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Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

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DOI:

10.3791/67042

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29 de novembro de 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

Neste artigo

Resumo

A formação de plaquetas pró-coagulantes tem sido correlacionada com um risco aumentado de trombose. Apresenta-se aqui um protocolo preciso para isolar plaquetas lavadas do sangue humano, destinado a quantificar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas, que são características distintivas das plaquetas pró-coagulantes.

Resumo

As plaquetas ativadas promovem a coagulação principalmente expondo o fosfolipídio pró-coagulante fosfatidilserina (PS) em suas superfícies externas de membrana e liberando microvesículas que expressam PS que retêm a arquitetura original da membrana e os componentes citoplasmáticos de suas células de origem. A acessibilidade da fosfatidilserina facilita a ligação dos principais fatores de coagulação, amplificando significativamente a eficiência catalítica das enzimas de coagulação, enquanto a liberação de microvesículas atua como um mediador fundamental da sinalização intercelular. As plaquetas pró-coagulantes desempenham um papel crucial na estabilização do coágulo durante a hemostasia, e sua proporção aumentada na corrente sanguínea se correlaciona com um risco aumentado de trombose. Também foi demonstrado que as microvesículas plaquetárias são ricas em fatores de crescimento que promovem a cicatrização de feridas e a modulação inflamatória. A análise da exposição à fosfatidilserina e da liberação de microvesículas por citometria de fluxo apresenta desafios significativos devido ao seu pequeno tamanho e ao número limitado de eventos positivos para marcadores de interesse. Apesar dos avanços consideráveis na última década, os métodos para avaliar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas continuam sendo um trabalho em andamento. Infelizmente, não existe um protocolo único universalmente aplicável, e vários fatores devem ser avaliados para determinar a metodologia mais apropriada para cada aplicação específica. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolamento de plaquetas lavadas do sangue humano, seguido de ativação de colágeno e/ou trombina, para medir a exposição da liberação de fosfatidilserina e microvesículas que caracterizam as plaquetas pró-coagulantes. Este protocolo foi desenvolvido para facilitar a preparação inicial do plasma rico em plaquetas e o isolamento das plaquetas lavadas. Finalmente, a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas são quantificadas por citometria de fluxo, permitindo a identificação de plaquetas pró-coagulantes.

Introdução

A formação de pró-coagulante plaquetário é crucial para manter a hemostasia 1,2,3. Esse processo envolve a expressão de fosfolipídios induzida por agonistas na membrana plaquetária, o que é essencial para a montagem de complexos de tenase e protrombinase 1,3,4. Após a ativação plaquetária, as microvesículas plaquetárias também são liberadas continuamente 5,6. Microvesículas (50 nm a mais de 1 μm de diâmetro) encapsulam tanto a estrutura da membrana quanto os constituintes citoplasmáticos das células originárias 7,8. As microvesículas são importantes mediadores da sinalização intercelular 9,10 e também repositórios de fatores de crescimento que promovem a cicatrização de feridas e a modulação inflamatória11,12. As microvesículas também foram sugeridas como sendo 50 a 100 vezes mais pró-coagulantes do que as plaquetas ativadas13. Notavelmente, evidências recentes sugerem que as plaquetas armazenadas são ativadas, levando à produção de microvesículas - isso tem ramificações potenciais para a prática da terapia transfusional de plaquetas. A duração prolongada do armazenamento das microvesículas e a atividade pró-coagulante aumentada as tornam um substituto promissor para as plaquetas em aplicaçõestransfusionais 14.

Inovações metodológicas têm sido feitas para, direta e indiretamente, avaliar a formação de pró-coagulantes plaquetários em condições de saúde e doença 4,14,15. Avaliações da exposição à fosfatidilserina e liberação de microvesículas usando plaquetas purificadas forneceram novos dados sobre como as respostas pró-coagulantes plaquetárias são perturbadas em diversas doenças humanas 1,4. Esse crescente campo de pesquisa também abre caminhos para intervenções terapêuticas 1,4. No entanto, o isolamento e a análise de plaquetas purificadas do sangue são demorados, requerem equipamentos laboratoriais especializados e, portanto, não são atualmente adaptáveis para diagnósticos clínicos de rotina16,17. A análise da exposição à fosfatidilserina e da liberação de microvesículas também é desafiadora devido ao seu pequeno tamanho e ao número de eventos positivos para marcadores de interesse18,19.

A citometria de fluxo, aproveitando a ligação fluorescente da Anexina-V, tem sido uma pedra angular na avaliação da expressão de PS em plaquetas e microvesículas desde sua criação, há duas décadas20. Ganhou ampla aceitação no exame de plaquetas e microvesículas pró-coagulantes21,22. Portanto, é apresentado aqui um protocolo otimizado que pode ser utilizado para o isolamento de plaquetas purificadas de amostras de sangue utilizando a técnica desenvolvida pelo grupo de Cazenave23, e a posterior caracterização da exposição à fosfatidilserina e liberação de microvesículas por citometria de fluxo após ativação plaquetária24. Este protocolo facilitará um estudo mais aprofundado e a caracterização aprofundada de plaquetas pró-coagulantes em populações clínicas de interesse.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do Hospital Universitário de Bordeaux. Amostras de sangue foram obtidas de voluntários saudáveis que forneceram consentimento informado, e essas amostras foram processadas de acordo com protocolos institucionais. Os doadores que haviam tomado quaisquer substâncias que pudessem afetar a função plaquetária foram excluídos se tais substâncias fossem tomadas nos 10 dias anteriores aos experimentos. O consentimento informado foi obtido de voluntários saudáveis para coletar seu sangue e publicar seus dados. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coleta de sangue e preparação de plaquetas lavadas

  1. Colete sangue venoso periférico em tubos de coleta contendo o anticoagulante ativo Citrato Trissódico com Ácido Cítrico e Dextrose (ACD) após descartar os primeiros 3 mL.
  2. Após a coleta, inverta suavemente o tubo para misturar o sangue com a DAC e deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 15 minutos antes da centrifugação.
  3. Conte as plaquetas usando um contador de células automatizado antes da centrifugação para determinar a velocidade correta de centrifugação (Tabela 1). Prepare o plasma rico em plaquetas (PRP) por centrifugação a 250 x g por 10 min em temperatura ambiente (RT) sem aplicar o freio para otimizar a recuperação de plaquetas.
    NOTA: Esta etapa produzirá três camadas na amostra: a camada superior contendo plasma, plaquetas e uma pequena fração de glóbulos brancos; uma camada intermediária enriquecida com glóbulos brancos; e uma camada inferior composta por glóbulos vermelhos. Transfira cuidadosamente o PRP da camada superior para um novo tubo cônico de 50 mL para evitar a contaminação com glóbulos vermelhos e brancos.
  4. Ao PRP, adicione 1 mL de ACD-A (ver Tabela 2) e 6,25 μL de apirase por 9 mL.
    NOTA: A apirase, na concentração de 0,02 U/mL, degrada traços de ATP ou ADP secretados pelas plaquetas, impedindo a dessensibilização dos receptores de ADP plaquetários e mantendo a forma plaquetária25. Um inibidor da prostaciclina PGI2 (0.5 μM) também pode ser incluído com a apirase para prevenir a ativação plaquetária.
  5. Preparar o sedimento de plaquetas por centrifugação a RT a 1100 x g durante 10 min. Aspire o sobrenadante contendo Plasma Pobre em Plaquetas (PPP) usando um método suave, como uma pipeta de Pasteur, e ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão de lavagem (ver Tabela 3 e Tabela 4). Homogeneizar suavemente com uma pipeta e, em seguida, adicionar mais 3-4 mL de tampão de lavagem.
    NOTA: O nível de cálcio é reduzido para evitar a coagulação com os fatores de coágulo presentes no plasma. Nesse estágio, o plasma pobre em plaquetas foi completamente removido, impedindo a formação de coágulos e a ativação plaquetária pela produção de trombina.
  6. Centrifugue novamente em RT a 1100 x g por 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de lavagem. Transfira 150 μL da suspensão plaquetária para um tubo de 1,5 mL para contagem de células usando um contador de células automatizado. Em seguida, ressuspenda o pellet com 3-4 mL de tampão de lavagem.
  7. Efectuar uma centrifugação final a 1100 x g durante 10 min (a RT). Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de plaquetas num volume de tampão de reacção (ver quadro 5 e quadro 6) para atingir uma concentração final de 5 x 1011 plaquetas/l.
  8. Deixe as plaquetas lavadas descansarem por pelo menos 30 minutos antes dos experimentos para permitir que os inibidores residuais se desgastem e para que as plaquetas se aclimatem ao tampão.

2. Preparação do ensaio

  1. Prepare todos os agonistas e fluorocromos no tampão de reação. Adicione 5 μL de trombina a 45 μL de tampão (diluição 1:10) e 5 μL de ionóforo a 495 μL de tampão (diluição 1:500).
    1. Para ensaios internos, compare as plaquetas não ativadas com aquelas tratadas com agonistas únicos e duplos. Adicionar, em diferentes alíquotas, 100 μL de plaquetas lavadas a 50 x 109 plaquetas/L a: i) 10 μL de tampão de reação, ii) 3 μL de colagénio não diluído (concentração final de 30 μg/ml), iii) 10 μL de trombina pré-diluída (0,5 UI/ml), iv) 3 μL de colagénio não diluído + 10 μL de trombina pré-diluída e v) 10 μL de ionóforo pré-diluído (concentração final de 2 μM), que é conhecido por aumentar diretamente os níveis de cálcio intracelular, como observado anteriormente26.
      NOTA: O tratamento com um ionóforo de cálcio, como A23187 ou ionomicina, é crítico, pois induz uma extensa embaralhamento da membrana fosfolipídica e maior externalização do PS.
    2. Agitar suavemente cada alíquota com a mão e incubar a 37 °C durante 5 min.
      NOTA: Uma incubação de agonistas mais longa (30 min) pode permitir uma melhor diferenciação entre as populações de plaquetas durante o processo de análise por citometria de fluxo.
  2. Adicione 5 μL de Annexin-V FITC não diluído a cada microtubo e incube em temperatura ambiente por 10 min no escuro.
    NOTA: Um anticorpo monoclonal contra um dos receptores específicos de plaquetas, GPIX (CD42b) ou integrina αIIb (CD41, GPIIb), também pode ser incluído para identificar melhor as células plaquetárias.
  3. Adicionar 500 μL de tampão de reacção para interromper o processo e proceder à análise da amostra utilizando um citómetro de fluxo.

3. Caracterização de plaquetas e microvesículas pró-coagulantes por citometria de fluxo (FC)

NOTA: Para uma análise confiável da função plaquetária, utilize um instrumento de citometria de fluxo (FC) configurado de acordo com os padrões estabelecidos27. O instrumento deve ser capaz de detectar dispersão direta (FSC) e pelo menos um sinal de fluorescência. Defina os detectores de dispersão de luz e fluorescência para ganho logarítmico. Dilua as amostras adequadamente para FC para garantir que apenas plaquetas individuais sejam contadas em uma velocidade reduzida de aquisição de dados.

  1. Defina o citômetro de fluxo para uma taxa de fluxo 'lenta' com um limite de pelo menos 10.000 eventos plaquetários. Monitore a emissão de fluorescência usando um filtro de passagem para FITC.
  2. Bloqueie a população de plaquetas usando dispersão direta (FSC). Examine as plaquetas e microvesículas liberadas de acordo com seus tamanhos. Use gráficos de densidade para identificar plaquetas e microvesículas liberadas para plaquetas em repouso e estimuladas; analise cada população fechada de forma independente.
  3. Distinguir as plaquetas pró-coagulantes de acordo com o eixo FL1. Coloque o ponto de corte negativo na extremidade direita da população de plaquetas no estado de repouso (ou seja, na presença de tampão de reação). Após a ativação plaquetária, classifique todos os eventos localizados à direita desse ponto de corte como plaquetas expondo fosfatidilserina.
  4. Diferenciar as microvesículas, sendo menores que as plaquetas, por suas características únicas de dispersão de luz. Defina o ponto de corte no valor mais baixo do FSC observado na população de plaquetas em repouso. Após a ativação, classifique quaisquer eventos positivos para fosfatidilserina abaixo desse limite como microvesículas.
    NOTA: Considere a variação individual no tamanho das plaquetas ajustando o ponto de corte, se necessário. Certifique-se de que menos de 1% das microvesículas estejam presentes no estado de repouso.

Resultados

A quantificação de plaquetas e microvesículas pró-coagulantes é obtida usando a coloração com Anexina-V, com pelo menos 50.000 eventos registrados por amostra. Conforme declarado na etapa 2.2, as medições plaquetárias basais foram obtidas de amostras incubadas com tampão de reação, conforme ilustrado na Figura 1A. Os tamanhos das plaquetas foram medidos usando o valor mediano de dispersão direta (FSC). Embora o FSC seja influenciado por vários fatores, ele continua sendo um proxy comum para a estimativa do tamanho das células, incluindo a das plaquetas. Gráficos de densidade de área (Figura 1A) foram usados para identificar e bloquear plaquetas em repouso e microvesículas liberadas.

No caso de plaquetas não ativadas, menos de 2,9% apresentaram fosfatidilserina (PS) conforme determinado pela coloração com Anexina-V. Após a ativação das plaquetas lavadas com colágeno sozinho ou em conjunto com trombina ou ionóforo de cálcio, houve um aumento observável na exposição ao PS. O colágeno sozinho provocou um aumento de 26,7% nas plaquetas positivas para PS. A trombina teve efeitos mínimos na exposição ao PS (9,1%), mas quando associada ao colágeno, aumentou a porcentagem de plaquetas expostas ao PS para 36,2%. Para referência, o tratamento com ionóforo de 2 μM resultou em 49,6% das plaquetas se tornando pró-coagulantes.

A Figura 1 ilustra que a proporção basal de microvesículas de plaquetas lavadas em um indivíduo saudável foi mínima (0,3%). Enquanto a trombina e o colágeno aumentaram minimamente a formação de microvesículas, foi apenas com a combinação de colágeno e trombina que a formação de microvesículas aumentou significativamente (Figura 1D; 11,4%). A adição de ionóforo de 2 μM resultou em 44,0% das microvesículas formadas por plaquetas de controle expostas ao PS.

A Figura 2 fornece informações sobre a variação, repetibilidade e reprodutibilidade esperadas desse processo.

figure-results-1
Figura 1: Exposição ao PS e formação de microvesículas em plaquetas de controle em repouso e ativadas. As plaquetas foram ativadas ou não ativadas (repouso) (A), com 30 μg/mL de colágeno (B), com 0,5 U/mL de trombina (C), com combinações de colágeno e trombina (D) com ionóforo 2 μM. Os gráficos de pontos representativos exibem o tamanho das plaquetas (dispersão direta (log FSC)) versus a ligação Annexin-V. As linhas horizontais e verticais (E) delineiam a população plaquetária negativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Repetibilidade e reprodutibilidade da exposição ao PS e formação de microvesículas após incubação com ionóforo. Análise da exposição ao PS e formação de microvesículas após incubação com ionóforo de 2 μM ou 5 μM em plaquetas lavadas, tratadas ou não com citrato (um quelante de cálcio): (A) de 4 controles saudáveis diferentes; (B) de um controle saudável repetido 5 vezes; e (C) de dois controles saudáveis preparados por dois técnicos diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Contagem de plaquetas no sangue total (109 por mL)Forças centrífugas relativas (g)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

Tabela 1: Forças centrífugas relativas para preparação de plasma rico em plaquetas em relação à contagem de plaquetas no sangue total.

ReagenteQuantidade
Ácido cítrico mono-hidratado (C6H8O7. H2O, 38 mM)8 gramas
Citrato trissódico di-hidratado (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 mM)180 gramas
Glicose (C6H12O6, 136 mM)24,6 gramas
O pH da solução não deve ser ajustado. Manter a solução a 4 °C.

Tabela 2: Preparação de uma solução aquosa de 1 L de ácido-citrato-dextrose (ACD).

ReagenteQuantidade
Ácido cítrico mono-hidratado (C6H8O7. H2O, 36 mM)7,56 gramas
NaCl (103 mM)6 g
NaOH4 gramas
MgCl2.6H 2O (1 mM)0,203 gramas
Ajuste o pH em 6,5. Manter a solução a 4 °C.

Tabela 3: Preparação da solução de estoque de tampão de lavagem.

ReagenteQuantidade
30% de albumina de soro bovino (BSA)583 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
Glicose40 mg
Apirase31,5 μL

Tabela 4: Preparação de uma solução extemporânea de 50 mL de tampão de lavagem da solução estoque.

ReagenteQuantidade
NaCl (137 mM)8 gramas
KCl (2,7 mM)0,2 g
MgCl2.6H 2O (1 mM)0,203 gramas
HEPES (5 mM)1,19 gramas
NaHCO3 (12 mM)1 g
NaH2PO4.2H 2O; 0,3 mM0,05 gramas
Ajuste o pH em 7,4. Manter a solução a 4 °C.

Tabela 5: Preparação de uma solução de estoque de tampão de reação.

ReagenteQuantidade
30% de albumina de soro bovino (BSA)167 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
Glicose50 mg

Tabela 6: Preparação de uma solução extemporânea de 50 mL de tampão de reação a partir da solução estoque.

Discussão

Estudos recentes sobre plaquetas pró-coagulantes têm destacado suas alterações durante várias doenças 1,28,29, ressaltando a importância de sua análise e caracterização detalhadas 30,31,32. Embora os testes clínicos atuais para avaliar a formação de pró-coagulantes plaquetários sejam limitados, houve um aumento significativo no interesse clínico nas últimas duas décadas. Por exemplo, a scramblase dependente de cálcio TMEM16F (ANO6) está envolvida na exposição à fosfatidilserina pró-coagulante (PS)33. Variantes de TMEM16F estão associadas à síndrome de Scott 33,34,35, um distúrbio hemorrágico raro caracterizado por embaralhamento de fosfolipídios prejudicado e redução da geração de trombina em plaquetas ativadas 36. Além disso, níveis elevados de plaquetas pró-coagulantes estão associados a acidentes vasculares cerebrais trombóticos e doença arterial coronariana, despertando interesse em terapias para reduzir a atividade pró-coagulante plaquetária37. Dos métodos atualmente disponíveis para avaliar a formação de plaquetas pró-coagulantes, a avaliação da exposição ao PS pela ligação da anexina-V e liberação de microvesículas é um dos mais comumente utilizados38,39.

O protocolo descrito aqui permite o isolamento de plaquetas purificadas por humanos e a caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição ao PS e a liberação de microvesículas usando citometria de fluxo. É crucial aconselhar voluntários saudáveis a se absterem de medicamentos que possam afetar a função plaquetária por pelo menos 10 dias antes da coleta de sangue. A coleta de sangue requer cuidados para evitar trauma venoso ou fluxo excessivamente lento, pois estes podem induzir a geração de trombina e ativação plaquetária. O sangue anticoagulado com citrato de sódio não é recomendado para o preparo de plaquetas lavadas, pois o cálcio residual pode permitir a geração de trombina e a ativação plaquetária durante a centrifugação17. O sangue anticoagulado com DAC tem um pH de 6,5 e uma concentração de citrato mais alta de 22 mmol / L em comparação com o pH do sangue anticoagulado com citrato de 7,5 e a concentração de citrato de 13 mmol / L17. O pH ácido e a redução da concentração de cálcio extracelular no sangue anticoagulado com DAC impedem a agregação plaquetária24. Minimizar a geração de trombina durante o processo de coleta é essencial. Uma punção venosa não traumática usando pelo menos uma agulha de 21 G é recomendada para evitar estase venosa ou pressão excessiva. Além disso, os primeiros mililitros de sangue devem ser descartados para evitar contaminação com fatores teciduais e vestígios de trombina17. Minimizar o tempo entre a punção venosa e o processamento da amostra também é essencial, pois o armazenamento prolongado de sangue pode levar à ativação plaquetária, aumentando assim a exposição ao PS e a liberação de microvesículas40. Atenção específica deve ser dada durante todo o procedimento de preparo plaquetário para evitar a pré-ativação plaquetária espontânea, que pode ocorrer durante o próprio processo de preparo41,17. Além disso, o isolamento de plaquetas purificadas requer evitar cuidadosamente a contaminação por outras células sanguíneas17. Isso envolve aspirar completamente o sobrenadante após centrifugar as plaquetas para garantir uma preparação limpa. Como o pellet é normalmente visível e firmemente aderido à parede do tubo, o sobrenadante pode ser facilmente aspirado usando uma ponta de pipeta.

Durante as etapas de lavagem por centrifugação, as plaquetas são ressuspensas em um tampão que simula condições fisiológicas. O uso de plaquetas lavadas em um tampão fisiológico as isola dos anticoagulantes e do plasma, evitando assim os artefatos mediados pela trombina. Embora o plasma rico em plaquetas (PRP) seja um método rápido para obter altas concentrações de plaquetas, seu uso para estudos funcionais é limitado por alterações de pH induzidas por anticoagulantes e pelo conteúdo extracelular de cálcio e proteína do plasma, que podem influenciar a ativação plaquetária17. Além disso, altos níveis de PS gerados durante a ativação plaquetária seriam suficientes para promover a montagem de complexos de coagulação plasmática, subsequente explosão de trombina e formação de coágulos no PRP, tornando os resultados experimentais ininterpretáveis. Em contraste, a ressuspensão em um tampão contendo apirase é recomendada para manter a funcionalidade plaquetária, evitando a dessensibilização dos receptores purinérgicos por meio da degradação de ATP e ADP42,43. Embora as etapas repetidas de centrifugação e lavagem exijam mais tempo, as suspensões de plaquetas lavadas preparadas por este método oferecem a vantagem de maior estabilidade (5-8 h) em comparação com as preparações de PRP citrato, que são estáveis por não mais que 1-3 h23.

Este estudo demonstra a viabilidade e simplicidade da quantificação de microvesículas por citometria de fluxo. No entanto, a produção de microvesículas pode se perder nos detritos e ruídos da máquina. Portanto, é fundamental garantir que o citômetro de fluxo tenha passado por uma limpeza extensa e que os tampões usados não contenham partículas contaminantes que possam levar a um alto fundo durante a análise de citometria de fluxo. Alternativamente, citômetros de fluxo especializados com recursos de detecção de partículas pequenas podem ser usados para identificar a formação de microvesículas. A ligação da Anexina-V marcada com fluoresceína em função do conteúdo de PS da membrana também foi estudada, destacando o papel crítico de concentrações suficientes de cálcio no tampão para a ligação da Anexina-V e resposta plaquetária pró-coagulante44.

Os dados que suportam a estabilidade das amostras de plaquetas ao longo do tempo são atualmente escassos. Vários laboratórios abordaram esse problema estabilizando as amostras por meio da adição de uma solução fixadora, como um tampão contendo formaldeído. A adição de um fixador a amostras de plaquetas recém-coletadas tem a vantagem de preservar as amostras para análise posterior. No entanto, a fixação de formaldeído pode causar aumento artificial da ligação da Anexina-V. Rochat e col. demonstraram que a fixação plaquetária com uma solução de formaldeído de baixa concentração e livre de cálcio não altera a proporção de plaquetas positivas para anexina-V45. No entanto, os pesquisadores que necessitam de fixação devem otimizar seu protocolo específico para garantir que ele não cause resultados alterados artificialmente. Caso contrário, as amostras devem ser processadas imediatamente.

Outra via que também pode levar à exposição ao PS envolve a apoptose intrínseca, um processo conhecido por regular a vida útil das plaquetas na circulação46. A ativação das proteínas BAK e BAX pró-apoptóticas resulta na ativação da caspase, que promove a externalização do PS, levando à depuração in vivo das plaquetas. Recentemente, foi sugerido que outro marcador de superfície plaquetária, P-selectina/CD62P, além da Anexina-V, seja usado para distinguir pró-coagulantes de plaquetas apoptóticas47. Espera-se que as plaquetas pró-coagulantes sejam positivas para os marcadores PS e P-selectina, enquanto as plaquetas apoptóticas são positivas para Anexina-V, mas negativas para P-selectina. No entanto, o tempo também é um fator diferenciador entre plaquetas pró-coagulantes e apoptóticas47. A geração de plaquetas pró-coagulantes in vitro é um processo rápido, enquanto a apoptose intrínseca é um processo mais lento, levando horas48. Nesse contexto, não é necessário o uso de marcadores adicionais para avaliar as plaquetas pró-coagulantes, simplificando o método. Aumentos sustentados na formação de plaquetas intracelulares de Ca2+ e pró-coagulante ocorrem em poucos minutos com agonistas muito fortes, como ionóforo ou ativação combinada com colágeno e trombina, enquanto um inibidor de BCL-XL (ou mimético de BH3) desencadeia a formação de plaquetas apoptóticas ativando BAK e BAX pró-apoptóticos, causando permeabilização da membrana externa mitocondrial, liberação de citocromo C, e ativação de caspases49.

Em conclusão, o protocolo aqui descrito facilita o isolamento de plaquetas purificadas e sua posterior caracterização quanto à atividade pró-coagulante usando equipamentos laboratoriais padrão e citometria de fluxo. Esse procedimento abre caminho para futuras pesquisas sobre plaquetas pró-coagulantes em amostras de sangue de pacientes, com potenciais aplicações na prática clínica, como o diagnóstico da rara síndrome de Scott50.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A tubos de coleta de sangueBD Vacutainer366645
Anexina-V FITCBD Pharmingen560931
Apirase Grau VIISigma-AldrichA6410
Albumina de soro bovino 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Ácido cítrico monohidratadoMerck5949-29-1
Colágeno Stago86924
Glicose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionóforo Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Hidrogenocarbonato de sódioMerck6329NaHCO3
Trombina Hífen BiomedEZ 006 A
Citrato trissódico di-hidratado Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2
Oα Integrina IIb (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Referências

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