É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

1.7K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 de novembro de 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

Neste artigo

Resumo

A formação de plaquetas pró-coagulantes tem sido correlacionada com um risco aumentado de trombose. Apresenta-se aqui um protocolo preciso para isolar plaquetas lavadas do sangue humano, destinado a quantificar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas, que são características distintivas das plaquetas pró-coagulantes.

Resumo

As plaquetas ativadas promovem a coagulação principalmente expondo o fosfolipídio pró-coagulante fosfatidilserina (PS) em suas superfícies externas de membrana e liberando microvesículas que expressam PS que retêm a arquitetura original da membrana e os componentes citoplasmáticos de suas células de origem. A acessibilidade da fosfatidilserina facilita a ligação dos principais fatores de coagulação, amplificando significativamente a eficiência catalítica das enzimas de coagulação, enquanto a liberação de microvesículas atua como um mediador fundamental da sinalização intercelular. As plaquetas pró-coagulantes desempenham um papel crucial na estabilização do coágulo durante a hemostasia, e sua proporção aumentada na corrente sanguínea se correlaciona com um risco aumentado de trombose. Também foi demonstrado que as microvesículas plaquetárias são ricas em fatores de crescimento que promovem a cicatrização de feridas e a modulação inflamatória. A análise da exposição à fosfatidilserina e da liberação de microvesículas por citometria de fluxo apresenta desafios significativos devido ao seu pequeno tamanho e ao número limitado de eventos positivos para marcadores de interesse. Apesar dos avanços consideráveis na última década, os métodos para avaliar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas continuam sendo um trabalho em andamento. Infelizmente, não existe um protocolo único universalmente aplicável, e vários fatores devem ser avaliados para determinar a metodologia mais apropriada para cada aplicação específica. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolamento de plaquetas lavadas do sangue humano, seguido de ativação de colágeno e/ou trombina, para medir a exposição da liberação de fosfatidilserina e microvesículas que caracterizam as plaquetas pró-coagulantes. Este protocolo foi desenvolvido para facilitar a preparação inicial do plasma rico em plaquetas e o isolamento das plaquetas lavadas. Finalmente, a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas são quantificadas por citometria de fluxo, permitindo a identificação de plaquetas pró-coagulantes.

Introdução

A formação de pró-coagulante plaquetário é crucial para manter a hemostasia 1,2,3. Esse processo envolve a expressão de fosfolipídios induzida por agonistas na membrana plaquetária, o que é essencial para a montagem de complexos de tenase e protrombinase 1,3,4. Após a ativação plaquetária, as microvesículas plaquetárias também são liberadas continuamente 5,6. Microvesículas (50 nm a mais de 1 μm de diâmetro) encapsulam tanto a estrutura da membrana quanto os constituintes citoplasmáticos das células originárias 7,8. As microvesículas são importantes mediadores da sinalização intercelular 9,10 e também repositórios de fatores de crescimento que promovem a cicatrização de feridas e a modulação inflamatória11,12. As microvesículas também foram sugeridas como sendo 50 a 100 vezes mais pró-coagulantes do que as plaquetas ativadas13. Notavelmente, evidências recentes sugerem que as plaquetas armazenadas são ativadas, levando à produção de microvesículas - isso tem ramificações potenciais para a prática da terapia transfusional de plaquetas. A duração prolongada do armazenamento das microvesículas e a atividade pró-coagulante aumentada as tornam um substituto promissor para as plaquetas em aplicaçõestransfusionais 14.

Inovações metodológicas têm sido feitas para, direta e indiretamente, avaliar a formação de pró-coagulantes plaquetários em condições de saúde e doença 4,14,15. Avaliações da exposição à fosfatidilserina e liberação de microvesículas usando plaquetas purificadas forneceram novos dados sobre como as respostas pró-coagulantes plaquetárias são perturbadas em diversas doenças humanas 1,4. Esse crescente campo de pesquisa também abre caminhos para intervenções terapêuticas 1,4. No entanto, o isolamento e a análise de plaquetas purificadas do sangue são demorados, requerem equipamentos laboratoriais especializados e, portanto, não são atualmente adaptáveis para diagnósticos clínicos de rotina16,17. A análise da exposição à fosfatidilserina e da liberação de microvesículas também é desafiadora devido ao seu pequeno tamanho e ao número de eventos positivos para marcadores de interesse18,19.

A citometria de fluxo, aproveitando a ligação fluorescente da Anexina-V, tem sido uma pedra angular na avaliação da expressão de PS em plaquetas e microvesículas desde sua criação, há duas décadas20. Ganhou ampla aceitação no exame de plaquetas e microvesículas pró-coagulantes21,22. Portanto, é apresentado aqui um protocolo otimizado que pode ser utilizado para o isolamento de plaquetas purificadas de amostras de sangue utilizando a técnica desenvolvida pelo grupo de Cazenave23, e a posterior caracterização da exposição à fosfatidilserina e liberação de microvesículas por citometria de fluxo após ativação plaquetária24. Este protocolo facilitará um estudo mais aprofundado e a caracterização aprofundada de plaquetas pró-coagulantes em populações clínicas de interesse.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do Hospital Universitário de Bordeaux. Amostras de sangue foram obtidas de voluntários saudáveis que forneceram consentimento informado, e essas amostras foram processadas de acordo com protocolos institucionais. Os doadores que haviam tomado quaisquer substâncias que pudessem afetar a função plaquetária foram excluídos se tais substâncias fossem tomadas nos 10 dias anteriores aos experimentos. O consentimento informado foi obtido de voluntários saudáveis para coletar seu sangue e publicar seus dados. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coleta de sangue e preparação de plaquetas lavadas

  1. Colete sangue venoso periférico em tubos de coleta contendo o anticoagulante ativo Citrato Trissódico com Ácido Cítrico e Dextrose (ACD) após descartar os primeiros 3 mL.
  2. Após a coleta, inverta suavemente o tubo para misturar o sangue com a DAC e deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 15 minutos antes da centrifugação.
  3. Conte as plaquetas usando um contador de células automatizado antes da centrifugação para determinar a velocidade correta de centrifugação (Tabela 1). Prepare o plasma rico em plaquetas (PRP) por centrifugação a 250 x g por 10 min em temperatura ambiente (RT) sem aplicar o freio para otimizar a recuperação de plaquetas.
    NOTA: Esta etapa produzirá três camadas na amostra: a camada superior contendo plasma, plaquetas e uma pequena fração de glóbulos brancos; uma camada intermediária enriquecida com glóbulos brancos; e uma camada inferior composta por glóbulos vermelhos. Transfira cuidadosamente o PRP da camada superior para um novo tubo cônico de 50 mL para evitar a contaminação com glóbulos vermelhos e brancos.
  4. Ao PRP, adicione 1 mL de ACD-A (ver Tabela 2) e 6,25 μL de apirase por 9 mL.
    NOTA: A apirase, na concentração de 0,02 U/mL, degrada traços de ATP ou ADP secretados pelas plaquetas, impedindo a dessensibilização dos receptores de ADP plaquetários e mantendo a forma plaquetária25. Um inibidor da prostaciclina PGI2 (0.5 μM) também pode ser incluído com a apirase para prevenir a ativação plaquetária.
  5. Preparar o sedimento de plaquetas por centrifugação a RT a 1100 x g durante 10 min. Aspire o sobrenadante contendo Plasma Pobre em Plaquetas (PPP) usando um método suave, como uma pipeta de Pasteur, e ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão de lavagem (ver Tabela 3 e Tabela 4). Homogeneizar suavemente com uma pipeta e, em seguida, adicionar mais 3-4 mL de tampão de lavagem.
    NOTA: O nível de cálcio é reduzido para evitar a coagulação com os fatores de coágulo presentes no plasma. Nesse estágio, o plasma pobre em plaquetas foi completamente removido, impedindo a formação de coágulos e a ativação plaquetária pela produção de trombina.
  6. Centrifugue novamente em RT a 1100 x g por 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de lavagem. Transfira 150 μL da suspensão plaquetária para um tubo de 1,5 mL para contagem de células usando um contador de células automatizado. Em seguida, ressuspenda o pellet com 3-4 mL de tampão de lavagem.
  7. Efectuar uma centrifugação final a 1100 x g durante 10 min (a RT). Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de plaquetas num volume de tampão de reacção (ver quadro 5 e quadro 6) para atingir uma concentração final de 5 x 1011 plaquetas/l.
  8. Deixe as plaquetas lavadas descansarem por pelo menos 30 minutos antes dos experimentos para permitir que os inibidores residuais se desgastem e para que as plaquetas se aclimatem ao tampão.

2. Preparação do ensaio

  1. Prepare todos os agonistas e fluorocromos no tampão de reação. Adicione 5 μL de trombina a 45 μL de tampão (diluição 1:10) e 5 μL de ionóforo a 495 μL de tampão (diluição 1:500).
    1. Para ensaios internos, compare as plaquetas não ativadas com aquelas tratadas com agonistas únicos e duplos. Adicionar, em diferentes alíquotas, 100 μL de plaquetas lavadas a 50 x 109 plaquetas/L a: i) 10 μL de tampão de reação, ii) 3 μL de colagénio não diluído (concentração final de 30 μg/ml), iii) 10 μL de trombina pré-diluída (0,5 UI/ml), iv) 3 μL de colagénio não diluído + 10 μL de trombina pré-diluída e v) 10 μL de ionóforo pré-diluído (concentração final de 2 μM), que é conhecido por aumentar diretamente os níveis de cálcio intracelular, como observado anteriormente26.
      NOTA: O tratamento com um ionóforo de cálcio, como A23187 ou ionomicina, é crítico, pois induz uma extensa embaralhamento da membrana fosfolipídica e maior externalização do PS.
    2. Agitar suavemente cada alíquota com a mão e incubar a 37 °C durante 5 min.
      NOTA: Uma incubação de agonistas mais longa (30 min) pode permitir uma melhor diferenciação entre as populações de plaquetas durante o processo de análise por citometria de fluxo.
  2. Adicione 5 μL de Annexin-V FITC não diluído a cada microtubo e incube em temperatura ambiente por 10 min no escuro.
    NOTA: Um anticorpo monoclonal contra um dos receptores específicos de plaquetas, GPIX (CD42b) ou integrina αIIb (CD41, GPIIb), também pode ser incluído para identificar melhor as células plaquetárias.
  3. Adicionar 500 μL de tampão de reacção para interromper o processo e proceder à análise da amostra utilizando um citómetro de fluxo.

3. Caracterização de plaquetas e microvesículas pró-coagulantes por citometria de fluxo (FC)

NOTA: Para uma análise confiável da função plaquetária, utilize um instrumento de citometria de fluxo (FC) configurado de acordo com os padrões estabelecidos27. O instrumento deve ser capaz de detectar dispersão direta (FSC) e pelo menos um sinal de fluorescência. Defina os detectores de dispersão de luz e fluorescência para ganho logarítmico. Dilua as amostras adequadamente para FC para garantir que apenas plaquetas individuais sejam contadas em uma velocidade reduzida de aquisição de dados.

  1. Defina o citômetro de fluxo para uma taxa de fluxo 'lenta' com um limite de pelo menos 10.000 eventos plaquetários. Monitore a emissão de fluorescência usando um filtro de passagem para FITC.
  2. Bloqueie a população de plaquetas usando dispersão direta (FSC). Examine as plaquetas e microvesículas liberadas de acordo com seus tamanhos. Use gráficos de densidade para identificar plaquetas e microvesículas liberadas para plaquetas em repouso e estimuladas; analise cada população fechada de forma independente.
  3. Distinguir as plaquetas pró-coagulantes de acordo com o eixo FL1. Coloque o ponto de corte negativo na extremidade direita da população de plaquetas no estado de repouso (ou seja, na presença de tampão de reação). Após a ativação plaquetária, classifique todos os eventos localizados à direita desse ponto de corte como plaquetas expondo fosfatidilserina.
  4. Diferenciar as microvesículas, sendo menores que as plaquetas, por suas características únicas de dispersão de luz. Defina o ponto de corte no valor mais baixo do FSC observado na população de plaquetas em repouso. Após a ativação, classifique quaisquer eventos positivos para fosfatidilserina abaixo desse limite como microvesículas.
    NOTA: Considere a variação individual no tamanho das plaquetas ajustando o ponto de corte, se necessário. Certifique-se de que menos de 1% das microvesículas estejam presentes no estado de repouso.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A quantificação de plaquetas e microvesículas pró-coagulantes é obtida usando a coloração com Anexina-V, com pelo menos 50.000 eventos registrados por amostra. Conforme declarado na etapa 2.2, as medições plaquetárias basais foram obtidas de amostras incubadas com tampão de reação, conforme ilustrado na Figura 1A. Os tamanhos das plaquetas foram medidos usando o valor mediano de dispersão direta (FSC). Embora o FSC seja influenciado por vários fatores, ele continua sendo um proxy comum para ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Estudos recentes sobre plaquetas pró-coagulantes têm destacado suas alterações durante várias doenças 1,28,29, ressaltando a importância de sua análise e caracterização detalhadas 30,31,32. Embora os testes clínicos atuais para avaliar a formação de pró-coagulantes plaquetários sejam limitados, houve um...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A tubos de coleta de sangueBD Vacutainer366645
Anexina-V FITCBD Pharmingen560931
Apirase Grau VIISigma-AldrichA6410
Albumina de soro bovino 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Ácido cítrico monohidratadoMerck5949-29-1
Colágeno Stago86924
Glicose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionóforo Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Hidrogenocarbonato de sódioMerck6329NaHCO3
Trombina Hífen BiomedEZ 006 A
Citrato trissódico di-hidratado Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2
Oα Integrina IIb (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Referências

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Plaquetas Pró-coagulantesAtivação PlaquetáriaCitometria de FluxoPlaquetas LavadasPlasma Rico em PlaquetasIsolamento de PlaquetasAtivação por ColágenoAtivação por Trombina
Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.