Sintetizando Nanopartículas Lipídicas por Fluxo Turbulento em Misturadores de Jato de Impacto Confinado

Sai Nikhil Subraveti; Brian K. Wilson; Navid Bizmark; Jason Liu; Robert  K. Prud'homme

doi:10.3791/67047

Artigo de método

Sintetizando Nanopartículas Lipídicas por Fluxo Turbulento em Misturadores de Jato de Impacto Confinado

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DOI:

10.3791/67047

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23 de agosto de 2024

Sai Nikhil Subraveti¹ , Brian K. Wilson¹ , Navid Bizmark¹ , Jason Liu¹ , Robert K. Prud'homme¹

¹Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

Neste artigo

Resumo

Um protocolo detalhado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) usando tecnologias de misturador de jato de impacto confinado (CIJ), incluindo um CIJ de dois jatos e um misturador de vórtice de entrada múltipla de quatro jatos (μMIVM), é demonstrado. Os misturadores CIJ geram ambientes de micromistura turbulentos e reprodutíveis, resultando na produção de LNPs monodispersos.

Resumo

As nanopartículas lipídicas (LNPs) demonstraram seu enorme potencial como veículos terapêuticos, conforme evidenciado pela aprovação e uso global de duas vacinas de RNA mensageiro (mRNA) COVID-19. Em pequena escala, os LNPs são frequentemente feitos usando microfluídica; no entanto, as limitações desses dispositivos impedem seu uso em larga escala. As vacinas COVID-19 são fabricadas em grandes quantidades usando misturadores turbulentos de jato de impacto confinado (CIJ). A tecnologia CIJ permite a produção em escala laboratorial com a confiança de que pode ser dimensionada para volumes de produção. Os conceitos-chave na mistura CIJ são que o comprimento da mistura e a escala de tempo são determinados pela intensidade da turbulência na cavidade de mistura e que a formação de nanopartículas ocorre longe das paredes, eliminando o problema de deposição em superfícies e incrustações. Este trabalho demonstra o processo de fabricação de LNPs usando a tecnologia de misturador de jato de impacto confinado com duas geometrias: o CIJ de dois jatos e o misturador de vórtice de entrada múltipla de quatro jatos (MIVM). As vantagens e desvantagens de cada geometria de mistura são discutidas. Nessas geometrias, os LNPs são formados pela mistura rápida de um fluxo de solvente orgânico (geralmente etanol contendo lipídios ionizáveis, co-lipídios e lipídios estabilizadores de PEG) com um fluxo aquoso anti-solvente (tampão aquoso contendo RNA ou DNA). Os parâmetros operacionais para os misturadores CIJ e MIVM são apresentados para preparar LNPs reprodutíveis com tamanho controlado, potencial zeta, estabilidade e eficácia de transfecção. As diferenças entre LNPs feitos com mistura pobre (soluções de pipetagem) em comparação com a mistura CIJ também são apresentadas.

Introdução

A terapêutica baseada em mRNA tem grande potencial para o tratamento e prevenção de uma ampla gama de doenças, incluindo doenças infecciosas, distúrbios genéticos e cânceres¹. Ao contrário da terapêutica de moléculas pequenas, que pode se difundir passivamente através da membrana celular, os ácidos nucléicos devem ser encapsulados para entrega intracelular². O encapsulamento fornece estrutura e estabilidade ao mRNA, facilitando sua entrega intracelular por vias endocíticas, bem como evitando a degradação de componentes intra e extracelulares, como nucleases³. Uma série de materiais e nanocarreadores foram desenvolvidos para o encapsulamento e entrega de mRNA, incluindo nanopartículas inorgânicas, polímeros, lipídios e materiais semelhantes a lipídios¹. Entre estes, os LNPs emergiram como a plataforma de entrega mais proeminente para terapias baseadas em mRNA⁴.

Os LNPs são compostos por quatro componentes lipídicos: lipídio ionizável, colesterol, lipídio zwitteriônico e estabilizador lipídico PEG⁵. Os lipídios ionizáveis adequados para entrega de mRNA exibem um equilíbrio cuidadoso entre a hidrofobicidade lipídica e a constante de dissociação (pKa) de um grupo amina ternária⁶. O pKa lipídico ionizável normalmente tem um pH entre 6,0 e 6,7, como KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) e ALC-0315⁷. Essa restrição de pKa no lipídio ionizável permite tanto o encapsulamento de polímeros de ácidos nucleicos como sais lipídicos hidrofóbicos quanto a entrega intracelular por meio de um processo de "escape de endossomos". Os LNPs entram em uma célula-alvo através de (várias) vias de endocitose que envolvem a acidificação do endossomo de pH 7,4 a pH ~ 5⁸. O pKa lipídico ionizável garante que os LNPs tenham superfícies quase neutras em condições fisiológicas, mas se tornem catiônicos em um endossomo acidificante⁹. Essa resposta de pH permite a ruptura seletiva apenas da membrana endossômica, a liberação do polímero de ácido nucleico encapsulado e preserva a viabilidade celular, ao contrário dos lipídios catiônicos permanentemente usados em sistemas de transfecção como a lipofectamina. O colesterol é uma molécula intersticial hidrofóbica na estrutura do LNP que melhora a fluidez lipídica. O lipídio zwitteriônico desempenha um papel estrutural e forma uma bicamada na superfície do LNP. O poli(etilenoglicol)-lipídio (PEG-lipídio) é um estabilizador coloidal que aumenta a estabilidade do LNP, conferindo um estabilizador estérico polimérico na superfície do LNP, que resiste à agregação de LNPs. Isso estabiliza o LNP, particularmente durante as mudanças no pH que regeneram a forma de base livre do lipídio ionizável que se comporta como um óleo hidrofóbico. A receita de Onpattro (patisiran) (doravante, referida como formulação LNP) é frequentemente usada como ponto de partida para a formulação de LNP com lipídio ionizável MC3, colesterol, distearoilfosfatidilcolina (DSPC) e PEG2000-DMG dissolvido em etanol misturado contra uma solução aquosa de RNA¹⁰.

Várias técnicas podem ser usadas para fabricar LNPs encapsulando polímeros de ácido nucleico, com a maioria delas contando com um tema comum de misturar rapidamente um fluxo de etanol contendo lipídios com um fluxo aquoso incorporando o ácido nucléico de interesse (siRNA, mRNA ou DNA) ⁹ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴. Nesse sentido, os processos de mistura em massa, como a mistura de pipetas e a mistura de vórtices, oferecem uma estratégia simples para formar LNPs que elimina a necessidade de usar instrumentos sofisticados¹². No entanto, a mistura em massa não fornece uma distribuição homogênea de componentes, levando a uma distribuição de tamanho LNP abaixo do ideal, juntamente com uma variabilidade significativa de lote para lote¹⁵.

Os laboratórios usam rotineiramente técnicas de mistura microfluídica para obter LNPs reprodutíveis, obtendo um controle mais preciso sobre as condições de mistura 12,13,16. No entanto, as condições de fluxo laminar em dispositivos microfluídicos, que são inerentes devido às pequenas escalas de comprimento e baixas velocidades em uma câmara microfluídica, resultam em uma mistura solvente/antissolvente comparativamente lenta¹⁷. As dimensões da pequena câmara limitam severamente o rendimento e a escalabilidade necessários para a produção de LNPs GMP, mas os pesquisadores paralelizaram as câmaras microfluídicas para tentar dimensionar os volumes de produção¹⁵. Uma geometria microfluídica paralelizada não elimina o problema de adsorção de lipídios em superfícies durante o processamento de grandes volumes, um problema comumente referido como "incrustação" do dispositivo de mistura, e há problemas com uniformidade e estabilidade de fluxos que tornam o aumento de escala microfluídica desafiador para a produção em escala industrial^18,19. Não é surpreendente que as empresas farmacêuticas tenham usado misturadores de jato turbulentos para fabricar mRNA-LNPs de vacinação COVID-19²⁰.

O processo de produção de LNPs carregados de RNA envolve a mistura de um fluxo tampão aquoso contendo a carga útil de RNA com um fluxo de etanol contendo os quatro componentes lipídicos distintos. Essas formulações utilizam um tampão ácido com pH de 4,0 ou menos, que carrega o lipídio ionizável à medida que os fluxos aquoso e etanólico se misturam. Os lipídios ionizáveis carregados positivamente interagem eletrostaticamente com os RNAs carregados negativamente, formando um sal lipídico de RNA hidrofóbico. Espécies lipídicas hidrofóbicas, incluindo o sal lipídico de RNA, precipitam nos solventes mistos e formam núcleos hidrofóbicos. Esses núcleos crescem através da precipitação de lipídios e colesterol zwitteriônicos até atingir um ponto crítico onde lipídios peguilados suficientes são adsorvidos na superfície dos LNPs, interrompendo o crescimento adicional - nucleação e mecanismo de crescimento²¹ ^, ²² ^, ²³ . A adição de tampão aquoso à solução lipídica, na medida em que os lipídios precipitam e os LNPs se formam, depende de duas escalas de tempo distintas: o período de mistura solvente-antissolvente, τ_mix, e o período de crescimento dos núcleos, τ_agg. O número de Damköhler adimensional, definido como Da = τ_mix/τ_agg, captura a interação entre essas escalas de tempo²⁴. Em casos de mistura lenta (Da > 1), o tamanho final dos LNPs é controlado por transporte e varia com o tempo de mistura. Por outro lado, durante a mistura rápida (Da < 1), o fluido é fragmentado em estrias ou camadas de comprimento de Kolmogrov, em que a formação de LNP é governada exclusivamente pela difusão molecular de cada constituinte, resultando em cinética homogênea de formação de LNP. Alcançar este último cenário exige que a concentração lipídica exceda um limite crítico, estabelecendo um estado de supersaturação propício à nucleação homogênea uniforme.

Estima-se que τ_agg varia de algumas dezenas a algumas centenas de milissegundos²⁵. Em sua configuração mais básica, os dois fluxos, um contendo etanol com lipídios e outro contendo um tampão aquoso com carga de RNA, são injetados em uma câmara conhecida como misturador de "jato de impacto confinado" (CIJ). Os vórtices turbulentos produzem escalas de comprimento de estriação solvente/antissolvente de 1 μm em 1,5 ms quando operados em velocidades apropriadas. As velocidades dos fluxos e a geometria de mistura determinam a conversão do momento linear em vórtices turbulentos que misturam os fluxos. Isso é parametrizado pelo número adimensional, o número de Reynolds (Re), que é linearmente proporcional às velocidades do fluxo. Re é calculado a partir de Re = Σ (V_iD_i / v_i), onde V_i é a velocidade do fluxo em cada vapor, v_i é a viscosidade cinemática de cada fluxo e D_i é o diâmetro de entrada do fluxo em dispositivos CIJ de 2 jatos²⁶ ou o diâmetro da câmara em MIVMs de 4 jatos²⁷. Nota: Algumas referências para o CIJ usam apenas um único diâmetro e velocidade do jato para definir Re²⁸. Re está na faixa de 1-100 em um dispositivo microfluídico, enquanto nos dispositivos CIJ, Re de 125.000 pode ser alcançado. Em um misturador CIJ, fluxos com momento igual colidem, dissipando seu momento com o impacto como mistura turbulenta, o que leva a uma micromistura eficiente devido às pequenas microescalas de Kolmogorov e ao pequeno número de Damköhler. Outro tipo de mixer é o "mixer de vórtice de entrada múltipla" (MIVM), onde quatro fluxos são direcionados para uma câmara central. Nesta configuração, fluxos contínuos para a câmara de mistura confinada garantem uma escala de tempo de mistura bem definida. Todos os elementos fluidos passam pela zona de mistura de alta energia em ambos os tipos de misturadores. Em contraste, dispositivos de mistura simples, como junções em T, não contêm uma câmara que forneça uma zona de mistura, resultando em menos mistura dos dois fluxos devido ao momento do fluxo de entrada ser amplamente desviado para a direção de saída, em vez de para a geração de vórtices turbulentos. Os misturadores CIJ e MIVM podem ser operados em batelada ou contínuos, oferecendo flexibilidade para a produção de LNP em várias escalas.

Este protocolo descreve como as formulações ideais de LNP são feitas empregando duas tecnologias de jato de impacto confinado: CIJ de 2 jatos e misturadores MIVM de 4 jatos. A operação dos misturadores CIJ e MIVM foi demonstrada anteriormente para a preparação de NPs com materiais de núcleo hidrofóbico²⁹. Esse artigo e vídeo devem ser consultados como um recurso adicional sobre a formação de NPs com esses mixers. Esta atualização se concentra na formação de NP à base de lipídios. A capacidade de ajustar o tamanho dos LNPs variando as condições de micromistura é demonstrada. Além disso, é demonstrada a utilidade das tecnologias CIJ na formação de LNPs estáveis e monodispersos com eficiências de transfecção in vitro aprimoradas em células HeLa quando comparadas a LNPs feitas com mistura de pipeta pobre. Além disso, são discutidas as vantagens e desvantagens de cada geometria de mistura CIJ, juntamente com as condições apropriadas necessárias para o aumento de escala desses misturadores.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de tampões, fluxos de solventes e antissolventes

Dissolva todos os componentes lipídicos em etanol em determinadas concentrações de massa, conforme mostrado na Tabela 1, para fazer uma formulação de patisiran LNP¹⁰. Antes da utilização, aquecer as soluções a 37 °C com uma sonicação suave para dissolver novamente os sólidos precipitados.
NOTA: Soluções de estoque maiores de vários mililitros podem ser preparadas e armazenadas a 4 ° C.
Preparar uma solução tampão de acetato a uma concentração de 100 mM, pH 4, combinando 186 mg de acetato de sódio e 464 mg de ácido acético em 80 ml de água isenta de nuclease. Ajustar o pH com HCl ou NaOH concentrado conforme necessário e completar o volume final para 100 ml.
Preparar uma solução de reserva de HEPES a uma concentração de 1 M, pH 7,5, dissolvendo 23,82 g de sal HEPES em 80 ml de água isenta de nuclease. Ajustar o pH com HCl ou NaOH concentrado conforme necessário e completar o volume final para 100 ml.
Diluir o polímero de ácido nucleico de interesse e o tampão de acetato de 100 mM com água livre de nuclease para produzir uma solução de 300 μg/ml de RNA em tampão de acetato de 30 mM. Prepare um volume adequado de solução de trabalho para os experimentos projetados, e este protocolo requer 1500 μL no total para os misturadores CIJ e MIVM.
NOTA: O RNA obtido do fornecedor já estará em um tampão apropriado, normalmente a uma concentração de 10 mg/mL (RNA de levedura) ou 1 mg/mL (mRNA codificador de luciferase, LucRNA ou mRNA CODIFICADOR DE GFP, GFP-RNA). O RNA de levedura pode ser usado como um RNA modelo de baixo custo para precipitações.

2. Formulação de LNPs usando um misturador CIJ de dois jatos

Preparação e limpeza de equipamentos
1. Limpe os misturadores CIJ imediatamente antes de usar, lavando o misturador com etanol. Encha duas seringas de 5 mL com etanol e trave cada uma em uma porta de entrada do CIJ. Pressione rapidamente as seringas e colete o efluente do misturador como resíduo.
  NOTA: Os misturadores CIJ podem ser construídos e operados conforme descrito anteriormente²⁹. Vários suportes de suporte podem ser usados para segurar o misturador CIJ, incluindo um suporte de anel, suporte de tubo de centrífuga ou frasco Erlenmeyer. Os fornecedores da JIC estão listados na Tabela de Materiais e no Arquivo Suplementar 1.
2. Remova as seringas de descarga de etanol do CIJ. Essas seringas podem ser armazenadas e reutilizadas para enxágues adicionais de etanol da CIJ.
3. Seque os canais internos do CIJ soprando um fluxo de nitrogênio seco através dos adaptadores de entrada. Use apenas ar seco e filtrado que não esteja contaminado com névoa de óleo da bomba ou aerossóis se o nitrogênio não estiver disponível.
Preparação de fluxos de solvente e anti-solvente
1. Misture as soluções de estoque lipídicas e dilua com etanol adicional para produzir 500 μL da solução lipídica de 6 mg / mL listada na Tabela 1 em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  NOTA: Esta formulação é a composição Onpattro comumente usada contendo 50% mol MC3, 10% mol DSPC, 38,5% mol colesterol e 1,5% mol% DMG-PEG2000.
2. Diluir o tampão de acetato de pH 4 de 100 mM para 10 mM em um volume total de 4 mL como banho de têmpera de efluentes do misturador CIJ.
  NOTA: Uma barra de agitação magnética também pode ser adicionada ao banho de têmpera.
3. Retire 500 μL da solução de RNA preparada na etapa 1.4 em uma seringa de 1 mL. Inverter a seringa e expulsar o ar deste fluxo aquoso de antissolvente contendo polímero de ácido nucleico.
4. Retirar 500 μL da solução lipídica preparada no passo 2.2.1 numa seringa de 1 ml. Inverter a seringa e expulsar o ar deste fluxo de solvente etanólico que contém lípidos.
Produção de LNP em um misturador de jato de tinta
1. Posicione o misturador CIJ limpo sobre o frasco para injetáveis do banho de têmpera.
  NOTA: Um suporte de anel clamp ou rack de tubo é um suporte conveniente para o misturador CIJ. Consulte a Figura 1A para obter uma configuração típica de JIJ.
2. Acople as duas seringas preenchidas na etapa 2.2.3 e na etapa 2.2.4 às portas de entrada do misturador CIJ.
3. Pressione ambas as seringas rapidamente para misturar os fluxos de solvente e antissolvente e coletar NPs lipídicas no banho de têmpera.
  NOTA: as seringas devem ser avançadas rapidamente (em menos de 1 s), mas de forma suave e uniforme. O fluxo assimétrico ou o fluxo lento produzirão LNPs grandes e polidispersos.
4. Remova o misturador CIJ sobre o banho de têmpera com as seringas ainda colocadas.
  NOTA: Não remova as seringas nem permita que o volume de retenção flua para o banho de têmpera, pois este material é mal misturado e afetará adversamente as propriedades de dispersão da produção se misturado ao banho de têmpera.
5. Segure o CIJ sobre um recipiente de resíduos e remova as seringas, permitindo que o volume residual de retenção flua para o recipiente de resíduos. Elimine estas seringas e repita o processo de limpeza conforme descrito na secção 2.1.
6. Analise os LNPs produzidos com o CIJ, conforme descrito na seção 5 abaixo.

3. Formulação de LNPs usando um misturador MIVM de quatro jatos

Montagem de um misturador MIVM, conhecido como MIVM de tamanho micro (μMIVM) para distingui-lo de modelos maiores usados para produção em escala
1. Reúna todos os componentes individuais necessários para montar um misturador MIVM: o receptor inferior, o disco de geometria de mistura, o disco superior, o O-ring e a chave inglesa.
  NOTA: A construção, montagem e operação do MIVM foram demonstradas anteriormente para o encapsulamento de espécies hidrofóbicas, e os fornecedores estão listados no Arquivo Suplementar 1 e na Tabela de Materiais²⁹. Consulte a Figura 2 para obter um esquema dos componentes e da terminologia do suporte do mixer.
2. Encaixe o O-ring na ranhura do disco de mistura.
3. Alinhe os orifícios do disco de mistura com os pinos no disco superior e empurre-os juntos sem desalojar o O-ring.
4. Aparafuse o disco de mistura acoplado, o O-ring e o conjunto do disco superior no receptor inferior frouxamente.
  NOTA: Remova a tubulação de saída do receptor inferior antes desta etapa.
5. Aperte o disco superior no receptor inferior usando a chave inglesa.
  NOTA: Um composto antigripante de grau alimentício ou farmacêutico pode ser aplicado às roscas do disco superior se for observada escoriação da rosca.
6. Insira e aperte o encaixe da tubulação de saída no receptor inferior para completar o MIVM.
7. Monte o MIVM montado no suporte do misturador de forma que a tubulação de saída saia pela placa de suporte.
  NOTA: O procedimento de ajuste do suporte do misturador MIVM deve ser realizado periodicamente para garantir que as paradas mecânicas no suporte do misturador estejam configuradas corretamente²⁹.
Preparação de fluxos de solvente e anti-solvente
1. Misture as duas soluções de fluxo de solvente lipídico etanólico em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, conforme indicado na Tabela 2, diluindo as soluções de estoque lipídico e adicionando etanol adicional conforme necessário para atingir uma concentração lipídica final de 6 mg / mL.
  NOTA: Esta é a mesma composição da solução lipídica que em 2.2.1, mas com um volume total de 1000 μL.
2. Diluir o tampão de acetato de pH 4 de 100 mM para 10 mM em um volume total de 8 mL como banho de resfriamento de efluentes MIVM.
  NOTA: Uma barra de agitação magnética também pode ser adicionada ao banho de têmpera.
Formulação de LNPs usando um misturador MIVM
1. Coloque o banho de têmpera de 8 mL embaixo do suporte do misturador para que a tubulação de saída seja esvaziada no banho de têmpera.
2. Retire os fluxos de solvente e antissolvente em seringas estanques a gás de 1 mL usando uma agulha de ponta romba. Remova todas as bolhas de ar e descarte a agulha. Prepare cada seringa invertendo e expelindo o ar da seringa.
3. Monte as quatro seringas na batedeira no sentido horário (Seringas 1-4, Tabela 2) com os mesmos jatos nos lados opostos. Consulte a Figura 1B para obter o esquema de aparência final.
4. Segure a caixa do mancal em ambos os lados da placa móvel. Evite colocar os dedos na face inferior da caixa, pois isso representa um risco de esmagamento devido aos batentes mecânicos. Abaixe cuidadosamente a placa móvel até que ela se apoie uniformemente nas seringas.
  NOTA: Os êmbolos da seringa devem estar todos a uma altura igual antes da operação.
5. Pressione a placa de forma constante e suave, com o objetivo de completar a operação em cerca de 0,5 s a 1 s para esses volumes de fluxo.
6. Tampe o banho de resfriamento, que contém a dispersão LNP.
7. Execute a limpeza do MIVM após o uso, seguindo as instruções do passo 3.5 abaixo.
Formulação de LNPs usando um misturador MIVM acionado por uma bomba de seringa
1. Monte o MIVM conforme descrito na etapa 3.1.
2. Prepare as soluções solvente e anti-solvente na composição desejada e em um volume suficiente para o tamanho de formulação necessário (Tabela 3).
  NOTA: Estas são as mesmas composições que os fluxos de antissolvente aquoso (etapa 1.4) e solvente etanólico (etapa 3.2.1), mas são ampliadas para uso com os volumes maiores de seringa na Tabela 3.
3. Carregue as soluções em seringas estanques a gás com volumes de 20 mL e conecte o tubo de PTFE com um adaptador luer instalado na extremidade. Prepare as seringas e o tubo invertendo a seringa e o tubo e, em seguida, expelindo o ar.
4. Monte as seringas em uma bomba de seringa e conecte as seringas às entradas do misturador no MIVM, conforme mostrado na Figura 3A.
  NOTA: O JIC também pode ser operado por meio de bombas da mesma maneira, mas com apenas uma seringa anti-solvente e de fluxo de solvente.
5. Diluir o tampão de acetato de pH 4 de 100 mM para 10 mM em um volume total de 320 mL como banho de têmpera de efluentes MIVM.
6. Coloque o banho de têmpera embaixo da saída MIVM.
7. Defina a taxa de fluxo volumétrico na bomba de seringa para 20 mL / min.
  NOTA: As taxas de fluxo volumétrico podem variar de 2 mL/min a 40 mL/min ajustando manualmente os valores na bomba de seringa para formar LNPs com diferentes condições de micromistura.
8. Ligue a bomba de seringa, mas deixe os primeiros 10 s de efluente fluírem para um copo de resíduos. Coletar o efluente MIVM no banho de têmpera após este período de fluxo de inicialização de 10 s.
9. Remova e tampe o banho de têmpera contendo dispersão de LNP feita na taxa de fluxo volumétrico selecionada (20 mL / min).
  NOTA: Este procedimento pode ser repetido para sintetizar LNPs em diferentes taxas de fluxo, selecionando volumes de banho de têmpera apropriados.
10. Limpe o MIVM entre cada experimento (ao alterar a taxa de fluxo) lavando pelo menos duas vezes o volume da tubulação de saída para evitar a coleta de LNPs feita na condição de taxa de fluxo anterior antes de iniciar a próxima síntese de LNP.
Limpeza do equipamento após o uso
1. Retire o misturador do suporte, mantendo as seringas presas e segure-o sobre um recipiente de lixo. Remova as seringas, deixando o volume de retenção escorrer para o recipiente. Em seguida, segure o conjunto do misturador de cabeça para baixo e use a chave inglesa para desmontar o misturador.
2. Enxágue a tubulação de saída com solvente (por exemplo, etanol) e seque com ar ou nitrogênio.
3. Enxágue a geometria de mistura com um solvente adequado, como água deionizada ou etanol, seguido de um enxágue com etanol. Seque os componentes usando uma corrente de ar ou nitrogênio.
4. Enxágue o O-ring com água deionizada e seque.
  NOTA: Se o O-ring parecer esticado ou deformado, deixe-o secar ao ar durante a noite antes de usá-lo. Mantenha um grande estoque de anéis de vedação, pois são peças consumíveis. Se a forma não se recuperar no dia seguinte, descarte o O-ring.
5. Enxágue bem o disco superior com solvente, usando um jato de ar ou nitrogênio para secar a superfície e as conexões da seringa.
6. Enxágue cada seringa com um bom solvente (por exemplo, água deionizada ou etanol). Aplique um enxágue final com etanol e seque ao ar antes do próximo uso.

4. Pós-processamento de LNPs

Troca de tampão e remoção de etanol
1. Dialise a dispersão de LNP contra um tampão HEPES de 10 mM a pH 7,4 utilizando um de diálise de tamanho apropriado com um cartucho de diálise de corte de peso molecular de 20 kDa.
  NOTA: Esta etapa remove o etanol residual de 10% e aumenta o pH de dispersão, substituindo o tampão acetato por HEPES.
2. Diluir o tampão HEPES 1 M para 10 mM num volume total de 1 L.
3. Carregue a dispersão de LNP em um de diálise de 12 mL usando uma seringa e uma agulha.
4. Mergulhe o cartucho de diálise no tampão HEPES de 1 L e agite magneticamente o tampão externo. Troque o tampão HEPES externo após 3 h e remova o cartucho de diálise após mais 3 h para um tempo total de diálise de 6 h.
5. Retire a dispersão de LNP dialisada do cartucho de diálise e descarte o cartucho gasto.
Concentração de suspensão LNP via ultracentrifugação
1. Pipetar a suspensão para um filtro centrífugo de tamanho adequado com um MWCO de 100kDa³⁰.
  NOTA: Os filtros centrífugos estão disponíveis em uma variedade de tamanhos, geralmente de 0,5 mL a 12 mL.
2. Centrifugue a dispersão a 2000 x g por 10-20 min (à temperatura ambiente) para aumentar a concentração por um fator de aproximadamente 5-20x.
  NOTA: Durante a centrifugação, verifique a amostra a cada 5 minutos para garantir que uma quantidade adequada de líquido permaneça.

5. Caracterização de LNPs

Medições de diâmetro hidrodinâmico com espalhamento dinâmico de luz (DLS)
1. Dispense 750 μL ou 900 μL da dispersão LNP preparada (sem diluições) em uma cubeta plástica micro ou quadrada, respectivamente.
  NOTA: Volumes menores também podem ser usados em cubetas apropriadas.
2. Defina a viscosidade apropriada para o solvente no qual os LNPs são dispersos (ou seja, 1,26 cP para mistura de etanol a 10 vol%).
3. Coletar a luz retroespalhada em um ângulo de 173° a 25 °C, seguida pela determinação do tamanho do LNP usando o modelo de Stokes-Einstein e o primeiro cumulante da expansão da série da função de correlação de espalhamento de luz, conforme definido no documento padrão ISO 13321:1996 E.
4. Repita as medições pelo menos três vezes.
Medições de potencial zeta
1. Adicione ~ 800 μL de dispersão LNP preparada em células zeta-sizer capilares dobradas.
  NOTA: Para evitar o aprisionamento de bolhas dentro do canal capilar, metade do líquido é dispensado nas células, mantido de cabeça para baixo e depois girado.
2. Repita as medições pelo menos três vezes.
  NOTA: A condutividade do tampão deve estar entre 0.2-2 miliSiemens/cm para obter melhores resultados.
Medições de eficiência de encapsulamento (EE) por kit de quantificação de RNA disponível comercialmente
1. Dilua a quantidade apropriada do tampão 20x Tris-EDTA (TE) em pH 7,5 fornecido no kit de ensaio para uma concentração de 1x usando água livre de nuclease.
2. Prepare uma solução Triton X-100 a 2% em peso.
3. Dilua a quantidade apropriada de dispersões de LNP no tampão 1x TE para obter uma concentração de massa total de aproximadamente 0,6 μg/mL para RNA, com teor de etanol abaixo de 0,2 vol%.
4. Prepare amostras semelhantes às da etapa anterior, mas contendo 0,5% em peso de Triton X-100, que efetivamente dissolve os LNPs, facilitando a diferenciação entre concentrações de RNA "livre" e total na ausência e presença de Triton X-100, respectivamente.
5. Prepare quantidades apropriadas de soluções de RNA de controle nas concentrações de 0 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,6 μg/mL, 0,8 μg/mL e 1,0 μg/mL no tampão 1x TE.
  NOTA: O kit de RNA pode precisar ser diluído inicialmente.
6. Repita a etapa anterior, mas a 0,5% em peso Triton X-100.
7. Dilua o corante Ribogreen (fornecido no kit) 200 vezes no tampão 1x TE.
8. Adicione volumes apropriados do corante Ribogreen diluído a todas as soluções de RNA e amostras de controle preparadas, com ou sem Triton X-100. O corante deve ser diluído igualmente entre o RNA de controle e as soluções de amostra por um fator de dois. Consequentemente, a diluição total do corante é 400 vezes maior do que sua concentração original no kit de ensaio.
9. Vortex misture os recipientes.
10. Prepare uma placa opaca de 96 poços, não tratada, de fundo plano, para análise em um leitor de placas.
11. Dispense volumes de 100 μL de amostras e controles de RNA em células separadas da placa.
  NOTA: Observe a formação de bolhas em soluções contendo Triton X-100. Pelo menos três réplicas são realizadas para cada amostra, exigindo pelo menos 350 μL de amostras.
12. Registre a intensidade de fluorescência usando o leitor de placas em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 528 nm, com uma duração de iluminação de aproximadamente 10 s por leitura. Não é necessário agitar.
  NOTA: O EE é determinado a partir de , onde I_{com Tritão} e I_{sem Tritão} representam a intensidade média de fluorescência de três réplicas de amostras com e sem Tritão X-100, respectivamente, e a_{com Tritão} e a_{sem Tritão} denotam a inclinação dos ajustes lineares para as duas curvas de calibração médias com e sem Tritão X-100, respectivamente³¹.

Resultados

A triagem de formulações ideais de LNP pode ser rapidamente alcançada com quantidades relativamente pequenas de material usando misturadores turbulentos CIJ de dois fluxos, desde que sejam operados em velocidades apropriadas. Um misturador μMIVM acionado por uma bomba de seringa programável, conforme ilustrado na Figura 3A, é utilizado para destacar a importância de obter micromistura suficiente, acima de um número crítico de Reynolds para formar LNPs pequenos e monodispersos. A Tabela 3 contém o resumo das formulações usadas para produzir LNPs, e a configuração do misturador segue o protocolo descrito na etapa 3.4. Os tamanhos de LNP foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz (DLS) em função do número de Reynolds. Conforme mostrado na Figura 3B, além de um Re crítico de 5000, LNPs pequenos e monodispersos são observados. Além disso, números altos de Reynolds (~ 10 4-10⁵) podem ser acessados quando as seringas são pressionadas uniformemente por operação manual ou usando o suporte de mistura (ponto de dados mais à direita na Figura 3B). O suporte de mistura, mostrado na Figura 2A, pressiona uniformemente todas as seringas simultaneamente²⁷. Como resultado, esses LNPs também têm tamanhos ideais. Com mistura inadequada (ou seja, muito pequena de um Re), LNPs maiores são formados. Fotos representativas de LNPs formadas em baixa (Foto 1) e alta Re (Foto 2) são mostradas na Figura 3B. As amostras feitas em baixa Re são turvas, indicando a presença de grandes estruturas de espalhamento de luz coloidal (efeito Tyndall), mas os LNPs formados em alta Re parecem claros devido ao espalhamento mais fraco e deslocado para o azul de colóides menores.

Os lipídios ionizáveis têm diferentes propriedades físico-químicas, que afetam as propriedades físico-químicas dos LNPs produzidos com formulações lipídicas idênticas. Um misturador CIJ (Figura 1A) é usado para testar isso. A Tabela 4 lista as formulações feitas com dois lipídios ionizáveis aprovados pela FDA: ALC-0315 e MC3. A Figura 4A mostra que os LNPs feitos em pH 5 de ALC-0315 são ~ 80 nm, enquanto os LNPs feitos usando MC3 são ~ 60 nm. Além disso, em pH 5, os MC3-LNPs têm um potencial zeta positivo (~ 28 mV), enquanto os ALC-LNPs têm um potencial zeta neutro (<10 mV). Essa distinção na carga de superfície, bem como no tamanho geral dos LNPs, surge do pKa dos dois lipídios. O MC3 apresenta maior pKa (6,44) quando comparado ao ALC0315 (6,09)³²; portanto, uma fração maior de lipídios MC3 é carregada em pH 5. Ambas as formulações têm estabilizador lipídico PEG-1,5 mol%; no entanto, os MC3-LNPs se estabilizam em um tamanho menor devido a maiores repulsões eletrostáticas durante a montagem do LNP durante a agregação limitada por difusão, o que interrompe o crescimento no tamanho menor. Ambas as formulações apresentam altas eficiências de encapsulamento (>90%), conforme mostrado na Figura 4B. A química dos lipídios é crucial para determinar as propriedades gerais, bem como o desempenho dos LNPs e, portanto, eles devem ser escolhidos cuidadosamente com base na aplicação alvo.

Os LNPs feitos usando ambas as geometrias do misturador turbulento (etapa 2.3 e etapa 3.3) têm propriedades físico-químicas semelhantes. Essa comparação é estendida aos LNPs feitos a partir de técnicas de mistura inadequadas, como a mistura de pipetas a granel, para ilustrar ainda mais a distinção entre misturadores turbulentos e técnicas de mistura não uniformes (Figura 1C). A Tabela 5 fornece o resumo das formulações usadas para fazer LNPs, conforme mostrado na Figura 5. No caso da técnica de mistura de pipetas, volumes iguais de etanol e fluxos aquosos são rapidamente misturados pipetando para cima e para baixo por 15-20 s, seguido de pipetagem da mistura em um banho tampão de acetato a pH 4. A Figura 5A mostra que os tamanhos dos LNPs no banho tampão de acetato de têmpera de 10 mM (pH 4, 10 vol% de etanol) são notavelmente semelhantes e pequenos (~ 50 nm), independentemente da geometria do misturador usada (CIJ ou MIVM). No entanto, os LNPs feitos com mistura de pipetas têm o dobro do tamanho dos LNPs feitos com misturadores turbulentos. Isso mostra que os LNPs feitos de diferentes geometrias CIJ exibem propriedades semelhantes quando feitos em velocidades suficientemente altas (regime turbulento acima do número crítico de Reynolds), enquanto a mistura ruim resulta em LNPs maiores e polidispersos.

Em seguida, os LNPs são dialisados contra um tampão HEPES de 10 mM, pH 7,4 (100x o volume), para remover o etanol e mudar o pH para 7,4. Durante esse processo, há alguma fusão e crescimento do LNP para um tamanho ligeiramente maior, conforme mostrado na Figura 5A, que está de acordo com o mecanismo de fusão bem estudado na literatura³³. No geral, os LNPs feitos usando misturadores CIJ e MIVM têm menos de 100 nm, enquanto os LNPs feitos com mistura de pipetas têm cerca de 140 nm. Como mostrado na Figura 5B, os potenciais zeta para essas formulações são inferiores a 10 mV, indicando que todos são neutros em pH 7,4. Além disso, todos eles mostram altas eficiências de encapsulamento de >95% (Figura 5C). Assim, os LNPs com propriedades físico-químicas ideais podem ser facilmente fabricados usando tecnologias de misturadores turbulentos. O desempenho desses LNPs é avaliado pela realização de transfecção in vitro em células HeLa.

O protocolo de ensaio de transfecção in vitro baseado em luciferase é adotado de uma publicação anterior³⁴. A Figura 6A representa graficamente a luminescência (RLU) por 1000 células para as três formulações resumidas na Tabela 5. A lipofectamina 3000 é usada como controle positivo. É importante notar que a lipofectamina 3000 é geralmente usada para formulações de DNA; no entanto, funcionou como um controle adequado nesses experimentos. Os LNPs feitos usando misturadores CIJ de 2 jatos e MIVM de 4 jatos transfectam muito melhor do que os LNPs feitos usando mistura de pipetas. Embora se espere que as partículas maiores transfectem melhor do que as partículas pequenas devido à maior carga útil por LNP, os LNPs feitos usando a mistura de pipetas aqui transfectam de forma menos eficaz. Isso implica claramente que há uma diferença significativa nas estruturas dos LNPs feitos com tecnologias CIJ em comparação com os LNPs feitos com mistura de pipetas. As eficiências de transfecção de LNPs feitas com misturadores CIJ e MIVM são essencialmente idênticas. A lipofectamina 3000 apresenta a menor eficiência de transfecção. A Figura 6B avalia a toxicidade do LNP in vitro em células HeLa usando um ensaio de viabilidade celular baseado em sal de resazurina sódica³⁵. Todas as formulações apresentam baixa citotoxicidade, exibida por altos níveis de viabilidade celular quando plotadas como uma porcentagem de células vivas versus o controle que não possui nenhum tratamento com nanopartículas.

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Figura 1: Métodos de mistura para produção de LNPs. (A) O misturador de jato de impacto confinado de dois jatos (CIJ) mostrando uma fotografia de um misturador transparente e uma configuração de misturador Delrin montada regularmente usada em laboratório. (B) O misturador de vórtice de entrada múltipla de quatro jatos (μMIVM) mostrando uma fotografia de um misturador transparente e uma configuração montada de aço inoxidável e misturador Delrin. Os fluxos de entrada do misturador transparente foram movidos para os lados do misturador para melhor visualização da geometria da mistura, enquanto no misturador prático, os fluxos de entrada entram pela parte superior. Tanto o CIJ quanto o μMIVM operam com velocidade de líquido suficiente para que os fluxos estejam no regime turbulento, e a mistura produz microescalas de Kolmogorov menores que 1 μm, o que permite a obtenção de supersaturação em ~ 1,5 ms. (C) A configuração de mistura de pipetas amplamente utilizada para preparar pequenos volumes de dispersões de LNP misturando soluções aquosas e etanólicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Vista expandida do μMIVM e seu suporte de mixagem. (A) μMIVM montado, com seringas de vidro, sob o suporte do misturador que facilita a depressão uniforme e rápida das seringas. Essa figura é reproduzida de Markwalter et ^al.29. (B) μMIVM desmontado mostrando os componentes internos. Essa geometria de mistura é idêntica ao misturador transparente na Figura 1B, exceto que os fluxos de entrada entram pelo disco superior e não pela superfície cilíndrica lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: O aumento do número de Reynolds em um misturador turbulento diminui o diâmetro hidrodinâmico do LNP até um número de Reynolds crítico de platô. (A) Representação esquemática da bomba de seringa e configuração do μMIVM usada para controlar o número de Reynolds no misturador turbulento, definindo as taxas de fluxo volumétrico. (B) Diâmetro hidrodinâmico LNP versus número de Reynolds no MIVM. O aumento do número de Reynolds e da dissipação de energia turbulenta melhora a mistura e leva a uma mistura mais homogênea, supersaturação e crescimento de partículas. Acima do número crítico de Reynolds, os tamanhos de LNP permanecem constantes com taxas de fluxo crescentes devido à condição Da<<1, ou seja, o tempo de difusão do solvente/antissolvente é menor que o tempo de montagem do NP. As taxas de fluxo fornecidas são as taxas de fluxo totais de todos os quatro fluxos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Propriedades coloidais de LNPs produzidos com diferentes lipídios ionizáveis. (A) Diâmetros hidrodinâmicos e potenciais zeta de LNPs produzidos com dois lipídios ionizáveis diferentes: ALC-0315 e MC3. As medições são feitas em pH 5 no banho de têmpera após a formação de LNP. Diferenças no pKa aparente dos lipídios ionizáveis afetam as propriedades coloidais dos LNPs. (B) Medições de eficiência de encapsulamento de ambos os LNPs (n = 3, barras de erro representam um desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Propriedades coloidais de LNPs produzidos com diferentes misturadores encapsulando o mRNA da luciferase usando lipídio ionizável MC3. (A) Diâmetros hidrodinâmicos de LNPs produzidos com misturadores de 2 jatos, 4 jatos e pipetas. As medições são realizadas sob as condições ácidas do banho de têmpera após a formação de LNP (lado esquerdo) e após diálise em um tampão HEPES neutro (lado direito). O tamanho do LNP cresce durante a neutralização do pH devido à deionização do lipídio ionizável, levando à fusão e crescimento do LNP. O estabilizador lipídico-PEG interrompe o crescimento da coalescência dessa partícula antes da formação de precipitados do tamanho de mícrons. (B) Medições de carga de superfície (como o potencial ζ) em LNPs dialisados no HEPES de 10 mM, condição de pH 7,4. Todos os LNPs estão dentro de 2 mV de 0 mV, o que indica que essas superfícies de partículas são neutras e têm apenas uma quantidade quase indetectável de carga catiônica. (C) Medições de eficiência de encapsulamento após diálise de LNPs (n = 3, barras de erro representam um desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Transfecção de células HeLa com LNPs preparados. (A) Luminescência da enzima luciferase expressa após tratamento com luciferina. (B) Viabilidade das células HeLa após incubação com LNPs. As células não mostram alteração estatisticamente significativa na viabilidade, conforme indicado por um ensaio metabólico de resazurina (n = 4, as barras de erro representam um desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fluxo(s) / Banho de têmpera	Componente	Formulação	Estoque	Volume
Seringa 1 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais)	Lipídio ionizável (MC3)	50 mol%	50 mg/ml	0,5 mL
	Lipídio de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/ml
	Colesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipídio peguilado (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	RNA de levedura	N/P 6	10 mg/ml	0,5 mL
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	Tampão de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 mL
Banho de têmpera	Tampão de acetato	10 mM, pH 4	100 mM, pH 4	4 mL

Tabela 1: Formulação padrão de LNP de patisirana produzida por um misturador CIJ. O RNA de levedura é usado como RNA modelo para este protocolo. Todas as soluções são dissolvidas molecularmente e misturadas completamente antes de serem colocadas nas seringas.

Fluxo(s) / Banho de têmpera	Componente	Formulação	Estoque	Volume
Seringa 1 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais)	Lipídio ionizável (MC3)	50 mol%	50 mg/ml	0,5 mL
	Lipídio de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/ml
	Colesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipídio peguilado (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	RNA de levedura	N/P 6	10 mg/ml	0,5 mL
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	Tampão de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 mL
Seringa 3 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais)	Lipídio ionizável (MC3)	50 mol%	50 mg/ml	0,5 mL
	Lipídio de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/ml
	Colesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipídio peguilado (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Seringa 4 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	RNA de levedura	N/P 6	10 mg/ml	0,5 mL
Seringa 4 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	Tampão de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 mL
Banho de têmpera	Tampão de acetato	10 mM, pH 4	100 mM, pH 4	8 mL

Tabela 2: Formulação padrão de LNP de patisiran produzida por um misturador MIVM. Um misturador MIVM utiliza quatro fluxos - dois solventes e dois antissolventes. Córregos com momentos desiguais podem ser usados; no entanto, fluxos com momentos iguais são escolhidos para este protocolo.

Fluxo(s) / Banho de têmpera	Componente	Formulação	Estoque	Volume
Seringa 1 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais)	Lipídio ionizável (MC3)	50 mol%	50 mg/ml	20 mL
	Lipídio de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/ml
	Colesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipídio peguilado (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	RNA de levedura	N/P 6	10 mg/ml	20 mL
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	Tampão de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	20 mL
Seringa 3 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais)	Lipídio ionizável (MC3)	50 mol%	50 mg/ml	20 mL
	Lipídio de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/ml
	Colesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipídio peguilado (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Seringa 4 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	RNA de levedura	N/P 6	10 mg/ml	20 mL
Seringa 4 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	Tampão de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	20 mL
Banho de têmpera (Hora de coleta = 30 s)	HEPES Buffer	10 mM, pH 7,5	1 m, pH 7,5	320 mL

Tabela 3: Formulação LNP produzida por um misturador MIVM acionado por uma bomba de seringa. O DODMA é usado como um lipídio ionizável junto com o RNA de levedura como RNA modelo. Um exemplo executado com 40 mL/min é escolhido para este protocolo.

Fluxo(s) / Banho de têmpera	Componente	Formulação	Estoque	Volume
Seringa 1 - Fluxo de etanol (12 mg/mL de lipídios totais)	Lipídio ionizável (MC3 ou ALC0315)	50 mol%	50 mg/ml	0,5 mL
	Lipídio de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/ml
	Colesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipídio peguilado (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,6 mg/mL de RNA)	RNA de levedura	N/P 6	10 mg/ml	0,5 mL
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,6 mg/mL de RNA)	Tampão de acetato	20 mM, pH 5	100 mM, pH 5	0,5 mL
Banho de têmpera	Tampão de acetato	10 mM, pH 5	100 mM, pH 5	9 mL

Tabela 4: Formulações LNP de dois lipídios ionizáveis diferentes produzidos por um misturador CIJ. As formulações são feitas de ALC-0315 ou MC3, enquanto todos os outros componentes são mantidos iguais.

Fluxo(s) / Banho de têmpera	Componente	Formulação	Estoque	Volume
Seringa 1 - Fluxo de etanol (6 mg/mL de lipídios totais)	Lipídio ionizável (MC3)	50 mol%	50 mg/ml	0,5 mL
	Lipídio de Zwitterion (DSPC)	10 mol%	5 mg/ml
	Colesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipídio peguilado (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	mRNA FLuc	N/P 6	1 mg/ml	0,5 mL
Seringa 2 - Fluxo aquoso (0,3 mg/mL de RNA)	Tampão de acetato	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 mL
Banho de têmpera	Tampão de acetato	10 mM, pH 4	100 mM, pH 4	4 mL

Tabela 5: Formulação padrão de LNP de patisirana produzida por um misturador CIJ. O mRNA FLuc que expressa uma proteína luciferase é empregado para medir a expressão gênica usando um ensaio de bioluminescência.

Arquivo Suplementar 1: Fornecedores de Misturadores CIJ e MIVM. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A síntese de LNPs contendo polímeros de ácidos nucleicos usando dois misturadores turbulentos de jato de impacto confinado foi apresentada. Quando conduzidos em velocidades apropriadas, os misturadores turbulentos CIJ garantem que a escala de tempo de mistura seja menor que o tempo de montagem do LNP, produzindo condições homogêneas de supersaturação para formar pequenos LNPs com distribuições de tamanho estreitas²¹. Consequentemente, os LNPs feitos com a mesma química usando diferentes geometrias de misturador turbulento (o CIJ de 2 jatos e o misturador MIVM de 4 jatos) exibem propriedades físico-químicas semelhantes e mostram boas eficiências de transfecção (Figura 5 e Figura 6). Em contraste, os LNPs feitos usando pipetagem que produz uma mistura mais pobre resultam em LNPs maiores e mais polidispersos (Figura 5A) com menores eficiências de transfecção. Há muito se entende que a cinética de mistura e montagem desempenha um papel significativo no processamento de LNP; Cullis et al. observaram que a mistura convectiva-difusiva rápida de etanol e tampão leva à formação de partículas pequenas com uma distribuição de tamanho estreita, enquanto a mistura difusiva lenta leva a partículas maiores com distribuições de tamanho amplas⁹. A escala de tempo de mistura em misturadores turbulentos CIJ diminui proporcionalmente às taxas de fluxo de entrada dos fluxos para o misturador²⁷. Isso é quantificado pelo número de Reynolds adimensional (Re), que mede a razão entre as forças inercial e viscosa. A turbulência dentro das câmaras de mistura do CIJ e MIVM ocorre em Re suficientemente alto, de modo que o alongamento turbulento do vórtice resulta em pequenas escalas de comprimento que produzem rápida mistura solvente / antissolvente por difusão. A escala de comprimento turbulento depende do Re e não da geometria específica do dispositivo de mistura. É por isso que o CIJ ou o MIVM produzem as mesmas partículas LNP e por que vários tamanhos de misturadores MIVM produzem os mesmos tamanhos^{NP 27}. Em alta Re, correspondendo a altas velocidades de entrada, os LNPs podem ser feitos de forma reprodutível sem variações de lote para lote ( Figura 3B ).

Este protocolo permite a formulação de uma variedade de LNPs de mRNA, DNA ou siRNA com diferentes propriedades físico-químicas usando misturadores CIJ turbulentos. Além de permitir versatilidade na composição e nas concentrações, essa técnica fornece um caminho claro para selecionar rapidamente as formulações na venda em bancada (alguns miligramas) e aumentar as formulações de chumbo para lotes industriais maiores a taxas de produção de 5 L/min³⁶. Este tem sido um grande obstáculo para várias outras técnicas, incluindo mistura em massa e microfluídica. Por exemplo, as técnicas de processamento em massa não conseguem fabricar LNPs de forma reprodutível de forma consistente, mesmo em escalas de alguns mililitros. As técnicas microfluídicas fornecem uma melhoria significativa em relação às técnicas de mistura a granel para permitir a produção de LNPs uniformes e reprodutíveis; no entanto, eles estão apenas na faixa de miligramas²⁹. Conforme detalhado na introdução, a paralelização de dispositivos microfluídicos fornece uma tentativa de escalonamento para escalas de produção, mas não elimina o problema de incrustação, e não pode ser dimensionada com tanto sucesso quanto os misturadores baseados na tecnologia de jato de colisão confinada.

Além dessas vantagens, os misturadores CIJ serão fundamentais na fabricação de LNPs de próxima geração que exibem recursos de direcionamento ou realizam edição de genes. As formulações atuais de LNP têm lipídios e ácidos nucléicos que têm difusividades semelhantes e, portanto, podem ser feitas mesmo com uma mistura ligeiramente pobre em escala de bancada. No entanto, as abordagens de edição de genes podem exigir o encapsulamento de espécies de ácidos nucléicos com pesos moleculares amplamente diferentes, como pequenas moléculas de RNA guia e grandes transcritos de mRNA, para codificar uma proteína CAS9³⁷. As escalas de tempo de difusão muito diferentes dessas diferentes espécies tornam desafiador o encapsulamento uniforme em proporções estequiométricas. Este problema de encapsulamento uniforme torna-se mais pronunciado à medida que a eficiência da mistura se torna mais pobre. Da mesma forma, o direcionamento de células não hepáticas pode precisar da incorporação de estabilizadores de difusão lenta fortemente ligados (como copolímeros de bloco de grande peso molecular com ligantes direcionados). Ligantes direcionados de até 14 kDa podem ser conjugados para bloquear copolímeros antes da montagem das nanopartículas, o que permite sua incorporação uniforme em NPs usando a mistura CIJ³⁸. Os misturadores turbulentos CIJ são ferramentas úteis para a fabricação de LNPs feitos com componentes com diferentes difusividades.

Embora os misturadores turbulentos CIJ demonstrem várias vantagens sobre outros misturadores para a formulação de LNPs, é importante observar as limitações associadas a cada geometria. O misturador CIJ de 2 jatos requer que ambos os fluxos de entrada (etanol e água) tenham momentos iguais (dentro de 10% -30%) para obter uma micromistura turbulenta uniforme na câmara. O facto de a corrente de saída ser composta por solvente/antissolvente 50:50 limita o nível de supersaturação na cavidade de mistura onde ocorre a precipitação²⁹. Essa desvantagem é abordada pelo misturador MIVM de 4 jatos, pois ele pode utilizar quatro jatos com momentos desiguais para atingir condições de alta supersaturação na câmara de mistura. Além disso, ambos os misturadores devem estar na ordem de miligramas de massa total, tornando-os uma escolha não ideal para triagem de alto rendimento de muitas formulações diferentes de LNP. Para formulações simples de LNP, a triagem pode ser melhor feita com microfluídica ou estratégias de pipetagem em escalas de microgramas e, em seguida, transferida para a tecnologia de jato de impacto confinado quando algumas formulações de chumbo forem identificadas. Também é crucial considerar os volumes mortos nos misturadores. No CIJ, dois misturadores a jato, os volumes de retenção são de 50 a 100 microlitros. Essa quantidade de material deve ser subtraída da quantidade capturada no banho de têmpera ao calcular a recuperação do processo. Essas perdas são insignificantes quando operam em grandes escalas, mas seriam responsáveis por perdas de 10% quando volumes totais de 5 mL são produzidos, como mostrado aqui. Os misturadores turbulentos a jato de impacto são uma ferramenta valiosa para a produção de LNPs na escala GMP, conforme evidenciado pelas duas vacinas COVID-19 aprovadas pela FDA.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

NSF Fellowship para BKW (DGA1148900), apoio da Tessera Therapeutics Inc., da Fundação Bill e Melinda Gates (BMGF, números de contrato OPP1150755 e INV-041182) e da FDA sob o prêmio 75F40122C00186.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
18:0 PC (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365P	Lipídio auxiliar
21 G x 1-1/2 pol. Agulha BD PrecisionGlide	BD	305167
Placa de Fundo Preto de Parede Preta de 96 Poços	Fisher Scientific	07-000-135
Placa de Fundo Branco/Transparente de 96 Poços, Superfície TC	Thermo Fisher Scientific	165306
Ácido Acético, Glacial	Fisher Scientific	A38-212
ALC-0315	Avanti Lipídios Polares	890900	Lipídios Ionizáveis
Filtro Centrífugo Amicon Ultra, 100 kDa MWCO, 15 mL	Millipore Sigma	UFC910024
Filtro Centrífugo Amicon Ultra, 100 kDa MWCO, 4 mL	Millipore Sigma	UFC810096
Bright-Glo Luciferase Sistema de Ensaio	Promega	E2620
Colesterol	Millipore Sigma	C8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)	Trilink Misturador de	L-7202
	da Biotechnologies Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Entre em contato com a Holanda ou DTD para pedidos personalizados e o sistema Helix Biotech é Nova BT. Texto de revisão para validação do novo misturador
D-Lin-MC3-DMA	MedChemExpress	HY-112251	Lipídio ionizável
DMEM, glicose alta, piruvato	Thermo Fisher Scientific	11995065
DMG-PEG 2000	Avanti Polar Lipids	880151P	PEG-lipid
DODMA	Avanti Polar Lipids	890899P	Lipídio ionizável
Etanol 200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga Cônica de Alta Clareza	Fisher Scientific	14-959-49A
Soro Fetal Bovino, certificado, Estados Unidos	Thermo Fisher Scientific	16000044
HeLa	ATCC	CCL-2
HEPES, ácido livre	IBI Scientific	IB01130
HSW HENKE-JECT duas partes 1 mL Luer	Henke Sass Wolf	4010.200V0
HSW HENKE-JECT duas partes 5 mL (6 mL) Luer Lock	Henke Sass Wolf	4050.X00V0
Idex 1648 Tubulação ETFE ” A PARTIR DE 0,093" ID	Idex Saúde & Ciência	1648
Idex P-678 ¼ "-28 para Luer montagem	Idex Health & amp Ciência	P-678
Virola Idex P-940 para tubulação ETFE	Idex Health & Ciência	P-940
Lipofectamina 3000 Reagente de Transfecção	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Luer encaixe	Idex Health & Ciência	P-604	Monte na entrada do mixer CIJ ou MIVM com roscas correspondentes. As peças Idex também estão disponíveis através da VWR e de muitos outros fornecedores
Suporte misturador	Holland Applied Technologies	N/A	Ver Markwalter & Prud'homme para design.²⁶ Entre em contato com a Holanda para compra
misturador de vórtice de entrada múltipla	Holland Applied Technologies e Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Entre em contato com a Holanda ou DTD para pedidos personalizados. Revise o texto para o novo O-ring de validação do misturador
(MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Peça peça consumível a granel. Garanta a compatibilidade do solvente se estiver usando uma fonte alternativa.
Virola de saída - CIJ	Idex Health & Ciência	P-200	Montagem com encaixe de saída (extremidade grande nivelada com tubulação)
Encaixe de saída - CIJ	Idex Health & Ciência	P-205	Monte com ponteira e tubulação na saída da câmara CIJ
Encaixe de saída - MIVM	Idex Health & Ciência	P-942	Combinação com tubulação
de saída de ponteira - CIJ	Idex Health & Ciência	1517	Use um cortador de tubos para pontas limpas. Certifique-se de que a tubulação extra não se projete na câmara de mistura
Tubulação de saída - MIVM	N/A	N/A	Ajuste para a identificação da ponteira.
PBS - Solução salina tamponada com fosfato (10x) pH 7,4, sem RNase	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
PHD 2000 Bomba de seringa programável	Harvard Aparelho	N/A
Seringa de plástico de duas peças 1 mL	Thermo Fisher Scientific	S7510-1
Plugue	Idex Saúde & Ciência	P-309	Monte nos lados do misturador CIJ (ponto de acesso de vedação da perfuração)
Kit de ensaio de RNA Quant-it RiboGreen e reagente de RNA RiboGreen, RediPlate 96 Kit de quantificação de RNA RiboGreen	Invitrogen por Thermo Fisher Scientific	R11491
Resazurin, Sal de sódio	Thermo Fisher Scientific	R12204
RNase AWAY Descontaminante de superfície	Thermo Fisher Scientific	7000TS1
Frasco de cintilação	DWK Lifesciences	74504-20
SGE Seringas à prova de gás, Luer Lock, 100 mL	SGE	100MR-LL-GT
SGE Seringas à prova de gás, Luer Lock, 50 mL	SGE	50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer de diálise, 20 K MWCO	Thermo Fisher Scientific	66012
Acetato de sódio	Millipore Sigma	32319-500G-R
Hidróxido de Sódio	Fisher Scientific	S320-500
Sacarose	Millipore Sigma	S7903-1KG
Filtros de Seringa, Estéril	Genesse Scientific	25-243
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho fenol	Thermo Fisher Scientific	25200056
Água, Qualidade Livre de Endotoxinas	Biológica	118-325-131	RNAse e DNAse livre
RNA de levedura (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM7118

Jatos de Impacto Confinado de de

Referências

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