Artigo de método

Estudos sobre o efeito anti-inflamatório das pílulas Xiaoyao no tratamento da osteoporose pós-menopausa em camundongos

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DOI:

10.3791/67051

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23 de agosto de 2024

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1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Geriatric Orthopedics, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 3Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Neste artigo

Resumo

A osteoporose pós-menopausa tornou-se um problema de saúde pública global. O objetivo deste estudo é explorar os efeitos terapêuticos e os mecanismos relacionados das pílulas Xiaoyao da medicina tradicional chinesa nessa condição.

Resumo

A osteoporose é uma doença metabólica comum em mulheres idosas e na pós-menopausa, sem sintomas óbvios durante seus estágios iniciais. Nos últimos estágios dessa condição, os pacientes são propensos a fraturas, o que pode afetar seriamente sua saúde e qualidade de vida. O aumento mundial da expectativa de vida tornou a osteoporose uma preocupação global. As pílulas Xiaoyao foram anteriormente
usado no tratamento da depressão. Além disso, a droga parecia ter atividade semelhante ao estrogênio, que afetou a expressão de ALP, um marcador precoce específico de osteoblastos, e COL-1, um componente importante da matriz extracelular óssea. As pílulas Xiaoyao foram avaliadas quanto aos seus efeitos na osteoporose pós-menopausa (PMOM) em camundongos. As informações de destino de cada componente herbal das pílulas Xiaoyao foram acessadas por meio do banco de dados de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP). Informações de GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank e outros sites foram usadas para construir a rede regulatória do complexo fitoterápico por meio da rede Cytoscape e String para avaliar as interações proteicas. Os camundongos foram ovariectomizados e tratados com altas e baixas doses de pílulas Xiaoyao e estes foram comparados aos controles. Seus sintomas foram avaliados por imunocitoquímica dos tecidos ósseos. Os resultados sugeriram que as pílulas Xiaoyao tiveram a capacidade de aliviar os sintomas de PMOM em camundongos ovariectomizados através da via de sinalização IL-17. Este medicamento tem o potencial de se tornar um novo agente terapêutico para o tratamento da osteoporose.

Introdução

A Organização Mundial da Saúde (OMS) define a osteoporose (PO) como uma doença caracterizada pela diminuição da massa óssea e deterioração da microarquitetura do tecido ósseo, levando a um aumento da fragilidade óssea e, portanto, a um aumento do risco de fratura1. O significado clínico da osteoporose é que ela pode levar a fraturas, que estão associadas a alta mortalidade, morbidade e custos econômicos2. A osteoporose pós-menopausa (PMOP) é causada por uma diminuição nos níveis de estrogênio em mulheres após a menopausa, o que leva a um aumento na atividade dos osteoclastos, resultando em perda óssea e destruição da microestrutura óssea. Isso geralmente causa osteoporose com sério impacto na saúde3. As terapias atuais para PMOP incluem terapia de reposição de estrogênio, bifosfonatos e paratormônio, mas podem ter graus variados de efeitos adversos, adesão insuficiente a longo prazo e altos custos4. Portanto, a fitoterapia acessível é uma alternativa viável para uma grande proporção da população.

As pílulas Xiaoyao estão incluídas na FarmacopeiaChinesa 5 e contêm oito componentes à base de plantas, incluindo Chai Hu, Angelica sinensis, Paeonia lactiflora branca, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, alcaçuz e gengibre fresco. Todas essas ervas são conhecidas por serem eficazes na desintoxicação do fígado e no fortalecimento do baço, na nutrição do sangue e na regulação do ciclo menstrual, e a mistura também tem sido usada para tratara depressão. No entanto, o papel das pílulas Xiaoyao na osteoporose não é claro.

Estudos iniciais sugeriram que a inflamação pode levar à perda óssea7 e que o declínio da densidade óssea associado a esse processo pode ser acelerado pela menopausa. Além disso, existe uma forte relação entre o desenvolvimento de osteoporose e inflamação. O fator inflamatório, interleucina-17 (IL-17), é um fator pró-inflamatório secretado pelas células Th17, um subconjunto de linfócitos T CD4+. Essas células estão associadas a várias condições inflamatórias crônicas e desempenham um papel importante no desenvolvimento da destruição óssea na artrite reumatoide8. Além disso, a IL-17 estimula o ativador do receptor ligante do fator nuclear κ B (RANKL), que regula a osteoclastogênese, levando a uma maior reabsorção óssea do que a formação óssea9. A IL-17 estimula a expressão de outras citocinas osteoclastogênicas, como TNFα, IL-1, IL-6 e IL-8. Tem a capacidade de sinergizar com outros fatores inflamatórios, tornando-se um importante efetor inflamatório10.

Estudos também mostraram uma ligação entre as pílulas Xiaoyao e a inflamação. Shi et al.11 e Fang et al.12 confirmaram recentemente que as pílulas Xiaoyao podem reduzir os níveis de IL-6 e TNF-α, respectivamente. Em outro estudo de esteato-hepatite associada ao metabolismo, foi relatado que as pílulas Xiaoyao poderiam regular positivamente a expressão de ácido propiônico, que por sua vez inibe a expressão de TNF-α e exerce um efeito anti-inflamatório13. No entanto, no momento, não se sabe se as pílulas Xiaoyao podem regular o desenvolvimento de PMOM mediando uma resposta inflamatória através da IL-17, que foi o objetivo deste estudo.

Este estudo previu a interseção dos alvos das pílulas Xiaoyao e genes relacionados à osteoporose por meio de farmacologia de rede e análise de bioinformática e analisou os genes de interseção para interações proteicas, GO e KEGG. Com base nos resultados previstos, pode-se observar a expressão de Act1 e IL-6, que são proteínas-chave na via de sinalização da IL-17 14,15, bem como os marcadores de remodelação óssea fosfatase alcalina (ALP) e colágeno tipo I (COL-1), para observar a eficácia terapêutica das pílulas Xiaoyao no modelo de camundongos PMOM.

Protocolo

O Comitê de Ética em Animais de Laboratório da Universidade Médica de Youjiang para Nacionalidades aprovou o protocolo do estudo (número de aprovação: 2022101502). Camundongos C57BL/6 fêmeas, com idade entre 10 e 12 semanas, classe SPF e pesos corporais (22 ± 2) g, foram alojados no Centro de Experimentos Animais da Classe SPF da Universidade Médica de Youjiang para Nacionalidades. Os animais experimentais foram mantidos a uma temperatura de 24-26 °C e umidade relativa de 55% a 60%.

1. Base de dados e plataforma de análise de farmacologia de sistemas de medicina tradicional chinesa

NOTA: O Banco de Dados e Análise de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) são plataformas de farmacologia de medicina chinesa que contêm informações sobre ingredientes da MTC, propriedades relacionadas ao ADME, alvos e doenças16,17.

  1. Acesse a interface web do TCMSP. Pesquise o nome de Herb, digite o nome do medicamento chinês e clique em Pesquisar. Clique em Nome latino nos resultados da pesquisa. Realize a triagem dos resultados dos ingredientes com os parâmetros OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18.
  2. Copie todos os resultados e salve-os no formato TXT, denominado Medicina Chinesa Name_ingredients.txt.
  3. Em Informações de Destinos na guia Destinos Relacionados, filtre por ID do Mol (ou seja, o resultado na etapa 1.2).
  4. Copie os resultados filtrados e salve-os no formato TXT chamado Chinese Medicine Name_targets.txt.
    NOTA: Através das etapas acima, todos os ingredientes ativos elegíveis e as informações de destino correspondentes da medicina tradicional chinesa (MTC) foram obtidos.
  5. Coloque todos os arquivos ingredients.txt e targets.txt acima na mesma pasta e coloque os scripts Perl (Arquivo de Codificação Suplementar 1) nessa pasta.
  6. Abra o CMD, digite o caminho da pasta cd, digite-o e execute o script Perl. Obtenha um novo arquivo de texto (allTargets.txt). Este novo arquivo de texto (allTargets.txt) contém o nome da erva, o nome do ingrediente, o ID do ingrediente e o alvo.

2. Banco de dados UniProt

NOTA: O banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org/) contém sequências de proteínas humanas anotadas com informações funcionais e é usado para normalizar os nomes dos alvos para seus nomes oficiais18.

  1. Vá para a interface da Web do UniProt. Clique na guia Pesquisar , selecione UniProtKB e clique em Pesquisar.
  2. Filtre na barra lateral esquerda, selecione Revisado (Swiss-Prot) para Status e Humano para organismos populares. Clique em Baixar, selecione Baixar tudo, selecione TSV para Formato e clique em Baixar para baixar o arquivo de anotação.
  3. Descompacte o arquivo baixado na pasta atual, abra o arquivo descompactado e copie e cole-o em um arquivo de texto chamado ann.txt.

3. Conversão de ID de alvo de medicamento

  1. Coloque todos os arquivos de destino de drogas allTargets.txt obtidos na seção 1 e o arquivo de anotação UniProt ann.txt obtido na seção 2 em uma pasta e coloque os scripts Perl (Arquivo de Codificação Suplementar 2) nela.
  2. Abra o CMD, digite cd + espaço + caminho da pasta, insira-o e execute o script Perl para obter um novo arquivo de texto (allTargets.symbol.txt). Este novo arquivo de texto (allTargets.symbol.txt) contém o nome da erva, o ID do ingrediente, o nome do ingrediente e o ID do gene.

4. Pesquisa em banco de dados

  1. GeneCards: Banco de dados de genes humanos (GeneCards)
    NOTA: O banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/) fornece informações de previsão e anotação para genes humanos. É usado para acessar alvos de doenças 19,20.
    1. Vá para a interface da Web do GeneCards. Digite osteoporose na caixa de pesquisa e clique em Pesquisar.
    2. Clique em Exportar e selecione Exportar para o Excel.
    3. Abra o arquivo baixado, copie os genes com pontuação de relevância ≥ 1, cole e salve-os em um arquivo chamado GeneCards.txt.
  2. Banco de dados OMIM
    NOTA: O banco de dados OMIM (https://omim.org) contém genes humanos, doenças genéticas e características21.
    1. Vá para a interface da Web do OMIM. Clique em GENE Map, digite osteoporose na caixa de pesquisa e clique em Pesquisar.
    2. Clique em Baixar como e selecione Arquivo do Excel.
    3. Abra o arquivo baixado, copie o nome do gene na coluna Símbolo Aprovado, cole-o e salve-o em um arquivo chamado OMIM.txt.
  3. Banco de dados PharmGkb
    NOTA: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), a base de conhecimento farmacogenômica, contém anotações de rótulos de medicamentos, vias centradas em medicamentos, resumos farmacogenéticos e relações entre genes, medicamentos e doenças22.
    1. Acesse a interface do site do PharmGkb. Digite osteoporose na caixa de pesquisa, clique em Pesquisar e marque Gene na barra lateral esquerda.
    2. Insira todos os resultados manualmente e salve-os em um arquivo chamado PharmGkb.txt.
  4. TTD: Banco de dados de alvos terapêuticos (TTD)
    NOTA: O banco de dados TTD (https://idrblab.org/ttd/) fornece informações sobre alvos de proteínas e ácidos nucleicos, doenças-alvo, informações sobre vias e medicamentos correspondentes para cada alvo23.
    1. Vá para a interface da Web do TTD. Digite osteoporose na caixa de pesquisa e clique em Pesquisar.
    2. Clique em Informações do Destino em ID do Destino no resultado, copie o Nome do Destino, cole-o e salve-o em um arquivo chamado TTD.txt. Um total de 33 resultados foram obtidos. Salve cada resultado da mesma maneira.
  5. Banco de dados do DrugBank Online (DrugBank)
    NOTA: O banco de dados do DrugBank (https://go.drugbank.com) contém informações sobre medicamentos e alvos de medicamentos, interações medicamentosas, mecanismos de medicamentos e metabolismo de medicamentos24.
    1. Acesse a interface do site do DrugBank. Selecione Indicações na guia de pesquisa, digite osteoporose na caixa de pesquisa e clique em Pesquisar.
    2. Clique na entrada Osteoporose nos resultados para obter mais informações, clique na guia MEDICAMENTOS E ALVOS e clique no link apropriado na coluna ALVO da tabela.
    3. Clique em Detalhes em Proteína, copie o Nome do gene, cole-o e salve-o em um arquivo chamado DrugBank.txt. Salve cada resultado da mesma maneira.

5. Diagrama de Venn

  1. Fusão de genes associados à doença e mapeamento de Venn
    1. Coloque os arquivos txt salvos, bem como o script na mesma pasta.
    2. Abra o código R (Merge Disease-Related Genes), copie e cole o caminho onde o arquivo txt acima está armazenado na linha onde o setwd está localizado no código R.
    3. Abra o software R, execute o código R modificado e salve. Defina o gene, nomeie o arquivo Disease.txt.
    4. Abra o site Draw Venn Diagram; na seção de entrada, copie e cole o conteúdo do texto salvo nas seções 4 a 8, um por um, na lista, nomeando-o com o respectivo banco de dados e clicando em Enviar.
    5. Clique em Salvar imagem como PNG abaixo da imagem e salve o resultado do texto na mesma pasta.
  2. Interseção de alvos de drogas e genes associados a doenças
    1. Coloque o arquivo allTargets.symbol.txt obtido na seção 3 e o arquivo Disease.txt obtido na etapa 5.1.3 na mesma pasta.
    2. Abra o código R (alvo do medicamento e interseção de genes relacionados à doença), copie e cole o caminho onde o arquivo txt acima está armazenado na linha onde o setwd está localizado no código R.
    3. Abra o software R, execute o código R modificado e salve. Defina o gene, nomeie o arquivo Drug_Disease.txt.
    4. Abra o site Desenhar Diagrama de Venn. Na seção de entrada, copie e cole allTargets.symbol.txt e Disease.txt na lista e nomeie-os com seus respectivos arquivos.
    5. Clique em Salvar imagem como PNG abaixo da imagem e salve os resultados de texto na mesma pasta.

6. Construção da rede regulatória de compostos TCM

  1. Coloque o arquivo allTargets.symbol.txt obtido na seção 3 na mesma pasta que o arquivo Disease.txt e o script Perl correspondente (Arquivo de Codificação Suplementar 3).
  2. Abra o CMD, digite o caminho do arquivo cd, pressione Enter e execute o script Perl. Obtenha quatro novos arquivos txt: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt e net.type.txt. O arquivo network.txt contém o ID do ingrediente TCM, o gene alvo, a relação alvo e o nome do ingrediente. net.type.txt contém o nome do nó, os atributos e a afiliação. net.geneLists.txt é a lista de genes e net.molLists.txt é a lista de ingredientes.
  3. Copie os arquivos de texto recém-obtidos na mesma nova pasta.
  4. Abra o software Cytoscape 3.9.1, clique em Arquivo, clique em Importar e selecione Arquivo de formulário de rede. Selecione net.network.txt, coloque a primeira coluna de ID do componente como Nó de origem, a segunda coluna de Genes como Nó de destino e a terceira coluna de Relacionamento de direcionamento como Tipo de interação e clique em OK.
  5. Importe net.type.txt da janela Tabela de Nós. Clique na guia Selecionar, selecione Nós, selecione Do arquivo de lista de ID, selecione net.geneLists.txt e clique em Abrir.
  6. Clique na guia Layout, selecione Layout de círculo classificado por grau e selecione Somente nós selecionados. Ajuste a altura e a largura dos nós para 70.
  7. Clique na Segunda Caixa em Altura, selecione degree.layout em Coluna, selecione Mapeamento Contínuo em Tipo de Mapeamento e clique duas vezes na Janela de Ajuste de Altura no lado direito do Mapeamento Atual para ajustar os limites superior e inferior da altura para um intervalo adequado.
  8. Repita a operação com a opção Largura.
  9. Clique na guia Layout novamente e clique em Ferramentas de layout > Ajustar a escala para que os nós não se sobreponham.
  10. Clique na janela superior direita do software para desmarcar a rede do nó, clique na guia Selecionar , selecione Nós, selecione Do arquivo de lista de ID, selecione net.molLists.txt e clique em Abrir.
  11. Clique na guia Layout, selecione Layout de atributos de grupo, selecione Somente nós selecionados e clique em Tipo.
  12. Clique em Tamanho da fonte do rótulo na coluna esquerda e defina o Valor padrão como 12. Clique em Valor Padrão na Imagem/Gráfico 1 na coluna da esquerda.
  13. Selecione Gráficos na janela pop-up, clique em Gráfico de pizza e selecione os Itens na coluna Colunas disponíveis, exceto grau. Layout na coluna de colunas selecionadas e clique em Aplicar.
  14. Clique em Border Paint na coluna da esquerda e defina o Valor padrão como #003EF8. Clique na guia Edge na parte inferior da barra lateral esquerda e defina Largura para 0,8.
  15. Clique em Arquivo na barra de ferramentas superior, selecione Exportar e, em seguida, selecione Rede para imagem.
  16. Na janela pop-up, selecione o formato PNG para Formato, selecione o diretório de salvamento e nomeie a rede de imagens, ajuste o Zoom no tamanho da imagem para o máximo de 500%, selecione Fundo transparente e clique em OK para terminar de salvar a imagem.

7. Construções de Redes de Interação Proteína-Proteína (PPI)

  1. Abra o site do STRING (https://string-db.org/), clique em Proteína Múltipla, clique em Procurar em Carregar um arquivo, selecione o arquivo Drug_Disease.txt obtido na etapa 5.2.3 e selecione Homo sapiens em Organismos. Clique em Pesquisar e clique em Continuar.
  2. Clique em Configurações, defina a pontuação mínima de interação necessária para a confiança mais alta (0,900) e marque Ocultar nós desconectados na rede nas opções de exibição de rede. Clique em Atualizar.
  3. Faça ajustes nos nós do diagrama de rede para que não haja sobreposição ou oclusão.
  4. Clique em Exportações e clique em Baixar como um bitmap de alta resolução para obter o mapa da rede de entrelaçamento de proteínas no formato PNG. Além disso, baixe o arquivo TSV como uma saída de texto tabular curta. Salve os dois arquivos em uma pasta unificada. O arquivo TSV contém o nome do gene, o ID interno da STRING e as pontuações para diferentes atributos.

8. Construção do núcleo da rede PPI

  1. Coloque o arquivo TSV obtido na seção 7 e os scripts Perl necessários em uma nova pasta.
  2. Abra o software Cytoscape 3.9.1, clique em Arquivo, selecione Importar, clique em Rede do arquivo, selecione o arquivo TSV acima, coloque a primeira coluna node1 como Nó de origem e a segunda coluna node2 como Nó de destino e clique em OK.
  3. Clique em Estilo na barra lateral esquerda, clique em Valor padrão em Largura e defina-o como 60. Arraste e solte os nós para que não haja sobreposição e oclusão na rede.
  4. Clique em APPs na barra de ferramentas superior, clique em CytoNCA e clique em Abrir.
  5. Na coluna da esquerda, selecione Sem peso em Intermediário, Proximidade, Grau, Vetor próprio, Método baseado em conectividade média local e Rede e clique em Analisar.
  6. Quando a análise estiver concluída, clique em Tabela de nós na janela inferior direita, clique em Exportar, salve-o na pasta e nomeie-o como pontuação 1.
    NOTA: O plug-in CytoNCA precisa ser instalado no software Cytoscape. Para fazer isso, clique em Aplicativos na barra de ferramentas superior, clique em Gerenciador de aplicativos, digite CytoNCA na caixa de pesquisa, marque CytoNCA na coluna do meio dos resultados retornados e clique em Instalar.
  7. Abra score1, ajuste a coluna de nome para a primeira coluna, copie as informações da tabela, cole-as em um novo arquivo de texto, nomeie-o score1.txt e salve-o.
  8. Abra o código R e copie e cole o caminho onde o arquivo score1.txt está localizado na linha onde o setwd está localizado no código R.
  9. Abra o software R e execute o código modificado para obter dois novos arquivos, score2.txt e score2.gene.txt. O arquivo score2.txt contém os genes para os quais todas as pontuações do programa foram maiores que a mediana e as pontuações específicas para cada programa. score2.gene.txt contém os genes que pontuaram mais do que a mediana para todos os itens.
  10. Para continuar no Cytoscape, clique em AnalysisPanel 1 na janela inferior direita, clique em Carregar do arquivo no lado esquerdo da janela, selecione o score2.gene.txt, clique em Abrir e toque em OK na janela pop-up.
  11. Clique em Selecionar nós na parte inferior e clique em OK na janela pop-up.
  12. Clique em Arquivo na barra de ferramentas superior, selecione Exportar, clique em Rede para imagem, ajuste o Zoom (%) em Tamanho da imagem para o máximo de 500%, marque Fundo transparente e salve o arquivo na mesma pasta, nomeie-o como rede1.
  13. Clique em Criar sub-rede na barra lateral direita da janela inferior para criar uma sub-rede, analise a sub-rede, clique em APPs na barra de ferramentas na parte superior, clique em CytoNCA e clique em Abrir.
  14. Na barra lateral esquerda, selecione Sem peso em Intermediário, Proximidade, Grau, Vetor próprio, Método baseado em conectividade média local e Rede e clique em Analisar.
  15. Quando a análise estiver concluída, clique em Tabela de nós na janela inferior direita, clique em Exportar e salve-a em uma nova pasta chamada score2.
  16. Abra a pontuação2, ajuste a coluna de nome para a primeira coluna, copie as informações da tabela, cole-as em um novo arquivo de texto, nomeie-o score2.txt e salve-o.
  17. Abra o código R e copie e cole o caminho onde o arquivo score2.txt está localizado na linha onde o setwd está localizado no código R.
  18. Abra o software R e execute o código modificado para obter dois novos arquivos: score3.txt e score3.gene.txt. O arquivo score3.txt contém os genes que pontuaram mais do que a mediana para todos os itens e as pontuações específicas para cada item. score3.gene.txt contém os genes que pontuaram mais do que a mediana para todos os itens.
  19. Para continuar no Cytoscape, clique em AnalysisPanel 1 na janela inferior direita, clique em Carregar do arquivo no lado esquerdo da janela, selecione a score3.gene.txt, clique em Abrir e toque em OK na janela pop-up.
  20. Clique em Selecionar nós na parte inferior e clique em OK na janela pop-up.
  21. Clique em Arquivo na barra de ferramentas superior, selecione Exportar, clique em Rede para imagem, ajuste o zoom (%) no tamanho da imagem para 500%, marque Fundo transparente e salve o arquivo na mesma pasta usada nesta etapa, nomeando-o rede2.
  22. Clique em Criar sub-rede na barra lateral direita da janela abaixo para criar uma sub-rede.
  23. Clique em Arquivo na barra de ferramentas na parte superior, selecione Exportar, clique em Rede para imagem, ajuste o Zoom (%) no tamanho da imagem para o máximo de 500%, marque Fundo transparente e salve o arquivo na mesma pasta usada nesta etapa e nomeie-o como rede3.

9. Conversão de ID de gene

  1. Coloque o arquivo Drug_Disease.txt na mesma nova pasta que o arquivo de código necessário.
  2. Abra o código R (Arquivo de Codificação Suplementar 4) e copie e cole o caminho onde o arquivo Drug_Disease.txt está localizado na linha onde o setwd está localizado no código R.
  3. Abra o software R, execute o código modificado usando a organização. Hs.eg.db pacote para converter o ID do gene e executar após a conclusão de um novo arquivo id.txt. O id.txt contém o símbolo do gene e o ID correspondente.

10. Análise de enriquecimento GO

  1. Coloque o arquivo id.txt da etapa anterior na mesma pasta que o código de análise de enriquecimento GO.
  2. Abra o código R (Arquivo de Codificação Suplementar 5) e defina o diretório de trabalho como id.txt e o caminho onde o código GO está armazenado.
  3. Abra o software R, execute o código modificado e use clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enriqueça o gráfico, o gráfico ggplot2, os histogramas de análise de enriquecimento GO e os gráficos de bolhas. Obtenha três novos arquivos, GO.txt, barplot.pdf e bubble.pdf, após a conclusão da execução.
    NOTA: O GO.txt é o arquivo de resultados de enriquecimento contendo classificação de enriquecimento (BP, CC, MF), GO ID, nome GO, proporção do gene, proporção de fundo, valor p de significância do enriquecimento, valor p corrigido (p.adjust, valor), ID do gene (nome) e número de genes enriquecidos em cada GO. barplot.pdf é o histograma, bolha. PDF é um gráfico de bolhas.

11. Análise de enriquecimento KEGG

  1. Coloque o arquivo id.txt na mesma pasta que o código de análise de enriquecimento KEGG.
  2. Abra o código R (Arquivo de Codificação Suplementar 6) e defina o diretório de trabalho para o caminho onde id.txt e o código KEGG estão armazenados.
  3. Abra o software R, execute o código modificado e use o clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, pacote ggplot2 para plotar histogramas de análise de enriquecimento GO, gráficos de bolhas e gráficos de caminhos. A execução é concluída com a produção de três novos arquivos, KEGG.txt, barplot.pdf e bubble.pdf.
    NOTA: O arquivo KEGG.txt é um arquivo de resultado de enriquecimento contendo ID da via, descrição da via, proporção do gene, proporção de fundo, valor p de significância do enriquecimento, valor p corrigido (p.adjust, qvalue), ID do gene (nome) e o número de genes enriquecidos em cada via. barplot.pdf é um gráfico de barras e bubble.pdf é um gráfico de bolhas.
  4. Pesquise IL-17 no arquivo KEGG.txt; O resultado mostra que existe apenas um caminho; copie o ID do caminho.
  5. Abra o código R, cole o ID do caminho IL-17 em KEGGID e use o pacote pathview para rotular o mapa do caminho. Execute o código R modificado e obtenha dois novos arquivos, hsa04657.pathview.png e hsa04657.png.
    NOTA: O arquivo hsa04657.png é o mapa do caminho, hsa04657.pathview.png é o mapa do caminho rotulado e os rotulados em vermelho são os genes presentes na rede de interações.

12. Preparação de pílulas Xiaoyao

NOTA: Para o método de preparação usado, consulte a Farmacopeia Chinesa5.

  1. Tome 100 g de Chai Hu, 100 g de Angelica sinensis, 100 g de Paeonia lactiflora branca, 100 g de Atractylodes macrocephala frito, 100 g de Poria cocos, 80 g de Radix glycyrrhizae preparada e 20 g de Menthae herba.
  2. Usando um moinho de pedra ou uma máquina de pó, esmague as ervas até formar um pó fino; Várias ervas são combinadas nas proporções acima e pulverizadas em um pó fino para se misturar naturalmente. Use uma peneira de 80 malhas com um diâmetro interno de 180 μm ± 7,6 μm e peneire o pó pulverizado. Homogeneizar.
  3. Pegue 100 g de gengibre, adicione água e ferva 2x por 20 minutos de cada vez. Coe e reserve.
  4. Pegue uma placa medicinal, mergulhe uma pequena vassoura em água de gengibre, escove-a na placa, pegue o pó acima, polvilhe na água de gengibre e vire a placa para que todo o pó fique úmido e possa ser moldado em forma de bola.
    NOTA: A formação da placa medicinal é uma etapa essencial durante a preparação das pílulas da MTC. A maior parte do bambu moso será dividida em tiras e tecida em um esqueleto. A pele de bambu, ou tengpi, é tecida na superfície e torna-se arredondada. A superfície da placa deve ser finamente revestida com óleo de tungue e depois escovada com uma camada de verniz. Este é seco para se tornar estanque. As pílulas feitas dessa maneira serão redondas e lisas.
  5. Pincele a água com gengibre novamente, polvilhe o pó e gire a placa para que o medicamento seja gradualmente arredondado e aumentado. Coloque em local fresco para secar.

13. Estabelecimento do modelo animal

  1. Após 7 dias de aclimatação, divida aleatoriamente os camundongos experimentais em 4 grupos, a saber, o grupo de operação simulada (Sham, onde apenas a gordura ao redor dos ovários foi removida) e três grupos de camundongos ovariectomizados consistindo em um grupo modelo (OVX), bem como grupos de administração de pílulas Xiaoyao de baixa e alta concentração.
  2. Anestesiar os camundongos com pentobarbital sódico a 3% (40 mg/kg) injetado por via intraperitoneal. Verifique se os camundongos entram no estado de anestesia observando relaxamento muscular generalizado, respiração profunda e lenta e movimento lento. Aplique pomada para os olhos dos camundongos antes da cirurgia.
  3. Coloque os animais em decúbito ventral e raspe a região renal das costas com um barbeador animal. Realize a desinfecção local com etanol a 75%.
  4. Faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 1 cm bilateralmente, próximo à região dorsal do rim, e faça uma incisão na fáscia para separar os músculos e o peritônio.
  5. Localize a parte superior do corno uterino e as trompas de falópio para ligadura. Insira uma pinça na incisão para exploração e localize o ovário, envolto por tecido adiposo em um padrão de couve-flor vermelha brilhante, com trompas de falópio dispostas em espiral abaixo do ovário, conectando o ovário ao corno uterino25. Remova os ovários com tesoura cirúrgica e sutura.
  6. Remova uma pequena quantidade de tecido adiposo perto do ovário como controle no grupo de operação simulada. Observe os animais até que eles recuperem a consciência. Colocar os animais em pós-operatório em gaiolas separadas até à recuperação total.
  7. Para prevenir a infecção, forneça gentamicina aos camundongos por 3 dias após a cirurgia. Após a operação, garanta uma dieta normal e um bom ambiente de crescimento de acordo com a condição real dos camundongos. Se houver alguma anormalidade, como infecção da ferida ou perda de apetite, consulte imediatamente o instrutor do Centro de Animais de Laboratório.

14. Administração de medicamentos

NOTA: De acordo com a Metodologia Experimental de Farmacologia26, a conversão das dosagens humanas e animais utilizadas foi de 9 g de comprimidos de Xiaoyao para um adulto de 70 kg, equivalente a uma dose (dosagem para uma única administração).

  1. Para os grupos de dose baixa e alta, use 0,683 g/kg e 2,73 g/kg, respectivamente, para um grupo de 8 animais. Use a mão esquerda para imobilizar o mouse de modo que a boca do mouse fique em linha reta com o esôfago. Segurando a agulha de gavagem com a mão direita, insira-a suavemente no esôfago ao longo da parede posterior da faringe a partir do canto da boca do camundongo.
  2. Nesse ponto, a direção da agulha de gavagem pode ser ligeiramente alterada para estimular uma ação de deglutição induzida. Injete a droga. Faça isso uma vez ao dia por 12 semanas.
  3. Para os grupos simulado e modelo, administre solução salina uma vez ao dia durante 12 semanas em uma quantidade determinada pelo peso do animal.
  4. Eutanásia de camundongos por luxação cervical e corte seus membros posteriores. Esfole os membros para separar o músculo do fêmur. Trate os fêmures de camundongos com solução de descalcificação EDTA por 1 mês e substitua por uma solução nova diariamente.

15. Coloração de hematoxilina-eosina (HE)

  1. Desparafine os tecidos femorais por 8 min e depois coloque em etanol gradiente por 3 min; Enxágüe com água corrente por 1 min.
  2. Adicione a solução de coloração de hematoxilina gota a gota nas seções para cobrir completamente o tecido, core por 5 min e lave com água da torneira
  3. Adicione a solução de diferenciação de ácido clorídrico ao tecido na lâmina, garantindo que ela cubra completamente o tecido. Pare quando a descoloração do tecido for observada. Enxágue com água da torneira.
  4. Adicionar a solução de corante de Eosina gota a gota e deixar cobrir completamente o tecido, atuando por 30 s a 2 min. Enxágue o excesso de corante com água corrente.
  5. Realize a desidratação do etanol gradiente com etanol anidro a 75% por 5 min, seguido de etanol anidro por 5 min e limpe usando solução de desparafinação por 3 min.
  6. Coloque uma quantidade adequada de goma neutra na lâmina de acordo com o tamanho do tecido e abaixe a lamínula com cuidado, evitando bolhas de ar.

16. Análise de micro-CT e imuno-histoquímica

  1. Remova o excesso de músculos e ligamentos ao redor das amostras de fêmur de diferentes grupos de camundongos e fixe os tecidos da amostra em paraformaldeído a 4% por 24 h.
  2. Secar os tecidos ósseos ao ar e realizar micro-CT por varredura de tecido ósseo para obter dados tridimensionais de micro-CT.
  3. A partir dos blocos de cera de rato preservados, corte-os em seções contínuas de 6 μm de espessura e asse as fatias a 70 °C -72 °C por 30-60 min.
  4. Desparafine por 8 min, seguido de tratamento com etanol anidro a 75% por 5 min, etanol anidro por 5 min e enxágue com PBS por 5 min por 3x.
  5. Realize o reparo de alta pressão com EDTA por 15 minutos, seguido de lavagem com PBS por 5 minutos por 3x.
  6. Adicione 3% de peróxido de hidrogênio gota a gota ao tecido, incube em temperatura ambiente por 10 min e lave com PBS por 5 min por 3x.
  7. Use uma caneta imuno-histoquímica para desenhar um círculo. Lave com PBS por 3 min por 3x.
  8. Coloração no anticorpo primário (pAb de coelho anti-ALP (1:200), pAb de coelho anti-COL-1 (1:200), pAb de coelho anti-IL-17 (1:275), anti-Act1 (1:500), pAb de coelho anti-IL-6 (1:500)) durante a noite, seguido de enxágue com tampão PBS por 5 min por 3x.
  9. Adicione gota a gota o anticorpo secundário (Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG conjugado com HRP (H + L; 1: 2000)) e incube em temperatura ambiente por 60 min. Lave com tampão PBS por 3 min por 3x.
  10. Incube em DAB pronto para uso por 3-5 min e depois enxágue com PBS.
  11. Realize a recoloração de hematoxilina por 3 min, seguida de enxágue com PBS.
  12. Use solução de diferenciação por cerca de 10 s, seguida de enxágue com PBS.
  13. Adicione a solução azul de retorno por 10 s, seguida de enxágue com PBS.
  14. Realize o tratamento com etanol anidro a 75% por 5 min, etanol anidro por 5 min e limpe por 3 min. Use resina neutra para selar as lâminas.

Resultados

Ingredientes ativos e alvos de ação das pílulas Xiaoyao
Ao pesquisar o banco de dados TCMSP e a triagem de acordo com os critérios de biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e propriedades semelhantes a medicamentos (DL) ≥ 0,18, 125 ingredientes ativos foram encontrados nas pílulas Xiaoyao. Entre eles, os ingredientes 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 e 2 eram de Paeonia lactiflora branca, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, alcaçuz e gengibre, respectivamente. Alguns dos ingredientes ativos são mostrados na Tabela 1. Além disso, um total de 879 alvos de ingredientes ativos eficazes foram obtidos do banco de dados TCMSP, e 232 alvos permaneceram após a conversão de ID e exclusão de valores duplicados.

Análise de rede da MTC - Ingrediente Ativo - Alvo de Interseção - Doença
Várias bases de dados foram pesquisadas usando a palavra-chave osteoporose para genes associados à doença. No banco de dados GeneCards, 1692 genes foram obtidos após filtragem de acordo com o escore de relevância ≥1. Um total de 35 genes foram obtidos no banco de dados OMIM. Havia 3, 33 e 386 genes nos bancos de dados PharmGkb, TTD e DrugBank, respectivamente. Posteriormente, o cruzamento dos resultados dessas cinco bases de dados foi utilizado para análise posterior (Figura 1A). Um dos genes que foi representado em quatro bancos de dados foi o CALCR. Um total de 102 genes de interseção foram obtidos após a combinação dos genes relacionados à doença e a interseção com o alvo da droga (Figura 1B). Com base nas interações entre os alvos da doença e os ingredientes ativos do medicamento, uma rede de doença-alvo de interseção de ingrediente ativo da MTC foi construída com o software Cytoscape. Como resultado, foram obtidas relações entre os componentes da droga e a regulação polimórfica de varreduras de genes relacionados à doença (Figura 2A).

No banco de dados String, as interações proteicas foram analisadas na interseção de genes de doenças e alvos de drogas para obter seus diagramas de rede de interação (Figura 2B), e estes foram então rastreados para as proteínas mais centrais (Figura 2C-D). Os resultados mostraram as interações mais fortes entre FOS, ESR1, MAPK3, TP53, MAPK1 e STAT3 entre os genes da doença e alvos de drogas (Figura 2E).

Função GO e análise de enriquecimento da via KEGG
A análise de enriquecimento do GO mostrou um total de 2177 entradas, incluindo 1990 entradas de processo biológico (BP), 58 entradas de componente celular (CC) e 129 entradas de funções moleculares (MF). No PB, os genes foram focados principalmente na resposta aos níveis de nutrientes, resposta ao estresse oxidativo e resposta celular ao estresse oxidativo. O MF concentrou-se na ligação do fator de transcrição de ligação ao DNA, ligação ao fator de transcrição de ligação ao DNA específica da RNA polimerase II, atividade do receptor nuclear, atividade do fator de transcrição ativado por ligante e atividade de citocinas (Figura 3A-B).

Na análise de enriquecimento da via KEGG, um total de 168 vias de sinalização relacionadas foram obtidas, e as mais significativas foram a via de sinalização AGE-RAGE, a via de sinalização IL-17, a via de sinalização TNF, a via de sinalização HIF-1 e a diferenciação de células Th17 (Figura 3C-D). Sugere-se que as pílulas Xiaoyao podem exercer efeitos terapêuticos sobre o PMOM de várias maneiras. A inflamação está fortemente associada à osteoporose e pode ser acelerada pela menopausa, sendo a IL-17 um importante fator inflamatório7. Portanto, o próximo plano é explorar se as pílulas Xiaoyao podem tratar a osteoporose de uma perspectiva inflamatória em relação à IL-17.

Alterações estruturais no tecido ósseo antes e após a remoção do tecido ovariano
A coloração HE mostrou que nos fêmures de camundongos Sham, as trabéculas estavam bem dispostas, com boa continuidade, pequenos espaços entre as trabéculas, fraturas raras e tamanho normal da cavidade da medula óssea. Em comparação com o grupo Sham, os fêmures do grupo OVX estavam esparsamente arranjados, com fraturas graves das trabéculas, continuidade interrompida e cavidade da medula óssea acentuadamente aumentada, mostrando alterações osteoporóticas típicas (Figura 4A).

Comparação de micro-CT entre os grupos
Os fêmures dos camundongos do grupo OVX mostraram uma malha trabecular incompleta, uma cavidade medular parcialmente vazia e afinamento do córtex ósseo em comparação com os dos camundongos do grupo Sham. O grupo Sham de camundongos mostrou uma abundância de trabéculas, boa continuidade e um estreitamento da cavidade medular em seus fêmures (Figura 4B).

Efeitos comportamentais das pílulas Xiaoyao em camundongos
Durante o período do estudo, com exceção do grupo OVX, todos os camundongos dos outros grupos apresentaram melhores hábitos de vida, cor normal do cabelo, alta mobilidade e boa saúde. A urina e as fezes de cada camundongo voltaram ao normal dentro de 1 semana após o tratamento com pílulas Xiaoyao. Não houve mordidas, infecções de feridas, obstrução gastrointestinal, descolamento de sutura, necrose de pele da incisão ou morte de qualquer um dos camundongos. Os camundongos do grupo OVX eram propensos à perda de cabelo, escurecimento da cor do cabelo, mobilidade reduzida, reflexos mais longos, aumento da excreção e diminuição de comer e beber.

Coloração HE de cortes patológicos de camundongos após intervenção medicamentosa
No grupo Sham, o tecido femoral era denso, reticular e regularmente disposto. O tamanho e a continuidade da cavidade medular eram normais e o espaçamento entre as trabéculas ósseas adjacentes era relativamente pequeno. Em comparação com o grupo Sham, o córtex femoral e o osso esponjoso no grupo OVX mostraram defeitos óbvios, diminuição das trabéculas, aumento das lacunas, continuidade interrompida, afinamento da estrutura, alargamento da cavidade medular e afinamento do córtex ósseo. Em comparação com o grupo OVX, as trabéculas femorais dos camundongos nos grupos tratados com drogas (doses baixas e altas) pareciam estruturalmente intactas, com espaçamento reduzido, maior conectividade, cavidades estreitas da medula óssea e estruturas mais densas (Figura 5A).

Detecção de índices de imagem em camundongos após intervenção medicamentosa
Quando comparados com o grupo Sham, os fêmures dos camundongos do grupo OVX tinham trabéculas ósseas esparsas e quebradas e córtex ósseo afinado. Em comparação com o grupo OVX, os camundongos do grupo de pílulas Xiaoyao de alta dose apresentaram menos trabéculas ósseas fraturadas, reticulação restaurada e um grau significativo de redução parcial da cavidade da medula óssea. No entanto, os camundongos tratados com pílulas Xiaoyao de baixa dose ainda tinham trabéculas ósseas fraturadas, embora houvesse aumento das trabéculas ósseas e redução da cavidade da medula óssea. A estrutura trabecular das trabéculas ósseas do grupo sham-operado apresentou maior continuidade e completude (Figura 5B).

Resultados imuno-histoquímicos dos tecidos dos grupos após intervenção medicamentosa
Act1 e IL-6 são proteínas-chave na via de sinalização da IL-17, e ALP e COL-1 são genes osteogênicos. A expressão das proteínas ALP, COL-1, IL-6, IL-17 e Act1 leva à formação de grânulos castanhos ou amarelos no tecido ósseo. Os resultados da imuno-histoquímica mostraram que os valores médios de densidade óptica de ALP e COL-1 no grupo da droga foram maiores do que os do grupo OVX após o tratamento com pílulas Xiaoyao, e a diferença foi estatisticamente significativa (p < 0,05). Os valores médios de densidade óptica de IL-17, Act1 e IL-6 no grupo droga foram menores do que os do grupo OVX, e a diferença foi estatisticamente significativa (p < 0,05; Figura 6). As pílulas Xiaoyao reverteram o declínio da ALP e COL-1 causado pela ovariectomia, diminuindo a expressão de várias proteínas-chave IL-17, IL-6 e Act1 na via de sinalização da IL-17, o que sugere que a droga pode exercer seus efeitos terapêuticos por meio dessa via.

figure-results-1
Figura 1: Análise de rede da interseção de ingredientes ativos da fitoterapia chinesa e genes relacionados a doenças. (A) A interseção de genes relacionados a doenças, obtidos dos bancos de dados GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD e DrugBank. Estes são representados pelas cores azul, vermelho, verde, amarelo e marrom com 1692, 35, 3, 33 e 386 genes, respectivamente. A interseção são os genes associados à doença nos cinco bancos de dados, e a parte sobreposta indica o número de genes que se cruzam em cada banco de dados. (B) Os alvos de drogas (com a cor azul indicando este conjunto de dados, ou seja, o conjunto de genes-alvo de ação de drogas coletados no banco de dados TCMSP após a transformação de ID e remoção de duplicatas) e genes relacionados a doenças (com a cor vermelha indicando este conjunto de dados, que contém todos os genes dos cinco bancos de dados mencionados acima) interseção são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Interação de ingredientes ativos da MTC com redes reguladoras de genes relacionados a doenças e proteínas centrais. (A) A rede regulatória de ingredientes ativos e genes relacionados a doenças na MTC mostra as relações regulatórias genéticas correspondentes a cada ingrediente ativo nas pílulas Xiaoyao, com cada ingrediente ligado ao gene que regula. (B) Os resultados da análise da interação proteína-proteína de genes que se cruzam em STRING (os nós da rede representam proteínas, Edges representam associações proteína-proteína e ligações múltiplas indicam múltiplas interações entre duas proteínas). (CE) As interações proteicas obtidas por String foram rastreadas várias vezes. (C) A rede de interação proteica foi obtida após a primeira triagem, e a parte destacada é sua porção central. (D) O resultado da segunda triagem e a parte destacada é a parte central. (E) A rede de interação proteica mais central na rede de interação proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Análise de enriquecimento de GO e KEGG. (AB) Os resultados da análise de enriquecimento GO de genes que se cruzam são divididos em 3 entradas, Processo Biológico (BP), Componente Celular (CC) e Função Molecular (MF), e cada entrada mostra apenas os 10 principais genes mais significativamente enriquecidos. (CD) Os resultados da análise de enriquecimento KEGG dos genes que se cruzam (mostrando os 30 principais enriquecidos de forma mais significativa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Estabelecimento e avaliação do modelo de camundongos ovariectomizados. (A) Comparação da morfologia óssea metafisária entre os grupos operado simulado e ovariectomizado (10x). No grupo OVX, as fraturas trabeculares foram graves, a continuidade foi interrompida e a cavidade da medula óssea foi significativamente aumentada, enquanto no grupo simulado, as fraturas trabeculares foram raras e a cavidade da medula óssea era normal em tamanho. (B) Micro-TC do fêmur nos grupos operados de forma simulada e ovariectomizados. No grupo OVX, a malha trabecular estava incompleta e a cavidade da medula óssea estava parcialmente vazia. No grupo Sham, as trabéculas eram abundantes e contínuas, e a cavidade da medula óssea era estreita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: HE e micro-CT após tratamento com as pílulas Xiaoyao. (A) Coloração HE (10x) de seções de fêmur de camundongos em cada grupo após o tratamento com pílulas Xiaoyao. No grupo OVX, as trabéculas ósseas foram reduzidas, a continuidade foi interrompida, a estrutura era esparsa e a cavidade medular estava aumentada. No grupo Sham, as trabéculas ósseas tinham boa continuidade, o tecido femoral era estruturalmente denso e a cavidade medular era normal. Em comparação com o grupo OVX, as trabéculas ósseas no grupo da droga pareciam estruturalmente intactas, com maior conectividade, uma cavidade medular reduzida e uma estrutura mais densa do que no grupo modelo. (B) Comparação de micro-CT de fêmures de camundongos em cada grupo após o tratamento com pílulas Xiaoyao. As trabéculas ósseas nos fêmures dos camundongos do grupo ovariectomizado eram esparsas e quebradas, enquanto o grupo Sham apresentava trabéculas mais contínuas e intactas. Em comparação com o grupo ovariectomizado, os camundongos do grupo tratado com drogas em altas doses tiveram menos trabéculas ósseas quebradas, estrutura reticular restaurada e cavidade da medula óssea parcialmente reduzida, enquanto os animais no grupo da droga de baixa dose tiveram mais trabéculas ósseas e cavidade da medula óssea reduzida, mas as trabéculas ósseas quebradas permaneceram. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Imuno-histoquímica para detectar o efeito das pílulas Xiaoyao na via de sinalização IL-17 e na expressão da proteína do gene marcador osteogênico em camundongos osteoporóticos (40x). Reações positivas para a presença de ALP, COL-1, IL-6, bem como proteínas IL-17 e Act1 foram manifestadas pelo aparecimento de grânulos castanhos ou amarelos no tecido ósseo. A expressão de ALP e COL-1 no grupo droga foi maior do que no grupo OVX (p < 0,05). A expressão de IL-17, Act1 e IL-6 no grupo droga foi menor do que no grupo OVX (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome da medicina tradicional chinesaIdentificação molecularNome da molécula
Paeonia lactiflora brancaMOL001918Paeoniflorgenone
Paeonia lactiflora brancaMOL000211Mairin
Atractylodes macrocephalaMOL00002214-acetil-12-senecioílo-2E,8Z,10E-atractilentriol
Atractylodes macrocephalaMOL0000493β-acetoxiatractilona
Menthae HerbaMOL000471aloe-emodin
Menthae HerbaMOL005190eriodictiol
Chai HuMOL000354isorhamnetina
Chai HuMOL013187Cubebin
Angélica sinensisMOL000449Estigmasterol
Angélica sinensisMOL000358beta-sitosterol
Poria cocosMOL000282ergosta-7,22E-dien-3beta-ol
Poria cocosMOL000283Peróxido de ergosterol
AlcaçuzMOL002311Glicirol
AlcaçuzMOL0049907,2',4'-tri-hidroxi-5-metoxi-3-arilcumarina
Gengibre frescoMOL0061296-metilgencediacetato2
Gengibre frescoMOL001771poriferaste-5-eno-3beta-ol

Tabela 1: Ingredientes ativos em medicamentos chineses selecionados. A primeira coluna lista os nomes dos medicamentos tradicionais chineses, a segunda coluna é o ID do ingrediente ativo da medicina chinesa e a terceira coluna é o nome do ingrediente ativo da medicina chinesa.

Arquivo de codificação suplementar 1: nome da erva, ingrediente e código de mesclagem do ID do alvo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: Conversão de ID de alvo de medicamento. Clique aqui para baixar este arquivo.

Ficheiro de Codificação Suplementar 3: Ficheiros para análise de rede. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 4: Conversão de símbolo para ID de gene. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de Codificação Suplementar 5: Análise de enriquecimento GO. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 6: Análise de enriquecimento KEGG. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Segundo as estatísticas, a osteoporose causa 1,5 milhão de fraturas a cada ano nos Estados Unidos, e a grande maioria delas ocorre em mulheres na pós-menopausa27. Com o aumento do envelhecimento da população, prevê-se que a maioria das futuras fraturas de quadril do mundo ocorrerá na Ásia e que, até 2050, o número total delas em todo o mundo chegará a 8,2 milhões28. O custo de prevenir fraturas é quase igual ao de tratá-las, e o uso de medicamentos inevitavelmente terá alguns efeitos colaterais29. Portanto, há uma necessidade urgente de uma maneira mais econômica de resolver esse problema em uma sociedade responsável.

As pílulas Xiaoyao consistem em oito ingredientes. Estudos sobre os efeitos de seus ingredientes na osteoporose estão em andamento. Poria cocos inibe a osteoclastogênese e a atividade osteolítica em um modelo de camundongo induzido por osteoporose ovariectomizada30. A combinação de dois componentes, alcaçuz e Shu-di-huang, pode exercer um efeito antioxidante ao inibir a via de sinalização NF-κB31. O tônico fitoterápico tradicional chinês, Danggui buxue tang, pode ser útil no tratamento da osteoporose por sua capacidade de inibir a remodelação óssea e modular a regulação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HPG) e, assim, prevenir a perda óssea em ratas ovariectomizadas32. Todos esses resultados sugerem que as pílulas Xiaoyao podem ter um efeito terapêutico na osteoporose. Os resultados deste estudo também sugerem que as pílulas Xiaoyao podem exercer um efeito anti-osteoporose, modulando a atividade da via de sinalização da IL-17 de maneira anti-inflamatória.

Um total de 168 vias de sinalização relevantes foram obtidas da rede regulatória de alvos de drogas e genes relacionados à osteoporose construídos neste estudo, e este estudo explorou ainda mais a via de sinalização da IL-17. A família IL-17 é composta por seis membros, incluindo IL-17A-F, dos quais IL-17A foi o primeiro e mais importante a ser descoberto33. Nos primeiros estudos, acreditava-se que a IL-17 estava associada a doenças inflamatórias e autoimunes em humanos. Mais tarde, estudos sugeriram que ele tinha um papel na manutenção da integridade da barreira, e também foi encontrado associado ao câncer15. No entanto, embora não desempenhe um papel fisiológico na remodelação óssea, ele se comporta de maneira diferente durante condições ósseas anormais. Além disso, a IL-17 pode atuar como um ativador fraco e sinergiza com outras citocinas para elevar a produção de energia. Isso é demonstrado por sua co-ativação com TNFα15,34.

Experimentosin vitro demonstraram que a IL-17 pode induzir a proliferação e diferenciação de MSCs osteoblásticas35, e também pode inibir a diferenciação induzida por BMP-2 de osteoblastos primários de ratos36. A IL-17 pode estimular os osteoblastos a expressarem RANKL, o que, por sua vez, promove a osteoclastogênese, mas esse efeito parece ser dependente da presença de osteoblastos37,38. Neste estudo, as diferentes concentrações das pílulas Xiaoyao produziram efeitos terapêuticos em camundongos modelo PMOM, especialmente quando usados em concentrações mais altas. IL-17, Act1 e IL-6, que estão correlacionadas com a via de sinalização da IL-17, foram significativamente diminuídas nesses camundongos quando comparados aos controles. Quando os resultados da análise de enriquecimento foram avaliados, estes sugeriram o envolvimento da via IL-17 quando os animais foram tratados com pílulas Xiaoyao.

Este estudo também testou alguns dos marcadores de conversão óssea. A ALP é uma enzima ligada à membrana tetramérica que pode ser secretada por osteoblastos e desempenha um papel importante na formação e mineralização óssea, degradando o inibidor de mineralização, pirofosfato39. Cerca de 90% da fração orgânica na matriz extracelular dos tecidos ósseos é composta por COL-1 e, durante a mineralização óssea, o colágeno desempenha um papel fundamental nesse processo40. No resultado deste estudo, os níveis de expressão das proteínas ALP e COL-1, observados por imuno-histoquímica de camundongos no grupo da droga, foram maiores do que os do grupo modelo, sugerindo que o efeito das pílulas Xiaoyao na melhora da osteoporose poderia ser alcançado aumentando os indicadores dos genes osteogênicos. Alguns estudiosos demonstraram que a expressão e a atividade transcricional do receptor de estrogênio hepatócito (ERα) podem ser reguladas positivamente por Xiaoyao san41. Os extratos de Angelica sinensis, White Paeonia lactiflora e alcaçuz no Xiaoyao san demonstraram ter atividade semelhante ao estrogênio. Os mesmos ingredientes também estão presentes nas pílulas Xiaoyao usadas neste estudo, que são feitas a partir da prescrição de Xiaoyao san por métodos modernos de preparação. Portanto, pode-se supor que as pílulas Xiaoyao também podem aumentar a expressão de genes osteogênicos, como ALP e COL-1 , exercendo efeitos semelhantes ao estrogênio nos osteoblastos para aumentar sua atividade e melhorar a qualidade óssea.

Este estudo estabeleceu com sucesso um modelo de PMOM em camundongos, removendo ambos os ovários por ovariectomia dorsal. O modelo animal é a base para todos os experimentos subsequentes neste estudo. Ao remover cirurgicamente os ovários dos camundongos, era importante garantir que os ovários dos camundongos nos grupos OVX e droga fossem completamente removidos, enquanto no grupo simulado, apenas a gordura perto dos ovários era removida, e também era importante evitar infecções de feridas.

O número de trabéculas ósseas e a densidade de conexão de camundongos melhoraram após o tratamento de ovariectomizados com pílulas Xiaoyao, o que sugeriu que essa droga teve um efeito terapêutico na osteoporose. Imuno-histoquímica e imunocitoquímica foram utilizadas para avaliar a eficácia do tratamento neste estudo; O tempo de ação de vários reagentes não é absoluto, especialmente no processo de desenvolvimento da cor, que requer observação em tempo real e reação oportuna para garantir os melhores resultados. Durante a incubação de anticorpos, o gradiente de concentração de anticorpos é definido primeiro e, após observação e comparação, escolha a concentração mais adequada para os experimentos subsequentes.

No entanto, houve algumas limitações neste estudo. Os dados de farmacologia da web tinham apenas uma única fonte de dados, e a análise em relação à composição do medicamento era de apenas um banco de dados. Além disso, a eficácia das pílulas Xiaoyao não foi comparada com drogas positivas neste estudo, e não foi possível avaliar as diferenças específicas entre as pílulas Xiaoyao e as modalidades de tratamento atuais.

Para o OMPM, a opção de tratamento de primeira linha disponível são os bifosfonatos. No entanto, o uso desses medicamentos pode levar a contraindicações gastrointestinais e fraturas atípicas de fêmur ainda mais graves e osteonecrose dos maxilares42,43. As opções de tratamento de segunda linha incluem o uso de denosumabe e terapia hormonal. Demonstrou-se que o denosumabe reduz as fraturas do quadril, vertebrais e não vertebrais. No entanto, o rebote pode ocorrer após a suspensão da droga, e quanto maior o tempo de descontinuação, maior a perda de densidade óssea 42,44,45. A terapia hormonal na menopausa reduz o risco de fraturas osteoporóticas da coluna vertebral, mas seus efeitos são limitados à idade e seus riscos a longo prazo parecem superar os benefícios46. A terapia sequencial é uma opção de tratamento de longo prazo para a OMPM, na qual o uso de medicamentos formadores ósseos seguidos de medicamentos antirreabsortivos pode alcançar o maior aumento da massa óssea. Medicamentos específicos são geralmente determinados paciente a paciente42.

A este respeito, pode-se supor que as ervas tradicionais chinesas podem ter um potencial vantajoso no tratamento da osteoporose. O modo de ação da fitoterapia é multi-via e multi-alvo, em vez de agir por meio de um único mecanismo47. Alguns estudiosos avaliaram a eficácia e a segurança de alguns fitoterápicos chineses e mostraram que o número de fraturas ao usar uma combinação de medicamentos chineses e ocidentais em comparação com a administração apenas de medicamentos chineses foi menor do que no grupo de medicamentos ocidentais isolados48. Em comparação com as drogas químicas, os remédios fitoterápicos chineses têm menos efeitos colaterais, são relativamente baratos e adequados para uso a longo prazo. Os remédios fitoterápicos chineses não apenas reparam a microestrutura óssea e aumentam o volume ósseo, mas também podem reduzir ou eliminar os sintomas de fraqueza da coluna lombar e dor nas costas49. O estudo atual pode ajudar a fornecer uma possível abordagem para descobrir novos medicamentos e tratamentos.

A aplicação de pílulas Xiaoyao para tratar PMOM parece ser promissora. No presente estudo, as pílulas podem melhorar a massa óssea e a qualidade óssea em um modelo de camundongo de PMOM, suprimindo a inflamação. Alguns estudiosos até sugeriram que uma combinação de medicina chinesa e acupuntura pode ser eficaz no tratamento do PMOM50. Ao mesmo tempo, uma combinação de medicina chinesa e ocidental provou ser eficaz51. Ambos os possíveis remédios são válidos, embora qualquer tratamento recomendado usando as pílulas Xiaoyao em conjunto com a acupuntura e a medicina ocidental deva ser validado por ensaios clínicos. O significado clínico da osteoporose está nas fraturas ósseas, e pesquisas futuras também devem se concentrar na prevenção delas.

Em resumo, este estudo demonstrou por meio de farmacologia de rede e experimentos com animais que os camundongos PMOM mostraram melhora significativa no metabolismo ósseo e aumento da massa óssea após o tratamento com pílulas Xiaoyao. O mecanismo de ação para esse fenômeno pode estar relacionado à inibição da via de sinalização da IL-17 e ao aumento dos fatores osteogênicos, ALP e atividade de COL-1. Este estudo estabelece uma base teórica e experimental para a aplicação clínica de pílulas Xiaoyao no tratamento de doenças associadas à osteoporose.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

O Programa de Pesquisa Científica e Desenvolvimento Tecnológico da Cidade de Baise (20224128) apoiou este trabalho. Os autores agradecem ao Dr. Dev Sooranna, do Imperial College London e YMUN, pela edição do manuscrito. YYX e ZYW contribuíram igualmente para este estudo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1ml AmostradorGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001para a anestesia no
poliformaldeído do Pequim dos ratos 4%polyformaldeídoCiência & Tecnologia Co., Ltd.P1110Para fixação de tecido
6-0 sutura absorvível (agulha angular)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06Para sutura pós-operatória
Bola de algodão absorventeVencedorMIANQIU-500gPara esterilização e hemostasia
Lâminas adesivasJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105Para seccionamento de tecidos
AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLPara anestesia em camundongos
Solução azuladaBeijing Solarbio Science & Tecnologia Co., Ltd.G1866Coloração azul dos núcleos das células após a ação da solução de diferenciação de hematoxilina
C57BL / 6 camundongosBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)Para uso em experimentos com animais
Lâminas cirúrgicas de aço carbonoPremier Medical Equipment Co.SP239Para cirurgia de camundongo
CIKS/TRAF3IP2 Coelho pAbBIOSS ANTICORPOSbs-6202RLiga-se a Act1 em tecidos
Solução de hematoxilina de Cole (para coloração convencional)Beijing Solarbio Science & Tecnologia Co., Ltd.G1140Para colorir seções de parafina
Colágeno Tipo I Anticorpo policlonalproteintech14695-1-APLiga-se a COL-1 em tecidos
Kit de substrato DAB, 20xBeijing Solarbio Science & Tecnologia Co., Ltd.DA1010Para o desenvolvimento da cor do tecido
Folha cirúrgica descartável 50 * 60 CMNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777Para cirurgia de camundongo
Solução de descalcificação EDTA (pH 7,2)Beijing Solarbio Science & Tecnologia Co., Ltd.E1171-500mlPara descalcificação de tecidos
Tampão de bloqueio de peroxidase endógena aprimoradaBeyotime BiotechnologyP0100BSequestro de peroxidases endógenas teciduais ou celulares
Líquido transparente de desparafinação ecologicamente corretoServicebioG1128-1LPara desparafinação de seções de parafina
Álcool etílicoCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)Para desidratação de seções de parafina
Diluente de anticorpos de uso geralEpizyme BiotechPS119LPara diluição de anticorpos
Solução de diferenciação de hematoxilinaServicebioG1039-500MLPara diferenciação após coloração de hematoxilina e remoção de corante excessivamente ligado e não especificamente adsorvido dos tecidos
Kit de coloração de hematoxilina Eosina (HE)Beijing Solarbio Science & Tecnologia Co., Ltd.G1120-3 * 100mlPara coloração de tecido
Cabo de faca cirúrgica de aço inoxidável de alta qualidadePremier Medical Equipment Co.SP0088Para cirurgia de camundongos
Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)proteintechSA00001-2Liga-se ao anticorpo primário e amplifica o sinal
IL-17A Anticorpo policlonalproteintech13082-1-APLiga-se à IL-17 nos tecidos
IL-6 Anticorpo policlonalproteintech21865-1-APLiga-se à IL-6 nos tecidos
Caneta de imuno-histoquímicaPequim Zhongshan Jinqiao Biotecnologia Co.ZLI-9305 (YA0310)Para círculos de desenho em imunohistoquímica
Sutura cirúrgica médica Não absorvente (bola) 5-0 3,5 mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2para sutura pós-operatória
Agulhas de sutura médica Agulhas de ângulo 4 * 10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4para sutura pós-operatória
Bálsamo neutroPequim Solarbio Science & Tecnologia Co., Ltd.G8590Como um selador de fatias
PBS (1X)Shenzhen Mohong Technology Co., LtdB0015Tampão para lavagem de lâminas e diluição parcial da solução
Tampão de bloqueio rápido livre de proteínas (1X)Epizyme BiotechPS108PEvitando a ligação não específica de proteínas
Anticorpo anti-osso anti-osso fosfataseBIOSS ANTICORPOS BIOSSBS-6292RLiga-se à fosfatase alcalina nos tecidos
Universidade médica afiliada salina de Youjiang do hospital para as nacionalidadesLHN500para animais pelo barbear da gavagem
/tosquiadeiras elétricasPRODUTOS CO. DO ANIMAL DE ESTIMAÇÃO DE HANGZHOU HUAYUAN, LTD.DTJ-002Para ratos de barbear
Agulha médica de aço inoxidável 14cm AgulhaPremier Medical Equipment Co.SP784Para cirurgia de camundongo
Pinça Oftálmica de Aço Inoxidável 10,5 cm Curvo (Sem Gancho)ZhuoyouyueYKNWW-10.5Para cirurgia de camundongo
Tesoura Oftálmica de Aço Inoxidável / Tesoura Cirúrgica 10 CM Ponta RetaPremier Medical Equipment Co.ZYJD-10-ZJPara cirurgia de camundongo
Agulha gástrica de ponta de aço inoxidável 12 calibre 55 mm cotoveloGWJ-12-55WPara uso em camundongos por gavagem
Fluido de reparo de antígeno Tris-EDTA (50x)proteintechPR30002Para reparo de antígeno de seções de parafina Placa de
dissecação de madeira 25 * 16 cmJP16 * 24Para cirurgia de camundongo
Xiaoyao pílulasJiuzhitang Co., Ltd.YPG-041Para entrega de medicamentos para animais
Outros
R 4.3.1Processamento de dados
Cytoscape3.9.1Recurso Nacional para Biologia de RedeConstruindo uma rede regulatória para a medicina tradicional chinesa
ImageJ 1.54fInstitutos Nacionais de SaúdeProcessamento de imagens para resultados de imuno-histoquímica
Adobe Photoshop 24.0.0AdobePara combinação de imagens
GraphpadPrism 9.5SoftwareAnálise estatística de células de dados
DimensãoOLYMPUSPara fatiar e fotografar
OLYMPUS BX53OLYMPUSPara coloração HE e fotografia de corte imuno-histoquímico
conjugado com HRP grossa GraphPad

Referências

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