Ablação de células a laser em larvas intactas de Drosophila revela competição sináptica

Resumo

Este protocolo demonstra a ablação de células a laser de neurônios individuais em larvas intactas de Drosophila . O método permite o estudo do efeito da redução da competição entre neurônios no sistema nervoso em desenvolvimento.

Resumo

O protocolo descreve a ablação de um único neurônio com um sistema de laser de 2 fótons no sistema nervoso central (SNC) de larvas intactas de Drosophila melanogaster . Usando este método não invasivo, o sistema nervoso em desenvolvimento pode ser manipulado de maneira específica da célula. Interromper o desenvolvimento de neurônios individuais em uma rede pode ser usado para estudar como o sistema nervoso pode compensar a perda de entrada sináptica. Os neurônios individuais foram especificamente ablacionados no sistema de fibras gigantes de Drosophila, com foco em dois neurônios: a fibra gigante pré-sináptica (GF) e o neurônio motor tergotrochanteral pós-sináptico (TTMn). O GF faz sinapses com o TTMn ipsilateral, que é crucial para a resposta de escape. A ablação de um dos GFs no cérebro de^3º ínstar, logo após o GF iniciar o crescimento axonal, remove permanentemente a célula durante o desenvolvimento do SNC. O GF restante reage ao vizinho ausente e forma um terminal sináptico ectópico para o TTMn contralateral. Este terminal atípico e bilateralmente simétrico inerva ambos os TTMns, como demonstrado pelo acoplamento de corante, e aciona ambos os neurônios motores, conforme demonstrado por ensaios eletrofisiológicos. Em resumo, a ablação de um único interneurônio demonstra competição sináptica entre um par bilateral de neurônios que pode compensar a perda de um neurônio e restaurar as respostas normais ao circuito de escape.

Introdução

A ablação a laser é uma ferramenta preferida para dissecar circuitos neurais em uma ampla variedade de organismos. Desenvolvido em sistemas genéticos modelo, como vermes e moscas, tem sido aplicado em todo o reino animal para estudar a estrutura, função e desenvolvimento do sistema nervoso ^1,2,3. Aqui, a ablação de neurônio único foi empregada para investigar como os neurônios interagem durante a montagem do circuito em Drosophila. O sistema de escape da mosca é um circuito favorito para análise porque contém os maiores neurônios e as maiores sinapses da mosca adulta, e o circuito foi bem caracterizado nas últimas décadas⁴. O papel que as interações neurônio-neurônio desempenham na montagem do circuito de Fibra Gigante é um ponto focal desta pesquisa.

Um tipo de interação que tem sido um ponto focal na neurociência desde o trabalho de Hubel e Wiesel na década de 1960 é a "competição sináptica"^5,6. Neste protocolo, a ablação a laser foi usada para revisitar o papel da competição por meio da ablação de célula única no sistema de fibras gigantes (GFS) de Drosophila, onde os fundamentos moleculares dos fenômenos podem ser descobertos.

A ablação de neurônios na mosca em desenvolvimento tem sido difícil por vários motivos, incluindo a visualização dos neurônios-alvo, a precisão do método de ablação e a sobrevivência da amostra. Para superar esses problemas no GFS, o sistema UAS / Gal4⁷ foi usado para rotular neurônios de interesse, e um microscópio de dois fótons foi usado para remover a fibra gigante pré-sináptica ou o neurônio motor de salto pós-sináptico (TTMn).

Neste estudo, para determinar o papel que os neurônios bilaterais vizinhos desempenham no ajuste da conectividade sináptica e da força sináptica no GFS, um dos pares bilaterais de neurônios (GF pré-sináptico ou neurônio motor pós-sináptico) foi excluído pouco antes do desenvolvimento da pupa. Nesse estágio de desenvolvimento, a axonogênese da FG não foi concluída⁸. A estrutura do GF e a função do circuito sináptico no adulto foram então examinadas, com atenção especial dada à saída do GF restante.

Protocolo

Todos os animais utilizados para o protocolo foram da espécie Drosophila melanogaster. Não há questões éticas em torno do uso desta espécie. A autorização ética não foi necessária para realizar este trabalho. Os detalhes das espécies, reagentes e equipamentos de Drosophila usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Criação de Drosophila e seleção do estágio larval correto

1. Escolha uma linha de driver Gal4 que conduza a expressão nas células que devem ser ablacionadas e recombine-a ou cruze-a com uma linha de repórter UAS-GFP. Criar moscas com alimentos normais para moscas a 25 °C.
   NOTA: Para ablação de fibra gigante (GF), R91H05-Gal4 ou A307-Gal4 foi recombinado com UAS-GFP. ShakB (letal) -GAL4 recombinado com UAS-GFP foi usado para ablações de TTMn (ver Tabela de Materiais).
2. Selecione as larvas que começaram a emergir da comida e rastejam pela lateral do frasco de comida. Essas larvas estão no estágio errante, que é o estágio preferido para realizar a ablação de células GF.
   NOTA: A ablação pode ser realizada em qualquer estágio larval. O último estágio larval foi importante para a manipulação do desenvolvimento do GFS porque os corpos celulares GF podem ser facilmente identificados no cérebro, mas os axônios GF não fizeram conexões com seus alvos neste estágio.

2. Preparando alarva de^3º ínstar

NOTA: As larvas foram anestesiadas por método semelhante ao de et ^al.9. Para manter os tempos de procedimento curtos, prepare apenas uma larva de cada vez. A exposição curta ao anestésico aumentará a sobrevida dos animais experimentais¹⁰.

1. Prepare um prato de vidro com uma tampa bem ajustada. Coloque uma bola de algodão no prato e, sob uma coifa, adicione cerca de 3-5 ml de éter etílico (líquido perigoso e inflamável, jaleco, luvas, óculos de proteção). Cubra o prato com a tampa.
2. Colete larvas individuais de^3º ínstar de frascos de mosca. No^3º estágio larval, as larvas deixam o meio alimentar e rastejam ao longo da lateral do frasco de alimento¹¹.
   1. Certifique-se de que as larvas ainda estejam se movendo e não tenham iniciado a formação de pupário. As larvas estacionárias e com encurtamento do corpo estão iniciando a pupação e são inadequadas para ablação. Pegue as larvas com um pincel pequeno.
      NOTA: O^3º estágio larval começa após a segunda muda às 72 h de desenvolvimento (após a postura dos ovos) e dura até a formação do pupário às 120 h para moscas criadas a 25 °C.
3. Transfira uma larva para um recipiente pequeno e aberto. Coloque o recipiente no prato de vidro com éter etílico e feche bem o prato. Ao abrir o prato de vidro, coloque-o sob um snorkel ou em um exaustor para evitar que a fumaça escape.
   1. Em intervalos de 30 s, remova a tampa com a larva do prato e verifique a mobilidade da larva sob um microscópio de dissecação. A larva geralmente será imobilizada em 1 minuto. Assim que os ganchos da boca pararem de se contorcer, a larva estará pronta para a montagem. Descarte todas as larvas que não estiverem totalmente imobilizadas após 3 min.
      NOTA: A parte superior de uma tampa de cabeça para baixo de um tubo de microcentrífuga (tampa removida do tubo) pode ser usada como recipiente.

3. Montagem de larvas em lâminas para ablação

1. Coloque a larva anestesiada em uma lâmina de microscópio de vidro. Mergulhe a larva em uma gota de solução salina para insetos; Isso removerá alguns dos restos de comida que podem grudar na larva.
2. Sob o microscópio de dissecação, remova a maior parte da solução salina com um lenço de papel. Posicione o lado dorsal da larva para cima para ablação de GF ou o lado ventral para cima para ablação de TTMn. Abaixe lentamente uma lamínula de vidro sobre a larva. Adicione soro fisiológico na lateral da lamínula para preencher o espaço entre a lâmina de vidro e a lamínula.
3. Para ablação de GF, verifique o posicionamento do cérebro sob alta ampliação no microscópio de dissecação. Certifique-se de que o cérebro esteja nivelado e visível através da cutícula. Freqüentemente, o cérebro será coberto com tecido adiposo, impossibilitando a visualização e a ablação celular.
   1. Para deslocar qualquer tecido adiposo que cubra o cérebro, aplique uma leve pressão na lamínula com uma pinça e mova a lamínula de um lado para o outro. Se o tecido adiposo não puder ser afastado do cérebro dessa maneira, use uma larva diferente.

4. Localizando as células-alvo

NOTA: O sistema multifóton usado para este estudo foi montado em um microscópio vertical. O software específico do sistema foi usado para controlar as configurações de aquisição e estimulação a laser. O sistema foi equipado com uma fonte de luz de epifluorescência para localizar as amostras. A lente objetiva era uma lente de imersão em água com ampliação de 25x, uma longa distância de trabalho de 2 mm e um NA de 1,10.

1. Coloque a amostra no estágio do microscópio multifóton e use o filtro GFP para localizar a amostra no modo de epifluorescência. Para a ablação de GF, os corpos celulares podem ser identificados no cérebro, como visto na Figura 1A, C, D. Para a ablação de TTMn, um aglomerado de quatro células pode ser identificado do lado ventral no cordão nervoso ventral (VNC), conforme mostrado na Figura 1A,B. Quando terminar de focar, centralize as células no campo de view e mude para o modo de 2 fótons.

5. Configurando os parâmetros de ablação

1. Ajuste as configurações do laser e o ganho do detector para visualizar as células que expressam GFP com o scanner Galvano. Um comprimento de onda de 870 nm funciona melhor para visualizar o sinal GFP. Centralize a célula no campo de visão.
2. Use uma região circular de interesse (ROI) para definir a área para ablação. Certifique-se de que a ROI cubra a maior parte da superfície da célula (Figura 1E, G).
3. Configure o protocolo de ablação no software. Defina um quadro de aquisição, depois estimulação, seguido por outro quadro de aquisição.
4. Inicie a configuração de potência do laser de estimulação em um valor mais baixo (10%-20%) e execute o protocolo de estimulação. Uma ablação bem-sucedida pode ser reconhecida por um círculo claro no centro do soma celular no local da ROI e um aumento na fluorescência ao redor da ROI (Figura 1F).
   1. Se a ablação não foi bem-sucedida e apenas branqueou a célula (Figura 1H), aumente a potência do laser em incrementos de 5% ou o número de loops, um de cada vez, e execute o protocolo novamente. A potência do laser aplicada foi entre 10% e 40% para o sistema utilizado no protocolo.
      NOTA: As configurações de potência do laser para ablação dependem muito da profundidade das células localizadas no tecido e de outros fatores, como dobra da cutícula. Se as células forem brilhantes e claramente visíveis, a potência do laser estará na extremidade inferior da faixa. A potência do laser será diferente para cada sistema, dependendo do modelo do laser e da idade do laser.

Figura 1: Identificação de neurônios para ablação a laser em larvas intactas de Drosophila L3 . (A) Esquema da localização do soma de fibra gigante (GF) no cérebro e aglomerado de neurônios motores contendo o neurônio motor tergotrochanteral (TTMn) no cordão nervoso ventral (VNC). (B) Projeção de intensidade máxima de shakB (letal) -Gal4 dirigindo a expressão de GFP no VNC larval. A linha média é indicada pela linha pontilhada. O círculo indica o aglomerado de neurônios contendo o TTMn que são direcionados para ablação a laser. Barra de escala: 50 μm. (C) Vista de projeção parcial do cérebro larval expressando GFP sob o controle de A307-Gal4. O círculo indica o soma GF direcionado para ablação a laser. Barra de escala: 50 μm. (D) Projeção de intensidade máxima do cérebro com R91H05-Gal4 acionando UAS-GFP. Ambos os GFs (círculos) são identificáveis por localização, forma e tamanho. Barra de escala: 50 μm. (E) GF soma visão ampliada antes da ablação a laser. O círculo magenta indica a região alvo para ablação a laser. Barra de escala: 10 μm. (F) GF soma visão ampliada após a entrega da potência do laser localizada e ablação bem-sucedida. Barra de escala: 10 μm. (G) GF soma visão ampliada antes da ablação a laser. O círculo magenta indica a região alvo para ablação a laser. Barra de escala: 10 μm. (H) GF soma visão ampliada após a entrega de potência de laser localizada e ablação malsucedida (clareamento). Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Recuperando as larvas

1. Depois de ablar com sucesso a célula, remova a lamínula e pegue suavemente as larvas da lâmina com um pincel. Coloque as larvas em um frasco de comida. As larvas começarão a rastejar novamente em 30 minutos.
   NOTA: Manter o tempo do procedimento curto melhora as taxas de sobrevivência dos animais. Com experiência, o experimento pode ser realizado em pouco menos de 10 min.
2. Continue criando larvas em condições padrão até que elas se feche do invólucro da pupa.

7. Testando a funcionalidade do GFS em moscas adultas

NOTA: Os passos a seguir são explicados em detalhes em Allan e Godenschwege12, e Augustin et ^al.13.

1. Teste moscas adultas com 2-5 dias de idade após a eclosão. Anestesiar moscas com CO₂ e montá-los na cera dental, empurrando as pernas para dentro da cera. Abra as asas em um ângulo de 90° e fixe-as no lugar com a cera. Prenda a cabeça empurrando a tromba na cera.
2. Coloque fios de estimulação em ambos os olhos, um fio terra no abdômen e eletrodos de gravação de vidro nos músculos do salto (TTMs) de cada lado.
3. Estimule o circuito GF com estímulos únicos para medir a latência de resposta para ambos os músculos. Estimule o circuito com trens de estímulos de 100 Hz e 200 Hz, respectivamente, para medir a frequência seguinte para ambos os músculos.

8. Dissecção e rotulagem do sistema de fibra gigante para imagens confocais

NOTA: A dissecção do SNC da mosca e a injeção de corante são detalhadas em Boerner e Godenschwege¹⁴.

1. Remova suavemente a mosca da cera dentária com uma pinça e transfira-a para uma placa de Petri revestida com elastômero de silicone sob um escopo de dissecação.
2. Remova as pernas, asas e tromba com uma tesoura e use alfinetes de insetos para prender o lado dorsal da mosca para cima no revestimento de elastômero.
3. Faça uma incisão lateral ao longo da linha média do abdômen médio, através de todo o tórax e subindo pelo pescoço, conectando o tórax à cabeça. Abra a braguilha com alfinetes de insetos. Remova órgãos e glândulas da mosca sem danificar o sistema nervoso.
   NOTA: Neste ponto, os axônios GF podem ser injetados com corantes para marcar os GFs e neurônios eletricamente acoplados¹³.
4. Remova a cápsula da cabeça da cabeça para expor o cérebro.

9. Imuno-histoquímica do sistema nervoso

1. Após a dissecção do SNC, fixe a mosca em PFA a 4% em PBS por 45 min em temperatura ambiente (TR). Lave por 20 min em PBS em RT (3 vezes).
2. Bloqueie a amostra por 1 h em RT em BSA a 3% em PBS com solução detergente a 0,5%.
3. Incubar por 2-3 noites a 4 ° C em BSA 3% em PBS com solução detergente a 0,3% e anti-GFP de coelho (1: 500). Lave por 20 min em PBS em RT (6 vezes).
4. Incube durante a noite a 4 ° C em PBS com Alexa 488 anti-coelho. Lave por 20 min em PBS em RT (6 vezes).
5. Desidrate amostras com uma série ascendente de etanol (50%, 70%, 90%, 100% de etanol) por 10 min em cada etapa. Remova os pinos e apare o abdômen e os músculos de vôo. Transfira o resto do tórax contendo o sistema nervoso para uma lâmina e cubra-o com um meio de montagem como salicilato de metila. Coloque uma lamínula na amostra e sele-a com esmalte.
6. Imagem do sistema nervoso em um microscópio confocal para analisar a anatomia do terminal GF.

Resultados

Este método pode ser usado para manipular o desenvolvimento de redes neuronais específicas no sistema nervoso de Drosophila. A principal questão de pesquisa aqui foi a formação de conexões sinápticas. A remoção do GF pré-sináptico ou do TTMn pós-sináptico permitiu a investigação da sinaptogênese reativa nesta sinapse central e os mecanismos moleculares cruciais para a função e o desenvolvimento sináptico. Conforme descrito no protocolo, foi realizada a ablação de células a laser de um dos GFs ou de um dos TTMns, e os efeitos na sinapse após o desenvolvimento da pupa na mosca adulta foram analisados.

Para garantir que o procedimento não tenha um efeito negativo na sobrevivência dos animais, ablações simuladas foram realizadas em paralelo. Para ablações simuladas, os animais foram tratados da mesma forma que os animais experimentais, mas os pulsos de laser foram entregues com uma potência de laser de 0%. Em 82,4% dos casos, os animais de ablações simuladas se transformaram em moscas adultas. GFs de moscas simuladas foram capazes de responder com uma latência de menos de 1 ms e seguir uma estimulação de 100 Hz para 79,3% dos estímulos. A anatomia GF era indistinguível das moscas não tratadas.

Para cada animal experimental, a ablação foi verificada anatomicamente. Em animais com ablação por GF, a FG não abladotada foi injetada com corante e fotografada (veja abaixo). Se apenas um axônio GF fosse visível no conjuntivo cervical (CvC), a ablação do outro GF era assumida. A ablação também pode ser verificada através da ausência de um soma marcado com GFP no lado ablateado do cérebro (Figura 2A, círculo). Para avaliar a ablação de TTMn, o sinal GFP no VNC adulto foi analisado onde o soma e o dendrito TTMn podem ser facilmente identificados. A ausência do TTMn em um lado foi facilmente reconhecida devido à falta de soma e dendritos (Figura 2B, círculo).

Para testar a função do GFS em moscas tratadas, foram registrados potenciais sinápticos dos músculos do salto^12,13, que são inervados pelo TTMn (Figura 3A). Os GFs formam uma sinapse eletroquímica mista com o dendrito medial TTMn¹⁵. O terminal GF não é ramificado e mostra uma curvatura lateral típica que se opõe ao dendrito TTMn na região sináptica (Figura 3D, Figura 4A ponta de seta). Nas moscas de controle, cada GF inerva exclusivamente seu motoneurônio ipsilateral. Nas gravações das fibras TTM, a força da conexão foi avaliada analisando a latência de resposta na estimulação de 1 Hz e a frequência seguinte na estimulação de 100 Hz (Figura 3B,C). As moscas de controle apresentaram uma latência média de resposta inferior a 1 ms e puderam seguir uma estimulação de 100 Hz para 78,1% dos estímulos (Figura 3B). Após a realização dos registros fisiológicos, a amostra foi dissecada para revelar o SNC e os GFs, que foram injetados com corante com uma mistura de TRITC-Dextrana e Neurobiotina. A grande molécula de Dextrana marca o axônio GF e o terminal, mas não passa pelas junções comunicantes. A neurobiotina pode atravessar as junções comunicantes entre GF e TTMn, e o sinal de neurobiotina foi detectado no dendrito pós-sináptico ( Figura 3E, F , pontas de seta ). Este acoplamento de corante de neurobiotina confirmou o acoplamento elétrico entre os dois neurônios. A neurobiotina também pode ser detectada em muitos outros neurônios no VNC que estão conectados através de junções comunicantes ao GF¹⁶ ( Figura 3E , F ).

Os mesmos testes fisiológicos e anatômicos foram realizados após a ablação de uma FG em L3. O axônio da maioria (13/15) das moscas remanescentes em moscas de ablação exibe uma divisão do terminal em dois ramos: um na localização ipsilateral usual e outro cruzando a linha média para uma posição homóloga contralateral à FG intacta (Figura 3G, seta). Cada ramo foi acoplado a um dos dendritos TTMn (Figura 3H, I, pontas de setas). Os registros fisiológicos dos TTMs confirmaram essa conexão sináptica de um GF com ambos os TTMns, embora mais fracamente do que o normal. As latências de resposta do TTM foram superiores a 1 ms para ambos os lados, e as frequências seguintes em 100 Hz foram de 37,1% para o TTMn ipsilateral ao GF intacto e 28% para o TTM contralateral (Figura 3C).

Como a ablação de um GF fez com que o GF restante inervasse ambos os neurônios-alvo, o próximo experimento teve como objetivo observar a resposta dos GFs vizinhos quando um não tinha um neurônio motor alvo ipsilateral normal. Para este experimento, um dos neurônios pós-sinápticos foi excluído e a anatomia e função do TTMn restante, bem como a morfologia dos terminais GF, foram avaliadas. Ao visualizar os TTMns e os GFs em animais de controle adultos, a região de contato sináptico presumido foi claramente visível (Figura 4A, pontas de setas). Cada dendrito medial de TTMn foi colocado ao terminal pré-sináptico GF ipsilateral. Pequenas projeções de dendritos TTMn de ambos os lados estavam em contato com a linha média (Figura 4C; inserção). O acoplamento do corante com a neurobiotina foi visivelmente visível em ambos os TTMn (Figura 4D, pontas de seta).

Quando um TTMn foi ablacionado, a morfologia do dendrito medial remanescente do TTMn foi alterada. O dendrito medial nesses espécimes se estendia por um ramo longo e espesso ao longo da linha média (Figura 4I, K; setas amarelas). Além disso, projeções mais finas em direção a ambos os terminais GF se estendiam anteriormente (Figura 4E, G; pontas de setas amarelas). O GF, ipsilateral ao TTMn, mostrou sua anatomia usual com um terminal projetando-se ao longo do dendrito TTMn.

A resposta da GF "órfã" sem um neurônio motor alvo foi de interesse primário. Na maioria dos casos (61,5% dos animais), a FG órfã exibiu um terminal dividido com um terminal no lado ipsilateral e o outro terminal cruzando a linha média e projetando-se em direção ao dendrito TTMn contralateral (Figura 4J, setas). Esses ramos cruzados da FG foram sempre menores do que os observados no experimento complementar quando a GF vizinha foi ablacionada (Figura 3F). O terminal ipsilateral entrou em contato com o ramo TTMn que se estendia pela linha média (Figura 4I, seta amarela). Em 23% dos espécimes, a FG órfã cruzou a linha média (Figura 4F, seta) e se projetou ao longo de um dos ramos anteriores do TTMn (Figura 4E, pontas de seta amarelas) e foi acoplada ao TTMn restante (Figura 4H, ponta de seta).

Mais dois fenótipos foram observados em moscas de ablação TTMn (Figura 4M). Em uma das 13 moscas, ambas as GFs fizeram a curva normal e permaneceram em seus respectivos lados do sistema nervoso. Em outro caso, a GF órfã exibiu o fenótipo infinito, onde a GF órfã não fez um terminal e parou antes da área onde geralmente se curva. Para todos os quatro fenótipos, as gravações de TTM no lado do TTMn intacto foram comparáveis à fisiologia do tipo selvagem (WT) com latência de resposta abaixo de 1 ms e frequência seguinte a 100 Hz a 100% ou perto de 100%. A remoção de um destino pode permitir que ambos os GFs compartilhem o TTMn de destino restante. Na maioria dos casos, ambos os GFs farão uma conexão com o TTMn restante. Geralmente, o GF órfão exibirá um terminal bilateral. Nas moscas de controle, os GFs nunca cruzarão a linha média; no entanto, em cerca de 85% das moscas de ablação de MTTn, uma GF cruzou a linha média para entrar em contato com a MTTn contralateral. A inervação de um TTMn por dois GF não influenciou negativamente a função sináptica.

Vale ressaltar que a ausência do GF vizinho tem um efeito maior do que a ausência do neurônio motor alvo. O terminal bilateral formado na ausência da FG contralateral é muito maior e mais obviamente funcional do que as alterações quando o alvo é removido.

Figura 2: Exemplos de ablações bem-sucedidas no SNC adulto. (A) Projeção de intensidade máxima de um cérebro de mosca adulta após ablação larval de GF. GFP (verde) é impulsionado por A307-GAL4. O círculo indica a área onde a FG ablativa está faltando. A ponta da seta aponta para o GF restante expressando GFP do outro lado do cérebro. O GF foi preenchido com TRITC-Dextran (vermelho). O axônio está se projetando posteriormente em direção ao VNC. Barra de escala: 20 μm. (B) Projeção de intensidade máxima de um VNC adulto onde um TTMn foi ablacionado em L3. O TTMn restante (ponta de seta) está expressando GFP sob o driver shakB (letal). A área do TTMn ausente é indicada pelo círculo. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A ablação larval de uma fibra gigante (GF) causa ramificação bilateral do terminal pré-sináptico da GF restante. (A) Esquema da configuração experimental para testar a estrutura e função do sistema de fibras gigantes adultas (GFS). O eletrodo de registro mede a latência e a seguinte frequência de saídas do neurônio motor tergotrochanteral (TTMn) nos músculos tergotrochanterais (TTM) após a estimulação do cérebro no animal intacto. Após a dissecção do sistema nervoso, o corante foi injetado nos axônios GF no conjuntivo cervical (CvC). (B, C) Rastreamentos de amostra para latência de resposta TTM e frequência de seguimento a 100 Hz (n representa o número de TTM registrado de cada situação com latência média e frequência de acompanhamento mostradas). (B) Animais controle com dois GFs intactos apresentam latências TTM abaixo de 1 ms e frequências seguintes próximas a 100% a 100 Hz. (C) O único FG remanescente em animais ablacionados inerva ambos os TTMns. As latências para ambos os TTMns são maiores do que nos controles e, após 100 Hz, a frequência é significativamente diminuída. (DI) Projeção de intensidade máxima de pilhas de imagens confocais para GFs preenchidas com corante. TRITC-Dextran (D, G, F, I em vermelho) e Neurobiotina (E, H, F, I em cinza) foram co-injetados. A neurobiotina pode atravessar as junções comunicantes entre o GF e o TTMn, marcando os neurônios pós-sinápticos. As linhas pontilhadas indicam a linha média. (D) Anatomia típica de GF de animais de controle com a curvatura terminal. (E, F) A neurobiotina rotula muitos neurônios pós-sinápticos eletricamente acoplados aos GFs. Os dendritos TTMn marcados transsinapticamente são indicados por pontas de seta. (G) Após a ablação, o GF restante cresce um terminal extra (seta), que cruza a linha média para inervar o TTMn contralateral. (H,I) Ambos os TTMn (pontas de seta) são acoplados ao mesmo GF. Barras de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. A ablação larval de um neurônio motor tergotrochanteral (TTMn) causa inervação do TTMn restante por ambas as fibras gigantes (GF). (A-L) Projeções de intensidade máxima de pilhas de imagens confocais de TTMns marcados com GFP (verde) sob o controle de shakB(letal)-Gal4 e os GFs foram preenchidos com corante TRITC-Dextran (magenta) e Neurobiotina (vermelho). A linha pontilhada indica a linha média do sistema nervoso. (A-D) Amostras de controle com ambos os TTMns intactos. Os GFs fazem sua curva terminal típica para longe da linha média para entrar em contato com o TTMn (A,B), e cada GF entra em contato com um TTMn. Os dendritos TTMn se encontram na linha média (C). Cada GF é corante acoplado ao seu TTMn (D, pontas de setas brancas). (E-H) O TTMn esquerdo foi ablacionado. O dendrito medial do TTMn restante se projeta através da linha média (G, seta amarela). A GF órfã cruza a linha média (seta branca) na região sináptica e entra em contato com o dendrito contralateral TTMn (E,F). Os GFs são corantes acoplados ao TTMn restante (H, ponta de seta). (IL) Exemplo de outro fenótipo GF em que o TTMn esquerdo foi ablacionado. O dendrito medial do TTMn restante se projeta através da linha média (I e K, seta amarela). O GF órfão esquerdo faz um terminal bilateral; um ramo se projeta contralateralmente e o outro permanece ipsilateral (J, setas) para se conectar ao TTMn. Barras de escala: 20 μm. (M) Esquema dos quatro fenótipos diferentes de GF observados em animais de ablação de TTMn. n indica o número de animais em cada classe. Dadas são as médias com erro padrão para latência de resposta TTM e frequência seguinte (FF) a 100 Hz para o lado do TTMn intacto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A ablação celular com um microscópio de 2 fótons provou ser um método altamente bem-sucedido para manipular o desenvolvimento do circuito neuronal em Drosophila. Como esse método não é invasivo, causa danos mínimos ao animal. Os dados apóiam a utilidade dessa manipulação específica de células de circuitos conhecidos.

Crucial para o sucesso da ablação foi selecionar o driver Gal4 mais apropriado. Como o GFS é bem estudado, muitas linhas específicas de driver Gal4 foram descritas⁷. A maioria dos drivers Gal4 são muito restritos, mas ainda expressos em muitos outros neurônios. Um desafio foi identificar de forma confiável as células-alvo no animal intacto. Para animais com um rótulo GFP claramente visível, a ablação pode ser realizada com baixa potência do laser e muitas vezes requer apenas um teste. Em animais onde o tecido adiposo cobria o cérebro ou a expressão de GFP era fraca, a deleção das células-alvo exigia maior potência do laser e vários loops de exposição ao laser. Os corpos celulares GF estavam localizados a cerca de 100 μm de profundidade do lado dorsal do cérebro. Para experimentos em que as células-alvo estão localizadas em uma profundidade mais profunda, pode ser útil realizar a ablação em estágios larvais anteriores, quando o sistema nervoso é menor.

Em experimentos anteriores no laboratório, diferentes métodos de ablação celular foram explorados. O uso do sistema UAS / Gal4 para impulsionar a expressão de toxinas também levou à exclusão de neurônios específicos. No entanto, é muito mais difícil controlar a exclusão de células individuais e evitar efeitos fora do alvo. A outra dificuldade é controlar o momento exato do evento de exclusão da célula. A ablação de células a laser permitiu um controle preciso sobre a localização do alvo e o momento da deleção, mas ainda havia alguns desafios a serem superados antes que o método fosse aperfeiçoado e as taxas de sucesso de mais de 80% (sobrevivência animal e ablação celular bem-sucedida) fossem alcançadas. A taxa de sobrevivência dos animais foi afetada negativamente pela longa exposição ao éter etílico e longos tempos de procedimento. Estudos mostraram que altas taxas de sobrevivência à pupação (78%) e eclosão a adultos (67%) podem ser alcançadas com a exposição de 3,5 minutos de larvas de Drosophila L3 ao éter etílico¹⁰. A exposição por 3,5 min garantirá que o animal fique imóvel por até 8 h. Para a ablação de células a laser, os animais precisam ficar imóveis por 30 minutos ou menos. Portanto, o tempo de exposição ao éter etílico pode ser mantido bem abaixo de 3,5 min. Na maioria dos casos, as larvas ficaram totalmente imóveis em 1 min.

Os resultados da ablação a laser demonstram que a FG pode ser ablacionada de forma limpa e o efeito na GF vizinha contralateral é facilmente avaliado. O resultado da ablação foi claro e consistente. Em 13 das 15 ablações unicelulares, os parceiros restantes exibem um terminal bilateral que nunca é visto em animais de controle. Este terminal bilateralmente simétrico é facilmente reconhecido, e o ramo contralateral incomum é semelhante em tamanho a um terminal normal e é acoplado ao neurônio motor alvo contralateral. O terminal bilateral é acoplado a ambos os neurônios motores alvo e funciona quase do tipo selvagem na maioria dos espécimes, conduzindo tanto o alvo normal-ipsilateral quanto o neurônio motor alvo contralateral com latências e frequências seguintes próximas aos valores de controle.

O experimento complementar, uma ablação unilateral de um neurônio motor alvo, fornece uma comparação interessante. O neurônio motor restante geralmente exibe um crescimento dendrítico reativo, estendendo um processo através da linha média para o espaço normalmente ocupado pelo vizinho excluído. Embora este dendrito não seja tão grande quanto o excluído, ele demonstra uma reação semelhante aos GFs que não têm seu companheiro bilateral. Em contraste, o GF agora sem alvo responde apenas modestamente ao alvo ausente, estendendo processos menores ao longo da linha média e ao longo dos dendritos do neurônio motor restantes. Essa resposta modesta contrasta fortemente com a resposta dramática do GF a um GF homólogo bilateral ausente, onde um grande terminal contralateral é formado para complementar o terminal normal e formar um terminal bilateral.

Um experimento de ablação paralela foi feito recentemente nas entradas pré-sinápticas para o GF no cérebro, onde um tipo semelhante de "competição" pelo espaço sináptico foi revelado¹⁷. As entradas visuais para o GF colocam o glomérulo onde os neurônios de projeção visual (VPN) alcançam os dendritos GF. A exclusão de um grupo de VPNs (neste caso, geneticamente) demonstra que as VPNs restantes assumem e inervam parte do espaço sináptico do vizinho ausente e produzem uma recuperação fisiológica compensatória da resposta visual a estímulos iminentes. Quando os primeiros aferentes de chegada são excluídos, os de chegada posterior ocupam espaço e não são mais ocupados. A principal semelhança fenomenológica com o presente trabalho é o papel aparente que a ocupação física desempenha na determinação do equilíbrio entre os vários insumos. Os terminais de saída dos dois GFs parecem competir entre si pelo espaço sináptico físico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jaxkson ImmunoResearch	111-545-003
Proteína fluorescente anti-verde, coelho	Fisher Scientific	A11122	concentração 1:500
Apo LWD 25x/1.10W Objetiva	Nikon	MRD77220	imersão em água longa distância de trabalho
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	B4287-25G
coerente			a laser Sapphire Vision II
	Genesee Scientific	51-101
Dextra, Tetrametilrodamina, 10.000 MW, Lisina Fixável (fluoro-Rubi)	Fisher Scientific	D1817
		Drosophila	de Gu e O'Dowd, 2006
Ethyl Ether	Fisher Scientific	E134-1	Perigo, líquido inflamável
Alimento para moscas B (receita de Bloomington)	LabExpress	7001-NV
Salicilato de metila	Fisher Scientific	O3695-500
Tubo de microcentrífuga 1.5 mL	Eppendorf	22363204
Microscópio de lamínula 18x18 #1.5	Fisher Scientific	12-541A
Vetor Rastreador de Neurobiotina	Laboratórios	SP-1120
Microscópio multifotônico Nikon A1R	Nikon		em um suporte vertical de microsope FN1
NIS Elements Advanced Research	Nikon		Software de aquisição e análise
de dados Paraformaldeído (PFA)	Fisher Scientific	T353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)	Fisher BioReagents	BP2944-100	Tablets
R91H05-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	40594
shakB(letal)-GAl4	Bloomington Drosophila Stock Center	51633
Superfrost lâmina de vidro para microscópio	Fisher Scientific	12-550-143
Triton X-100	Fisher Scientific	Solução de detergente	422355000
UAS-10xGFP	Bloomington Centro de Estoque de Drosophila	32185

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