Artigo de método

Preparação de um modelo modificado para reperfusão de oclusão da artéria cerebral média

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DOI:

10.3791/67060

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31 de maio de 2024

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1School of Medicine, Foshan University, 2School of Medicine, Shaanxi University of International Trade and Commerce

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o processo de preparação para a reperfusão da oclusão da artéria cerebral média através da artéria carótida comum.

Resumo

O modelo de reperfusão de oclusão da artéria cerebral média (MCAO/R) é crucial para a compreensão dos mecanismos patológicos do AVC e para o desenvolvimento de medicamentos. No entanto, entre os métodos de modelagem comumente usados, o método de Koizumi frequentemente enfrenta escrutínio devido à sua ligadura da artéria carótida comum (CCA) e sua incapacidade de alcançar reperfusão adequada. Da mesma forma, o método de Longa tem sido criticado por desconectar e ligar a artéria carótida externa (ECA). Este estudo tem como objetivo apresentar um método de preparo de modelo modificado que preserve a integridade da ECA, envolva a inserção de uma sutura de náilon monofilamentar através da CCA, reparando a incisão ligada da CCA e mantendo a reperfusão da CCA. A reperfusão do fluxo sanguíneo foi confirmada por meio de imagens de fluxo de manchas a laser. Métodos de avaliação como a escala de Longa, Modified Neurological Severity Score, coloração com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) e marcação de imunofluorescência de neurônios demonstraram que essa abordagem poderia induzir danos estáveis ao nervo isquêmico. Este protocolo de modelo MCAO/R modificado é simples e estável, fornecendo orientação valiosa para os profissionais no campo da isquemia cerebral.

Introdução

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, o AVC permaneceu como a segunda principal causa de morte em todo o mundo na última década, com alta taxa de incidência, alta mortalidade e alta taxa de incapacidade 1,2. À medida que a população global envelhece, espera-se que a incidência de AVC aumente nos países em desenvolvimento, tornando-se potencialmente a principal causa de morte prematura e incapacidade em adultos. Além disso, há uma tendência de ocorrência de acidentes vasculares cerebrais em uma idade mais jovem3. A perda da força de trabalho após um AVC também sobrecarrega as famílias e a sociedade4. Portanto, o desenvolvimento de tratamentos seguros e eficazes representa um grande desafio na pesquisa do AVC.

Os modelos animais servem como ferramentas cruciais para estudar a prevenção e o tratamento de doenças humanas. A tradução bem-sucedida das estratégias de tratamento do AVC depende da reprodutibilidade e confiabilidade dos modelos animais de AVC 5,6. A artéria cerebral média (ACM) é um local comum para AVC clínico, tornando o modelo MCAO o modelo mais próximo do AVC isquêmico humano. O modelo MCAO, elaborado pelo método de sutura, tem sido favorecido pelos pesquisadores devido a vantagens como a ausência de craniotomia e o fácil controle do tempo isquêmico. Tem sido utilizado em mais de 40% dos experimentos neuroprotetores7. No entanto, apesar de suas inúmeras vantagens, os detalhes operacionais desse modelo permanecem um tópico controverso para muitos pesquisadores.

Para o modelo de oclusão da artéria cerebral média induzida por sutura (MCAO), a reperfusão ocorre pela retirada da sutura. Atualmente, dois métodos principais são usados para a inserção da sutura: o método de Koizumi8 e o método de Longa9. No método de Koizumi, a sutura entra na artéria carótida interna (ACI) principalmente através da incisão da artéria carótida comum (ACC), enquanto no método de Longa, passa pela artéria carótida externa (ACE) cortada para a ACI. Durante a reperfusão, o método de Koizumi requer a ligação permanente da incisão da ACC e depende do círculo de Willis para a reperfusão10. No entanto, alguns estudos sugerem que a reperfusão efetiva não pode ser alcançada apenas por meio do suprimento compensatório do círculo de Willis após a perda do suprimento de CCA. Além disso, o círculo de Willis exibe alta variabilidade anatômica, especialmente em camundongos C57Bl/6, aumentando a variabilidade do infarto e reduzindo a confiabilidade dos dados experimentais. Consequentemente, esse método tem sido cada vez mais questionado por pesquisadores11.

O método de Longa envolve a inserção de uma sutura através da ACE cortada e, em seguida, a ligação permanente da artéria carótida interna (ACI) assim que a sutura é retirada. Isso preserva a permeabilidade da CCA, permitindo a perfusão sanguínea de até 100% dos valores basais. No entanto, esse método requer a separação da artéria carótida externa e pequenos ramos arteriais, cortando-os ou eletrocoagulando-os, tornando o procedimento desafiador. Também interrompe a estrutura completa do fluxo sanguíneo do cérebro, que difere do estado clínicodo paciente 12. É importante ressaltar que estudos indicam que o corte ou ligadura da ECA pode causar lesões isquêmicas nos músculos que controlam a mastigação e a deglutição, afetando a dieta animal e levando à morte pós-operatória do animal e danos sensoriais e motores graves em ratos13,14.

Portanto, um método de preparação de modelo modificado é urgentemente necessário para resolver esses problemas. Este estudo apresenta um método de modelagem MCAO modificado que repara a incisão de inserção do CCA e alcança uma reperfusão eficaz. O procedimento é simples, prático e viável, induzindo danos neurológicos significativos e lesões replicáveis de infarto e fornecendo orientações valiosas para pesquisadores de AVC.

Protocolo

O protocolo experimental foi conduzido em conformidade com as diretrizes do Comitê de Uso e Uso de Animais de Laboratório e Cuidados Institucionais com Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (número de registro: 2019-DL-002). Todos os dados de pesquisa com animais foram documentados seguindo as diretrizes ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). Ratos machos da raça Sprague Dawley (SD) pesando 250 g ± 20 g e com idade entre 6 e 8 semanas foram utilizados para este estudo. As especificidades sobre os animais, reagentes e equipamentos empregados estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

  1. Induzir e manter anestesia profunda em ratos usando Zoletil 50 (50mg/kg, IM) e Cloridrato de Xilazina (40mg/kg, IP). Certifique-se de que a temperatura corporal seja mantida em 37 ± 0.5 °C usando uma sonda retal conectada a uma almofada de aquecimento durante todo o procedimento cirúrgico. Aplique pomada veterinária nos olhos do rato para evitar que sequem.
  2. Raspe o cabelo da cabeça e pescoço dos ratos. Use creme depilatório para remover o pelo da cabeça e pescoço e, em seguida, lave o creme com soro fisiológico. Desinfetar a pele no local da cirurgia aplicando etanol e iodopovidona três vezes com bolas de algodão estéreis.
  3. Faça uma incisão de 2 cm no meio da cabeça do rato ao longo da direção da sutura sagital usando um bisturi e remova cuidadosamente os músculos que cobrem o crânio.
  4. Afine o crânio no lado isquêmico do rato usando uma broca de crânio. Use solução salina normal para resfriar e remover detritos durante o processo de moagem. Registre o fluxo sanguíneo basal dos ratos usando imagens de contraste de manchas a laser (LSCI).
  5. Aplique etanol e iodopovidona três vezes na pele do pescoço usando bolas de algodão estéreis. Faça uma incisão de 2 cm ao longo da linha média do pescoço usando uma lâmina cirúrgica. Use afastadores para puxar lateralmente a pele e as glândulas salivares, expondo os músculos esternocleidomastóideo e cervical.
  6. Separe os músculos esternocleidomastóideo e cervical para expor o território carotídeo. Identifique a anatomia vascular da artéria carótida comum (ACC), da artéria carótida interna (ACI) e da artéria carótida externa (ACE). Com base na anatomia vascular, separe a ACC, bem como a ECA derivada da CCA e a ICA15.
    NOTA: A estrutura anatômica do rato indica que a região CCA é coberta principalmente pelos músculos esternocleidomastóideo e cervical, com a ACI e a ECA derivadas da CCA. Depois que a separação expõe o CCA, um garfo em forma de Y pode ser visto ao longo do CCA, representando o ICA e o ECA. Tenha cuidado para não danificar o nervo vago, que corre paralelo ao CCA.

2. Oclusão do MCA

  1. Dê um nó facilmente desembaraçado sobre a artéria carótida externa (ECA) e a artéria carótida comum (CCA) usando um fio de seda 3-0 para bloquear temporariamente o fluxo sanguíneo. Posicione um clipe de vaso no CCA a aproximadamente 0.5 cm do primeiro nó.
    1. Pinte a agulha de uma seringa de 5 mL de preto. Faça um pequeno furo no CCA usando a agulha tingida de preto e marque os orifícios em preto.
  2. Insira a sutura de náilon monofilamento no CCA através da marca preta. Abra o clipe vascular e guie o fio de náilon na Artéria Carótida Interna (ACI) até que ele pare com leve resistência. Aperte o segundo nó com segurança para manter a sutura de náilon monofilamento no lugar dentro da artéria, evitando o deslocamento da posição de bloqueio.
  3. Observe o tempo de isquemia neste ponto e meça o valor do fluxo sanguíneo no lado isquêmico usando LSCI. Administre gotas de bupivacaína na ferida do pescoço para analgesia e fechamento da ferida. Remova a máscara de anestesia e permita que o rato se recupere.
    NOTA: Se a sutura de náilon monofilamentar tiver dificuldade em entrar na ACI, retraia-a ligeiramente e tente inserir novamente.

3. Reperfusão de MCAO

  1. Após 90 min de isquemia, reanestesiar os ratos com isoflurano. Meça o fluxo sanguíneo cerebral do lado isquêmico usando LSCI e certifique-se de que a sutura de náilon monofilamentar não tenha se deslocado.
  2. Desatar os nós na artéria carótida externa (ECA) para permitir a reperfusão sanguínea. Solte o nó na artéria carótida comum (CCA), prenda a sutura do monofilamento e retire a sutura. Aplique um clipe vascular antes da sutura de monofilamento fixa para evitar sangramento.
  3. Substitua o primeiro nó CCA por um clipe vascular. Use uma pinça para girar a incisão do vaso lateralmente (Figura 1). Prenda a incisão com uma pinça e ligue-a com fio 6-0 para reparar a incisão. Remova o clipe vascular, verifique se há vazamentos e confirme a reperfusão completa (Vídeo 1).
    NOTA: Realize a ligadura para reparar a incisão para evitar o pinçamento excessivo do vaso, o que pode levar à estenose CCA.
  4. Registre os valores do fluxo sanguíneo cortical cerebral usando LSCI após a ligadura da incisão para confirmar a reperfusão bem-sucedida. Feche a incisão cervical com suturas e administre 1,00,000 unidades de penicilina e 2 mL de solução salina para prevenir infecção e desidratação.
  5. Mantenha o calor até que os ratos recuperem a consciência. Ofereça alimentos macios pós-operatórios e monitore os sinais vitais dos animais.

4. Avaliação da função nervosa e lesão isquêmica cerebral

  1. Uma vez que os ratos tenham despertado completamente, sua função neural será avaliada por pesquisadores que desconhecem o agrupamento de animais. Utilize a escala de pontuação de Longa (Tabela 1) e a escala de pontuação de gravidade neurológica modificada (mNSS) (Tabela 2) para avaliar a função neurológica de todos os ratos.
  2. Após 24 h pós-operatório, eutanasiar os ratos sob anestesia induzida por isoflurano (isoflurano a 4% a 4 L/min de oxigênio) via luxação cervical16 (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Enxágue o cérebro com água gelada para remover o sangue restante.
  3. Divida o tecido cerebral em 5 seções e core-as com TTC. Capture imagens de ambos os lados das fatias de tecido cerebral, meça a área isquêmica da frente e de trás usando o software Image J e calcule a taxa de infarto usando a seguinte fórmula:
    figure-protocol-1
    NOTA: S1 e S2 representam a área do infarto dos lados proximal do prosencéfalo e do tronco encefálico proximal das fatias cerebrais, respectivamente. A área do infarto de cada fatia do cérebro é corrigida usando a fórmula de Swanson, onde h representa a espessura da fatia do cérebro. Essa fórmula, previamente delineada pelo autor em pesquisas anteriores17, permite um cálculo mais preciso do tamanho da lesão do infarto.
  4. Analise os dados usando software estatístico e gráfico para avaliar a taxa de sucesso e a estabilidade do modelo.
  5. Empregue o método de imunofluorescência para marcar neurônios corticais em ratos, validando ainda mais o dano neuronal causado por este método. Após 24 h de isquemia-reperfusão em ratos, foi realizada perfusão cardíaca com PBS pré-resfriado para obtenção de tecido cerebral.
  6. Incorpore e congele o tecido cerebral em seções. Use anticorpos neuronais, como o marcador neuronal imaturo Doublecortin (DCX)18, o marcador de núcleo neuronal Neuronal Nuclei (NeuN)18 e o marcador dendrítico de neurônios Microtubule-associated protein-2 (MAP-2)19. Observe a expressão de neurônios isquêmicos usando microscopia confocal a laser.

Resultados

A imagem de fluxo de manchas a laser demonstrou que, antes da oclusão da sutura de náilon monofilamentar, havia fluxo sanguíneo abundante na área da artéria cerebral média (ACM), e os valores basais de fluxo sanguíneo dos ratos foram registrados. Após a oclusão da ACM, o valor do fluxo sanguíneo no lado isquêmico do cérebro diminuiu rapidamente. Antes de retirar a sutura, os valores do fluxo sanguíneo no lado isquêmico foram verificados novamente para confirmar se a sutura estava ocluindo a ACM. Os resultados indicaram apenas uma ligeira mudança no fluxo sanguíneo. Ao retirar a sutura, a perfusão do fluxo sanguíneo se recuperou rapidamente (Figura 2). O vídeo 1 também mostra o pulso de enchimento robusto da artéria carótida comum, sugerindo que esse método pode alcançar perfusão de fluxo sanguíneo suficiente pós-isquemia cerebral.

Os resultados dos escores de função neurológica (Figura 3) revelaram que, em comparação com o grupo de cirurgia simulada, o escore de Longa do grupo modelo foi de 1,80 ± 0,27 (p < 0,05) e o escore mNSS foi de 7,4 ± 0,89 (p < 0,05). Esses escores indicam que o modelo de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média (MCAO/R) preparado usando esse método levou a danos neurológicos significativos. O vídeo 2 demonstra o comportamento característico dos ratos do grupo modelo girando enquanto engatinham, uma marca registrada de lesão induzida por AVC, confirmando ainda mais a validade desse método.

A coloração TTC demonstrou que a taxa de infarto nos ratos do grupo modelo foi de 5,58 ± 1,79 (p < 0,05), com a área do infarto afetando principalmente o estriado e o córtex, e o tamanho do infarto permaneceu relativamente estável. A coloração por imunofluorescência ilustrou a perda de neurônios corticais após isquemia-reperfusão (Figura 4). Esses achados indicam coletivamente que este método pode estabelecer um modelo MCAO/R estável adequado para avaliar a eficácia pré-clínica do medicamento.

figure-results-1
Figura 1: Diagrama esquemático da ligação do conector do CCA. O círculo amarelo denota o ponto de inserção e o local de ligadura do plugue do fio, enquanto a posição de ligadura (seta amarela) indica onde a artéria carótida comum (ACC) foi ligada ao fio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagens do fluxo sanguíneo com manchas de laser nos momentos de ratos no lado isquêmico pré, pós-oclusão e pré e pós-reperfusão. (A) Imagens do fluxo sanguíneo cerebral de ratos, onde as áreas azuis indicam valores baixos de fluxo sanguíneo e as áreas vermelhas indicam valores altos de fluxo sanguíneo. Barras da escala: 200 mm. (B) Alterações na isquemia-reperfusão cerebral em ratos, apresentadas como média ± desvio padrão, com tamanho amostral de n = 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Resultados dos escores de área de infarto e função neurológica no grupo simulado e no grupo modelo. (A) A coloração TTC representou as áreas infartadas do tecido cerebral tanto no grupo simulado quanto no grupo modelo, com áreas brancas indicando tecido infartado e áreas vermelhas indicando tecido normal. (B) São apresentados os resultados quantitativos dos escores Longa e mNSS, bem como a taxa de infarto. A significância estatística em relação ao grupo sham é denotada por *p < 0,05, com tamanho amostral de n = 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Resultados da lesão do neurônio cortical no grupo simulado e no grupo modelo. Expressão de NeuN (A), DCX (B) e MAP-2 (C) em neurônios corticais. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Diagrama de oclusão e reperfusão da ACM por Koizumi, Longa e o método modificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Testes de motores/forte>Pontos
Levantando rato pela cauda3
1 Flexão do membro anterior
1 Flexão do membro posterior
1 Cabeça movida > 10° para o eixo vertical em 30 s
Colocando rato no chão3
0 Caminhada normal
1 Incapacidade de andar em linha reta
2 Circulando em direção ao lado parético
3 Caia para o lado parético
Testes sensoriais2
1 Teste de colocação (teste visual e tátil)
2 Teste proprioceptivo (sensação profunda, empurrando a pata contra a borda da mesa para
estimular os músculos dos membros)
Testes de equilíbrio de feixe6
0 Equilibra-se com postura firme
1 Agarra o lado da viga
2 Abraços a viga e um membro cai da viga
3 Abraça a viga e dois galhos caem da viga ou gira na viga (>60 s)
4 Tenta se equilibrar na trave, mas cai (>40 s)
5 Tenta se equilibrar na trave, mas cai (>20 s)
6 Quedas: Nenhuma tentativa de equilibrar ou segurar a viga (<20 s)
Reflexos ausentes e movimentos anormais4
1 reflexo do pavilhão auricular (balançar a cabeça ao tocar o conduto auditivo)
1 Reflexo da córnea (piscar os olhos ao tocar levemente a córnea com algodão)
1 Reflexo de sobressalto (resposta motora a um breve ruído de estalar um papel de prancheta
1 Convulsões, mioclonia, miodistonia
Máximo de pontos18

Tabela 1: Escore de gravidade neurológica modificado.

Pontuação de Zea-Longa
PontuaçãoSintoma
0 pontosSem déficits neurológicos
1 pontoLeve: incapaz de estender completamente a pata dianteira direita quando a cauda é levantada
2 pontosModerado: círculos para a direita/esquerda ao caminhar
3 pontosGrave: tomba para a direita/esquerda ao caminhar
4 pontosIncapaz de andar espontaneamente com perda de consciência

Tabela 2: Escores de Zea-Longa.

Vídeo 1: Principais etapas para o reparo da ligadura da incisão CCA durante a reperfusão em ratos. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Vídeos comportamentais de ratos submetidos a MCAO/R. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

O modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) induzido por uma sutura de náilon monofilamentar é o método mais comum usado para a preparação de modelos MCAO. Essa abordagem é amplamente adotada em estudos pré-clínicos e ganhou reconhecimento de muitos profissionais devido à sua simplicidade, falta de necessidade de craniotomia, trauma cirúrgico mínimo e capacidade de obter reperfusão.

Existem duas técnicas cirúrgicas clássicas para o filamento intraluminal MCAO: o método de Koizumi8 e o método de Longa9. A principal diferença entre esses métodos está em como a sutura é introduzida para ocluir a ACM. No método de Koizumi, a sutura é inserida através da incisão da artéria carótida comum (ACC) na artéria carótida interna (ACI). A extremidade frontal da sutura é revestida com silicone para bloquear o ponto inicial da ACM. Por outro lado, no método Longa, a sutura é inserida na ACI através da artéria carótida externa (ECA) cortada. A extremidade frontal da sutura é expandida em uma forma esférica para bloquear o ponto inicial da ACM (Figura 5). Durante a reperfusão, a sutura é retirada suavemente para restaurar o fluxo sanguíneo.

O método Longa envolve a introdução da sutura na artéria carótida interna (ACI) através da artéria carótida externa (ECA) cortada. Este processo requer a separação e desconexão do ECA, bem como a separação e remoção de pequenos ramos, que são então cortados com uma caneta de eletrocoagulação para evitar sangramento. Consequentemente, este método exige uma operação cuidadosa e precisa. Além disso, a extremidade residual curta da ECA cortada pode facilitar o deslizamento da sutura durante a inserção, aumentando ainda mais a complexidade do procedimento. Esse desafio é particularmente pronunciado ao preparar um modelo de isquemia cerebral em camundongos, pois muitas vezes requer o uso de um microscópio para garantir a precisão, aumentando assim a complexidade geral da operação.

A principal preocupação com o método de Koizumi reside na ligadura da artéria carótida comum (CCA), que resulta em reperfusão compensatória do tecido cerebral no lado isquêmico apenas através do Círculo de Willis. A CCA é um ramo crucial do arco aórtico do coração e serve como a principal artéria que fornece perfusão do fluxo sanguíneo cerebral. Portanto, o modelo de isquemia-reperfusão cerebral criado pelo método de Koizumi freqüentemente experimenta um estado de hipoperfusão. Essa hipoperfusão não se limita à região da artéria cerebral média, mas se estende a todo o hemisfério isquêmico do mesmo lado. Mesmo após 35 dias da modelagem, o valor do fluxo sanguíneo não retorna à linha de base, sugerindo que o método de Koizumi deve ser considerado como um modelo isquêmico com hipoperfusão crônica e não como um modelo de isquemia-reperfusão10.

Em contraste, o método Longa pode atingir um valor de fluxo sanguíneo de 100% em animais MCAO/R. No entanto, é crucial notar que alcançar a recanalização completa não significa necessariamente que o método Koizumi deva ser abandonado. Ao considerar a tradução clínica, o método de Koizumi pode ser mais adequado para pacientes com recanalização lenta espontânea após oclusão da artéria. No entanto, esse fenômeno é relativamente raro na prática clínica. Apenas uma pequena porcentagem de pacientes com AVC isquêmico preenche os critérios para trombólise e recebe tratamento efetivo dentro da janela de tempo de tratamento20,21. Além disso, alguns pacientes não alcançam a revascularização completa mesmo após a terapia trombolítica22. Assim, o método de Koizumi pode ser utilizado para simular as condições desses pacientes.

Por outro lado, o método Longa permite que os vasos se recanalizem rapidamente após a oclusão, tornando-o mais adequado para simular pacientes que recebem terapia trombolítica eficaz ou trombectomia na prática clínica. Para simular pacientes que não foram submetidos à terapia trombolítica, o modelo de isquemia cerebral permanente elaborado pelo método de Koizumi pode oferecer uma oclusão mais completa e um procedimento cirúrgico mais simples.

O método de Longa para indução de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média (MCAO/R) pode levar a uma lesão de reperfusão mais significativa, preservando a recanalização vascular derivada da artéria carótida comum (ACC)23,24. No entanto, é importante notar que a artéria carótida externa (ECA) precisa ser cortada e permanentemente ligada durante o método Longa, o que interrompe a estrutura completa do fluxo sanguíneo do cérebro e não é consistente com pacientes clínicos. Além disso, as artérias lingual, maxilar e occipital são ramos da ECA13. Assim, cortar ou ligar permanentemente a ECA pode causar distúrbios alimentares e etilômicos, resultando em perda de peso25. Estudos anteriores indicaram que as mortes de camundongos após a modelagem MCAO são principalmente devidas à ingestão inadequada de alimentos ou água, e não à lesão isquêmica cerebral14,26. Além disso, a ligadura do ECA pode reduzir o fluxo sanguíneo retiniano e induzir danos retinianos na forma de morte celular27.

Além disso, o indicador mais importante para a pesquisa do AVC é o volume do infarto; No entanto, o volume de infartos induzidos pelo método de sutura tem se mostrado um desvio padrão significativo, mesmo seguindo protocolos cirúrgicos e de coleta de dados rigorosos. Em relatos anteriores, o volume do infarto foi associado ao grau de reperfusão28, e a reperfusão do modelo de AVC elaborado pelo método de Koizumi depende da circulação de Willis 29,30,31. No entanto, foi comprovado que o ciclo de Willis tem alta variabilidade anatômica, especialmente em camundongos C57Bl/6, onde 90% dos animais podem não ter uma ou duas artérias comunicantes posteriores32, que é o principal determinante da alta variabilidade na lesão isquêmica33. Portanto, preservar a perfusão da ACC pode reduzir a variabilidade do volume do infarto34. Foi relatado que o coeficiente médio de variação no tamanho do infarto em ensaios de AVC foi de 29,5%31, o que contribuiu para o baixo poder estatístico dos ensaios de AVC. Também representa um enorme desafio para a descoberta potencial de medicamentos. Isso, sem dúvida, aumenta o custo de desenvolvimento e tradução clínica e pode levar os pesquisadores a perder medicamentos potencialmente eficazes. Também aumenta o número de animais a serem incluídos na análise estatística do experimento, o que viola ainda mais o princípio 3R da ética animal.

Portanto, neste estudo, os métodos de modelagem foram modificados para garantir a integridade da estrutura do fluxo sanguíneo do tecido cerebral e reperfusão suficiente após isquemia cerebral. As principais modificações incluem duas etapas: (1) inserir a sutura na ACC usando uma agulha de seringa de 5 mL em vez de fazer uma pequena incisão; esta etapa reduz a incisão da ACC e é mais propícia à ligadura da incisão; (2) retirar a sutura e usar fios de seda mais finos para ligar a abertura da agulha da CCA, sem afetar a perfusão do fluxo sanguíneo da CCA. Claro, isso também requer uma operação cirúrgica cuidadosa, mas é diferente da introdução de sutura via ECA; este método preserva a integridade da estrutura do fluxo sanguíneo cerebral, permitindo que o fluxo sanguíneo seja totalmente reperfundido através da CCA, tornando o procedimento operacional mais simples e reduzindo a variabilidade do volume do infarto. Alguns pesquisadores usaram métodos de pesquisa semelhantes para reparar incisões com cola de tecido, mas isso tem potencial para trombose, o que trará efeitos incontroláveis. E leva mais tempo para estabilizar a incisão25.

Em conclusão, este estudo fornece uma abordagem modificada para a preparação do modelo de isquemia-reperfusão cerebral que permite uma perfusão sanguínea adequada após a retirada do filamento e pode resultar em volumes de infarto significativamente reprodutíveis e danos neurológicos. Todos os resultados acima demonstram que o método modificado é viável e reprodutível e pode fornecer uma referência para os profissionais prepararem modelos para facilitar a tradução clínica eficaz de drogas isquêmicas cerebrais.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82173781 e 82373835), projeto de pesquisa de pós-doutorado (BKS212055), Projeto de Inovação em Ciência e Tecnologia do Departamento de Ciência e Tecnologia de Foshan (2320001007331), Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangdong (2019A1515010806), Principais Projetos de Campo (Manufatura Inteligente) das Universidades Gerais da Província de Guangdong (2020ZDZX2057) e os Projetos de Pesquisa Científica (Inovação Característica) da General Universidades na província de Guangdong (2019KTSCX195).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de anestesia para animaisRayward Life Technology Co., LtdR500IE
Mantenedor da temperatura animalRayward Life Technology Co., Ltd69020
Anticorpo secundário Cy3Wuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB21303
anticorpo DAP1Wuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdG1012
AnticorpoDCXWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB13434
Soro de cabraBeyotime Biotechnology Co., LTDC0265
GraphPad PrismGraphPad SoftwareGraphPad Prism 8.0
ImageJInstitutes of HealthImageJ software
IsofluranRayward Life Technology Co., LtdR510-22
Sangue salpicado a laser sistema de imagem de fluxoRayward Life Technology Co., LtdPeriCam PSI NR
MAP-2 anticorpoWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB11128
Broca de crânio portátil em miniaturaRayward Life Technology Co., Ltd87001
sutura de monofilamentoRayward Life Technology Co., Ltd250-280g
NeuN anticorpoWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB11138
agente de incorporação BIOSHARPBL557A
Penicilina sódicaChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.17121709-2
Solução rápida da recuperação do antígeno para abiotecnologia congelada Co. de Beyotime, biotecnologia Co. dos ratos do SD do LTDP0090
(Pequim), Ltd.250-280g
Triton X-100Beyotime Biotechnology Co., LTDST795
TTCChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.
National 2019030101

Referências

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