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Radiossíntese, controle de qualidade e imagens de tomografia por emissão de pósitrons de pequenos animais de 68nanomoléculas marcadas com Ga

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DOI:

10.3791/67048

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4 de outubro de 2024

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1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve a radiossíntese, formulação, controle de qualidade de uma nova sonda radiomarcada (ou seja, nanocorpo NM-02 marcado com 68Ga) e seu uso para imagens de PET/CT de pequenos animais em um modelo de xenoenxerto.

Resumo

As técnicas de imagem de Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET) e Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único (SPECT) de pequenos animais são cruciais na pesquisa pré-clínica do câncer, exigindo atenção meticulosa à síntese de radiotraçadores, garantia de qualidade e protocolos de injeção in vivo . Este estudo apresenta um fluxo de trabalho abrangente adaptado para aumentar a robustez e a reprodutibilidade de experimentos com PET em pequenos animais. O processo de síntese no laboratório de radioquímica usando 68Ga é detalhado, destacando rigorosos protocolos de controle e garantia de qualidade para cada produção de radiotraçador. Parâmetros como concentração, atividade molar, pH e pureza são rigorosamente monitorados, alinhando-se aos padrões aplicáveis a estudos em humanos. Esta metodologia introduz uma preparação simplificada da seringa e uma cânula 30G personalizada para injeções intravenosas precisas em camundongos. O monitoramento da saúde animal durante o exame, incluindo temperatura e frequência cardíaca, garante seu bem-estar durante todo o procedimento. As dosagens para exames PET e SPECT são predeterminadas para equilibrar a aquisição de dados com a minimização da exposição à radiação em animais e pesquisadores. Da mesma forma, as tomografias computadorizadas empregam configurações pré-programadas para limitar a exposição à radiação, especialmente pertinente em estudos de longo prazo que avaliam os efeitos do tratamento. Ao otimizar essas etapas, o fluxo de trabalho visa padronizar procedimentos, reduzir a variabilidade e melhorar a qualidade das imagens de PET/SPECT/CT de pequenos animais. Este recurso fornece informações valiosas para pesquisadores que buscam melhorar a precisão e a confiabilidade das investigações pré-clínicas em imagens moleculares, avançando no campo.

Introdução

Um tópico de extrema relevância é a pesquisa no campo do câncer de mama. Ocâncer de mama continua sendo um câncer que ocorre com frequência, representando cerca de 1/3 de todos os cânceres em mulheres. O tratamento é adaptado às características biológicas e histológicas do tumor e ao estágio da doença. A chance de sobrevivência é geralmente boa, a menos que o tumor já tenha metástase, caso em que a sobrevida em 5 anos é de apenas cerca de 30%1. Outros cânceres ginecológicos sofrem de um destino semelhante, com, por exemplo, o câncer de ovário mostrando > 95% de sobrevida em 5 anos para tumores em estágio 1, mas apenas 15% para tumores metastizados em estágio 4 2,3.

A imagem não invasiva, particularmente a tomografia por emissão de pósitrons (PET), tem transformado a pesquisa do câncer, pois oferece insights incomparáveis sobre os aspectos moleculares do tumor, como metabolismo, expressão do receptor e resposta terapêutica 4,5,6. Ele permite a visualização e quantificação de áreas metabólicas específicas - permitindo não apenas diagnosticar com precisão, mas também monitorar o efeito de (novas) terapias em momentos muito curtos. De fato, o PET permite a avaliação da resposta versus não resposta após 1-3 ciclos de terapia e faz isso melhor e mais rápido em comparação com as alterações morfológicas, como visto pela imagem clássica de tomografia computadorizada (TC)7. A natureza não invasiva do PET também permite estudos longitudinais.

Qualquer modelo animal requer padronização máxima para avaliar minuciosamente a capacidade terapêutica de novos fármacos (radioativos), portanto, a ênfase deve ser colocada nisso - tanto na geração do modelo tumoral quanto na imagem / análise de dados de PET de pequenos animais. Pode-se debater sobre o melhor modelo tumoral em animais (inoculação subcutânea ou implante ortotópico, camundongos, tumores humanos ou singênicos, acompanhados ou não de cuidados clínicos de rotina), mas isso estaria além do objetivo desta publicação. Vários modelos são usados por nós para estudos de câncer, e o descrito aqui é um modelo subcutâneo relativamente simples.

O controle de qualidade em radioquímica é fundamental para a segurança animal e a eficácia do tratamento. Isso não afeta apenas o radiofármaco em si, mas também a formulação do produto. Existe uma extensa legislação sobre a produção de radiofármacos para aplicações clínicas 8,9 (ver 10 para uma visão geral abrangente da legislação e diretrizes atuais) e várias diretrizes sobre as propriedades dos radiofármacos para pesquisa pré-clínica (ver 11 para uma visão geral abrangente). Produzimos radiofármacos para aplicações clínicas e pré-clínicas, simplificando a tradução do controle de qualidade de ponta, como encontrado em sínteses para aplicações clínicas, para aplicações pré-clínicas.

Nosso foco de pesquisa é a teranóstica direcionada, especialmente em cânceres positivos para o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). Por isso, desenvolvemos novos radiofármacos para diagnosticar e monitorar o câncer durante o tratamento. Radiofármacos diagnósticos bem-sucedidos também são avaliados como compostos terapêuticos usando diferentes radioisótopos. A avaliação desses radiofármacos é realizada inicialmente em modelos animais, buscando a tradução clínica após resultados pré-clínicos promissores. Neste artigo, apresentaremos os protocolos utilizados, exemplificados com um radiofármaco, para garantir o controle e a garantia da qualidade, bem como a prática padrão para injeção intravenosa em camundongos e PET/CT, a fim de melhorar a precisão e a confiabilidade das investigações pré-clínicas em imagens moleculares. O protocolo é dividido em três seções diferentes: radioquímica (síntese de traçadores e controle de qualidade), geração de modelos animais (modelo de tumor subcutâneo) e imagens.

Protocolo

O protocolo de pesquisa segue os mais altos padrões de bem-estar animal e está em estrita conformidade com as Diretrizes de Cuidados com Animais do Hospital Universitário RWTH Aachen. Estamos comprometidos em garantir o tratamento ético e humano de todos os animais envolvidos nos estudos, e os procedimentos são revisados e aprovados pelo comitê local de ética animal. Todas as experiências com animais foram aprovadas por uma autoridade competente alemã (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV) para conformidade com a Lei de Proteção Animal, em conjunto com o regulamento para a proteção de animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos.

NOTA: Uma lista completa dos equipamentos, materiais e reagentes usados ao longo deste estudo é fornecida na Tabela de Materiais. É importante ressaltar que o manuseio de 68Ga deve ser feito por pipeta sempre que possível e certamente evitar qualquer metal, pois o ferro pode reduzir muito o rendimento da rotulagem. Isso significa que as agulhas devem ser evitadas até que os procedimentos radioquímicos sejam concluídos.

1. Radioquímica

  1. Radiomarcação de NM-02-DOTA-GA com 68Ga
    CUIDADO: O protocolo envolve o manuseio e manipulação de materiais radioativos. Os pesquisadores devem seguir a legislação local sobre o manuseio de materiais radioativos, práticas ALARA (tão baixas quanto razoavelmente possível), trabalhar com blindagem de chumbo, minimizar o tempo de contato direto e manter distância máxima em cada etapa da exposição à radiação. Os procedimentos experimentais devem ser monitorizados com dispositivos de detecção de radioactividade.
    1. Eluir o gerador de 68Ge/68Ga manual ou automaticamente em 10 mL de 0,6 M HCL (1,2 GBq/10 mL). Prenda o 68Ga em um cartucho PS-H+ (tamanho M - 0,8 mL) passando o eluído pelo cartucho. Eluir o cartucho PS-H+ SPE com um total de 1 mL de NaCl 4 M passo a passo e lentamente para um tubo de microcentrífuga.
    2. Rejeitar os primeiros 0,3 ml do eluído e recolher os restantes 0,7 ml noutro tubo de microcentrífuga.
    3. Pegue um novo tubo de microcentrífuga e prossiga com a radiomarcação de NM-02-DOTA-GA conforme indicado no protocolo do fabricante.
      NOTA: O conjugado nanocorpo-quelante (NM-02-DOTA-GA) foi previamente preparado de acordo com o protocolo do fornecedor. O conjugado pode ser armazenado em alíquotas a -80 °C por vários meses.
    4. Ajuste o pH do produto para cerca de 7 usando até 5 μL de 3 M NH4OAc.
  2. Controle de qualidade
    1. Meça a atividade da amostra concentrada no tubo de microcentrífuga usando um medidor de atividade na configuração correta (68Ga como isótopo; seringa de 1 mL, 0,1 mL para geometria). O rendimento radioquímico (corrigido pelo decaimento) deve ser de pelo menos 40%.
    2. Determine o pH com uma tira de teste de pH (0-14) identificando uma quantidade suficiente na tira de teste de pH (10-15 μL).
    3. Cromatografia em camada delgada (TLC)
      1. Identifique 1 μL da mistura de reação de radiomarcação em uma tira de TLC impregnada de sílica. Deixe a alíquota secar por cerca de 1 min. Execute o TLC usando ácido cítrico como uma fase móvel, pré-preenchido por cerca de 2-3 mm, em uma câmara fechada de TLC. Remova a tira TLC da câmara quando o líquido atingir o topo da tira.
      2. Coloque a tira TLC em um scanner de TLC de rádio e meça-a de acordo com o protocolo do fabricante. O produto deve aparecer na origem (Rf < 0,2), enquanto os cátions livres de 68Ga eluem com a frente do solvente (Rf > 0,9).
      3. Calcule o rendimento de radiomarcação da reação usando o radiocromatograma, dividindo a área integrada sob a curva (AUC) de Rf 0,0-0,2 pela AUC total (Rf 0,0-1,0) e multiplicando por 100.
    4. Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC)
      1. Certifique-se de que a HPLC esteja funcionando por pelo menos 10 minutos usando o solvente correto para que todas as linhas sejam inundadas e ajuste a configuração para a medição. Utilizar o fluxo isocrático de uma mistura 50:50 de acetonitrilo (solvente A) e uma mistura de solução de NaCl a 0,9% (980 ml) combinada com ácido trifluoracético (1 ml) e solução de citrato (20 ml) como solvente B. Medir a absorvância UV a 280 nm.
      2. Pegue 5 μL do produto e dilua com 15 μL de NaCl a 0,9%. Injectar 15 μl da mistura na radio-HPLC analítica (coluna SEC-s2000 de 5 μm 154 Å; caudal: 2 ml/min).
      3. Utilizar o fluxo isocrático de uma mistura 50:50 de acetonitrilo (solvente A) e uma mistura de solução de NaCl a 0,9% (980 ml) combinada com ácido trifluoracético (1 ml) e solução de citrato (20 ml) como solvente B. Medir a absorvância UV a 280 nm. Há uma pequena mudança nos tempos de retenção entre os canais UV e gama; isso se deve ao design da HPLC (o sinal gama é instalado em série após o detector UV).
      4. Determine a pureza radioquímica integrando os picos no canal gama. O produto deve estar na faixa de integração que foi determinada anteriormente pela medição do nanocorpo não radiomarcado. Além disso, integre todos os outros picos no canal gama e avalie-os como impurezas. A pureza deve ser >95%.
    5. Endotoxinas
      1. Prepare uma diluição de 1:20 do produto com um volume total de 150 μL usando água livre de endotoxinas (certificada) para diluir.
      2. Insira um cartucho de endotoxina descartável, que é pré-preenchido comercialmente com todos os reagentes necessários, no leitor de teste de endotoxina e carregue 25 μL do produto diluído em cada câmara do cartucho.
      3. Pressione Play. O PTS tem controles internos positivos e negativos e será incluído no relatório final. O teste leva cerca de 15 min. O produto é considerado livre de endotoxinas se o teor de endotoxinas for < 8,7 UE/mL em Vmax = 20 mL.
    6. Esterilidade retrospectiva
      1. Após a injeção e a colheita da amostra de qualidade, conservar o radiofármaco num frasco estéril no frigorífico a 4 °C.
      2. Entregar a amostra a um instituto certificado para análise de esterilidade (interno ou externo) se o limite de isenção de 105 Bq ou 10 Bq/g não for excedido para realizar um teste de esterilidade de acordo com12.
  3. Preparação da seringa (uma por animal)
    1. Meça a atividade do produto usando um medidor de atividade na configuração correta (68Ga como isótopo; seringa de 1 mL, 0,1 mL para geometria).
    2. Pegue 15 MBq do produto (cerca de 25 μL) em um tubo de microcentrífuga e encha o volume com 0,9% de NaCl a 75 μL.
    3. Adicione 50 μL à seringa e meça-o usando um medidor de atividade na configuração correta (68Ga como isótopo; seringa de 1 mL, 0,1 mL para geometria). A seringa deve conter 10 MBq do produto.
      NOTA: Assim que o nanocorpo NM-02 marcado com 68Ga é formado, as pontas de pipeta de plástico não são mais necessárias ao manusear o 68Ga. A partir daqui, sempre que o protocolo mencionar o manuseio de um líquido, use uma seringa apropriada (1 mL) e agulha (27-30G).

2. Geração de modelos animais

  1. Alojamento de animais
    1. Use camundongos fêmeas imunodeficientes Rj: ATHYM-Foxn1nu / nu com 6-8 semanas de idade (de um fornecedor comercial) para desenvolver tumores subcutâneos. Na chegada, abrigue todos os ratos diretamente na sala dos animais e dê pelo menos 1 semana após o transporte para aclimatação.
    2. Alojar os animais em um ciclo de 12 h de luz / 12 h de escuridão e fornecer acesso gratuito a comida e água. Mantenha a temperatura ambiente e a umidade relativa entre 20-25 °C e 45%-65%, respectivamente.
  2. Preparação de células para implantação
    1. Inicie a cultura celular com 1 x 106 células SKOV-3 e adicione 25 mL de meio DMEM/F12 pré-aquecido enriquecido com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina em um frasco de cultura de células T175.
    2. Cultive as células em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 e substitua o meio completo pelo menos 2x por semana.
    3. 1 semana ou, o mais tardar, 1 dia antes da implantação celular, retirar 20 μL de meio do frasco de cultura celular para testar o micoplasma13. Use apenas células micoplasmáticas negativas para injeção de células.
    4. No dia da injeção celular, aspire o meio completo e pipete 5 mL de PBS para o frasco. Gire a garrafa para frente e para trás várias vezes para lavar o meio restante.
    5. Adicione 3 mL de tripsina ao frasco e incube-o por 4 min na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 para dissociar as células. Verificar ao microscópio com uma ampliação de 40x se as células se separaram do balão de cultura de células.
    6. Adicione 7 mL de meio para neutralizar a atividade da tripsina e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 50 mL.
    7. Centrifugue as células a 150 x g por 5 min (à temperatura ambiente) para obter um pellet de célula. Remova o sobrenadante e adicione 1 mL de meio para ressuspender as células.
    8. Pegue 12 μL da suspensão celular em um tubo de microcentrífuga e adicione uma quantidade igual de azul de tripano. Carregue a câmara do hemocitômetro com 10 μL da suspensão de células cuidadosamente misturada.
    9. Conte as células viáveis não coradas dentro da área definida e calcule o número de células. Ajuste a concentração celular para 5 x 107 células/mL de meio e misture cuidadosamente a suspensão celular com 1 mL de matriz de membrana basal.
    10. Tome 5 x 106 células em 0,2 mL de meio celular com 50% de matriz de membrana basal em uma seringa de insulina de 1 mL para cada camundongo. Mantenha a seringa no gelo até à injeção para evitar a solidificação da matriz da membrana basal.
      NOTA: Se um rato pesar menos de 20 g, injete apenas 150 μL (para 15-20 g) ou 100 μL (para 10-15 g) da mistura. Para aplicações subcutâneas, deve-se tomar cuidado para garantir que o volume máximo de 10 mL / kg de peso corporal recomendado pelo GV-SOLAS não seja excedido14.
  3. Inoculação e acompanhamento
    1. Injete a suspensão celular por via subcutânea no flanco do animal acordado, fixando o pescoço e a cauda com uma mão. Normalmente, preferimos injeções no flanco esquerdo.
    2. Aguarde 10−15 s para que a matriz da membrana basal endureça e, em seguida, remova a agulha.
    3. Monitore o crescimento do tumor diariamente após o implante usando um paquímetro digital para medir dois eixos tumorais perpendiculares.
    4. Usando essas medições, avalie o crescimento do tumor usando o volume do tumor calculado pela fórmula:
      VT = L × B2 × π / 6
      onde VT é o volume do tumor em mm3, L é o comprimento do tumor em mm (ou seja, o maior dos dois eixos perpendiculares) e B é a largura do tumor em mm (ou seja, o menor dos dois eixos perpendiculares15). Essa técnica tende a superestimar o volume do tumor, pois também inclui a pele.
    5. A massa tumoral influencia o peso do camundongo quando medida na balança eletrônica. Para calcular o peso do animal corrigido para a massa tumoral, use a seguinte fórmula:
      mmouse-T = mmouse - 0,82 × VT
      onde mmouse-T é o peso do camundongo excluindo a massa tumoral em g, mmouse é o peso do camundongo de acordo com a balança eletrônica em g e VT é o volume tumoral calculado em mm3. O número 0,82 g/mm3 resulta do valor médio de uma série de tumores isolados de experiências anteriores com animais, pesados e o seu volume determinado utilizando a fórmula fornecida. Representa uma densidade tumoral média.
    6. Além disso, determine o tamanho do tumor em comparação com o camundongo e monitore a carga tumoral usando a seguinte fórmula:
      Carga tumoral [%] = (0,82 × VT) / mcamundongo × 100
      onde a carga tumoral é expressa como uma porcentagem, 0,82 × VT corresponde à massa tumoral em g (ou seja, VT, o volume tumoral calculado em mm3, vezes a densidade tumoral média), e mcamundongo é o peso do camundongo de acordo com a escala em g.
    7. Quando os animais atingirem um volume tumoral superior a 200 mm3, programe-os para PET/CT ou SPECT/CT não invasivos, dependendo do experimento.

3. Exames de imagem

  1. Preparação de seringas (sistema feito sob medida)
    NOTA: A cauda do rato é pequena; portanto, é necessário o uso de uma cânula 27G ou menor (números maiores correspondem a agulhas menores). No caso de camundongos fêmeas, as únicas veias acessíveis para injeções em bolus são as três veias da cauda. Anatomicamente, a veia dorsal da cauda está mais próxima da coluna vertebral em comparação com as duas veias laterais; Não injete nesta veia para evitar arranhões ósseos iatrogênicos. Com base na experiência, o uso de uma cânula 30G fornece os melhores resultados, pois veias menores também podem ser acessadas. Como os cateteres 30G não estão disponíveis para compra, esse tipo precisa ser feito com cuidado pelo pesquisador.
    1. Prepare a seringa com o marcador radioativo, dependendo da via de administração planeada. Para injeções intravenosas, certifique-se de que um volume máximo de 5 mL / kg de peso corporal seja administrado para um camundongo de 25 g; isso significa um volume máximo injetado de 125 μL.
    2. Para preparar um cateter 30G, em primeiro lugar, use qualquer agulha 30G e remova a haste da agulha metálica, seja com uma tesoura de metal ou dobrando-a para longe do plástico.
    3. Insira manualmente um tubo PE10 de 0.3 mm de diâmetro na parte do eixo que foi removida do cubo. Deve-se tomar cuidado para evitar perfurar o tubo.
      NOTA: Outros tipos de plástico também podem ser usados; no entanto, o PE10 oferece o melhor equilíbrio entre rigidez e flexibilidade da parede.
  2. Injeção intravenosa
    NOTA: As injeções intravenosas também podem ser feitas em animais acordados; No entanto, se isso não for necessário, os animais devem ser injetados sob sedação com isoflurano para reduzir a carga sobre o animal de pesquisa.
    1. Encha o cateter 30G com tampão NaCl a 0,9% ou qualquer outro tampão desejado.
    2. Coloque o camundongo em uma câmara de indução e encha-o continuamente com uma mistura de oxigênio (ou ar pressurizado de grau médico) e isoflurano gasoso até que o animal perca o reflexo de endireitamento. Para indução, use isoflurano a 3,5% -5% com um fluxo de oxigênio ou ar de 0,8 L / min.
    3. Coloque imediatamente o camundongo sedado em uma posição ventral inicial em uma esteira de aquecimento (37-38 ° C), mantendo a sedação com isoflurano através de um cone nasal. Verifique os ratos com frequência em busca de sinais de superaquecimento (por exemplo, alongamento excessivo, respiração rápida, vermelhidão da pele). Para manutenção da anestesia, use isoflurano a 1,8% a 2,5% com fluxo de oxigênio ou ar de 0,8 L/min.
    4. Aplique uma pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar o ressecamento durante a sedação. Inspecione ambas as veias laterais da cauda e selecione a melhor para injeção. A visibilidade e o diâmetro da veia devem ser levados em consideração. Para obter melhores resultados, gire levemente a cauda para que a veia selecionada entre em contato com a esteira de aquecimento e deixe a veia dilatar por 1 min.
    5. Gire todo o mouse para a posição lateral para que a veia selecionada suba. Fixe a ponta e a base da cauda com fita adesiva.
    6. Pegue o cateter 30G com a mão dominante e coloque suavemente o dedo indicador da mão não dominante na veia selecionada para criar um backup de sangue no interior. No local do backup, a veia se dilata, formando uma pequena corcunda.
    7. Com a mão dominante, coloque o cateter 30G paralelo à cauda voltada para a corcunda na veia. Mova a mão dominante para frente. Na maioria das vezes, essa técnica garante uma punção venosa direta.
    8. Uma vez dentro da veia, o refluxo sanguíneo torna-se visível no tubo de plástico. Fixe o tubo de plástico para garantir que a agulha não se mova dentro da veia durante a injeção. Na extremidade livre do tubo, insira a seringa traçadora conectada a uma agulha 30G.
      NOTA: Quando uma distribuição dinâmica do traçador precisa ser avaliada, os seguintes pontos precisam ser executados depois que o animal é colocado na base do scanner PET e o PET é iniciado.
    9. Injete lentamente o conteúdo da seringa marcadora durante pelo menos 10 seg. Enquanto mantém a agulha 30G ainda conectada ao sistema de cateter 30G, remova apenas a seringa traçadora e conecte uma seringa com tampão NaCl a 0,9% (ou qualquer outro tampão desejado) para lavar o cateter. Monitore a respiração continuamente durante o procedimento de injeção e ajuste a concentração de isoflurano para manter aproximadamente 1 respiração por segundo.
    10. Remova o cateter 30G da veia da cauda e use uma compressa de algodão estéril para estancar o sangramento.
    11. Para medir a atividade restante, meça o cateter 30G, a seringa tampão, a seringa traçadora vazia e a compressa de algodão, pois todos contêm pequenas quantidades de traçador que não atingiram o animal.
  3. Aquisição de PET/CT
    NOTA: Para o nanocorpo NM-02 marcado com 68Ga, todos os animais são fotografados com um sistema PET / CT de pequenos animais.
    1. Aquisição de PET
      1. Coloque o rato sedado em posição ventral na cama do animal e conecte-o ao scanner PET. Mude o fluxo de isoflurano para o cone nasal no PET e mantenha-o em 1,5%-2,5% de isoflurano no ar medicinal a 0,8 L/min para que a frequência respiratória do animal durante a varredura fique entre 75 e 50 respirações por minuto.
      2. Fixe o mouse atrás do pescoço na cama do animal com fita adesiva. Se necessário, aplique uma pomada oftálmica mais uma vez nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento durante a sedação.
      3. Ligue a almofada de aquecimento na cama do animal com cerca de 80% da potência, o que equivale a cerca de 30 °C.
      4. Defina o tempo de aquisição para 45 min e selecione a região de interesse que será verificada. Selecione 68Ga como o isótopo do estudo e inicie a varredura. Insira a quantidade de atividade injetada, o tempo de injeção e o tempo de medição da seringa vazia. Uma posição de leito PET é de 160 mm, o que é longo o suficiente para uma varredura de camundongo de corpo inteiro.
      5. Quando uma distribuição dinâmica do traçador precisar ser avaliada, primeiro inicie o PET scan, aguarde 30 s para aquisição e só então prossiga com as etapas 3.2.9-3.2.10. Deixe o cateter no camundongo com a seringa tampão conectada para evitar mais perda de sangue. O cateter pode ser desconectado ao final da PET, antes da aquisição da TC para evitar artefatos.
    2. Aquisição de TC
      1. Desconecte a cama do animal do scanner PET e conecte-a imediatamente ao scanner de TC. Se necessário, retire também a cânula da veia da cauda. Após pelo menos 30 minutos após a punção venosa, o local da injeção já está coagulado, portanto, não ocorrerá mais sangramento.
      2. Mude o fluxo de isoflurano para o cone nasal no tomógrafo.
      3. Selecione a mesma região de interesse a ser escaneada para a imagem PET. Selecione o protocolo de aquisição padrão: 440 μA, 50 kVp, tempo de exposição de 32 ms e rotação de 1080° em modo espiral com 960 exposições/360°; a duração da tomografia computadorizada é de aproximadamente 7 minutos para uma varredura de corpo inteiro em camundongos.
      4. Controle a taxa de respiração e ligue a almofada de aquecimento na cama do animal. Monitore a respiração continuamente durante os exames e ajuste a concentração de isoflurano para manter uma frequência respiratória entre 75 e 50 respirações por minuto.

4. Cuidados com animais pós-imagem

  1. No final dos exames, o animal precisa de pelo menos 15 minutos para acordar. Para evitar a agressão do irmão de ninhada, enjaule o animal sozinho por cerca de 15 minutos ou até que ele seja capaz de andar sozinho até colocá-lo de volta em sua gaiola original. Durante esse tempo, use luz infravermelha para evitar hipotermia.
  2. Inicialmente, coloque o animal do lado esquerdo (posição segura) para evitar um choque hemodinâmico. Deixe a pomada oftálmica permanecer, pois ela será removida pelo próprio animal assim que estiver acordado.

5. Reconstrução PET/CT

  1. Realize a reconstrução PET usando uma maximização de expectativa de subconjunto ordenado tridimensional (ou seja, OSEM-3D com 30 iterações) com uma janela de energia de ± 15% de um pico de 511 keV a um tamanho de voxel isométrico de 0,4 mm em uma matriz de 192 × 192 × 384. Aplique correções baseadas em TC (ou seja, correção de atenuação, correção de dispersão, tempo morto e eventos aleatórios) à reconstrução do PET.
  2. Caso seja necessário avaliar uma distribuição dinâmica do traçador, aplique uma reconstrução multi-frame. Como exemplo, os seguintes quadros podem ser usados para uma varredura de 45 minutos: 4 x 30 s, 3 x 1 min, 5 x 2 min, 2 x 5 min e 2 x 10 min.
  3. Reconstrua os protocolos de aquisição padrão de TC usando um processo de reconstrução de algoritmo de reconstrução iterativo (ou seja, ISRA) para um tamanho de voxel isométrico de 0,2 mm em uma matriz de 200 × 200 × 425. Usando o software do fornecedor, converta os valores de CT em unidades Hounsfield (HU) usando a fórmula:
    figure-protocol-1
    onde μw é o coeficiente de atenuação linear da água, μa é o coeficiente de atenuação linear do ar e μt é o coeficiente de atenuação linear do tecido.
  4. As imagens de PET e TC foram alinhadas automaticamente após a reconstrução usando a matriz gerada a partir de uma varredura fantasma capilar. Arquive todos os dados reconstruídos, bem como transfira-os para um servidor de banco de dados usando software de análise de imagem, conforme necessário.

6. Processamento e análise de imagem

NOTA: As imagens PET/CT co-registradas são usadas posteriormente para quantificação no servidor de banco de dados de um software de análise de imagem, onde cada varredura híbrida é salva como um assunto.

  1. Identifique o tumor com base na TC e selecione-o como a região de interesse. Mascare manualmente a base do tumor na TC.
  2. Para obter a segmentação independente do usuário, limite a máscara tumoral recém-formada no PET ou SPECT. Para PET, use um limite mínimo de 1,0 valor de absorção padronizado (SUV). Para SPECT, use um limite mínimo maior do que a captação média do pool sanguíneo medida no coração ou na aorta abdominal terminal.
  3. Registre a média, o máximo, a média dos 10 voxels mais quentes (ou seja, média quente 10) e a absorção total dos volumes de interesse recém-gerados.
  4. Use esses valores para gerar valores de SUV e TBR (target-to-background), que serão usados posteriormente para análise estatística.

Resultados

Um dos aspectos mais importantes do controle de qualidade de um radiofármaco é por meio de HPLC, pois esta mostra não apenas a pureza química e radioquímica (98,2% neste caso), mas também permite comprovar a identidade do radiofármaco comparando o tempo de eluição e a forma do pico com a de um composto de referência não radioativo. Este composto de referência é, neste caso, um nanocorpo não marcado, comprovado como o composto correto por técnicas clássicas como espectrometria de massa ou ressonância magnética nuclear. Essas técnicas não podem ser aplicadas diretamente ao composto radioativo (não há massa suficiente para gerar um sinal), mas comparando o composto radioativo com sua referência, são reunidas evidências suficientes de que o composto correto foi de fato rotulado e não alterado durante a síntese. Observe a pequena diferença no tempo de retenção entre o produto radioativo e a referência na Figura 1, correspondente à medição serial do fluxo de HPLC (o UV é medido primeiro; o fluxo precisa então de aproximadamente 0,2 min para atingir o detector de radioatividade em uma configuração típica).

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Figura 1: Cromatograma HPLC analítico típico para controle de qualidade do nanocorpo NM-02 marcado com 68Ga (GLNM-02). A absorbância UV do composto frio (ou seja, painel superior) é medida a 280 nm e mostra um pico em 4,18 min, com um deslocamento de 0,22 min. O pico do produto marcado com 68Ga pode ser visto no detector gama (ou seja, painel inferior). O rendimento radioquímico é de 98,2%. mAU = mili Unidades de Absorbância, NM-02 = nosso produto, UV = canal de luz ultravioleta, nm = nanômetro, min = minuto, CPS = contagens por segundo, GLMN-02 = 68nanocorpo marcado com Ga NM-02, 68Ga-DOTA-GA = [68Ga]Ga-DOTA-GA, γ ChA = canal gama. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na ausência de HPLC ou em adição a ela, a TLC pode ser usada para determinar o rendimento e a pureza da rotulagem do produto final (mas não a identidade, e não tão detalhada quanto a HPLC). Devido à sua baixa complexidade, a CPT é ideal quando a via de radiossíntese ainda está sendo otimizada. A Figura 2 mostra o cromatograma TLC do nanocorpo NM-02 marcado com 68Ga (pureza radioquímica aparente de 99,9%).

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Figura 2: Cromatograma TLC analítico típico para controle de qualidade de 68 nanocorpos marcados com GaNM-02 (GLNM-02). As contagens de área são plotadas em relação à distância percorrida pelo solvente (citrato) na placa TLC. O Rf é 0,2 e a pureza radioquímica é de 99,9%. C = Contagens, mm = milímetro, GLNM-02 = 68nanocorpo marcado com Ga NM-02, TLC = cromatografia em camada delgada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No processo de preparação de dados de imagem para publicação, é prática padrão mostrar pelo menos uma imagem autônoma de TC e PET. Essa abordagem permite uma avaliação abrangente da biodistribuição do traçador. A escala padrão da TC está entre -1000 UH e 1000 UH, o que permite a visualização de todos os tecidos moles em uma única janela. Conforme mostrado na Figura 3A, esse método permite a demarcação clara dos rins de camundongos e, ao mesmo tempo, permite a avaliação óssea.

Para a escala PET, defina o limite inferior em um SUV de 0,0, mantendo um limite superior mínimo de 1,0 (Figura 3B), de preferência usando a normalização do peso corporal durante o cálculo do SUV (ou seja, SUVbw). Além disso, para quantificação, o SUVmean é preferido em comparação com o SUVmax; se o SUVmax for usado, use a média dos 10 voxels mais quentes em vez do valor do voxel único mais quente no cálculo do SUVbw . Prepare fusões de características de imagens PET/CT mesclando as fatias de TC e PET (Figura 3C).

Para permitir que os leitores avaliem de forma independente a biodistribuição do traçador de corpo inteiro, a projeção de intensidade máxima do mesmo PET scan pode ser apresentada usando a mesma escala que a fatia de PET (Figura 3D).

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Figura 3: Imagens in vivo de PET/CT de um camundongo portador de tumor SKOV-3 subcutâneo. A imagem foi adquirida 3 h após a injeção intravenosa de 5 MBq 68 (A) A imagem de TC é dimensionada entre -1000 UH e 1000 UH, enquanto (B) a imagem PET está entre um SUV de 0,0 e 5,0. (C) A fusão PET/CT usa a mesma escala. (D) A imagem PET de projeção de intensidade máxima (MIP) também é dimensionada usando um SUV de 0,0 e 5,0. Todas as imagens de PET mostram uma boa captação tumoral de GLNM-02, e a depuração renal é claramente visível. TC = tomografia computadorizada, PET = tomografia por emissão de pósitrons, PImáx = projeção de intensidade máxima, HU = unidade Hounsfield, SUV = valor de captação padronizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No caso específico do nanocorpo NM-02 marcado com 68Ga, uma captação tumoral notável pode ser observada no flanco esquerdo do camundongo. Além disso, a depuração renal do traçador também é evidente. Ao apresentar a projeção de intensidade máxima do PET, a atividade da bexiga urinária também se torna visível, reforçando a depuração renal do traçador. Nesse caso específico, vale ressaltar que o rim, o tumor e a bexiga não podem ser mostrados no mesmo corte 2D. Ao incluir a projeção de intensidade máxima nas publicações, toda a biodistribuição do traçador é apresentada na mesma imagem.

Discussão

Radiossíntese
A radiossíntese descrita aqui é típica para um novo composto marcado com 68Ga - tempo de síntese curto, com ênfase no pH adequado e evitando metais sempre que possível. Para isso, é importante seguir rigorosamente a ordem em que os componentes são adicionados. Em qualquer caso, o valor do pH da solução de 68Ga deve ser previamente ajustado para pH 4 com 3 M NH4OAc; caso contrário, o nanocorpo pode se degradar se o pH for muito ácido. Os conceitos gerais de 68síntese de Ga foram descritos anteriormente16, então não entraremos em detalhes aqui. O módulo de síntese automatizada requer otimização adicional em relação à redução da dose de radiação. Isso requer um esforço significativo que está além do escopo da pesquisa exploratória em um experimento pré-clínico típico, conforme descrito aqui. Além disso, é improvável que uma síntese automatizada produza os pequenos volumes que podemos produzir com o método atual (< 1 mL), permitindo concentrações mais altas de 68Ga e maior atividade específica.

O controle de qualidade ainda deve ser realizado e registrado em grande detalhe. Uma exceção a esse detalhe é o pH: embora as medições de pH para sínteses clínicas sejam frequentemente realizadas com muita precisão usando medidores de pH, aqui é suficiente medir o pH com uma simples faixa de pH, pois os requisitos para injeções intravenosas permitem isso (qualquer pH entre 6 e 8 é permitido14). Essa técnica simples reduz o custo e a chance de contaminar o equipamento com material radioativo.

Formulações para modelos animais
A formulação final do traçador é um aspecto crucial do traçador, um aspecto que muitas vezes é mal descrito em pesquisas pré-clínicas. Embora exista uma legislação clara para a formulação de produtos farmacêuticos para ensaios em humanos, incluindo radiofármacos, pré-clinicamente, existem apenas diretrizes17,18 que não discutem especificamente solventes ou formulações. Essas diretrizes são frequentemente usadas na elaboração ou avaliação de protocolos legalmente exigidos para aprovação por comitês de ética (animal) (na Alemanha: LANUV19), mas esses documentos enfatizam insuficientemente a importância da formulação. É provável que formulações inadequadas possam levar a resultados falsos (negativos), mas tal afirmação é difícil de verificar, considerando o persistente viés de publicação que ainda existe, também no campo da oncologia20.

Além das diretrizes ARRIVE, optamos por seguir a legislação projetada para aplicações humanas tanto quanto possível, assumindo que as formulações adequadas para humanos geralmente também são adequadas para roedores. A principal diferença é o tamanho do assunto e, portanto, a quantidade de volume que pode ser injetada com segurança. Para isso, optou-se por purificar o composto sempre que possível usando filtros de corte de peso molecular (MWCO), pois estes provaram ser eficazes na purificação de compostos grandes21. Eles permitem que um marcador típico marcado com 68Ga seja finalmente dissolvido em uma solução de escolha e em um pequeno volume adequado para camundongos (injeção intravenosa máxima típica de 100 a 150 μL).

Na Alemanha, a GV-SOLAS (Gesellschaft für Versuchstierkunde, em português: Associação para animais de laboratório) serve como intermediária entre a proteção animal e a pesquisa, beneficiando humanos e animais. Portanto, essa associação estabeleceu recomendações para múltiplos aspectos da pesquisa animal, especialmente nas áreas de oncologia e anestesia, para padronizar o cuidado com os animais em nível nacional14. A partir de agora, a maioria das autoridades competentes e comitês nacionais de ética impõem a adesão dos protocolos em animais a essas recomendações. A GV-SOLAS tem recomendações para volumes máximos da maioria das rotas de aplicação. Para injeção intravenosa, recomenda-se um máximo de 5 mL/kg de peso corporal; para um camundongo de 25 g, isso equivale a 150 μL. Por esse motivo, todas as produções de traçadores radioativos são definidas para um volume máximo de injeção de 150 μL por animal. Exceder esse limite ao injetar por via intravenosa aumenta o risco de insuficiência cardíaca aguda causada por hipervolemia. Injeções intravenosas repetidas que excedem esse limite levam a um risco aumentado de fibrose pulmonar, pois cada injeção, dependendo da velocidade do fluxo, causa edema pulmonar menor. Um equivalente humano do IV de camundongo apresentado neste artigo seria injetar por via intravenosa em bolus (dentro de 10 s) um volume total de 375 mL para um humano de 75 kg. No tratamento clínico padrão, 500 mL de solução de NaCl a 0,9% são administrados durante 1 h; isso significa que 375 mL seriam administrados em 45 minutos para evitar complicações.

O GV-SOLAS recomenda que a carga tumoral não atinja mais de 5%; Caso o animal esteja em tratamento, a carga pode ser estendida até 10%22. Essa diferença entre os grupos tratados e não tratados tem o potencial de criar um viés de pesquisa, especialmente no caso de sobrevivência, pois os camundongos com tumor tratados podem atingir uma carga tumoral maior do que o grupo controle aferente. Para evitar tais casos, a carga tumoral de 5% também deve ser fixada para animais de tratamento; No entanto, isso pode levar a dilemas éticos para matar animais de pesquisa antes de atingir o chamado ponto final humanitário, ou (de preferência) argumentar que o aumento para 10% no caso dos grupos de controle aferentes é eticamente fundamentado para evitar viés.

Como a carga tumoral precisa ser calculada todos os dias de maneira não invasiva, aplicamos um fator de correção (ou seja, 0,82) para converter o volume tumoral calculado diariamente em um peso tumoral. Calculamos esse fator medindo os diâmetros dos tumores usando um paquímetro digital antes que os animais fossem mortos de acordo com o protocolo e, posteriormente, o peso real do tumor usando uma balança. Esse fator de correção é diferente da densidade do tecido tumoral, pois o volume tumoral medido também inclui a pele. Portanto, esse fator provavelmente é < 1,0, pois o volume tumoral medido é maior que o volume tumoral real. Como os tumores que pesamos eram relativamente grandes, pois a avaliação foi feita no último dia do experimento, esse fator de fato superestima o peso de tumores pequenos. Deve ser usado apenas na avaliação da carga tumoral.

Outro aspecto das recomendações do GV-SOLAS é que, para camundongos, um diâmetro tumoral fixo de 15 mm é definido como um desfecho humano17. Freqüentemente, o tumor tende a crescer rapidamente ao longo do canal da agulha feito pela injeção subcutânea se nenhum ar ou tampão for injetado após a solução contendo células tumorais. Portanto, os 15 mm são alcançados mais rapidamente para determinadas vias de aplicação. Uma vez que, em termos de experiência, alguns tumores crescem em uma forma elíptica, adaptamos e usamos a fórmula de volume tumoral mencionada acima para fazer comparações imparciais entre diferentes vias de aplicação.

Os modelos animais que utilizamos são projetados seguindo as diretrizes ARRIVE17 e PREPARE18 , permitindo uma fácil reprodução experimental. O modelo está sujeito a um certo grau de variação, pois a taxa de crescimento do tumor varia entre diferentes camundongos, tornando a padronização e a interpretação mais difíceis de manusear. No entanto, essas variações refletem a heterogeneidade intra e intertumoral presente nos pacientes oncológicos23.

Este protocolo não é isento de limitações. Os animais devem ser sedados durante a injeção, especialmente durante a tomografia computadorizada por emissão de pósitrons. A sedação, particularmente com isoflurano, afeta o fluxo sanguíneo, e os animais podem ficar hipotérmicos, exigindo o uso de uma esteira de aquecimento e o monitoramento da profundidade da sedação. Esse problema pode ser evitado examinando animais acordados; no entanto, isso requer software interno especializado e experiência, que muitas vezes não estão disponíveis.

Outra limitação é a dose de radiação. Embora a dose recebida pelos animais seja insignificante para um único exame, a realização de vários exames (ou seja, especialmente se mais de 10) pode resultar em uma dose cumulativa significativa, potencialmente afetando o crescimento do tumor. Quando o crescimento do tumor é um parâmetro de leitura, é essencial que todos os animais recebam o mesmo número de exames e doses para garantir grupos comparáveis, aumentando a carga de trabalho de todo o projeto. O uso de um sistema PET/MRI em vez de um sistema PET/CT pode reduzir a exposição à radiação. No entanto, essa abordagem envolve tempos de varredura mais longos, custos adicionais e um método diferente de obtenção de informações anatômicas.

Aderindo às recomendações de organizações de bem-estar como a GV-SOLAS na Alemanha e seguindo diretrizes estabelecidas como ARRIVE e PREPARE, nos esforçamos para padronizar modelos animais e minimizar a variabilidade nos protocolos experimentais. Esses esforços são cruciais para garantir a confiabilidade e a reprodutibilidade dos estudos pré-clínicos, facilitando a tradução de radiofármacos promissores da bancada para a beira do leito.

Divulgações

A FMM é consultora médica da NanoMab Technology Ltd. e da Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH. Recentemente, ele recebeu subsídios institucionais da NanoMab Technology Ltd., Siemens e GE Precision Healthcare LLC. Além disso, ele tem um contrato de pesquisa intervencionista com a CURIUM.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Susanne Allekotte por seu apoio técnico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
EquipamentoMedidor de
atividade ISOMED 2010Nuviatech Healthcare -
Centrífuga MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
Teste de endotoxinas Endosafe nexgen-PTSCharlesRiver-Bloco de
aquecimento NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
Sistema HPLC, incluindo detector de rádioKnauer & Raytest-Softwarede análise de
imagem Pmod 4.4 PMOD Technologies LLC-Sistema
PET/CT para pequenos animais β-CUBE e X-CUBEMolecubes NV-TLC
MiniGITA*Elysia-Raytest-
Materiais
0.3 mm de diâmetro Tubo PE10fisher scientific22-204008
30G agulhaB|Filtro4656300
; 10 kDa MWCO, 0.5 mLMilliporeUFC501008
Tira de papel para cromatografia iTLC-SGAgilent TechnologiesSGI0001
Cartucho de endotoxina, sensibilidade de 0.05 EU/ml Charles RiverPTS-2005
Coluna de HPLC Biosep SEC-s2000de
microcentrífuga Phenomenex (1,5 mL)Eppendorf0030125150
Tira de pH 0,0 - 6,0Merck KGaA109531
Tira de pH 0-14Merck KGaA109535
PS-H+ Cartucho SPEMacherey Nagel GmbH &; Co. KG731861
frasco estéril 10 mLALK Life Science SolutionsSEV100
Reagents
68Ge/68Ga-GeneratorNRF-iThembaLABS-AmmoniumacetateMerck
KGaA101116
Ácido cítricoMerck KGaA
Ácido clorídricoMerck KGaA320331
NaClMerck KGaAS9888
Nanobody NM-02Radiopharm Theranostics-P-SCN-Bz-DOTA-GA
CheMatechC115
Ácido trifluoracéticoMerck KGaAT6508
Água ultrapuraMerck KGaA
centrífugo Braun Tubo 100241101262

Referências

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