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Artigo de método

Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

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DOI:

10.3791/67057

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12 de julho de 2024

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1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Resumo

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é amplamente atribuída à exposição à fumaça do tabaco. Investigar como as células epiteliais das vias aéreas se adaptam funcionalmente à fumaça do tabaco é crucial para entender a patogênese da DPOC. O presente estudo foi estabelecer um modelo in vitro usando células epiteliais primárias das vias aéreas murinas para imitar o impacto da fumaça do tabaco na vida real. Ao contrário das linhagens celulares estabelecidas, as células primárias retêm mais propriedades semelhantes às in vivo, incluindo padrões de crescimento, envelhecimento e diferenciação. Essas células exibem uma resposta inflamatória sensível e diferenciação eficiente, representando de perto as condições fisiológicas. Nesse modelo, células epiteliais primárias das vias aéreas murinas foram cultivadas por 28 dias sob uma interface ar-líquido com uma concentração ótima de extrato de fumaça de cigarro (CSE), o que levou à transformação de uma monocamada de células indiferenciadas em um epitélio colunar pseudoestratificado, indicativo de aclimatação ao CSE. Análises multiômicas abrangentes foram então aplicadas para elucidar os mecanismos pelos quais o CSE influencia a diferenciação das células basais das vias aéreas. Esses insights fornecem uma compreensão mais profunda dos processos celulares que sustentam a progressão da DPOC em resposta à exposição à fumaça do tabaco.

Introdução

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma condição pulmonar heterogênea com características complexas, enquanto os pacientes com DPOC tendem gradualmente a ser mais jovens1. O tabagismo, um fator de risco primário para DPOC2, tem um impacto profundo nas células epiteliais das vias aéreas, que servem como barreira inicial contra a fumaça do tabaco. Apesar dessa associação conhecida, os mecanismos detalhados pelos quais a fumaça do tabaco induz alterações nas células epiteliais das vias aéreas permanecem inadequadamente explorados. Uma compreensão completa dessas alterações moleculares é essencial para identificar marcadores diagnósticos precoces e alvos terapêuticos para a DPOC.

Para resolver essa lacuna, desenvolvemos um novo modelo in vitro usando células epiteliais das vias aéreas murinas. Essas células foram submetidas a estimulação de longo prazo com extrato de fumaça de cigarro (CSE), permitindo-nos monitorar as mudanças celulares dinâmicas e explorar as mudanças nas células epiteliais das vias aéreas sob estimulação de tabaco de longo prazo e o mecanismo subjacente. Nesse modelo, o transwell foi usado para fornecer a interface ar-líquido das células epiteliais das vias aéreas, e o extrato de fumaça de cigarro foi estimulado no estágio inicial da diferenciação das células epiteliais até o final da diferenciação aos 28 dias. Estudos anteriores investigaram apenas a diferenciação e estimulação de curto prazo das células epiteliais das vias aéreas (dominância da linha celular). Eles foram limitados a uma única via regulatória 3,4,5,6. No entanto, o protocolo apresentado aqui usa células epiteliais primárias das vias aéreas de camundongos e otimiza o processo de extração celular para uma melhor atividade celular do que os métodos anteriores de cultura de células epiteliais das vias aéreas. Este modelo se concentra em alterações na diferenciação celular juntamente com análises transcriptômicas, proteômicas, metabolômicas e epigenômicas abrangentes. Empregando imunofluorescência e técnicas multiômicas avançadas, nosso objetivo foi elucidar as respostas celulares das células epiteliais das vias aéreas à exposição crônica à fumaça do tabaco, contribuindo assim para uma compreensão mais profunda da patogênese da DPOC. Este modelo pode ser usado para explorar as mudanças no padrão de diferenciação das células epiteliais das vias aéreas e seu mecanismo causado pela estimulação de longo prazo de vários poluentes.

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Protocolo

O protocolo geral requer 44 dias, incluindo 1 dia para preparação de células epiteliais das vias aéreas isoladas de traqueias murinas, 15 dias para proliferação celular e 28 dias para estimulação de CSE na interface ar-líquido. Todos os animais experimentais estão alojados na Sala de Animais de Barreira SPF do Centro de Experimentos Animais da Capital Medical University e foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Animais de Laboratório e Experimentos Animais da Capital Medical University (AEEI-2020-100) para atender aos requisitos das diretrizes ARRIVE7.

1. Isolamento de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas das traqueias murinas

  1. Preparação
    1. Prepare o meio de expansão completo combinando 1 mL de suplemento 50x e 0,05 mL de estoque de hidrocortisona com 48,95 mL de meio basal de expansão. Conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 4 semanas.
    2. Dissolva 7,5 mg de proteinase e 5 mg de desoxirribonuclease I em 5 mL de F-12 de Ham para preparar uma solução de proteinase. Filtre-o para esterilizar e armazenar a 4 °C e use dentro de 4 semanas.
    3. Prepare soluções antibióticas adicionando 0,05 mL de penicilina/estreptomicina 100x e 0,01 mL de gentamicina/anfotericina 500x a 5 mL de meio de expansão completo, PBS e solução de proteinase (penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 U/mL, gentamicina 10 μg/mL e 0,25 μg/mL de anfotericina B). Conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 4 semanas.
    4. Esterilize os instrumentos cirúrgicos e prepare a cabine de segurança biológica para o isolamento celular. Simultaneamente, certifique-se de que o equipamento padrão de cultura de células esteja pronto para uso.
    5. Prepare pratos revestidos com colágeno de cauda de rato adicionando colágeno de cauda de rato (100 μg / mL em ácido acético 0,02 N) em placas de cultura de 100 mm e transwells de 24 mm (0,05 mL / cm2). Deixe aberto durante a noite sob luz ultravioleta para esterilização.
  2. Isolamento de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas
    1. Use camundongos C57BL / 6 (6-8 semanas de idade, machos, levantados com FPS) para isolamento de células epiteliais traqueais. Eutanasiar com overdose de solução de pentobarbital sódico a 1% (cerca de 200 mg/kg). Use cinco camundongos para obter rendimento celular suficiente.
    2. Esterilize o camundongo por imersão em solução de etanol a 75%, não mergulhando o nariz e a boca em álcool para evitar que o álcool flua para a traqueia.
    3. Disseque o mouse.
      1. Use lâminas cirúrgicas e fórceps, um conjunto de dispositivos para cortar e abrir a epiderme da mandíbula inferior até a cavidade abdominal do camundongo.
      2. Use outro conjunto de instrumentos cirúrgicos para separar as glândulas tireoides de ambos os lados e remover as conexões entre a traqueia, o tecido muscular circundante e o esôfago.
      3. Depois disso, corte cuidadosamente o peito, use uma pinça para mergulhar mais fundo na cavidade torácica, retire todo o pulmão e encontre o final da traqueia.
    4. Processe a traqueia.
      1. Corte a traqueia da cartilagem tireóide até o ramo traqueobrônquico e coloque-a em um meio de expansão pré-frio contendo quatro antibióticos.
      2. Agite o tubo para enxaguar o máximo de sangue possível da superfície da traqueia, mantenha-o no gelo e inicie a cirurgia para o próximo camundongo.
    5. Transfira todas as traqueias coletadas para o tampão PBS pré-resfriado contendo quatro antibióticos (200 U / mL de penicilina, 200 U / mL de estreptomicina, 20 μg / mL de gentamicina e 0,5 μg / mL de anfotericina B) para pré-tratamento antes da digestão.
    6. Use um conjunto de instrumentos cirúrgicos para remover coágulos e outros tecidos das superfícies da traqueia e, em seguida, corte-os no tamanho 1 cm2 .
    7. Incubar o tecido traqueal em solução de proteinase a 37 °C durante 40 min.
    8. Após 40 min, balance o tubo várias vezes e use um filtro de células de 40 μm para remover os tecidos restantes. Lave as traqueias picadas em uma peneira com 5 mL de meio de expansão, centrifugue a suspensão celular a 400 x g por 5 min a 4 ° C e descarte o sobrenadante.
    9. Ressuspenda as células obtidas em 8 mL de meio de expansão.
    10. Conte as células viáveis usando azul de tripano e um hemocitômetro.
    11. Suspensão de células da placa P0 em placas de 100 mm (1 x 104 células vivas/cm2) pré-revestidas com colágeno de cauda de rato e cultivar as células em uma incubadora a 37 ° C, 5% CO2.

2. Cultura de expansão e passagem de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas

  1. Substitua o meio para a cultura de células P0 a cada 3 dias até que as células atinjam 70%-80% de confluência, geralmente dentro de 6 dias. Nesse ponto, as células epiteliais traqueais murinas podem formar uma monocamada intacta com aparência de paralelepípedo (Figura 1A-D).
  2. Pré-aqueça volumes suficientes de PBS, meio de expansão completo e kit de dissociação celular sem componentes animais (ACF) a 37 °C.
  3. Enxágue suavemente as células com 3 mL de PBS.
  4. Realize a dissociação enzimática.
    1. Adicione 3 ml de solução de dissociação enzimática ACF à cápsula e incube a 37 °C durante 5 min. Após a pipetagem, desalojar as células suavemente e transferir a suspensão celular para 3 ml de solução de inibição enzimática ACF.
    2. Repita a adição de 3 mL de solução de dissociação enzimática ACF e incube novamente por 5 min para garantir o descolamento máximo das células.
  5. Girar a suspensão celular a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
  6. Ressuspenda as células em 1 mL de meio de expansão.
  7. Conte as células viáveis usando azul de tripano e um hemocitômetro.
  8. Suspensão de células da placa P1 em vários pratos de 100 mm (5 x 104 células vivas/cm2) pré-revestidos com colagénio de cauda de rato e cultura das células numa incubadora a 37 °C, 5% de CO2.

3. Diferenciação e estimulação de CSE de células epiteliais primárias das vias aéreas murinas na interface ar-líquido

  1. Confirme o tipo de célula.
    1. Verificar a origem epitelial das células isoladas usando um ensaio de imunofluorescência (IFA) com anticorpos contra citoqueratinas. As células da semente em lâminas de vidro revestidas por colágeno de cauda de rato usam paraformaldeído para fixá-las por pelo menos 12 h após as células atingirem 80% de confluência.
    2. Lave as lâminas 3 vezes com solução de PBS por 5 min e incube-as com 3% de BSA e 0,1% de triton X-100 em solução de PBS em temperatura ambiente (RT) por 1 h.
    3. Incubar as lâminas durante a noite a 4 °C com anticorpo anticitoqueratina anti-pan comercial a uma diluição de 1:500.
    4. No dia seguinte, lavar as lâminas 3 vezes com solução de PBS durante 5 min e incubá-las com tampão de anticorpos secundários a uma diluição de 1:1000 em RT durante 2 h no escuro.
    5. Após a incubação, lave as lâminas 3 vezes com PBS (5 min por lavagem) e adicione DAPI a uma diluição de 1:1000. Após incubação em RT por 15 min, lave as lâminas uma vez com PBS por 5 min.
    6. Observe as lâminas sob um microscópio de fluorescência e compare os padrões de expressão com um controle positivo (linha celular A549) e um controle negativo (linha celular Raw264.7) (Figura 2).
  2. Semeie as células para diferenciação.
    1. Separar e centrifugar as células P2 conforme descrito anteriormente e ressuspender o sedimento celular em um volume apropriado de meio de expansão para facilitar o plaqueamento de 1 x 104 células vivas/cm2.
    2. Pipete 1 mL de suspensão celular na câmara apical da inserção da membrana de policarbonato transwell. No compartimento basal do transpoço, adicione 1,5 mL de meio de proliferação.
  3. Incubar as células a 37 °C e mudar completamente todo o meio nas câmaras basal e apical a cada 3 dias usando meio de expansão até atingir a confluência. Isso normalmente leva de 3 a 6 dias.
  4. Prepare 50 mL de meio de diferenciação completo adicionando 5 mL de suplemento ALI 10x, 500 μL de suplemento de manutenção ALI, 100 μL de solução de heparina e 250 μL de solução estoque de hidrocortisona a 44,15 mL de meio basal ALI.
  5. Prepare CSE.
    1. Borbulhe um cigarro através de 12,5 mL de meio de diferenciação e, em seguida, filtre-o através de um filtro de poros de 0,22 μm para preparar o CSE. Para garantir a padronização entre experimentos e lotes de CSE, medir a absorbância a 320 nm em um espectrofotômetro e definir a densidade óptica (DO) de 1 como 100%8.
  6. Utilizar o meio de diferenciação que contém uma concentração adequada de CSE para estimular as células epiteliais primárias das vias aéreas murinas a fim de detectar efeitos na diferenciação das células.
  7. Permitir que as células se diferenciem durante 28 dias, durante os quais o meio da câmara basal é mudado e o lado apical é lavado duas vezes por semana, removendo o meio da câmara apical e substituindo o meio da câmara basal pelo meio de diferenciação que contém a concentração adequada de CSE.
  8. Analise as células pós-exposição.
    1. Após a exposição ao meio de diferenciação contendo CSE, colher as células e os sobrenadantes da cultura a qualquer momento (ou seja, 0-28 dias) para detectar alterações morfológicas (ou seja, ensaio de imunofluorescência (IFA) ou coloração de hematoxilina-eosina (HE) ou para procedimentos analíticos de bioinformática (ou seja, transcriptômica, proteômica, metabolômica, etc.).

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Resultados

Diferenciação
As células epiteliais das vias aéreas murinas se diferenciaram com sucesso após a cultura em uma interface ar-líquido com um meio de diferenciação por 28 dias. A presença de células ciliadas e caliciformes foi demonstrada pelo ensaio de imunofluorescência do marcador de cílios acetilado α-Tubulina (verde; Figura 3A) e o marcador de células caliciformes Mucin5AC, respectivamente6 (vermelho; Figura 3B).

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Discussão

A DPOC é uma doença inflamatória crônica comum das vias aéreas. A exposição à fumaça do tabaco leva à inflamação crônica das vias aéreas, remodelação das vias aéreas e destruição estrutural pulmonar, que é o resultado da interação de várias células estruturais e células imunes10. Como linha de frente do sistema imunológico inato no pulmão, as células epiteliais das vias aéreas desempenham um papel muito importante durante o desenvolvimento da doença11. Nesse ponto de vista,...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82090013).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100x Solução de Penicilina/EstreptomicinaGibco15140122
Transwell de 24 mm com 0.4 µ m Inserção de Membrana de Poliéster de Poros, EstérilBIOFILTCS016012
40 µ m Cell StrainerFalcon352340
500x Solução de Gentamicina/AnfotericinaGibcoR01510
acetilada &alfa;-TubulinaCST#5335
Acetil-&alfa;-Tubulina (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb cellsignal#5335
Kit de Dissociação de Células Livres de Componentes AnimaisCélula-tronco05426
Anticorpo anti-pan citoqueratinaabcam ab7753
CigarroMarlboro
Claudin3imunowayYT0949
Desoxirribonuclase I do pâncreas bovinoSigma-AldrichDN25
Desoxirribonuclásio I de pâncreas bovinoSigmaDN25
Ham» s F-12Sigma-AldrichN6658
Solução de Heparina Célula-tronco07980
Solução de estoque de hidrocortisonaCélula-tronco07925
Mucina 5ACabcamab212636
Oclusinaproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Solução de penicilina-estreptomicinaGibco15140122
PneumaCult-ALI
Célula-tronco Basal Média		05002 
Suplemento PneumaCult-ALI 10x Stemcell05003 
PneumaCult-ALI Suplemento de ManutençãoCélula-tronco05006
PneumaCult-Ex Plus 50x SuplementoCélula-tronco05042
PneumaCult-Ex Plus Tronco Médio Basal05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Colágeno de cauda de ratoCorning354236
Trypan BlueCélula-tronco07050 

Referências

  1. Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
  2. Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD. Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).
  3. Leino, M. S., et al. Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8 (8), e71278(2013).
  4. Benediktsdóttir, B. E., Arason, A. J., Halldórsson, S., Gudjónsson, T., Másson, M., Baldursson, Ó Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10. Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).
  5. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respir Res. 14 (1), 135(2013).
  6. Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., BéruBé, K. Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model. Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).
  7. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
  8. Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).
  9. Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq. Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).
  10. Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. 11, Suppl 5 (Suppl 5) S252-S258 (2014).
  11. Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD. Front Immunol. 14, 1201658(2023).
  12. Zhou, J. -S., et al. Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice. Eur Respir J. 56 (3), 2000404(2020).
  13. Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface. J Vis Exp. (48), e2513(2011).
  14. You, Y., Brody, S. L. Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).
  15. Wandalsen, G. F., Lanza, F. deC., Nogueira, M. C. P., Solé, D. Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests. Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).
  16. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  17. Takagi, R., et al. How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets. Regen Ther. 1, 1-4 (2015).
  18. Culp, D. J., Latchney, L. R. Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture. Am J Physiol. 265 (3), Pt 1 L260-L269 (1993).
  19. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).
  20. Bebök, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).

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