Este protocolo demonstra a ablação de células a laser de neurônios individuais em larvas intactas de Drosophila . O método permite o estudo do efeito da redução da competição entre neurônios no sistema nervoso em desenvolvimento.
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Artigo de método
Ablação de células a laser em larvas intactas de Drosophila revela competição sináptica
Neste artigo
Resumo
Resumo
O protocolo descreve a ablação de um único neurônio com um sistema de laser de 2 fótons no sistema nervoso central (SNC) de larvas intactas de Drosophila melanogaster . Usando este método não invasivo, o sistema nervoso em desenvolvimento pode ser manipulado de maneira específica da célula. Interromper o desenvolvimento de neurônios individuais em uma rede pode ser usado para estudar como o sistema nervoso pode compensar a perda de entrada sináptica. Os neurônios individuais foram especificamente ablacionados no sistema de fibras gigantes de Drosophila, com foco em dois neurônios: a fibra gigante pré-sináptica (GF) e o neurônio motor tergotrochanteral pós-sináptico (TTMn). O GF faz sinapses com o TTMn ipsilateral, que é crucial para a resposta de escape. A ablação de um dos GFs no cérebro de3º ínstar, logo após o GF iniciar o crescimento axonal, remove permanentemente a célula durante o desenvolvimento do SNC. O GF restante reage ao vizinho ausente e forma um terminal sináptico ectópico para o TTMn contralateral. Este terminal atípico e bilateralmente simétrico inerva ambos os TTMns, como demonstrado pelo acoplamento de corante, e aciona ambos os neurônios motores, conforme demonstrado por ensaios eletrofisiológicos. Em resumo, a ablação de um único interneurônio demonstra competição sináptica entre um par bilateral de neurônios que pode compensar a perda de um neurônio e restaurar as respostas normais ao circuito de escape.
Introdução
A ablação a laser é uma ferramenta preferida para dissecar circuitos neurais em uma ampla variedade de organismos. Desenvolvido em sistemas genéticos modelo, como vermes e moscas, tem sido aplicado em todo o reino animal para estudar a estrutura, função e desenvolvimento do sistema nervoso 1,2,3. Aqui, a ablação de neurônio único foi empregada para investigar como os neurônios interagem durante a montagem do circuito em Drosophila. O sistema de escape da mosca é um circuito favorito para análise porque contém os maiores neurônios e as maiores sinapses da mosca adulta, e o circuito foi bem caracterizado nas últimas décadas4. O papel que as interações neurônio-neurônio desempenham na montagem do circuito de Fibra Gigante é um ponto focal desta pesquisa.
Um tipo de interação que tem sido um ponto focal na neurociência desde o trabalho de Hubel e Wiesel na década de 1960 é a "competição sináptica"5,6. Neste protocolo, a ablação a laser foi usada para revisitar o papel da competição por meio da ablação de célula única no sistema de fibras gigantes (GFS) de Drosophila, onde os fundamentos moleculares dos fenômenos podem ser descobertos.
A ablação de neurônios na mosca em desenvolvimento tem sido difícil por vários motivos, incluindo a visualização dos neurônios-alvo, a precisão do método de ablação e a sobrevivência da amostra. Para superar esses problemas no GFS, o sistema UAS / Gal47 foi usado para rotular neurônios de interesse, e um microscópio de dois fótons foi usado para remover a fibra gigante pré-sináptica ou o neurônio motor de salto pós-sináptico (TTMn).
Neste estudo, para determinar o papel que os neurônios bilaterais vizinhos desempenham no ajuste da conectividade sináptica e da força sináptica no GFS, um dos pares bilaterais de neurônios (GF pré-sináptico ou neurônio motor pós-sináptico) foi excluído pouco antes do desenvolvimento da pupa. Nesse estágio de desenvolvimento, a axonogênese da FG não foi concluída8. A estrutura do GF e a função do circuito sináptico no adulto foram então examinadas, com atenção especial dada à saída do GF restante.
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Protocolo
Todos os animais utilizados para o protocolo foram da espécie Drosophila melanogaster. Não há questões éticas em torno do uso desta espécie. A autorização ética não foi necessária para realizar este trabalho. Os detalhes das espécies, reagentes e equipamentos de Drosophila usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Criação de Drosophila e seleção do estágio larval correto
- Escolha uma linha de driver Gal4 que conduza a expressão nas células que devem ser ablacionadas e recombine-a ou cruze-a com uma linha de repórter UAS-GFP. Criar moscas com alimentos normais para moscas a 25 °C.
NOTA: Para ablação de fibra gigante (GF), R91H05-Gal4 ou A307-Gal4 foi recombinado com UAS-GFP. ShakB (letal) -GAL4 recombinado com UAS-GFP foi usado para ablações de TTMn (ver Tabela de Materiais). - Selecione as larvas que começaram a emergir da comida e rastejam pela lateral do frasco de comida. Essas larvas estão no estágio errante, que é o estágio preferido para realizar a ablação de células GF.
NOTA: A ablação pode ser realizada em qualquer estágio larval. O último estágio larval foi importante para a manipulação do desenvolvimento do GFS porque os corpos celulares GF podem ser facilmente identificados no cérebro, mas os axônios GF não fizeram conexões com seus alvos neste estágio.
2. Preparando alarva de3º ínstar
NOTA: As larvas foram anestesiadas por método semelhante ao de et al.9. Para manter os tempos de procedimento curtos, prepare apenas uma larva de cada vez. A exposição curta ao anestésico aumentará a sobrevida dos animais experimentais10.
- Prepare um prato de vidro com uma tampa bem ajustada. Coloque uma bola de algodão no prato e, sob uma coifa, adicione cerca de 3-5 ml de éter etílico (líquido perigoso e inflamável, jaleco, luvas, óculos de proteção). Cubra o prato com a tampa.
- Colete larvas individuais de3º ínstar de frascos de mosca. No3º estágio larval, as larvas deixam o meio alimentar e rastejam ao longo da lateral do frasco de alimento11.
- Certifique-se de que as larvas ainda estejam se movendo e não tenham iniciado a formação de pupário. As larvas estacionárias e com encurtamento do corpo estão iniciando a pupação e são inadequadas para ablação. Pegue as larvas com um pincel pequeno.
NOTA: O3º estágio larval começa após a segunda muda às 72 h de desenvolvimento (após a postura dos ovos) e dura até a formação do pupário às 120 h para moscas criadas a 25 °C.
- Certifique-se de que as larvas ainda estejam se movendo e não tenham iniciado a formação de pupário. As larvas estacionárias e com encurtamento do corpo estão iniciando a pupação e são inadequadas para ablação. Pegue as larvas com um pincel pequeno.
- Transfira uma larva para um recipiente pequeno e aberto. Coloque o recipiente no prato de vidro com éter etílico e feche bem o prato. Ao abrir o prato de vidro, coloque-o sob um snorkel ou em um exaustor para evitar que a fumaça escape.
- Em intervalos de 30 s, remova a tampa com a larva do prato e verifique a mobilidade da larva sob um microscópio de dissecação. A larva geralmente será imobilizada em 1 minuto. Assim que os ganchos da boca pararem de se contorcer, a larva estará pronta para a montagem. Descarte todas as larvas que não estiverem totalmente imobilizadas após 3 min.
NOTA: A parte superior de uma tampa de cabeça para baixo de um tubo de microcentrífuga (tampa removida do tubo) pode ser usada como recipiente.
- Em intervalos de 30 s, remova a tampa com a larva do prato e verifique a mobilidade da larva sob um microscópio de dissecação. A larva geralmente será imobilizada em 1 minuto. Assim que os ganchos da boca pararem de se contorcer, a larva estará pronta para a montagem. Descarte todas as larvas que não estiverem totalmente imobilizadas após 3 min.
3. Montagem de larvas em lâminas para ablação
- Coloque a larva anestesiada em uma lâmina de microscópio de vidro. Mergulhe a larva em uma gota de solução salina para insetos; Isso removerá alguns dos restos de comida que podem grudar na larva.
- Sob o microscópio de dissecação, remova a maior parte da solução salina com um lenço de papel. Posicione o lado dorsal da larva para cima para ablação de GF ou o lado ventral para cima para ablação de TTMn. Abaixe lentamente uma lamínula de vidro sobre a larva. Adicione soro fisiológico na lateral da lamínula para preencher o espaço entre a lâmina de vidro e a lamínula.
- Para ablação de GF, verifique o posicionamento do cérebro sob alta ampliação no microscópio de dissecação. Certifique-se de que o cérebro esteja nivelado e visível através da cutícula. Freqüentemente, o cérebro será coberto com tecido adiposo, impossibilitando a visualização e a ablação celular.
- Para deslocar qualquer tecido adiposo que cubra o cérebro, aplique uma leve pressão na lamínula com uma pinça e mova a lamínula de um lado para o outro. Se o tecido adiposo não puder ser afastado do cérebro dessa maneira, use uma larva diferente.
4. Localizando as células-alvo
NOTA: O sistema multifóton usado para este estudo foi montado em um microscópio vertical. O software específico do sistema foi usado para controlar as configurações de aquisição e estimulação a laser. O sistema foi equipado com uma fonte de luz de epifluorescência para localizar as amostras. A lente objetiva era uma lente de imersão em água com ampliação de 25x, uma longa distância de trabalho de 2 mm e um NA de 1,10.
- Coloque a amostra no estágio do microscópio multifóton e use o filtro GFP para localizar a amostra no modo de epifluorescência. Para a ablação de GF, os corpos celulares podem ser identificados no cérebro, como visto na Figura 1A, C, D. Para a ablação de TTMn, um aglomerado de quatro células pode ser identificado do lado ventral no cordão nervoso ventral (VNC), conforme mostrado na Figura 1A,B. Quando terminar de focar, centralize as células no campo de view e mude para o modo de 2 fótons.
5. Configurando os parâmetros de ablação
- Ajuste as configurações do laser e o ganho do detector para visualizar as células que expressam GFP com o scanner Galvano. Um comprimento de onda de 870 nm funciona melhor para visualizar o sinal GFP. Centralize a célula no campo de visão.
- Use uma região circular de interesse (ROI) para definir a área para ablação. Certifique-se de que a ROI cubra a maior parte da superfície da célula (Figura 1E, G).
- Configure o protocolo de ablação no software. Defina um quadro de aquisição, depois estimulação, seguido por outro quadro de aquisição.
- Inicie a configuração de potência do laser de estimulação em um valor mais baixo (10%-20%) e execute o protocolo de estimulação. Uma ablação bem-sucedida pode ser reconhecida por um círculo claro no centro do soma celular no local da ROI e um aumento na fluorescência ao redor da ROI (Figura 1F).
- Se a ablação não foi bem-sucedida e apenas branqueou a célula (Figura 1H), aumente a potência do laser em incrementos de 5% ou o número de loops, um de cada vez, e execute o protocolo novamente. A potência do laser aplicada foi entre 10% e 40% para o sistema utilizado no protocolo.
NOTA: As configurações de potência do laser para ablação dependem muito da profundidade das células localizadas no tecido e de outros fatores, como dobra da cutícula. Se as células forem brilhantes e claramente visíveis, a potência do laser estará na extremidade inferior da faixa. A potência do laser será diferente para cada sistema, dependendo do modelo do laser e da idade do laser.
- Se a ablação não foi bem-sucedida e apenas branqueou a célula (Figura 1H), aumente a potência do laser em incrementos de 5% ou o número de loops, um de cada vez, e execute o protocolo novamente. A potência do laser aplicada foi entre 10% e 40% para o sistema utilizado no protocolo.
Figura 1: Identificação de neurônios para ablação a laser em larvas intactas de Drosophila L3 . (A) Esquema da localização do soma de fibra gigante (GF) no cérebro e aglomerado de neurônios motores contendo o neurônio motor tergotrochanteral (TTMn) no cordão nervoso ventral (VNC). (B) Projeção de intensidade máxima de shakB (letal) -Gal4 dirigindo a expressão de GFP no VNC larval. A linha média é indicada pela linha pontilhada. O círculo indica o aglomerado de neurônios contendo o TTMn que são direcionados para ablação a laser. Barra de escala: 50 μm. (C) Vista de projeção parcial do cérebro larval expressando GFP sob o controle de A307-Gal4. O círculo indica o soma GF direcionado para ablação a laser. Barra de escala: 50 μm. (D) Projeção de intensidade máxima do cérebro com R91H05-Gal4 acionando UAS-GFP. Ambos os GFs (círculos) são identificáveis por localização, forma e tamanho. Barra de escala: 50 μm. (E) GF soma visão ampliada antes da ablação a laser. O círculo magenta indica a região alvo para ablação a laser. Barra de escala: 10 μm. (F) GF soma visão ampliada após a entrega da potência do laser localizada e ablação bem-sucedida. Barra de escala: 10 μm. (G) GF soma visão ampliada antes da ablação a laser. O círculo magenta indica a região alvo para ablação a laser. Barra de escala: 10 μm. (H) GF soma visão ampliada após a entrega de potência de laser localizada e ablação malsucedida (clareamento). Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
6. Recuperando as larvas
- Depois de ablar com sucesso a célula, remova a lamínula e pegue suavemente as larvas da lâmina com um pincel. Coloque as larvas em um frasco de comida. As larvas começarão a rastejar novamente em 30 minutos.
NOTA: Manter o tempo do procedimento curto melhora as taxas de sobrevivência dos animais. Com experiência, o experimento pode ser realizado em pouco menos de 10 min. - Continue criando larvas em condições padrão até que elas se feche do invólucro da pupa.
7. Testando a funcionalidade do GFS em moscas adultas
NOTA: Os passos a seguir são explicados em detalhes em Allan e Godenschwege12, e Augustin et al.13.
- Teste moscas adultas com 2-5 dias de idade após a eclosão. Anestesiar moscas com CO2 e montá-los na cera dental, empurrando as pernas para dentro da cera. Abra as asas em um ângulo de 90° e fixe-as no lugar com a cera. Prenda a cabeça empurrando a tromba na cera.
- Coloque fios de estimulação em ambos os olhos, um fio terra no abdômen e eletrodos de gravação de vidro nos músculos do salto (TTMs) de cada lado.
- Estimule o circuito GF com estímulos únicos para medir a latência de resposta para ambos os músculos. Estimule o circuito com trens de estímulos de 100 Hz e 200 Hz, respectivamente, para medir a frequência seguinte para ambos os músculos.
8. Dissecção e rotulagem do sistema de fibra gigante para imagens confocais
NOTA: A dissecção do SNC da mosca e a injeção de corante são detalhadas em Boerner e Godenschwege14.
- Remova suavemente a mosca da cera dentária com uma pinça e transfira-a para uma placa de Petri revestida com elastômero de silicone sob um escopo de dissecação.
- Remova as pernas, asas e tromba com uma tesoura e use alfinetes de insetos para prender o lado dorsal da mosca para cima no revestimento de elastômero.
- Faça uma incisão lateral ao longo da linha média do abdômen médio, através de todo o tórax e subindo pelo pescoço, conectando o tórax à cabeça. Abra a braguilha com alfinetes de insetos. Remova órgãos e glândulas da mosca sem danificar o sistema nervoso.
NOTA: Neste ponto, os axônios GF podem ser injetados com corantes para marcar os GFs e neurônios eletricamente acoplados13. - Remova a cápsula da cabeça da cabeça para expor o cérebro.
9. Imuno-histoquímica do sistema nervoso
- Após a dissecção do SNC, fixe a mosca em PFA a 4% em PBS por 45 min em temperatura ambiente (TR). Lave por 20 min em PBS em RT (3 vezes).
- Bloqueie a amostra por 1 h em RT em BSA a 3% em PBS com solução detergente a 0,5%.
- Incubar por 2-3 noites a 4 ° C em BSA 3% em PBS com solução detergente a 0,3% e anti-GFP de coelho (1: 500). Lave por 20 min em PBS em RT (6 vezes).
- Incube durante a noite a 4 ° C em PBS com Alexa 488 anti-coelho. Lave por 20 min em PBS em RT (6 vezes).
- Desidrate amostras com uma série ascendente de etanol (50%, 70%, 90%, 100% de etanol) por 10 min em cada etapa. Remova os pinos e apare o abdômen e os músculos de vôo. Transfira o resto do tórax contendo o sistema nervoso para uma lâmina e cubra-o com um meio de montagem como salicilato de metila. Coloque uma lamínula na amostra e sele-a com esmalte.
- Imagem do sistema nervoso em um microscópio confocal para analisar a anatomia do terminal GF.
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Resultados
Este método pode ser usado para manipular o desenvolvimento de redes neuronais específicas no sistema nervoso de Drosophila. A principal questão de pesquisa aqui foi a formação de conexões sinápticas. A remoção do GF pré-sináptico ou do TTMn pós-sináptico permitiu a investigação da sinaptogênese reativa nesta sinapse central e os mecanismos moleculares cruciais para a função e o desenvolvimento sináptico. Conforme descrito no protocolo, foi realizada a ablação de células a laser de um dos GFs ou de um dos TTMns,...
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Discussão
A ablação celular com um microscópio de 2 fótons provou ser um método altamente bem-sucedido para manipular o desenvolvimento do circuito neuronal em Drosophila. Como esse método não é invasivo, causa danos mínimos ao animal. Os dados apóiam a utilidade dessa manipulação específica de células de circuitos conhecidos.
Crucial para o sucesso da ablação foi selecionar o driver Gal4 mais apropriado. Como o GFS é bem estudado, muitas linhas específicas de driver Gal4 foram descritas
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Experimentos no microscópio de 2 fótons foram realizados no Núcleo de Imagem Celular Avançada do Instituto do Cérebro Stiles-Nicholson da FAU. Gostaríamos de agradecer à Jupiter Life Science Initiative pelo apoio financeiro.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Proteína fluorescente anti-verde, coelho | Fisher Scientific | A11122 | concentração 1:500 |
| Apo LWD 25x/1.10W Objetiva | Nikon | MRD77220 | imersão em água longa distância de trabalho |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| coerente | a laser Sapphire Vision II | ||
| Genesee Scientific | 51-101 | ||
| Dextra, Tetrametilrodamina, 10.000 MW, Lisina Fixável (fluoro-Rubi) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila | de Gu e O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Perigo, líquido inflamável |
| Alimento para moscas B (receita de Bloomington) | LabExpress | 7001-NV | |
| Salicilato de metila | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Tubo de microcentrífuga 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscópio de lamínula 18x18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Vetor Rastreador de Neurobiotina | Laboratórios | SP-1120 | |
| Microscópio multifotônico Nikon A1R | Nikon | em um suporte vertical de microsope FN1 | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Software de aquisição e análise | |
| de dados Paraformaldeído (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(letal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost lâmina de vidro para microscópio | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | Solução de detergente | 422355000 |
| UAS-10xGFP | Bloomington Centro de Estoque de Drosophila | 32185 |
Referências
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- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
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Reimpressões e permissões
