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Identificação de células quiescentes em um modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de peixe-zebra usando coloração de proliferação celular

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DOI:

10.3791/67059

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19 de julho de 2024

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1Pharmacology and Nutritional Sciences, The University of Kentucky, 2Markey Cancer Center, The University of Kentucky, 3Department of Molecular and Cellular Biochemistry, The University of Kentucky

Neste artigo

Resumo

Usamos a coloração de proliferação celular para identificar células quiescentes no modelo de leucemia linfoblástica aguda T de peixe-zebra. A coloração é retida em células que não se dividem e reduzida durante a proliferação celular, permitindo a seleção de células dormentes para interrogação posterior. Este protocolo fornece uma ferramenta funcional para estudar a auto-renovação no contexto da quiescência celular.

Resumo

A quiescência celular é um estado de parada de crescimento ou proliferação lenta que é descrito em células-tronco normais e cancerígenas (CSCs). A quiescência pode proteger as CSCs de drogas quimioterápicas antiproliferativas. Em modelos de camundongos com xenoenxerto derivado de pacientes (PDX) de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), as células quiescentes estão associadas à resistência ao tratamento e à estaminalidade. Os corantes de proliferação celular são ferramentas populares para o rastreamento da divisão celular. O corante fluorescente é covalentemente ancorado em grupos amina na membrana e macromoléculas dentro da célula. Isso permite o rastreamento de células marcadas para até 10 divisões, que podem ser resolvidas por citometria de fluxo.

Em última análise, as células com as maiores taxas de proliferação terão baixa retenção de corante, pois serão diluídas a cada divisão celular, enquanto as células dormentes e de divisão mais lenta terão a maior retenção. O uso de corantes de proliferação celular para isolar células dormentes foi otimizado e descrito em modelos de camundongos T-ALL. Complementar aos modelos de camundongos existentes, o modelo T-ALL de peixe-zebra derivado de rag2: Myc fornece um excelente local para interrogar a auto-renovação em T-ALL devido à alta frequência de células-tronco leucêmicas (LSCs) e à conveniência do peixe-zebra para experimentos de transplante em larga escala.

Aqui, descrevemos o fluxo de trabalho para a coloração de células T-ALL de peixe-zebra com um corante de proliferação celular, otimizando a concentração do corante para células de peixe-zebra, passando células coradas com sucesso in vivo e a coleta de células com níveis variados de retenção de corante por classificação de células vivas de animais transplantados. Dada a ausência de fabricantes de superfície celular bem estabelecidos para LSCs em T-ALL, essa abordagem fornece um meio funcional para interrogar células quiescentes in vivo. Para resultados representativos, descrevemos a eficiência do enxerto e a frequência de LSC de células de alta e baixa retenção de corante. Este método pode ajudar a investigar propriedades adicionais de células quiescentes, incluindo resposta a medicamentos, perfis transcricionais e morfologia.

Introdução

As células-tronco adultas são responsáveis pela regeneração de tipos celulares diferenciados em um determinado órgão e estão predominantemente presentes em um estado dormente e sem divisão 1,2. Por exemplo, as células-tronco hematopoiéticas (HSCs), que mantêm o sangue, permanecem em grande parte quiescentes, e apenas uma pequena fração entra no ciclo celular para se auto-renovar ou se diferenciar para gerar componentes sanguíneos maduros3. Da mesma forma, nos cânceres, uma subpopulação rara de células chamadas células-tronco cancerígenas (CSCs) possui a capacidade de autorrenovação e é responsável pela manutenção a longo prazo da malignidade4. As células-tronco cancerígenas existem in vivo em um estado de quiescência ou crescimento lento, o que pode permitir que elas escapem dos tratamentos antiproliferativos contra o câncer5, evitem a depuração pelo sistema imunológico6, reduzam o estresse oxidativo e melhorem suas vias de reparo do DNA7. Mesmo um baixo número de CSCs deixadas para trás após o tratamento pode potencialmente repovoar o tumor, resultando na recaída do paciente8. Assim, a compreensão da quiescência celular é uma grande promessa para a identificação de vulnerabilidades potenciais das CSCs e o desenvolvimento de novas maneiras de direcioná-las.

Corantes de proliferação celular, como a coloração de éster carboxifluoresceína succinimidil (CFSE) e seus derivados, são comumente usados para rastrear a frequência das divisões celulares9. O corante permeia a membrana celular e, uma vez dentro da célula, sofre ativação por esterases intracelulares em um produto fluorescente. O composto fluorescente resultante é retido dentro da célula através das ligações amida covalentes formadas entre a fração succinimidil e os grupos funcionais amina das proteínas intracelulares10. Com cada divisão celular, o composto fluorescente é dividido igualmente entre as duas células resultantes, causando uma diluição de sinal dupla. Este corante permite a detecção de até 10 divisões celulares por meio da análise de citometria de fluxo11.

Essa abordagem foi utilizada anteriormente para enriquecer populações de CSC in vitro, identificando populações de células de ciclo lento com alta retenção do corante11,12. Na LLA-T, o CFSE tem sido usado para rastrear o crescimento tumoral in vivo em xenoenxertos derivados de pacientes em camundongos. Após a marcação celular e três semanas de transplante, a análise de citometria de fluxo mostrou uma população rara de células que ainda retinham a fluorescência do CFSE. Essa população foi associada a stemness, resistência ao tratamento e alta semelhança com células causadoras de recidiva em pacientes13. Assim, este corante fornece uma ferramenta útil para o estudo dos fenótipos de células-tronco de leucemia (LSC) em T-ALL.

O objetivo do trabalho é estender a aplicação do corante de proliferação celular para estudar a quiescência in vivo usando um modelo T-ALL de peixe-zebra. Em particular, o modeloT-ALL de peixe-zebra acionado por rag2: Myc fornece um excelente local para o estudo da auto-renovação devido à alta frequência de LSCs em comparação com modelos de camundongos e doenças humanas15. Além disso, o uso de peixe-zebra permite estudos de transplante em larga escala, que podem ser feitos a um custo muito menor de cuidados e manutenção em comparação com seus equivalentes de camundongos16. O peixe-zebra também é excelente para aplicações de imagem ao vivo, pois as células tumorais marcadas com fluorescência podem ser facilmente visualizadas usando um microscópio de fluorescência simples para estimar a taxa de desenvolvimento do tumor16.

Neste protocolo, descrevemos o fluxo de trabalho para coloração de células T-ALL de peixe-zebra com corante de proliferação celular seguido de propagação in vivo de células coradas em peixe-zebra CG1 singênico. Após o desenvolvimento da leucemia, descrevemos a classificação das células que retiveram o corante e seu uso para um experimento de transplante de diluição limitante subsequente para quantificar as taxas de auto-renovação do LSC. Este protocolo pode ser estendido para aplicações adicionais, incluindo triagem de drogas in vivo de compostos potenciais para o direcionamento de LSCs quiescentes. Além disso, as células coletadas podem ser usadas para diferentes análises a jusante, como perfil transcriptômico, proteômica e metabolômica, oferecendo insights exclusivos sobre o comportamento de LSCs quiescentes em T-ALL.

Protocolo

Neste protocolo, estamos usando células T-ALL de peixe-zebra marcadas com GFP que foram geradas anteriormente na cepa CG1 e, portanto, podem ser injetadas diretamente no peixe-zebra CG1 singênico do receptor15. Resumidamente, a leucemia foi gerada por microinjeção de DNA de rag2:Myc e rag2:GFP em embriões de peixe-zebra CG1 de célula única. Os animais foram monitorados quanto ao desenvolvimento de leucemia a partir de 3 semanas após a injeção, usando microscopia de fluorescência. As células de leucemia GFP-positivas foram isoladas com FACS e transplantadas em série no peixe-zebra receptor CG1 para gerar clones com alta frequência de LSC. Os detalhes de todo o protocolo são descritos por Blackburn et al.15.

Alternativamente, a LLA-T primária derivada de rag2:Myc pode ser gerada por microinjeção de DNA de embriões de peixe-zebra17. A microinjeção de DNA de rag2:Myc com um repórter fluorescente acionado por rag2, como GFP, pode resultar no desenvolvimento de células B, células T e LLA18 mista. Os clones de leucemia utilizados neste protocolo foram previamente verificados como T-ALL15. Todos os procedimentos experimentais envolvendo peixe-zebra foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Kentucky, protocolo 2019-3399.

1. Propagação de células T-ALL de peixe-zebra in vivo

  1. Descongele um frasco contendo 1 mL de células T-ALL de peixe-zebra congeladas com rótulo GFP em banho-maria a 37 °C com agitação suave, até descongelar. Depois de descongelado, transfira para o gelo.
  2. Pipete lentamente o conteúdo do tubo em um tubo cônico de 15 mL com 4 mL de meio de peixe (0,9x PBS + 5% FBS) para diluir o meio de congelamento.
  3. Gire para baixo por 5 min a 2.500 × g a 4 °C. Remova a mídia do pellet. Ressuspenda em 0,5 mL de meio de peixe e mantenha as células no gelo.
  4. Conte as células e dilua-as, se necessário, para 100.000 células/5 μL.
  5. Anestesiar o peixe-zebra CG1 adulto adicionando 200 μL de anestésico 4 mg/mL (MS-222) a 25 mL de água do sistema de peixes em uma placa de Petri. Segure o peixe CG1, com o lado ventral para cima, e injete 5-6 μL no espaço intraperitoneal (IP) usando uma seringa de microlitro Hamilton. Mova os animais de volta para seus tanques e monitore o retorno à natação normal antes de colocá-los de volta no sistema.
    NOTA: Peixes-zebra adultos, com 60 dias ou mais, foram usados para os estudos de transplante descritos neste protocolo.
  6. Monitore o crescimento da leucemia uma vez por semana usando um microscópio de fluorescência. Consulte a Seção 2 abaixo para obter detalhes sobre o procedimento de triagem.

2. Colheita de células de leucemia marcadas com fluorescência

  1. Aproximadamente 21-28 dias após o transplante, anestesiar o peixe-zebra CG1 adulto adicionando 200 μL (4-5 gotas) de 4 mg/mL de anestésico a 25 mL de água do sistema de peixes em uma placa de Petri.
  2. Examine o peixe-zebra CG1 quanto à carga de leucemia, avaliando a porcentagem de células de leucemia marcadas com GFP no animal com um microscópio epifluorescente, usando o filtro apropriado para detectar a fluorescência GFP. A leucemia positiva para GFP está pronta para ser colhida se tiver se espalhado por >70% do animal.
  3. Eutanasiar o animal adicionando 1 mL de anestésico 4 mg/mL em uma placa de Petri contendo 9 mL de água do sistema de peixes. Permita que todos os sinais de vida cessem; Por exemplo, observe o peixe quanto à cessação do movimento opercular (~ 5 min).
  4. Mova o peixe-zebra para uma nova placa de Petri e adicione 1 mL de meio de peixe para servir como um tampão para as células. Usando uma nova lâmina de barbear, primeiro decapite o peixe-zebra e, em seguida, macere o tecido usando a mesma lâmina de barbear. Pipet para cima e para baixo para desalojar grandes aglomerados de células.
  5. Passe as células através de um filtro de células de 40 μm para um tubo cônico de 50 mL para dissociar em uma suspensão de célula única. Mantenha as células no gelo.

3. Otimização da concentração do corante de proliferação celular (CellTrace Far Red) para coloração e viabilidade celular do peixe-zebra

NOTA: Para este protocolo, e uma vez que as células tumorais são marcadas com GFP, usamos um corante de proliferação de glóbulos vermelhos distantes (CellTrace Far Red) para evitar sobreposição espectral, que será referido como CT-FR.

  1. Prepare uma solução de 1 mM do corante fluorescente imediatamente antes de usar, adicionando o volume apropriado de DMSO de acordo com as recomendações do fabricante. Ter soluções de trabalho de 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM e 0,01 mM; Diluir conforme necessário em meio de peixe para testar a viabilidade celular após a coloração.
  2. Conte as células e colete 1 × 106 células em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Centrifugar a 2.500 × g a 4 °C durante 5 min. Remova o líquido e ressuspenda as células em 1 mL de 0,9x PBS.
  4. Divida a suspensão celular entre quatro tubos de 250 μL cada para tratamento com CT-FR.
  5. Adicione 250 μL de 0,9x PBS para aumentar o volume para 500 μL cada um com aproximadamente 250.000 células/tubo.
  6. Adicione as quantidades necessárias das soluções de trabalho descritas acima a cada um dos quatro tubos para atingir as seguintes concentrações finais de 1 μM, 0,5 μM, 0,1 μM e 0,05 μM. Incubar por 20 min a 37 ° C, protegido da luz.
  7. Pulverize as células girando a 2.500 × g por 5 min em temperatura ambiente. Remova o líquido e lave as células com 500 μL de meio de peixe para remover o excesso de corante.
  8. Pellet novamente, remova o líquido e ressuspenda em 25 μL de meio de peixe. Use 1 μL para contar as células em uma diluição de 1:10 em 50% de azul de tripano.
  9. Examine as células ao microscópio quanto à viabilidade celular; as células vivas não reterão o azul de Trypan e parecerão brilhantes ao microscópio, enquanto as células mortas absorverão o corante e parecerão escuras. Examine as células sob o canal de fluorescência apropriado primeiro para identificar células tumorais e, em seguida, use o canal de campo claro para avaliar a viabilidade celular.
  10. Selecione a concentração que resulta em uma coloração bem-sucedida, mantendo a viabilidade celular (>90% de células negativas para azul de tripano).
    NOTA: Para as células T-ALL de peixe-zebra testadas neste experimento, a concentração de 1 μM foi usada para uma coloração bem-sucedida e >90% da viabilidade celular.

4. Propagação de células de peixe-zebra T-ALL coradas com CT-FR in vivo

  1. Usando a concentração otimizada de CT-FR da Seção 3, core as células do peixe-zebra. Deixe algumas células tumorais sem coloração para a geração do tumor T-ALL marcado com GFP, como um controle positivo para GFP durante a classificação FACS. Dilua as células coradas e não coradas para 50.000 células/5 μL para transplante.
  2. Anestesiar o peixe-zebra CG1 adulto adicionando 200 μL de anestésico 4 mg/mL a 25 mL de água do sistema de peixes em uma placa de Petri.
  3. Injectar 5 μL da suspensão celular na cavidade IP do peixe-zebra, conforme descrito na secção 1, tanto para as células coradas como para as não coradas. Injete 5-6 peixes-zebra por grupo para contabilizar a mortalidade potencial após a injeção.
  4. Examinar os animais por microscopia fluorescente sob sedação 2x semanalmente para o desenvolvimento de leucemia.
    NOTA: Após ~ 10-14 dias, a leucemia deve ocupar cerca de 30-40% deste corpo. Planeje a colheita da leucemia e a subsequente classificação dentro desse prazo. Esperar que o tumor se expanda para um tamanho grande pode resultar em uma maior diluição do corante de células fluorescentes e dificuldade em detectar seu sinal. Considere a otimização do tempo de colheita do tumor para o modelo de tumor escolhido. Além disso, o monitoramento mais frequente do tumor é recomendado aqui para garantir a captura do tamanho desejado do tumor.

5. Preparação para a classificação de células T-ALL de peixe-zebra coradas com CT-FR

  1. Prepare os seguintes controles para a classificação de células: Sem controle de cor (suspensão de célula única, não corada, não transgênica, de um peixe-zebra do tipo selvagem), células T-ALL marcadas com GFP e células de peixe-zebra CT-FR WT recém-coradas (para definir um limite máximo de sinal vermelho distante).
  2. Preparação de controles não corados e CT-FR
    1. Colha células de peixes do tipo selvagem (WT) sacrificando um peixe-zebra CG1 não transplantado, adicionando 1 mL de anestésico 4 mg / mL em uma placa de Petri contendo 9 mL de água do sistema de peixes.
    2. Mova o peixe-zebra para uma nova placa de Petri e adicione 1 mL de meio de peixe para servir como um tampão para as células. Use uma nova lâmina de barbear para primeiro decapitar e depois macerar o peixe-zebra usando a mesma lâmina de barbear; pipetar para cima e para baixo para desalojar grandes aglomerados de células.
    3. Passe as células através de um filtro de células de 40 μm para um tubo cônico de 50 mL para dissociar em uma suspensão de célula única. Mantenha as células no gelo.
    4. Para o controle CT-FR, transfira 250.000 células WT para um tubo de microcentrífuga e peletize as células por centrifugação a 2.500 × g por 5 min em temperatura ambiente. Remova o meio de peixe e adicione 500 μL de 0,9x PBS + 1% FBS.
    5. Adicione 0,5 μL da solução estoque de corante CT-FR de 1 mM para uma concentração final de 1 μM. Pipete suavemente com 1.000 μL de pipeta para misturar. Incubar a 37 °C durante 20 min, protegido da luz.
    6. Remova o líquido e lave as células com 500 μL de meio de peixe para remover o excesso de corante.
    7. Pulverize as células por centrifugação novamente, remova o líquido e ressuspenda as células em 500 μL de 0,9x PBS + 1% FBS e passe por uma tampa de filtro de 35 μm em um tubo FACS. Mantenha no gelo.
  3. Preparando a placa doadora
    NOTA: A placa doadora é uma placa de fundo em V de 96 poços na qual as células T-ALL coradas com CT-FR do peixe-zebra transplantado serão classificadas. Cada poço da placa contém 5.000 células WT CG1 não coradas em 50 μL de meio de peixe para servir como um transportador para ajudar a peletar as células classificadas nas etapas subsequentes.
    1. Conte 500.000 células WT CG1 e transfira-as para um tubo cônico de 15 mL.
    2. Dilua esse estoque de células para 100 células / μL adicionando 5 mL de meio de peixe.
    3. Dispense 50 μL da suspensão celular em cada poço da placa de 96 poços. Misture o tubo de estoque de suspensão celular após cada linha para manter a homogeneidade da suspensão celular. Manter a placa a 4 °C até separar.
  4. Preparando as amostras de peixes transplantados
    1. Selecione peixes transplantados com 30-40% de carga T-ALL. Colete peixes transplantados com células coradas com CT-FR e células tumorais GFP não coradas.
    2. Colher células conforme descrito na Seção 2.
      NOTA: Como se espera que as células retentoras de corante estejam presentes em baixa abundância, prepare-se para classificar um grande número de células da amostra CT-FR GFP.
    3. Diluir na concentração apropriada para classificação ~ 3-5 × 106 células / mL em 0,9x PBS + 1% FBS e passar por uma tampa de filtro de 35 μm em um tubo FACS. Adicione DAPI (1 mg / mL) na diluição de 1:1.000 como um corante vital para excluir células mortas. Mantenha no gelo.
    4. Para as células tumorais GFP não coradas, transfira 250.000 células para um tubo de microcentrífuga e pellet a 2.500 × g por 5 min em temperatura ambiente. Remova o meio de peixe, adicione 500 μL de PBS e passe por uma tampa de filtro de 35 μm em um tubo FACS. Mantenha no gelo.

6. Classificação

NOTA: Mantenha todos os tubos e a placa doadora no gelo o tempo todo, exceto quando usados para triagem.

  1. Para classificar parâmetros e portas, comece aplicando o gating de dispersão direta e lateral para identificar as células de interesse com base em seu tamanho e eliminar os detritos celulares. Em seguida, use a altura de dispersão direta versus a área de dispersão direta para excluir células duplicadas e manter apenas singlets. Finalmente, use os controles sem cor e de cor única para desenhar os quadrantes para identificar populações de células positivas para GFP e CT-FR.
    NOTA: Espera-se que o controle CT-FR seja muito mais brilhante do que as amostras para triagem, uma vez que a coloração para o controle foi feita fresca, sem divisões celulares; espera-se que as células das amostras CT-FR GFP apareçam na extremidade inferior da porta positiva CT-FR.
  2. Classifique o número de células a serem transplantadas para cada peixe em um poço da placa doadora.
    NOTA: Para este experimento, usamos um ensaio de diluição limitante para estimar a frequência de células-tronco de leucemia em CT-FR High e CT-FR Low. Este ensaio utilizou uma dose de 25 células, transplantadas em 3 animais, e uma dose de 10 células, transplantadas em 10 animais. Um ensaio típico de diluição limitante usando o T-ALL derivado de peixe-zebra 2: Myc envolveria um grupo com um número maior de células (500 ou 1.000), uma vez que a frequência de LSC neste modelo é estimada em 1 LSC em centenas de células. No entanto, neste ensaio, estamos usando um dos clones T-ALL descritos anteriormente por Blackburn et al.15. A frequência de LSC na amostra usada aqui é ~ 1 LSC em dezenas de células; Prevemos que a leucemia seja detectada em animais transplantados no grupo de 25 células. Ao otimizar este ensaio para o seu modelo de doença, deve-se tomar cuidado ao selecionar o grupo de maior número de células para garantir o enxerto do tumor.
  3. Após a classificação, mantenha o prato no gelo até que esteja pronto para o transplante.
    NOTA: Os procedimentos de classificação podem ser estressantes e afetar a viabilidade celular. Antes de executar o experimento de diluição limitante real, um experimento piloto de classificação foi feito. As células selecionadas foram transplantadas e o desenvolvimento da leucemia foi monitorado para determinar se a classificação era prejudicial à viabilidade celular. Alternativamente, a viabilidade celular pode ser avaliada colorindo as células selecionadas com azul de tripano e examinando-as ao microscópio antes do transplante.

7. Transplante de células classificadas na diluição limitante e no rastreamento do início do tumor

  1. Gire a placa usando uma grande centrífuga de bancada a 2.500 × g a 4 °C.
  2. Remova cuidadosamente 45 μL do sobrenadante de cada poço, deixando 5 μL de líquido para trás e evitando tocar no pellet de célula no fundo do poço.
  3. Ressuspenda as células com uma pipeta de 20 μL. Ressuspenda 2-3 poços com a pipeta e, em seguida, usando a seringa de microlitro Hamilton, injete as suspensões de células de cada poço no número desejado de peixe-zebra CG1 via transplante IP. Em seguida, ressuspenda as células no próximo grupo de poços para evitar o reassentamento das células.
  4. Examine o peixe-zebra por microscopia de fluorescência sob sedação uma vez por semana para o desenvolvimento de T-ALL por pelo menos 6 semanas.

8. Determinação da frequência de células-tronco leucêmicas

  1. Registre o número de animais positivos por dose de célula e grupo de tratamento 6 semanas após o transplante, considerando os animais com qualquer quantidade de sinal de GFP como positivos. Considere que os animais têm carga significativa de leucemia quando o sinal GFP ocupa >50% do corpo.
  2. Use o software estatístico ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) baseado na web (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)19 para calcular a frequência de LSCs dentro de cada população de células.
    NOTA: Uma ilustração esquemática do fluxo de trabalho é fornecida na Figura 1.

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Figura 1: Fluxo de trabalho para o uso da coloração de rastreamento celular para isolar células quiescentes no modelo T-ALL de peixe-zebra. Ilustração esquemática da coloração de células T-ALL de peixe-zebra com a coloração de proliferação celular, propagação em um peixe-zebra CG1 (painel superior) e classificação de células com base na retenção da coloração de proliferação celular (painel do meio). As células coletadas foram usadas para um ensaio de diluição limitante para determinar a frequência de LSCs (painel inferior). Abreviaturas: LLA-T = leucemia linfoblástica aguda de células T; LSCs = células-tronco leucêmicas; CT-FR = CellTrace Vermelho Distante; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Seguimos o protocolo descrito acima para classificar as células que retiveram o corante de proliferação celular, CT-FR, e as usamos para um ensaio de diluição limitante (LDA) para estimar a frequência de LSC nas populações CT-FR High e CT-FR Low. Para definir o gating para o experimento de citometria de fluxo, usamos um controle sem fluoróforo (sem cor), além de controles de cor única (Figura 2A). Esses quadrantes foram usados para identificar populações positivas e negativas para FITC e PE para a instalação dos portões de triagem. O controle positivo de cor única CT-FR foi preparado no mesmo dia da triagem, colorindo células WT de um peixe-zebra não transplantado e, portanto, espera-se que a intensidade do sinal seja muito maior do que o sinal das células propagadas na amostra.

No GPF T-ALL corado com CT-FR (Figura 2B), as células que apareceram no quadrante superior direito em uma baixa frequência de 0,13% foram consideradas CT-FR Alta, e uma porta de classificação rotulada como "CT-FR alta" foi colocada neste quadrante. Outra porta foi criada no quadrante inferior direito para coletar células de leucemia que são CT-FR Low. Como as células CT-FR High existiam em baixa abundância na amostra do tumor, um grande número de células (~ 2,5 × 106) foi classificado para coletar o número necessário de células para o experimento de diluição limitante.

Após o transplante do peixe-zebra CG1 com as células selecionadas para o LDA, o peixe-zebra foi monitorado por 6 semanas. As células do CT-FR High tiveram uma frequência de LSC quatro vezes maior em comparação com a população de células CT-FR Low (p = 0,0134) (Figura 3A). Imagens representativas de animais 28 dias após o transplante são mostradas na (Figura 3B). No grupo CT-FR High, dose de 10 células, 8 de 9 animais (89%) dos animais desenvolveram leucemia, em comparação com 2 de 10 (20%) no grupo CT-FR Low (Figura 3A). Os animais do grupo CT-FR High apresentaram uma latência significativamente menor para leucemia (p = 0,0014) (Figura 3C). Finalmente, os animais do CT-FR High tiveram uma sobrevida global significativamente menor (p = 0,0408) (Figura 3D); na semana 6, 70% dos animais CT-FR Low estavam vivos em comparação com apenas 10% dos animais CT-FR High. Esses resultados demonstram o enriquecimento de LSCs auto-renovados dentro da população de células quiescentes e de divisão lenta no modelo T-ALL de peixe-zebra acionado por rag2:Myc e a utilização da coloração de proliferação celular para isolar essa população.

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Figura 2: Classificação de células usando citometria de fluxo. (A) Gráficos FACS de células WT recém-coradas com CT-FR e células T-ALL marcadas com GFP foram usados para criar as portas para classificação CT-FR Células GFP+ T-LLA. (B) Exemplo representativo das células GFP + T-ALL coradas com CT-FR propagadas. As células do quadrante superior direito foram consideradas CT-FR Alto e as células do quadrante inferior direito foram consideradas CT-FR Baixo. Abreviaturas: LLA-T = leucemia linfoblástica aguda de células T; CT-FR = CellTrace Vermelho Distante; GFP = proteína fluorescente verde; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina; FACS = classificação de células ativadas por fluorescência; WT = tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Frequência significativamente maior de LSC em células com alta retenção da coloração de proliferação celular. (A) Dados do ensaio de diluição limitante informando o número de animais positivos para leucemia pós-transplante com duas doses crescentes de células (10 e 25 células). A frequência calculada do LSC e o intervalo de confiança de 95% são declarados (p = 0,0134). (B) Imagens representativas de animais após 28 dias do transplante; barra de escala = 10 mm. (C) Latência para leucemia significativa considerada como o tempo necessário para >50% do animal se tornar GFP-positivo, representando carga significativa de leucemia. (D) Curva de sobrevivência do animal transplantado com 10 células. Abreviaturas: LSCs = células-tronco leucêmicas; CT-FR = CellTrace Vermelho Distante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os LSCs são conhecidos por serem resistentes aos tratamentos convencionais de quimioterapia antiproliferativa, e encontrar terapias direcionadas contra essas células é uma grande promessa na redução da ocorrência de recidiva e na melhoria do prognóstico do paciente20. Pesquisas anteriores descreveram o uso de colorações de proliferação de células fluorescentes para identificar uma pequena população de células quiescentes associadas à resistência a drogas e stemness em modelos T-ALL PDX13. Neste trabalho, descrevemos o uso de uma coloração de proliferação celular semelhante para resolver células de divisão lenta ou quiescentes em um modelo de peixe-zebra de T-ALL. Usamos essa ferramenta para descrever o enriquecimento de LSCs nas células com maior retenção da coloração de proliferação celular. A extensão dessas investigações ao peixe-zebra oferece inúmeras vantagens. O peixe-zebra é altamente fecundo; Cada par de acasalamento pode gerar centenas de descendentes a cada semana, alimentando o transplante e limitando os estudos de diluição que requerem um grande número de animais 15,17,21. Além disso, o peixe-zebra é muito conveniente para imagens in vivo, permitindo a triagem rápida de animais positivos por microscopia de fluorescência simples16. Assim, este protocolo pode servir como base para investigação adicional de células quiescentes no modelo T-ALL de peixe-zebra.

Aqui descrevemos o uso de clones T-ALL com alta frequência de LSCs que foram previamente gerados em peixe-zebra CG115, portanto, as células congeladas foram simplesmente descongeladas e propagadas para uso. Alternativamente, a LLA-T acionada por rag2:Myc pode ser gerada por microinjeção de DNA de embriões de peixe-zebra, triagem de animais que desenvolvem LLA-T e colheita da leucemia de peixe-zebra positivo, conforme descrito anteriormente17. O uso do peixe-zebra singênico também oferece inúmeras vantagens para esse tipo de pesquisa. Como os animais são geneticamente idênticos, as células transplantadas podem ser enxertadas de forma robusta no hospedeiro sem a necessidade de se adaptar a um novo microambiente, permitindo uma estimativa precisa da frequência de LSC 15,17,22.

Como alternativa ao uso de animais singênicos, este protocolo pode ser seguido usando uma cepa de peixe-zebra do tipo selvagem que foi submetida a ablação imunológica química ou mediada por radiação. Se estiver usando animais imunoablados, deve-se tomar cuidado para otimizar o ensaio de diluição limitante, pois mais células podem ser necessárias para o enxerto bem-sucedido no transplante alogênico. Além disso, devido à recuperação do sistema imunológico após 21 dias, provavelmente será necessária uma duração mais curta de observação17. Este protocolo também pode ser estendido ao xenotransplante de células humanas. O peixe-zebra emergiu como um modelo eficiente e econômico para xenotransplantes de câncer complementares aos seus homólogos de camundongos16. O peixe-zebra prkdc−/−, il2rga−/− adulto imunodeficiente tem sido usado para enxertar com sucesso células humanas a 37 °C por até 60 dias23. Com este modelo, em vez de se propagar e ter as células coradas divididas in vivo como descrito aqui, as células humanas podem ser coradas e divididas in vitro e depois classificadas e transplantadas para um peixe-zebra prkdc−/−, il2rga−/− para estudos in vivo . Várias limitações precisam ser consideradas ao usar o peixe-zebra como modelo de xenoenxerto. Por exemplo, o peixe-zebra deve ser adaptado para sobreviver a 37 °C. Além disso, os transplantes ortotópicos podem não ser possíveis para certos tipos de câncer devido à ausência de certos órgãos no peixe-zebra, como pulmão e mama16.

Em conclusão, o uso das colorações de proliferação celular no modelo T-ALL de peixe-zebra fornece um caminho promissor para a investigação de LSCs quiescentes e seus papéis no desenvolvimento de doenças e resistência ao tratamento. Aproveitando as vantagens do peixe-zebra CG1, incluindo sua relação custo-benefício e homogeneidade genética, este protocolo oferece uma plataforma robusta para a compreensão da biologia do LSC em T-ALL. O uso do modelo de peixe-zebra pode complementar os modelos de camundongos e PDX para permitir o desenvolvimento de terapias otimizadas e direcionadas que, em última análise, melhorarão o prognóstico de pacientes com LLA-T.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

O financiamento para esta pesquisa foi fornecido pelo Instituto Nacional do Câncer (R37CA227656 ao JSB). Esta pesquisa também foi apoiada pelos Recursos Compartilhados de Citometria de Fluxo e Monitoramento Imunológico do Centro de Câncer Markey da Universidade de Kentucky (P30CA177558).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Micro-seringa de 26 G/2"Hamilton87930NA
35 µ m tampa do filtro FACS tubosFalcon352235NA
40 µ filtro de células mCELLTREAT229482NA
96 poços rodapé placa PCRThermo Fisher ScientificAB0800NA
Classificador de célulasSony BiotechnologySY3200NA
CellTrace Far RedThermo Fisher ScientificC34564NA
Tubos cônicosVWR10026-078NA
DAPIThermo Fisher Scientific62248NA
DMSOSigma-AldrichD4818NA
Dulbecco'sSolução salina tamponada com fosfato (PBS)Caisson Labs22110001NA
Microscópio estereoscópico de epifluorescênciaNikonSMZ25NA
Soro fetal bovino (FBS)Sigma-Aldrich12306CNA
Sistema de peixes águaN/AN/A0,03-0,05% de salinidade, pH 6,5-8, tamponado com bicarbonato de sódio
Tubos de microcentrífugaThermo Fisher ScientificC2171NA
MS-222PentaireTRS-1mesilato de tricaína, um anestésico
Placas de PetriCorning07-202-011NA
Lâminas de barbearAmerican Line66-0089NA
Trypan BlueThermo Fisher ScientificT10282NA

Referências

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