concentrações diminuídas de ROL sérico e ocular podem afetar a formação da proteína retinilideno, que por sua vez causa localização incorreta da opsina, acúmulo de apoproteína opsina, cegueira noturna e degeneração do EO dos fotorreceptores, levando à Retinite Pigmentosa ou Amaurose Congênita de Leber, que pode causar cegueira ^3,10.

O retinol totalmente trans é a forma de transporte fundamental da vitamina A na dieta e é a fonte da qual todos os retinóides funcionais e metabólitos da vitamina A da dieta são derivados. O fígado serve como o principal órgão para o armazenamento de vitamina A na dieta. O retinol hepático é transportado através do soro como seu complexo com a proteína 4 de ligação ao retinol (RBP4). A RBP4, expressa principalmente no fígado, forma um holocomplexo com o substrato retinol e transtirretina (TTR), que entra na circulação 11,12,13,14,15,16,17. O relato de um receptor de superfície celular para RBP4 na década de 1970 levou à hipótese de proteínas de transporte de membrana auxiliando no transporte de retinóides para dentro e para fora das células. O receptor de superfície celular para retinol ligado a RBP4 (RBP4-ROL) foi identificado como estimulado pelo retinol de ácido retinóico 6 (STRA6) no epitélio pigmentar da retina (EPR) do olho. O STRA6 se liga ao complexo holo-RBP4 circulatório e transporta o retinol ligado ao RBP4 através do EPR para ser utilizado pelos fotorreceptores^18,19. Mutações no STRA6 podem levar a uma miríade de doenças e fenótipos associados a concentrações reduzidas de ROL ocular. Mutações STRA6 durante o desenvolvimento podem levar a anoftalmia, microftalmia e outros sintomas não oculares que se sobrepõem aos fenótipos associados à síndrome de Matthew-Wood 20,21,22,23,24,25,26,27. O STRA6 é expresso em diferentes órgãos e tecidos, como o EPR no olho, mas não em todos os tecidos^26,27. Embora o local primário de armazenamento de retinóides seja o fígado, o STRA6 não é expresso no fígado.

Alapatt e colegas descobriram que o receptor 2 da proteína de ligação ao retinol 4 (RBPR2) se ligava ao RBP4 com alta afinidade e era responsável pela captação de retinol ligado ao RBP4 no fígado, semelhante ao STRA6 no RPE²⁸. Foi relatado que RBPR2 compartilha homologia estrutural com STRA6 29,30,31. Propõe-se que RBP4 se ligue aos resíduos S294, Y295 e L296 em RBPR2, um domínio de ligação a aminoácidos parcialmente conservado entre RBPR2 e STRA6 também 29,30,31. A partir desses estudos, propõe-se que os receptores de membrana da vitamina A, como STRA6 e RBPR2, que contêm um ou mais resíduos/domínios de ligação extracelular, interajam com o RBP4-ROL circulatório. Os receptores de membrana, portanto, desempenham um papel importante na ligação do receptor ao RBP4 circulatório para internalização do ROL nos tecidos-alvo, como o fígado e o olho.

Na primeira parte deste estudo, utilizamos a Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) para investigar a interação de dois receptores de membrana de vitamina A (RBPR2 e STRA6) com seu ligante fisiológico RBP4³¹. As afinidades de ligação e a cinética de associação/dissociação de proteínas a complexos ligantes podem ser medidas em tempo real usando SPR. Essa metodologia teve como objetivo fornecer informações cinéticas, estruturais e bioquímicas críticas sobre os motivos de ligação a RBP4 em RBPR2 e STRA6, que são críticos para a compreensão dos estados patológicos de deficiência de vitamina A^31,32. Como mencionado acima, o ROL circulatório é internalizado no EPR via STRA6 para gerar o cromóforo 11-cis retinal, que se liga à opsina para gerar a proteína retinilideno, rodopsina, nos fotorreceptores³³. Usamos metodologias de espectrofotometria para quantificar a GPCR-opsina e seu complexo retiniano ligante 11-cis em lisados retinianos murinos, o que é fundamental para a compreensão dos mecanismos de redução da proteína retinilideno, rodopsina, em estados patológicos oculares de Retinite Pigmentosa ou Amaurose Congênita de Leber³⁴. Em geral, esses protocolos podem ser aplicados para estudar in vitro as consequências fisiológicas da RBP4, STRA6 ou RBPR2 mutantes em influenciar a homeostase sistêmica e ocular da vitamina A ou o impacto da rodopsina mutante ou proteínas do ciclo retinóide na função visual^35,36.

Protocolo

1. Metodologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR)

1. Preparação e purificação da proteína RBP4 de camundongo
   1. Projete primers para gerar cDNA RBP4 de camundongo de comprimento total (msRBP4) (Sequência de referência NCBI: NM_001159487.1). Clone o cDNA msRBP4 em um vetor de expressão resistente à canamicina pET28a His-tag e expresse em células BL-21 DE3 (Tabela de Materiais).
   2. Transformar as células competentes para BL-21 DE3 (de acordo com o protocolo do fabricante) com o vector msRBP4-pET28a ligado e, em seguida, colocar em placas de ágar de caldo Luria-Bertani (LB) contendo canamicina 50 μg/ml^30,37. Incubar as placas durante a noite a 37 °C numa incubadora e procurar colónias positivas no dia seguinte.
   3. Escolha uma única colônia e incube durante a noite a 37 ° C em 5 mL de caldo LB contendo canamicina 50 μg / mL.
   4. Para cultura secundária em 500 mL de caldo LB contendo canamicina 50 μg / mL, use 1% do volume de cultura primária (da etapa 1.1.3.) e incube a 37 ° C por 3-4 h; Verifique a densidade óptica usando um espectrofotômetro. Idealmente, proceda se o valor de OD estiver entre 0,6 e 1 para induzir a expressão da proteína com 0,5 mM IPTG a 24 °C durante a noite.
   5. Use várias concentrações de IPTG de 0,1-1 mM e faixa de temperatura de 16-30 °C para otimizar a expressão e a estabilidade do msRBP4.
   6. Centrifugue a cultura (da etapa 1.1.5.) a 16.000 × g por 10 min, descarte o sobrenadante e mantenha o pellet no gelo.
   7. Homogeneizar o pellet com tampão de lise (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 10% de glicerol, 0,5 mM de PMSF e inibidores de protease [pH 8,0]). Sonicar o lisado por 15 s ON e 30 s OFF cycle usando um homogeneizador com saída de 250 Watt e 40-50% de frequência de saída de 20 kHz. Repita 5x.
   8. Remover os restos celulares e as células não lisadas por centrifugação a 16.000 × g durante 20 min. Passar o sobrenadante do lisado através de uma coluna NTA de níquel com equilíbrio tampão.
   9. Lavar a coluna com tampão de lise (do passo 1.1.8) contendo 30 mM de imidazol.
   10. Em frações, eluir a proteína msRBP4 ligada usando tampão contendo 250 mM de imidazol. Execute as frações eluídas e monitore visualmente a quantidade de proteína com um gel de poliacrilamida SDS a 12%, corado com Coomassie Brilliant Blue R-250 em solução de metanol: água: ácido acético (45:45:10) e remova a coloração com solução sem coloração de Coomassie metanol: água: ácido acético (45:45:10).
   11. Agrupe as frações não utilizadas e dialise as frações agrupadas com um de diálise de 10K de 10 kDa MWCO.
   12. Avalie a qualidade da fração dialisada em um gel SDS-PAGE a 12% e quantifique a concentração de proteína.
       NOTA: A proteína Apo-RBP4 foi usada na análise da RPS. Para gerar holo-RBP4 (RBP4-retinol), consulte protocolos detalhados publicados em outro lugar ^36,37.
2. Validação inicial dos peptídeos RBPR2 e STRA6 com RBP4 para estrutura e interação por ensaio de fluorescência de triptofano e espectroscopia de dicroísmo circular (CD)
   1. Ensaio de fluorescência de triptofano
      1. Use a ferramenta de análise de composição de proteína on-line (https://web.expasy.org/protparam/) e cole a sequência de aminoácidos em código de uma letra para avaliar a composição estrutural da proteína RBP4 recombinante e os peptídeos individuais de RBPR2 e STRA6 para determinar os resíduos de aminoácidos triptofano nos peptídeos e proteínas individuais (Tabela de Materiais).
      2. Clique no botão calcular parâmetros e avalie a composição de aminoácidos para resíduos de triptofano (Trp).
         NOTA: Os resíduos de triptofano devem estar presentes nos peptídeos ou proteínas individuais que estão sendo analisados.
      3. Dilua os peptídeos RBPR2 e STRA6 individuais em várias concentrações micromolares e incube individualmente com 3 μg msRBP4 em uma placa de 96 poços em temperatura ambiente por 5 min. Excitar a mistura a 290 nm e varrer a emissão do comprimento de onda de 300 nm a 400 nm.
      4. Normalize os dados com a condição de controle em branco (somente tampão, sem peptídeo e sem proteína) e peptídeo (sem proteína) e plotagem.
         NOTA: O incremento de fluorescência do triptofano após a exposição a uma concentração de peptídeo baixa a alta sugere uma interação positiva entre os dois peptídeos individuais e a proteína RBP4.
   2. Espectroscopia de dicroísmo circular (CD)
      1. Dilua os peptídeos individuais e a proteína RBP4 recombinante em 1x tampão PBS, pH 7,0. Use várias concentrações de peptídeos RBPR2 e STRA6 e proteína RBP4 de 0,1 a 10 μg/mL para uma verificação de qualidade, conforme descrito abaixo.
      2. Adicionar peptídeos e proteínas diluídos individuais numa cubeta de 0,1 cm de comprimento e medir a absorbância/elipticidade da CD utilizando um espectrofotómetro de CD (195-250 nm). Use a fórmula abaixo para calcular a elipticidade média do resíduo (θ).
         [v] = (S × mRw)/(10cl)
         S representa o sinal CD em mθ; mRw representa a massa média do resíduo; c representa a concentração da proteína em mg/mL; e l representa o comprimento do caminho em cm.
      3. Calcule a variação percentual na estrutura da molécula usando a Análise de Estrutura Secundária BeStSel para Previsão de Dobras de Proteínas por Espectroscopia de CD (https://bestsel.elte.hu).
         NOTA: A estrutura secundária indica o dobramento adequado e as confirmações conservadas cruciais para o estudo de interação e o resultado das interações. Inspecione a estrutura prevista do domínio e prossiga com o estudo de interação.

2. Análise de SPR para determinar as afinidades de ligação e parâmetros cinéticos dos receptores de membrana da vitamina A (RBPR2 e STRA6) com seu ligante fisiológico RBP4

1. Para a imobilização do RBP4 na configuração da superfície do chip CM5, usamos o chip sensor SPR, que carrega um ligante carboximetil dextrano estendido a um tamanho de ~ 100 nm covalentemente preso em uma superfície de ouro. Na presença de cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), a N-hidroxisuccinimida (NHS) converte os grupos carboxila na superfície do chip em ésteres de N-hidroxisuccinimida, que reagem espontaneamente com os grupos amina de aminoácidos e proteínas, forçando o ligante a se ligar covalentemente à superfície do chip (Tabela de Materiais).
   1. Imobilize a proteína msRBP4 purificada no chip do sensor (Figura 1 e Figura 2). No menu Executar do software, escolha o Assistente e prossiga com a opção de imobilização . Diluir o ligante (proteína msRBP4 obtida na etapa 1.1) em tampão de imobilização (tampão acetato de sódio 10 mM, pH 5,0) para 10 μg/ml (4 μL de ligante + 396 μL de tampão) e alíquota dos reagentes de acoplamento em frascos para injetáveis. Abra a janela do assistente de configuração de imobilização no controle do software, selecione o chip CM5 e a opção Imobilizar a célula de fluxo 2 e o nível-alvo de 1,200 Unidade de resposta (RU) para atingir Rmax de 30 RU no estudo cinético e na solução de lavagem: etanolamina. Digite o nome RBP4 e clique em Avançar.
      NOTA: Opcional: A caixa de diálogo Preparações do sistema para a opção Preparar antes da execução não é necessária se a preparação com o tampão PBST (solução salina tamponada com fosfato com uma solução detergente Tween 20 a 0,05%) tiver sido realizada anteriormente.
   2. Na caixa de diálogo Posição do rack , clique em Ejetar rack. Pegue na prateleira e coloque os frascos com os volumes atribuídos para cada reagente: 156 μL de msRBP4, 177 μL de etanolamina, 89 μL de EDC, 89 μL de NHS e um frasco vazio. Insira o rack com sample frascos e clique em OK e Avançar.
   3. Na caixa de diálogo Preparar Executar Protocolo , clique em Iniciar e Salvar.
2. Configuração do ensaio cinético dos peptídeos RBPR2 e STRA6
   1. Dilua em série os peptídeos RBPR2, RBPR2 mutante e STRA6 de camundongo (sintetizados quimicamente anteriormente³¹ e listados na Tabela de Materiais) em tampão de corrida em uma faixa de 0,8-26,6 μM.
   2. Abra o software de controle e selecione o assistente Kinetics/Affinity. Clique em Arquivo | Abra o modelo e selecione Cinética/Afinidade. Insira o caminho do fluxo de diálogo da sequência de injeção 2-1 (célula de fluxo 2 como ativa e célula de fluxo 1 como referência), verifique o Tipo de chip CM5 e clique em Avançar. Na caixa de diálogo de configuração , marque Executar ciclos de inicialização, insira Solução: buffer e ciclos: e clique em Avançar.
   3. Na caixa de diálogo de parâmetros de injeção , insira os valores para os parâmetros da amostra : tempo de contato: 120 s, vazão 30 μL/min, tempo de dissociação 300 s; para parâmetros de regeneração : insira o nome da solução de regeneração: Glicina-HCl (pH 2.5), tempo de contato: 30 s, vazão: 30 μL/min e clique em Avançar.
   4. Na caixa de diálogo de amostras , insira o nome dos peptídeos, peso molecular e concentrações e clique em Avançar. Na caixa de diálogo Posição do rack , atribua os peptídeos diluídos como amostras individuais de ~120 μL de várias concentrações de 1 a 100 μM e ~230 μL de tampão, ~120 μL de tampão e ~1.000 μL de glicina, pH 2,5, às posições no rack. Clique em Ejetar rack e insira todos os frascos. Clique em Avançar e, na caixa de diálogo Preparar Protocolo de Execução , clique em Iniciar, insira um nome de arquivo e Salvar (Figura 2).
   5. No software, clique no menu Iniciar e selecione Avaliação. Escolha abrir o arquivo no software e, no menu suspenso de seleção, escolha Fc2-1 para analisar o sensorgrama ativo subtraído em branco da célula de referência para as fases de associação e dissociação dos peptídeos msRBP4 e msRBPR2 e msSTRA6 mutantes.
   6. Clique no botão suspenso Cinética/Afinidade e escolha Limite de superfície; para abrir a caixa de diálogo Selecionar curvas , marque a coluna de inclusão na tabela e clique em Avançar. Selecione a caixa de diálogo Dados para mostrar os sensorgramas subtraídos em branco; clique em Cinética e afinidade, mantenha os parâmetros padrão e clique na opção Ajustar para ajuste de curva. Inspecione a guia Relatório para obter a constante de dissociação de equilíbrio K_d e K_a ou K_na taxa de associação e K_d ou K_na taxa de dissociação. Salve o sensorgrama de dados cinéticos em .txt formato delimitado por guias e use os valores para plotar gráficos (Figura 3).
   7. Para determinar a constante cinética de afinidade K_d (concentração de ligante que se liga a metade dos receptores em equilíbrio), copie e cole as colunas de dados no arquivo de formato .txt gerado a partir do gráfico de avaliação para XY usado no software. Clique em Analisar e regressão não linear (ajuste de curva), verifique a coluna de dados e clique em Ok. Na caixa de diálogo de parâmetros , clique em Saturação de vinculação e em Modelo de encaixe de vinculação específico de um site com a fórmula de:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Onde Bmax é o número máximo de sítios de ligação (Unidade de Resposta), X é a concentração dos peptídeos e Y é a ligação (Unidade de Resposta) (Figura 3).

3. Metodologia de espectrofotometria para quantificar o complexo proteico retiniano GPCR-11-cis (retinilideno proteína rodopsina) em lisados retinianos

1. Transporte o grupo predeterminado de camundongos que consiste em camundongos WT-C57BL/6J adultos para a sala escura.
2. Adapte os camundongos durante a noite por 12-16 h e, sob luz vermelha, coloque o camundongo em uma câmara de eutanásia e abra a válvula de gás CO₂ no regulador a 5 L / min por ~ 5 min. Garanta a morte aplicando pressão no pescoço e na cauda puxada para trás (luxação cervical).
3. Enuclear os globos oculares e homogeneizar os olhos num tampão gelado contendo 20 mM de bis-tris propano (1,3-bis (tris(hidroximetil)metilamino)propano; BTP) pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM e com inibidor de protease (Tabela de Materiais).
4. Centrifugar o homogenato durante 15 min a 16000 x g a 4 °C, rejeitar o sobrenadante contendo proteínas citosólicas solúveis em água. Ressuspender e solubilizar a membrana peletizada e as proteínas da membrana em tampão contendo 20 mM de n-dodecil-β-d-maltosídeo (DDM), 20 mM de bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA e com inibidor de protease durante 1 h a 4 °C numa plataforma rotativa.
5. Centrifugar a fracção de membrana resolubilizada durante 1 h a 16000 x g, 4 °C. Misturar o sobrenadante com 30 μL de esferas de anticorpo Rho 1D4 e incubar durante 1 h a 4 °C numa plataforma rotativa.
6. Usando um suporte magnético, separe o pulldown usando contas, descarte o sobrenadante e lave as contas com tampão 20 mM bis-tris propano (BTP) pH 7.4, 500 mM NaCl e 2 mM DDM.
7. Eluir a proteína rodopsina incubando por 5-10 min em temperatura ambiente com tampão 20 mM bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DDM contendo 0,2 mg / mL 1D4 peptídeo (-TETSQVAPA) (Figura 4 e Figura 5).
8. Analise a absorbância do eluimento de 200 nm a 800 nm usando uma cubeta retangular, submicro, quartzo, abertura de 2 mm, comprimento de caminho de 10 mm, 50 μL em uma configuração de varredura rápida com espectrofotômetro.
   NOTA: Use apenas cubetas de quartzo de alta qualidade (Figura 4).
9. Para validar e determinar a qualidade, verifique e exponha a eluição à luz brilhante por 1 min e, em seguida, repita a etapa 3.8.
10. Subtraia a absorbância em branco e calcule a proporção dos espectros de absorbância analisados com absorbância a 500 nm para opsina ligada à retina 11-cis, 380 nm para opsina ligada à retina totalmente trans exposta à luz e 280 nm para proteína Apo-Opsina livre de ligante (Figura 6). A opsina livre sem ligante retinal fornece uma absorbância basal a 500 nm.
11. Para quantificar a concentração de rodopsina, use a Lei de Beer-Lambert:
    A = ε · C·l ou C=A/ε·l
    Onde A é a absorbância, ε o coeficiente de extinção molar (rodopsina ε500 = 40.600 M⁻¹ cm⁻¹ para Apo Opsina livre ε280 = 81.200 M⁻¹ cm⁻¹), C é a concentração e l comprimento do caminho.
12. Para quantificar a opsina ligante em porcentagem, use uma proporção de A280 / A500.
13. Traçar os espectros de absorvância subtraídos em branco e calcular o valor de opsina livre³².
14. Calcule a concentração de rodopsina usando o coeficiente de extinção ε₅₀₀ = 40600 M⁻¹ cm⁻¹. A concentração de opsina livre de ligante é calculada com a Lei de Beer-Lambert usando o coeficiente de extinção ε₂₈₀ = 81.200 M⁻¹ cm⁻¹.

Resultados

Métodos quantitativos são descritos para estudar as interações proteína-ligante de receptores de membrana de vitamina A e fotorreceptor opsina com seus respectivos ligantes fisiológicos. O RBP4 de camundongo recombinante deve ser expresso em E. coli e a proteína purificada usada como ligante conjugado em um chip SPR. O RBPR2, STRA6 sintetizado quimicamente e o mutante S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 interacting extracellular site" de um peptídeo de ~ 40 aminoácidos é usado como analito em várias concentrações para medir a cinética de ligação e saturação de equilíbrio K_d de interação (Figura 1 e Figura 2).

A proteína RBP4 recombinante, como ligante para RBPR2 e STRA6, mostrou uma afinidade de ligação com os locais de interação nesses peptídeos, medidos em K_d ~ 22,38 μM e ~ 26,73 μM, respectivamente. O motivo de aminoácidos "SYL" desempenha um papel essencial na estabilização dessas interações tanto em RBPR2 quanto em STRA6 e, como previsto, o peptídeo mutante S294A aumentou K_d de ~ 114,9 μM, sugerindo um aumento no número de cópias dos requisitos do peptídeo RBPR2 mutante para atingir a saturação de ligação (Figura 3). A captação de retinol no olho via STRA6 e a conversão em vários retinóides para a conversão final da retina 11-cis como cromóforo com ligação ao resíduo de lisina 296 da rodopsina torna um receptor funcional para detecção de fótons e visão. A ligação covalente da retina 11-cis à proteína Opsina para formar rodopsina exibe certas características de absorbância. A absorbância de proteínas ocorre a 280 nm e a absorbância de retinol livre é de ~ 325 nm. No entanto, a holo-Opsina com absorbância de 11-cis Retinal ou Rodopsina ocorre no comprimento de onda de 500 nm.

Qualquer defeito nesta formação complexa devido ao baixo retinol sistêmico ou defeito na captação de retinol por uma mutação em RBPR2 ou STRA6 leva ao acúmulo de opsina livre ou apoproteína opsina desprovida de cromóforo 11-cis retinal, alterando as mudanças de absorbância características para baixa absorbância a 500 nm. Quantificando a absorbância e usando a razão de absorbância de 280 nm e comprimento de onda de 500 nm, é possível estimar as opsinas ou rodopsinas ligantes. Através de uma breve exposição à luz, é possível verificar a foto-isomerização da absorbância de Opsina ligada à retina 11-cis a 500 nm para a absorbância de Opsina (Meta II rodopsina) ligada a todos os trans-retinais a 380 nm (Figura 4, Figura 5 e Figura 6). Em uma configuração experimental, a chance de artefatos e contaminantes é alta; as duas principais fontes de artefatos encontrados são a exposição não intencional à luz dos instrumentos e a lavagem de sal de baixa concentração com falha na remoção de moléculas contaminantes do RPE ou lente (Figura 7).

Figura 1: Área de trabalho de ressonância plasmônica de superfície. Materiais necessários e visão geral da instrumentação SPR. (A) Doca de carregamento de chips SPR. (A') Chip CM5 com superfície de ouro anexada covalentemente a dextrano carboximetilado para imobilização via grupos -NH2, -SH, -CHO, -OH ou -COOH. (B) Rack de injetores robóticos de carregamento de amostras. (B') cápsulas de borracha tipo 3. (B'') frascos de plástico de 7 mm para alíquotas de amostra. (C, D) Reservatório tampão de equilíbrio/funcionamento e tanque de coleta de resíduos. (E) Painel de controle do software Biacore. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão geral esquemática da Ressonância Plasmônica de Superfície e as etapas de aquisição de sensorgramas. Passo 1: A superfície do chip CM5 imobilizada com proteína RBP4 com um alvo de 1.200 unidades de resposta. Passo 2: Várias concentrações de peptídeos RBPR2 são executadas como analitos, e essa interação biomolecular altera a densidade de carga de elétrons na superfície do chip de ouro, levando à mudança / redução na reflexão da luz em um ângulo específico ou em um ângulo de ressonância. Etapa 3: A lavagem reverte o fenômeno do plasmon de superfície, levando à reversão da intensidade de reflexão e à queda do sensorgrama para a linha de base. A cinética dessas interações foi usada para determinar as constantes de dissociação de associação e a força das interações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Estudos de ligação de ressonância plasmônica de superfície de peptídeos individuais do domínio de ligação ao receptor de vitamina A com seu ligante fisiológico RBP4. (A) O prompt do software mostrando a imobilização alcançada de RBP4 na superfície do chip CM5. (B, C, D) Sensogramas de interações peptídeo-ligante RBPR2-RBP4, STRA6-RBP4 e mutante S294A RBPR2-RBP4 em várias concentrações. (B',C',D') Cinética de ligação e determinação de equilíbrio K_d mostrando a diferença e a proximidade do padrão de ligação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Espaço de trabalho de absorbância retiniana Opsin-11-cis e visão geral da instrumentação. (A) Centrífuga de bancada refrigerada, todos os indicadores LED cobertos com burocracia; (B) espectrofotómetro UV-visível, um indicador LED coberto com burocracia; (B') Célula retangular ultramicro, cubeta de quartzo e suporte magnético. (C) Software de aplicação de digitalização; (D) lâmina da tampa do compartimento do espectrofotômetro aberta, suporte da cubeta para análise e tampa do compartimento fechada. (E) Configuração de luz desligada com monitor desligado para preparação de amostras sob uma única fonte de luz vermelha. (F) Rotador refrigerado para preparação e solubilização de amostras. (G) Configuração de luz desligada com monitor ligado para medição de absorbância da amostra. (H) Análise de absorbância em XY-Plot. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Visão geral do fluxo de trabalho da metodologia de absorbância retiniana Opsina-11-cis. Etapa 1: Retinas de camundongos adaptados ao escuro sob uma única fonte de luz vermelha são isoladas, homogeneizadas e solubilizadas para obter frações da membrana retiniana. Passos 2-4: Em uma sequência de centrifugações, o pellet é solubilizado na ausência de detergente e na presença de tampão detergente DDM. Passos 5-6: O pellet solubilizado contendo fotorreceptores retinianos e outras proteínas de membrana prontas para retirada e purificação de anticorpos. Passo 7: A opsina eluída usando o peptídeo VAPA 1D4 pronto para análise de absorbância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Espectros de absorbância de rodopsina. (A) Extrato de retina de camundongos adaptados ao escuro usando rodopsina purificada 1D4 mostrando o pico de absorbância de 500 nm e (B) extrato de retina exposto à luz usando rodopsina purificada 1D4 mostrando o pico de absorbância de 380 nm. (C) Western blot usando anticorpo de rodopsina 1D4 mostrando a qualidade da purificação da rodopsina e distribuição de tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Artefato de espectros de absorbância de rodopsina. (A) O artefato nos espectros de absorbância do extrato de olho adaptado ao escuro é mostrado com o pico de absorbância em 380 nm; As exposições não intencionais à luz dos indicadores LED dos instrumentos ou a falha do bloqueador de luz da porta da sala escura causam o branqueamento da proteína rodopsina. (B) Lavagens insuficientes com alto tampão de sal causam acúmulo de contaminantes de EPR, lente ou outras fontes de extrato ocular, levando a alta dispersão do espectro de absorbância e artefatos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Representação esquemática das interações entre os receptores de membrana da vitamina A (RBPR2 e STRA6) e a proteína Opsina com seus respectivos ligantes (RBP4 e 11-cis retinal) críticos para a geração da proteína retinilideno em fotorreceptores para a função visual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar S1: Intensidades intrínsecas de fluorescência do triptofano. Evidência preliminar de interação e mudança nas orientações dos resíduos intrínsecos de triptofano de RBP4 ao interagir com várias concentrações de peptídeos RBPR2 e STRA6. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S2 suplementar: Acoplamento e interação proteína-proteína RBPR2 e RBP4. Os resíduos da interface são visualizados no PyMOL e a orientação do RBPR2 na membrana é visualizada usando a ferramenta do servidor https://opm.phar.umich.edu/. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S3 suplementar: Pipeline para análise in-silico da interação de encaixe proteína-proteína e possíveis locais de contato. O pipeline de análise demonstra a sequência de execução do script Python e o uso da linha de comando do PyMOL das etapas 1 a 6, garantindo a confiabilidade da aquisição dos sites de interações. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S4: Análise da estrutura secundária da espectroscopia de CD mostrando a composição dos peptídeos RBP4, RBPR2 e STRA6. O gráfico de pizza mostra as parcelas de estruturas secundárias presentes na molécula. Usando a ferramenta BeStSel Secondary Structure, a predição de dobras de proteínas por espectroscopia de dicroísmo circular (https://bestsel.elte.hu) foi analisada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Etapas críticas no protocolo
Metodologia SPR
Modelagem in silico e análise de docking: A estrutura prevista de RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) e STRA6, e a estrutura conhecida para obanco de dados ms RBP4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa), devem ser usadas para o estudo de docking^29,31. Além disso, métodos in vitro (cultura de células) devem ser usados para confirmar a interação dos locais de ligação putativos nos receptores de vitamina A (RBPR2 e STRA6) com seu ligante (RBP4) ^{29 , 31} (Figura Suplementar S1, Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3). Determine a qualidade dos peptídeos usando espectroscopia de CD. Anteriormente, para o espectro de CD de UV distante, células retangulares de 1 mm 0,1 μg / μL ~ 200 μL (3-4 μg de proteína RBP4, 32 μM RBPR2 e 32 μM de peptídeos STRA6) foram usados³¹ (Figura Suplementar S4). O fluxo de gás nitrogênio deve ser usado para evitar a formação de ozônio prejudicial sob lâmpadas de xenônio de emissão e reduzir a absorbância de fundo em 200-300 nm. Usando o parâmetro padrão, o espectro foi medido de 185 nm a 300 nm. A linha de base deve ser corrigida por subtração com o Blank. O conteúdo da hélice alfa e da folha beta é calculado com base na propriedade de absorbância, como os picos negativos da hélice alfa em 222 nm.

Analise as proteínas RBPR2 e STRA6 e os dados dos domínios topológicos no banco de dados (https://www.uniprot.org), confirme os possíveis locais de interação previamente conhecidos de regiões extracelulares e use a sequência ~ 40-50 aminoácidos para sintetizar quimicamente os peptídeos. O estudo requer proteína RBP4 de camundongo recombinante purificada (msRBP4) e peptídeos RBPR2 e STRA6 sintetizados quimicamente, abrangendo os resíduos de ligação RBP4 propostos para estudar as interações receptor-ligante 18,19,29,31. Antes de selecionar os peptídeos, a sequência de peptídeos extracelulares das proteínas receptoras de vitamina A em interação deve ser determinada usando análise in silico (acoplamento proteína-ligante baseado em computador)³¹. O ensaio de SPR é realizado para entender a cinética das interações receptor-ligante. É crucial conhecer os locais previstos de interações por ensaios in-silico baseados em computador ou a partir de análises in vitro. Neste estudo, o peptídeo projetado faz referência à região extracelular das proteínas de membrana RBPR2 e STRA6, que são conhecidas por interagir com RBP4. Para garantir resultados precisos e evitar possíveis artefatos e sensorgramas SPR negativos, é crucial padronizar os tampões, as concentrações de peptídeos e a solubilidade. Para estudos de absorbância de rodopsina, o isolamento do lisado de retina requer condições escuras rigorosas e etapas de lavagem para evitar artefatos e picos de absorbância indesejados (Figura 7).

Para entender a importância do motivo SYL nos transportadores de vitamina A na ligação de RBP4, RBPR2, STRA6 e um mutante S294A-RBPR2, os peptídeos³¹ foram sintetizados quimicamente usando uma reação de condensação dos grupos carboxila e amino entre dois aminoácidos. O protocolo seguiu a adição gradual precisa de aminoácidos sequenciais à resina de ancoragem. O processo de síntese de aminoácidos sofre modificações químicas de proteção e desproteção da unidade de aminoácidos N-terminal, permitindo a síntese e formação de polímeros peptídicos. Uma vez concluído, o peptídeo é recuperado da resina e purificado. A validação inicial das interações da proteína RBP4 e dos peptídeos do receptor de vitamina A deve ser confirmada usando um ensaio interno de fluorescência de triptofano e verificada usando um espectrômetro CD (Figura Suplementar S1). A qualidade da interação inicial da proteína RBP4 recombinante com camundongo STRA6 (msSTRA6), camundongo RBPR2 (msRBPR2) e peptídeos de controle deve ser confirmada usando ensaio de fluorescência de triptofano intrínseco (Figura Suplementar S1). O ensaio de fluorescência intrínseca do triptofano é um procedimento experimental crítico para avaliar a extinção ou aumento de resíduos de aminoácidos triptofano em proteínas para fluorescência ao ligar o receptor e o ligante. A fluorescência medida é uma indicação direta da mudança no ambiente local como resultado da interação.

Modificações e solução de problemas dos métodos
Otimize o SPR com tampões de corrida: 1x solução salina tamponada com fosfato (Tween 20) ou 1x HEPES (P20). Para evitar precipitados, os peptídeos diluídos devem ser centrifugados e filtrados antes do uso. Padronize a absorbância da rodopsina com vários tampões com alto teor de sal (300-500 mM NaCl). Para confirmar os picos de absorbância da rodopsina no escuro a 500 nm, exponha as amostras à luz por 30 s e repita a medição para garantir a qualidade através da mudança do pico de absorbância para 380 nm e a eficácia do pulldown.

Limitações dos métodos
O SPR pode fornecer informações específicas sobre a interação de duas proteínas; no entanto, se a interação exigir um terceiro componente desconhecido, os dados podem se tornar complexos de compreender. A mudança na conformação da molécula permanecerá não identificada na interação. Como a proteína RBP4 é preparada na ausência de retinol (apo-RBP4), o que é medido é a ligação do apo-RBP4 aos seus receptores. Portanto, o RBP4 carregado com retinol (holo-RBP4) pode ter uma afinidade alterada pelos receptores RBPR2 e STRA6 em comparação com o apo-RBP4^35,36. Curiosamente, as afinidades para apo e holo-RBP4 para STRA6 foram previamente mostradas em ambos os intervalos micromolares, e nenhuma diferença estatística foi observada entre as ligações de apo e holo-RBP4 ao receptor STRA6³⁵. A metodologia de absorbância de rodopsina pode identificar a presença de opsina não ligada (apoproteína opsina) no olho, mas não pode identificar o(s) mecanismo(s) causador(es).

Espectros de absorbância de rodopsina
PONTO DE VERIFICAÇÃO CRÍTICO: A fotoisomerização da retina 11-cis para totalmente trans retiniana é altamente sensível e instantânea³². A quantificação da rodopsina (holo-opsina) deve ser realizada sob condições estritas de escuridão para medir o conteúdo retiniano adequado de opsina e 11-cis no escuro (500 nm) ou sob condições adaptadas à luz como Meta II Rodopsina (380 nm) ³² . Os camundongos devem, portanto, ser adaptados ao escuro em uma sala escura por 12-16 h para medir a rodopsina³² não branqueada. Para isso, a sala escura deve ser completamente escura, com a porta de entrada coberta com pano blackout e fontes de luz LED externas em todos os equipamentos cobertas com burocracia. Cubra a tela do laptop com uma folha de plástico vermelha e mantenha fechada até que seja necessário. Uma fonte de luz vermelha suspensa também é necessária.

PASSO CRÍTICO: Padronize as etapas de lavagem em várias concentrações altas de sais para remover proteínas de lente ou RPE ou contaminantes de moléculas que tenham absorbância de comprimento de onda de 300-500 nm e possam interferir na medição da absorbância de opsina.

Importância dos métodos em relação aos métodos existentes/alternativos
Não há abordagem viável para estudar a utilização sistêmica de retinóides, contribuições multiteciduais e impacto de mutações nos receptores proteicos de ligação ao retinol para os mecanismos de distribuição de retinol. Este protocolo utiliza duas técnicas essenciais para entender e preencher as conexões ausentes na depleção de retinol em fotorreceptores com Apo-Opsina e utilização de armazenamento de retinóides hepáticos por meio de interações receptor-ligante RBPR2-RBP4 (Figura 3, Figura 6 e Figura 8).

Importância e potenciais aplicações do método em áreas de investigação específicas
Os ensaios de espectroscopia de rodopsina baseados em SPR e absorbância fornecem uma estratégia significativa para estudar os mecanismos de homeostase sistêmica e ocular da vitamina A para a geração da proteína retinilideno (rodopsina). Em resumo, essas técnicas e abordagens experimentais podem elucidar a cinética do transporte dependente do receptor de membrana de retinóides dietéticos através do fígado e para o olho, facilitando a geração de rodopsina (Figura 8). Eles também ajudam a entender os mecanismos e as consequências oculares de mutações nos receptores de vitamina A e proteínas opsina, particularmente na ligação aos seus respectivos ligantes. Essas interações podem influenciar a geração da proteína retinilideno, que é crucial para a função visual.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit 2-D Quant Cytiva		80648356
Kit de acoplamento de amina	Cytiva	BR100050
software de avaliação Biacore	Biacore S200	Versão 1.1
Chip sensor Biacore CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propano	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 células competentes	Thermo Espectrofotômetro CD Scientific	EC0114
	Jasco	J-815 Espectropolarímetro
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Ajuste do modelo, análise de dados
LB caldo	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecil-β-d-maltosídeo (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a Vetor de expressão resistente à canamicina His-tag	Addgene	69864-3
	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer de diálise 10K	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Nome do peptídeo	Sequência de peptídeos	HPLC-pureza<	strong>Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforma
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90,84%	Em conformidade com o
mutante S294A do camundongo Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0,92%	Em conformidade