Protocolo Integrativo para Geração de Organoides Hepáticos Humanos 3D Derivados de iPSC

Resumo

Os organoides hepáticos 3D derivados de iPSC humanos constituem uma ferramenta potencial para entender a ação do hormônio tireoidiano no desenvolvimento do fígado.

Resumo

A obtenção de células hepáticas estáveis em cultura representa um desafio significativo para os estudos hepáticos. Tendo isso em mente, um método otimizado é descrito utilizando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) para gerar culturas 3D de organoides hepáticos humanos (HHOs). A utilização de HHOs oferece uma abordagem valiosa para entender o desenvolvimento do fígado, desvendar doenças hepáticas, conduzir estudos de alto rendimento para o desenvolvimento de medicamentos e explorar o potencial de transplante de fígado. Na primeira investigação, por meio de técnicas de imunofluorescência e RT-PCR quantitativo, a progressão foi monitorada, identificando a presença de várias populações celulares, como hepatoblastos e os dois tipos de células derivadas de hepatoblastos: colangiócitos ou células semelhantes a hepatócitos, em diferentes estágios de desenvolvimento. Este relatório apresenta um protocolo 3D direto a partir de hiPSC para adquirir HHOs que refletem os estágios do desenvolvimento do embrião humano. O protocolo, que abrange de 46 a 50 dias, abrange várias etapas: (i) gerenciamento meticuloso da cultura de hiPSC para gerar HHOs, (ii) início da diferenciação celular em 2D e a subsequente transição para 3D e (iii) uma estratégia de dissociação otimizada para quebrar HHOs em células únicas para sequenciamento de RNA de célula única. Como ilustração das amplas aplicações dessa abordagem, o presente protocolo foi aplicado anteriormente para desvendar o papel da sinalização do hormônio tireoidiano no desenvolvimento de células hepáticas.

Introdução

O fígado desempenha diversas funções metabólicas, como regular a disponibilidade de substratos energéticos prontamente utilizáveis, como glicose e corpos cetônicos, bem como desintoxicar compostos xenobióticos. Nos últimos anos, houve um aumento significativo na prevalência de doenças hepáticas, em grande parte atribuídas à esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), que, se não tratada, pode avançar para cirrose ou câncer¹. Portanto, é imperativo entender as funções metabólicas do fígado e suas doenças relacionadas para facilitar o desenvolvimento de tratamentos eficazes ^2,3.

O surgimento de culturas tridimensionais (3D) levou à criação do modelo organoide, representando uma abordagem inovadora e inovadora para abordar a funcionalidade e a complexidade do desenvolvimento de órgãos⁴. Os organoides são definidos como agregados auto-organizados 3D de células diferenciadas que imitam as funções e a citoarquitetura do respectivo órgão⁵.

Nas últimas décadas, uma miríade de protocolos de organoides hepáticos humanos (HHO) ganhou amplo interesse, desde a utilização de diversas células derivadas de iPSC humanas⁶ ou apenas células semelhantes a hepatócitos⁷ até a incorporação de uma variedade de microambientes intrincados de fatores de crescimento ou inibidores e diferenciação de células progenitoras em monocamada⁷ ou 3D⁸. Essas abordagens se prestam a uma infinidade de objetivos potenciais, desde a triagem de medicamentos de alto rendimento⁹ até a obtenção de mais informações sobre os mecanismos subjacentes às doenças hepáticas¹⁰.

Aqui, é realizado um protocolo passo a passo de diferenciação de HHO com base nas pistas químicas mencionadas¹¹ , com variações metodológicas adaptadas. Este protocolo começa com o manuseio e cultivo apropriados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC), detalhando técnicas para manipulação de gel de matriz extracelular, passagem celular e diferenciação em HHOs. O processo começa estimulando a diferenciação de hiPSCs em endoderma definitiva (DE)¹² e, posteriormente, imitando os efeitos in vivo de FGF e BMP para promover o desenvolvimento de células de monocamada do intestino posterior (PFG)¹³. A arquitetura 3D é alcançada no dia 10, quando as células PFG são diferenciadas em uma fase hepática imatura que se tornará os hepatoblastos, a célula precursora fetal de colangiócitos e hepatócitos². Finalmente, as estruturas 3D são dissociadas em células únicas para estudos de sequenciamento de RNA. Como exemplo da aplicabilidade desse protocolo, foi demonstrado como esse modelo de OHH se presta ao estudo da ação do hormônio tireoidiano e da desiodase tipo 2 (D2) no desenvolvimento de hepatócitos e colangiócitos¹⁴.

Protocolo

1. Gestão do hiPSC

NOTA: hiPSCs (linha celular CS03iCTR-n3) foram adquiridos comercialmente. O manejo adequado do revestimento de gel da matriz extracelular e do meio hiPSC é fundamental para prender os hiPSCs às placas e alimentá-los. Aqui, os volumes necessários para uma placa de 6 poços foram descritos. Os hiPSCs restantes da placa de 6 poços, que não se diferenciam em organoides, podem ser armazenados em nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

1. Dispensação de gel de matriz extracelular e meio hiPSC
   1. Descongele adequadamente o frasco do gel de matriz extracelular, colocando-o em um recipiente com gelo a 4 °C durante a noite.
      NOTA: Antes de aliquotar, verifique o certificado de análise para verificar o volume do fator de diluição. Isso representa a concentração de proteína do gel da matriz extracelular; portanto, varia de um lote para outro.
   2. Distribuir o gel de matriz extracelular em alíquotas adequadas de acordo com o factor de diluição (4x, 2x e 1x) utilizando tubos pré-refrigerados e marcados. Adicione um fator de diluição de 4x de gel de matriz extracelular a 25 mL de DMEM/F12 frio para revestir quatro placas de 6 poços. Feche imediatamente as tampas com filme de vedação de laboratório e congele-as a -80 °C. Evite a exposição prolongada ao ar e a criação de bolhas nas alíquotas.
   3. Descongele 100 mL de meio suplementar hiPSC a 4 °C durante a noite. Adicione-o a 400 mL de meio basal hiPSC. Uma vez homogeneizado com uma pipeta sorológica de 50 mL, alíquota do meio hiPSC em tubos de 40 mL e congelar a -20 °C até o uso.
2. Revestimento de placas para a cultura hiPSC
   1. Numere e rotule a(s) placa(s) de 6 poços. Mantenha uma alíquota de gel de matriz extracelular por perto, imersa em gelo seco.
   2. Para revestir uma placa de 6 poços, diluir uma alíquota de gel de matriz extracelular (1x) em 6,25 mL de DMEM/F12 frio (2x em 12,5 mL e 4x em 25 mL de DMEM/F12).
   3. Pipete um pequeno volume de DMEM/F12 (~500 μL) no tubo de gel da matriz extracelular. Gire para cima e para baixo para descongelar e homogeneizar o gel da matriz extracelular com DMEM/F12 frio, evitando a criação de bolhas, e retorne-o ao resto do tubo contendo DMEM/F12 frio usando uma pipeta sorológica para misturar completamente.
   4. Incorpore 1 mL de gel de matriz extracelular em DMEM/F12 em um poço para revestir a placa de 6 poços (6 mL para toda a placa). Distribua o 1 mL uniformemente sobre a superfície, movendo, sem agitar, a placa até que esteja totalmente coberta.
   5. Deixe descansar em temperatura ambiente (RT) por 1 h antes de usar. Se a placa de 6 poços não for totalmente usada, sele-a com filme de vedação de laboratório e guarde-a na geladeira a 4 °C.
      NOTA: Uma placa revestida pode ser armazenada por 1 semana na geladeira a 4 °C.
3. Descongelamento e cultura de hiPSC
   1. Calcule antecipadamente o volume de hiPSC médio e quente em RT junto com a placa revestida de 6 poços 1 h antes do uso (2 mL por poço).
      NOTA: No caso de alíquotas frias ou congeladas, mergulhe-as em uma incubadora a 37 ° C ou em banho-maria 15 minutos antes de usar.
   2. Divida 1 mL de hiPSCs em N₂ líquido de um criogenio em 3 poços de uma placa de 6 poços (proporção de 1:3). Para uma placa inteira de 6 poços, use 2 criogeniais. Aqui, o protocolo descreve o descongelamento e a cultura de hiPSCs de um criogenial. Repita o processo para 2 criogeniais.
   3. Introduza o criogenio contendo aproximadamente 1 mL de hiPSCs congelados, segurando-o através da tampa e deslizando-o através da água superficial, com o fundo do frasco imerso em banho-maria a 37 ° C até o descongelamento.
   4. Depois de descongelado, pulverizar o criogenio com etanol e pipetar 1 mL de hiPSCs. Dispense lentamente em um tubo cônico vazio de 15 mL. Adicione 5 mL de hiPSC médio quente gota a gota enquanto agita suavemente o tubo.
   5. Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 min a RT. Eliminar delicadamente o sobrenadante aspirando com uma pipeta de vidro ligada ao vácuo, sem perturbar o sedimento, deixando algum meio residual. Ressuspenda cuidadosamente o pellet em 6 mL de meio e, em seguida, adicione 2 mL por poço em 3 poços da placa de 6 poços.
      NOTA: Deixe pequenos agregados de hiPSCs para o crescimento correto.
   6. Dobre a placa de 6 poços e aspire o gel de matriz extracelular da placa previamente revestida sem tocar a ponta no fundo do poço.
   7. Transferir 2 mL do meio com hiPSCs por poço. Agite suavemente a placa para frente, para trás e de um lado para o outro para distribuir uniformemente os agregados hiPSC na placa.
   8. Coloque a placa de 6 poços em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade. Troque o meio diariamente (2 mL por poço), verificando o crescimento progressivo.
   9. HiPSCs de passagem quando 80% da confluência de crescimento é adquirida (após 4-5 dias; ver Figura 1A). As características dos hiPSCs saudáveis e proliferativos incluem bordas distintas e empacotamento apertado de grandes núcleos no centro das agregações celulares em crescimento.
4. Passagem de hiPSC
   1. Uma vez que os hiPSCs atinjam 80% de confluência, indicando aproximadamente 1,2 x 10⁶ células por poço, passagem para uma nova placa de 6 poços. Divida em uma proporção de 1:3 (de 1 bem para 3) ou ajuste a proporção (1:4; 1:6) de acordo com os requisitos do experimento.
   2. Antes de passar, prepare a incorporação de gel de matriz extracelular necessária para o número apropriado de placas de 6 poços, conforme descrito na etapa 1.2.
   3. Remova o sobrenadante de cada poço e adicione 2 mL de PBS por poço. Aspire o PBS, seguido pela adição de 1 mL de meio descolante hiPSC por poço por 1 min. Em seguida, remova 1 mL de meio descolante hiPSC.
   4. Coloque a placa de 6 poços em uma incubadora a 37 °C por 7 min. Adicionar 1 ml de meio hiPSC por alvéolo. Retire e colete pipetando 1 mL do meio hiPSC com células no tubo de 15 mL.
   5. Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 min à RT. Para colocar as células em uma placa de 6 poços, repita as etapas 1.3.5-1.3.7. Coloque a placa de 6 poços em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade. Vá para a etapa 1.5. para congelar hiPSC, se necessário.
5. Congelamento hiPSC (opcional)
   NOTA: O número de hiPSCs necessários para promoção em HOs pode resultar em poços restantes que podem ser armazenados a longo prazo. Caso haja necessidade de expandir a passagem para armazenamento criovial, os hiPSCs podem ser mantidos por longos períodos.
   1. Descongele o volume necessário de meio de criopreservação (1 mL por poço de células) em gelo a 4 °C. Rotule os criotubos com o número de passagens, data e linha celular. Retire as células com o meio de descolamento hiPSC como na etapa 1.4. em tubo cônico de 15 mL.
   2. Centrifugue a 300 x g durante 5 min a RT. Aspirar totalmente o sobrenadante, deixando cuidadosamente o sedimento celular intacto. Ressuspenda prudentemente o pellet em 1 mL de meio de criopreservação a frio (por poço), deixando agregados de hiPSC.
      NOTA: Se os poços estiverem em baixa densidade, menos de 50% confluentes, 1 mL de meio de criopreservação pode ser usado para cada 2 poços.
   3. Transfira 1 mL de meio de criopreservação com os hiPSCs para o criotubo. Agite suavemente o criotubo para homogeneizar o conteúdo celular.
      NOTA: Se estiver preparando mais tubos para criopreservação, deixe os tubos já preparados no gelo.
   4. Coloque os tubos no recipiente de congelamento de taxa controlada a -80 °C durante a noite. Transfira os tubos para o tanque de nitrogênio líquido após 24 h.

2. Diferenciação passo a passo de hiPSC em organoides hepáticos

NOTA: A reconstituição dos reagentes foi realizada e seguida de acordo com as orientações do fabricante.

1. Diferenciação 2D de hiPSC em DE (dia 0-dia 4 (D-0 a D-4); Figura 1B)
   1. Após 3 passagens, se as células estiverem saudáveis e crescendo bem e rápido, prossiga para a diferenciação do hiPSC. Cubra uma placa de 6 poços conforme descrito na etapa 1.2. Para diferenciar hiPSC em DE, utilize o kit DE seguindo as instruções do fabricante.
   2. Antes de iniciar a diferenciação, cultive hiPSCs em uma proporção de passagem de 2:1 (de 6 poços para obter 3 para iniciar a diferenciação) por 24 h para atingir a concentração celular no poço indicado nas instruções de DE.
   3. Execute a diferenciação de acordo com o protocolo do fabricante com as seguintes modificações.
      1. Aumente a concentração de Y-27632 adicionado ao hiPSC de 10 μM para 50 μM (um dia antes de iniciar a diferenciação).
      2. Aumente 1,5 mL por poço do reagente de dissociação e também o volume de DMEM/F12 para a mesma quantidade por poço que o reagente de dissociação. Adicione 1 mL de DMEM/F12 (de 1,5) a cada poço e 0,5 mL extra acumulado em um tubo de 15 ou 50 mL.
2. Diferenciação de células DE em células PFG (D-4 a D-10; Figura 1C)
   1. Prepare o meio PFG (DMEM / F12 avançado como meio basal, 1x suplemento de Glutamax, 1x suplemento de B27, 20 ng / mL BMP4, 10 ng / mL FGF2) para a diferenciação de células DE dias antes da indução em PFG e armazene-o a 4 ° C.
      NOTA: B27 contém T3 como parte de sua composição. No caso de estudos de hormônio tireoidiano (HT), a partir daqui, a B27 deve ser substituída por B26¹⁵ caseiro que não contenha TH.
   2. Aqueça o meio PFG (2 mL por poço) e DMEM/F12 avançado a 37 °C por 15 min ou RT por 1 h. Dobre sobre a placa e aspire o meio DE dos poços com uma pipeta de vidro conectada a um vácuo (ou manualmente com uma pipeta P1000) sem arranhar as células.
   3. Adicione 2 mL de DMEM/F12 avançado quente por poço e aspire-o. Adicione 2 mL de meio PFG quente por poço na placa de 6 poços. Altere o meio diariamente pelos próximos 6 dias.
3. Indução de células PFG 2D para organoides hepáticos imaturos 3D (IHOs; D-10 a D-18)
   NOTA: Quase 30.000-35.000 células são necessárias em 30 μL adicionados a cada poço da placa ULA de 96 poços. A razão de passagem é de 2:1, a partir de 2 poços (placa de 6 poços) com uma monocamada de células PFG diferenciadas; ele fornecerá uma placa de fixação ultrabaixa (ULA) completa de 96 poços (Figura 1D).
   1. Antes de iniciar os organoides 3D ou em dias anteriores, prepare previamente o meio IHO (DMEM/F12 avançado como meio basal, 1x suplemento N2, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM Dexametasona, 5 μM CHIR99021, 500 nM ácido valpróico, 50 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano (EGF), 20 ng/mL de fator de crescimento de hepatócitos humanos (HGF), 40 ng/mL Jagged-1, 300 ng/ml de sal de sódio de 30,50-35 monofosfato cíclico de N-6,20-O-dibutiriladenosina 30,50-cíclico (dbCAMP), 10 μM de nicotinamida) e conservá-lo a 4 °C.
   2. Rotule uma placa de fixação ultrabaixa (ULA) de 96 poços. Para separar as células PFG, use a enzima de dissociação celular de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Aqueça a enzima de dissociação, DMEM/F12 avançado e PBS a 37 °C antes de usar. Aspire e descarte o meio PFG dos poços. Adicione 2 mL de PBS por poço e aspire.
   4. Adicione 1,5 mL de enzima de dissociação celular por poço a 37 ° C por 7 min para separar as células do poço. Sem remover a enzima de dissociação celular, adicione 1 mL de DMEM avançado. Reúna todas as células e adicione-as em um tubo de 50 mL.
   5. Conte o número de células por mL com um contador de células ou um hemocitômetro. Centrifugue a 150 x g por 8 min.
   6. Ao pellet, adicione o volume apropriado (3 mL de meio IHO para uma placa ULA inteira de 96 poços) e 1x gel de matriz extracelular para ajustar ao número final de células necessárias (30.000-35.000 células).
   7. Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora configurada até 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade. Após 24 h (D-11), as células se reagruparão em forma circular; adicionar 50 μL por alvéolo do meio IHO.
   8. No dia seguinte (D-12), aumentar para 100 μL de meio IHO por poço. Em D14, remova ~ 100-120 μL de cada poço com a pipeta de vidro conectada a um vácuo ou com uma pipeta, um por um. Tome cuidado para não aspirar os organoides. Adicione 100 μL de meio IHO em D-14 e D-16.
      NOTA: Após D-16, por não ser colocado em movimento, aparece um crescimento excessivo que desaparece após D18.
4. Organoides de hepatoblastos (HBOs, D-18 a D-26)
   NOTA: Nesta etapa, os IHOs da placa ULA de 96 poços serão realocados para uma placa ULA de 6 poços. Para 96 IHOs da etapa anterior, 10 organoides foram colocados por poço, representando um total de 1 e 1/2 placas ULA de 6 poços para prosseguir com a maturação (Figura 1E).
   1. Como feito nas etapas anteriores de diferenciação, prepare o meio de diferenciação HBOs nos dias anteriores.
      1. O coquetel de reagentes usado para diferenciar em HBOs é descrito na etapa 2.3. Remova o ácido valpróico e incorpore ao coquetel os seguintes bioquímicos: BMP7, BMP4 e FGF7. A composição final é Advanced DMEM/F12 como meio basal, 1x suplemento N2, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM Dexametasona, 5 μM CHIR99021, 500 nM ácido valpróico, 50 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano (EGF), 20 ng/mL de fator de crescimento de hepatócitos humanos (HGF), 40 ng/mL Jagged-1, 300 ng/mL N-6,20-O-dibutiriladenosina 30,50-cíclico 35 monofosfato de sódio sal (dbCAMP), 10 μM de nicotinamida, 25 ng/mL FGF7, 50 ng/mL BMP4, 20 ng/mL BMP7.
   2. Aqueça previamente meio HBO (3 mL por poço) e Advanced DMEM/F12 (3 mL por poço) a 37 °C. Adicione 3 mL de DMEM/F12 avançado quente a cada poço.
   3. Distribua 10 organoides IHO por poço da placa de 96 poços com uma ponta de furo de 200 mL de largura. Remova o DMEM/F12 avançado curvando-se sobre a placa e aspirando-a com a pipeta de vidro conectada ao vácuo (ou manualmente com um P1000).
   4. Adicione 3 mL de meio HBO quente por poço. Ligue e coloque as placas ULA de 6 poços em um agitador multiplataforma a 65 rpm dentro da incubadora ajustada a 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade. Após 4 dias (D-22) e 6 dias (D-24), substitua o meio HBO (3 mL por poço).
5. Maturação em organoides hepáticos (HO) através de 2 fases diferentes (D-26 a D-46)
   NOTA: Este é o último processo de maturação que acontece em dois períodos de diferenciação devido ao teor e ao tipo de reagentes no meio.
   1. Preparar previamente o primeiro meio HO (HO1) e conservá-lo a 4 °C. Remova Jagged1 e diminua a concentração de CHIR99021 em comparação com o meio HBO. A composição final é: DMEM/F12 avançado como meio basal, 1x suplemento N2, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM Dexametasona, 2 μM CHIR99021, 50 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano (EGF), 20 ng/mL de fator de crescimento de hepatócitos humanos (HGF), 300 ng/mL N-6,20-O-dibutiriladenosina 30,50-cíclico 35 monofosfato de sódio sal (dbCAMP), 10 μM de nicotinamida, 25 ng/mL FGF7, 20 ng/mL BMP4, 20 ng/mL BMP7.
   2. Aqueça os meios avançados DMEM/F12 e HO1 a 37 °C antes de usar. Na mesma placa ULA de 6 poços, aspire cuidadosamente o meio HBO anterior dobrando a placa e colocando a ponta da pipeta de vidro conectada a um vácuo contra a parede (ou manualmente com uma pipeta P1000).
   3. Adicione 3 mL de DMEM/F12 avançado quente por poço e aspire. Adicione 3 mL de meio HO1 quente por poço. Troque o meio HO1 a cada 3 dias (D-29, D-32, D-35, D-38) junto com a coleta da amostra.
   4. Em D 38, modifique o coquetel de reagentes para o segundo período de HO (HO2) removendo CHIR99021, BMP4, dbcAMP e FGF7 e substituindo-os por FGF19 e DAPT. A composição final do meio é Advanced DMEM/F12 como meio basal, 1x suplemento N2, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM Dexametasona, 50 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano (EGF), 20 ng/mL de fator de crescimento de hepatócitos humanos (HGF), 10 μM de nicotinamida, 20 ng/mL BMP7, 25 ng/mL FGF19, 5 μM DAPT.
   5. Aqueça o meio DMEM/F12 e HO2 avançado a 37 °C antes de usar. Continue com a mesma placa ULA de 6 poços e aspire cuidadosamente o meio HO1 anterior. Adicione 3 mL de Advanced DMEM/F12 por poço e remova-o.
   6. Adicione 3 mL de meio HO2 quente por poço. Troque o meio HO2 a cada 4 dias (D-42, D-46, D-50, ...) e colete amostras nos mesmos dias em que o meio é trocado.

3. Dissociação unicelular

NOTA: Esta etapa é crítica para a técnica de sequenciamento de RNA de célula única. O número de organoides pode variar de acordo com o tamanho, e quanto mais antigo o dia da dissociação, maior a quantidade de células nos organoides. Antigamente, o número de organoides dissociados aumentava e os tempos de dissociação diminuíam com quantidades iguais. A dissociação foi realizada com 10 organoides em D-14 e D-17, 8 organoides em D-23 e D-26 e 6 organoides em D-30 e D-45. Os procedimentos para um cluster de organoides são detalhados (Figura 1F).

1. Preparação de reagentes
   1. Prepare o Advanced-DMEM com uma concentração final de 7,5% de Fração V de Albumina Bovina (BSA) e filtre após a homogeneização.
   2. Prepare 1 mL do meio enzimático de dissociação com 1 mL de tripsina 0,5% - EDTA (10x) como meio basal, 50 μM Y-27632, inibidor de RNase 40 U / μL e 1 U / μL DNase I.
   3. Prepare o meio de inativação de tripsina com 2 mL de DMEM/F12 avançado + BSA 7,5% como meio basal, 50 μM Y-27632, inibidor de RNase 40 U/μL e 1 U/μL de DNase I.
   4. Aqueça o meio e o PBS a 37 °C antes de começar.
2. Dissociação de HHOs
   1. Limpe o local de trabalho e as ferramentas com o limpador RNase. Colete o número de organoides de acordo com o dia da diferenciação em um tubo de polipropileno de 15 mL com uma ponta bem aberta.
   2. Lave com PBS 2x-3x. Adicione 1 ml de meio enzimático de dissociação no tubo de 15 ml com os organoides recolhidos e mantenha a 37 °C num balancim a 30 rpm durante 5 min.
      CUIDADO: Tenha cuidado para não deixar cair o tubo do balancim.
   3. Após 5 min, primeiro, verifique a tampa em busca de organoides restantes e, em seguida, interrompa mecanicamente os organoides com um P1000 girando para cima e para baixo 10x por organoide (60 vezes no total). Repita a mesma interrupção com um P200. Verifique a tampa do tubo caso os organoides fiquem presos nela.
   4. Coloque o tubo de 15 mL novamente no balancim na incubadora por mais 5 min. Repita o processo do ponto 4, começando girando para cima e para baixo em um P200 e continuando com uma pipeta sorológica de 1 mL conectada a uma ponta P10.
   5. Coloque o tubo de 15 mL novamente no balancim na incubadora nos últimos 5 minutos. Em caso de não dissociação, deixe agir por mais 5 minutos e repita a interrupção manual.
   6. Adicione 1 mL de meio de inativação de tripsina e homogeneize-o. Coloque um novo tubo de polipropileno de 15 mL com um filtro de células de 40 μm por cima. Filtrar os 2 ml (células com o meio enzimático de dissociação e o meio de inactivação da tripsina) através de um filtro de células de 40 μm para o tubo de 15 ml.
   7. Adicione mais 1 mL de meio de inativação de tripsina para recuperar quaisquer células restantes do filtro de células de 40 μm.
   8. Pegue 5 μL de meio unicelular misturado com 5 μL de uma solução de corante para contar o número de células dissociadas para prosseguir com sua fixação. Contar as células após centrifugação e ressuspensão com o primeiro reagente do kit de fixação e efectuar a filtração das células utilizando um filtro de células de 40 μm.

Resultados

Cada estágio deste protocolo de diferenciação gradual de hiPSC em HHOs foi definido usando medidas quantitativas por qPCR e imunofluorescência de marcadores conhecidos específicos do estágio da bibliografia (Figura 2). O passo a passo de ambas as técnicas e os resultados alcançados relacionados à correta diferenciação em HOs foram descritos em¹⁴. Na investigação anterior, as hiPSCs foram definidas por meio dos níveis de mRNA de POU5F1 (também conhecido como OCT4) e SOX2, dois fatores de Yamanaka bem conhecidos¹⁶, que diminuíram ao longo do tempo (Figura 2A). Posteriormente, foram medidos os níveis de mRNA dos marcadores DE¹¹, como OTX2, CER1 e FOXA2, e os marcadores PFG¹¹ HNF4A, CDX2 e TBX3, juntamente com a expressão localizada de OTX2, HNF4A e TBX3 por imunofluorescência (Figura 2A,B). Após a promoção 3D, acompanhar a progressão da imunofluorescência da albumina e HNF4a (Figura 2C); o marcador proliferativo, MKI67¹⁷ e TBX3, importante na regulação do hepatoblasto¹⁸ (Figura 2D), foi realizado de D-18 a D-46. Notavelmente, albumina colocalizada com HNF4a (Figura 2C); enquanto isso, MKI67 apareceu esporadicamente em D-46 (Figura 2D). Além disso, células semelhantes a hepatócitos e colangiócitos foram identificadas por meio dos níveis de mRNA e imunofluorescência de HNF4A¹⁹ e KRT7¹⁸ em D-46 (Figura 2E).

O volume dos organoides em desenvolvimento aumentou progressivamente de D-14 para D-38, conforme indicado pelo aumento de ~ 2 vezes nos níveis de mRNA para o marcador proliferativo MKI67 em D-22 em comparação com D-10. A ausência de T4 no meio levou a um aumento nos níveis de mRNA de MKI67 em ~ 20% e ~ 75% em D-14 e D-18, respectivamente, em comparação com o dia 10 (Figura 3A). Para comprovar a funcionalidade do organoide hepático, os níveis de albumina, apolipoproteína B e A1¹⁴ coletados do meio dos organoides hepáticos foram medidos por meio de ELISA. Em D-42 e D-46, os níveis de mRNA de ALB permaneceram substancialmente mais altos nos T4-HOs em comparação com T3-HOs ou V-Hos em 3,0 vezes e 2,5 vezes, respectivamente (Figura 3B). Por outro lado, os níveis de APOB foram ~ 10 vezes e 3 vezes maiores ( Figura 3C ), e os níveis de APOA1 foram ~ 3 vezes e ~ 2 vezes maiores ( Figura 3D ) em D-42 e D-46, respectivamente.

Figura 1: Estágios de diferenciação de hiPSC para organoides hepáticos. (A) Crescimento transicional de hiPSC (linha CS03iCTR-n3) de 0 h a 96 h, atingindo aproximadamente 70%-80% de confluência nos poços de uma placa. Barra de escala: 125 μm. (B) Progressão do estágio inicial de diferenciação do hiPSC para endoderma definitiva (DE), mostrando 100% de confluência no dia anterior (D menos 1) após 24 h, e diferenciação até D4 (D-0 a D-4). Barra de escala: 300 μm. (C) Diferenciação de DE (D-4) em intestino anterior posterior (PFG; D-10) com T4 adicionado B26. Barra de escala: 300 μm. (D) Transformação de 2D-PFG em organoides hepáticos imaturos 3D (IHO) com B26 adicionado de T4 de D-10 como células únicas até D-18, excluindo D-13. Barra de escala: 300 μm. (E) Manutenção e crescimento de organoides hepatoblastos (HBO) com B26 adicionado de T4 em D-20, D-22, D-24 e D-26. Barra de escala: 300 μm. (F) Dissociação de HBO em D-26 (~ 2,5 x 10⁵ células em 750 μL; esquerda) e HO1 em D-30 (~ 4 x 10⁵ células em 750 μL; direita) em células únicas com B26 adicionado de T4. A inserção ilustra o tamanho quadrado de 1 mm da câmara de Neuebauer, onde o quadrado menor mede 250 μm. As imagens foram levadas para HHOs cuja concentração livre de T4 utilizada na mídia foi de ~15 pM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Monitoramento e caracterização da diferenciação dos HHOs. (A) Expressão de níveis de mRNA de marcadores hiPSC (POU5F1, SOX2), endoderme definida (DE; OTX2, CER1, FOXA2) e intestino anterior posterior (PFG; TBX3, HNF4A, CDX2). (iPSC, n=8; DE e GFF n=7; HNF4A na GFF, n=6). (B) Imunofluorescência em hiPSC, DE e PFG de OTX2 (superior, vermelho), HNF4A (médio, verde) e TBX3 (inferior, vermelho). (C) "Imunofluorescência em D-18, D-26 e D-46 de albumina (vermelho) e HNF4A (verde). (D) Imunofluorescência em D-18, D-26 e D-46 de MKI67 (verde) e TBX3 (vermelho). (E) Imunofluorescência em D-46 de albumina (marcador de hepatócitos; vermelho) e KRT7 (marcador de colangiócitos; verde). Os núcleos são mostrados com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Esta figura foi modificada de¹⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise da maturação do HHO. (A) Níveis relativos de mRNA do marcador proliferativo MKI67 na ausência de TH (preto) versus T4 livre a ~ 15 pM (vermelho) no meio de D-10 a D-46 (n = 4, exceto T4-HOs em D-42, n = 2; e em D-46, n = 3). (B) Os níveis de albumina foram medidos no meio de D-35 a D-50 em três condições: ausência de HT (preto), com T4 livre em ~15 pM (vermelho) e T3 livre em ~10 pM (azul; n=4). (C, D) Os níveis de apolipoproteína B (APOB) e A1 (APOA1) foram medidos no meio de D-35 a D-50 em três condições: ausência de HT (preto); e com T4 livre a ~15 pM (vermelho). Dados de 10 organoides por poço (n=4). O teste t de Student bicaudal para comparar V-HOs versus T4-HOs dias e ANOVA de uma via e teste de Tukey foram usados para comparações múltiplas. Os dados são a média de duplicatas, representadas como gráficos de pontos de dispersão alinhados e sua média. *: p<0,05; **: p<0,01; : p<0,001; : p<0,0001. O eixo x indica os dias da diferenciação. Esta figura foi modificada de¹⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo atual oferece vários detalhes metodológicos sobre como lidar com hiPSCs e as subsequentes culturas organoides 3D. Isso inclui as duas principais etapas críticas: (i) o desprendimento das culturas 2D e, em seguida, seu desenvolvimento em organoides hepáticos 3D após 10 dias, bem como (ii) a delicada dissociação de uma estrutura 3D em células únicas. Com base nas informações disponíveis, este é o primeiro relato de um modelo 3D de HHO para estudar a ação do hormônio tireoidiano, demonstrando um pico de expressão de DIO2 em células semelhantes a hepatoblastos¹⁴ , conforme originalmente identificado em camundongos com fígado P1²⁰.

Tal como acontece com muitas outras técnicas que utilizam andaimes aplicados às células, o gel de matriz extracelular foi usado para imitar a matriz extracelular²¹, facilitando assim a montagem na estrutura 3D característica dos organoides. A natureza sensível ao calor deste reagente ressalta a importância de sua manipulação, mantendo-o congelado e, durante o manuseio, imerso em gelo. Consequentemente, o uso de um gel de matriz extracelular diferente é possível²², embora as hiPSCs não tenham se fixado e proliferado em uma placa de ausência de andaime neste protocolo, tornando seu manejo adequado um aspecto crucial no início do protocolo, juntamente com a geração de organoides 3D.

Depois de completar a diferenciação dos HOs, uma dissociação viável de organoides em células únicas representou outro grande obstáculo a ser superado, pois a interrupção mecânica pode provocar a morte celular, então dados de sequenciamento de RNA de baixa qualidade²³. Para garantir os melhores resultados, o presente protocolo mostrou que mais de 70% de viabilidade unicelular pode ser alcançada, com a dissociação de mais de 10⁵ células antes e depois da fixação para código de barras subsequente.

Ao contrário de outros manuscritos que descrevem apenas um tipo de célula nos organoides⁷, a diferenciação do HHO inclui pelo menos duas células derivadas de hepatoblastos: células semelhantes a hepatócitos e colangiócitos. A incorporação de dois reagentes responsáveis por sua formação, HFG²⁴ e EGF²⁵, e juntamente com dexametasona²⁶ que promove a maturação dos hepatócitos, e Jagged-1¹⁸ que ativa a sinalização Notch levando aos colangiócitos. Essa rede de sinais entrelaçada no desenvolvimento de HOs nos permite alcançar a estrutura 3D e mimetizar experimentos in vivo , além de superar a desvantagem do declínio na diferenciação de culturas de longo prazo de hepatócitos primários²⁷. É notável que, apesar da expressão de marcadores hepáticos adultos típicos, a presença de marcadores fetais em fases avançadas dos organoides²⁸ ainda pode ser detectada, como demonstra este protocolo. Isso, de fato, reflete o desenvolvimento hepático normal em humanos, nos quais marcadores hepáticos fetais podem ser normalmente detectados até 1 ano de vida²⁹.

Uma ocorrência pouco frequente observada durante o desenvolvimento de hiPSCs em HHOs (particularmente durante períodos imaturos dos HOs, como nos últimos dias de IHO e alguns HBO e HO1) foi o aparecimento de estruturas císticas superdesenvolvidas, que eventualmente desapareceram quando as placas foram colocadas no agitador. Essa progressão desproporcional das estruturas císticas sugere um núcleo necrótico até então, a necessidade de maior irrigação³⁰ com alterações mais frequentes do meio ou a adição de baixos volumes de gel de matriz extracelular para eliminar o crescimento excessivo do cisto.

Em contraste com a publicação original, que se concentrou em um número maior de organoides no último período de diferenciação para triagem de drogas de alto rendimento¹¹, o método agora relatado introduziu o uso de placas ULA para promover a formação precoce de organoides 3D de grande porte e facilitar o manuseio dos HHOs. Esses ajustes demonstram a flexibilidade e a vasta gama de estudos que podem ser realizados por meio desse protocolo simples.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 µ L Pontas de Pipeta Universais Filtradas, Baixa rentenção, Pré-estéril	VWR	613-6462	Todos os procedimentos
1000 µ L Pontas de Pipeta Universais Filtradas, Baixa rentenção, Pré-estéril	VWR	613-6470	Todos os procedimentos
15 mL Tubo Cônico de Polipropileno	Falcon (Corning)	352097	Dissociação Organoides Hepáticos
200 µ L Pontas de Pipeta Universal Filtradas, Baixa rentenção, Pré-estéril	VWR	613-6465	Todos os procedimentos
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma	T2877-100	Diferenciação de organoide hepático
40 μ m Filtro de Células	Corning	431750	Dissociação Organoides Hepáticos
50 mL tubo	Falcon (Corning)	352070	Todos os procedimentos
6 placas de poço Nunc Cell-Culture Treated Multiplates	Thermo fisher scientific		140675 manutenção hiPSC
A83-01	R& D Systems	2939/10	Diferenciação de organoides hepáticos
DMEM/F12	Gibco	12634010	Diferenciação de organoides hepáticos
ART Pontas de pipeta filtradas de grande diâmetro	ART	2069GPK	Todos os procedimentos
Suplemento B27	Gibco	17504044	Diferenciação de organoide hepático
BMP7	R& D Systems	354-BP-010/CF	Diferenciação de organoide hepático
Fração V de albumina bovina (solução a 7,5%)	Organoides hepáticos BSA da dissociação	15260037	Gibco
, fração V, ácidos gordos livres para a cultura de tecidos	Organoides hepáticos da dissociação	GoldBio	A-421-100
CHIR99021	R& D Systems	4423/10	Diferenciação de organoide hepático
Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment	Corning	3474	Diferenciação de organoide hepático
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment	Corning	3471	Diferenciação de organoide hepático
CS03iCTR-n3 linha de células-tronco pluripotentes induzida por humanos	Cedro-sinai		hiPSC manutenção
DAPT	R & D Systems	2634/10	Diferenciação de organoides hepáticos
dbCAMP	Millipore Sigma	D0627-100MG	Diferenciação de organoides hepáticos
Dexametasona	R& D Systems	1126/100	Diferenciação de organoides hepáticos
DMEM/F12	Gibco	11320033	manutenção hiPSC
DNAse I, livre de RNase, HC	Thermo Fisher scientific	EN0523	Dissociação Organoides Hepáticos
Falcon 10 mL Pipeta sorológica, poliestireno, incrementos de 0,1, embalados individualmente,	corning	estéril 357551	todos os procedimentos
Pipeta Sorológica Falcon 5 mL, Poliestireno, Incrementos de 0,1, Embalados Individualmente, Corning Estéril		357543	Todos os procedimentos
Falcon 50 mL Pipeta Sorológica, Poliestireno, Incrementos de 1,0, Embalados Individualmente, Corning Estéril		357550	Todos os procedimentos
Reagente de Dissociação Celular Suave (GCDR)	Stemcell Technologies	100-0485	Diferenciação Organoide Hepática
Glutamax suplemento	Gibco	35050061	Diferenciação de organoides hepáticos
L-tiroxina	Sigma	T1775-1G	Diferenciação de organoides hepáticos
Matrigel hESC-Qualified Matrix, livre de LDEV, 5 mL	Corning	354277	Gel de matriz extracelular
mFreSR	Stemcell Technologies	5855	hiPSC meio de criopreservação
mTeSR 5x Suplemento	Stemcell Technologies	100-0276	hiPSC médio
mTeSR Plus	Stemcell Technologies	100-0276	hiPSC médio
Multi Platform Shaker	Fisherbrand (tecnologias Thermo Fisher)	88861021	Suplemento de diferenciação de organoides hepáticos
N2	Gibco	17502048	Diferenciação de organoides hepáticos
Nicotinamida	R& D Systems	4106/50	Diferenciação de organoide hepático
PBS, pH 7.4	Manutenção Gibco	10010023	hiPSC
BMP4 humano recombinante	R& D Systems	314-BP-010/CF	Diferenciação de organoides hepáticos
EGF humano recombinante	R& D Systems	236-EG-200	Diferenciação de organoide hepático
FGF humano recombinante básico/FGF2/bFGF	R& D Systems	233-FB-010/CF	Diferenciação de organoides hepáticos
Humano recombinante FGF19	R& D Systems	959-FG-025/CF	Diferenciação de organoides hepáticos
HGF humano recombinante	R& D Systems	294-HG-005/CF	Diferenciação de organoide hepático
humano recombinante Jagged-1 Fc Chimera	R& D Systems	1277-JG-050	Diferenciação de organoides hepáticos
Humano recombinante KGF / FGF7	R & D Systems	251-KG-010/CF	Diferenciação de organoide hepático
ReLeSR	Stemcell Technologies	100-0483	hiPSC meio desprendimento
Inibidor de RNAse Ambion, clonado, 40 U/μ L	Invitrogen	AM2682	Dissociação Organoides Hepáticos
RNase Zap	Invitrogen	AM9780	Dissociação Organoides Hepáticos
Sorvall  Legenda XT/XF Série Centrífuga	Thermo Fisher Scientific	75004539	Todos os procedimentos
STEMdiff Kit Definitivo de Endoderme	Stemcell Technologies	5110	Diferenciação de organoides hepáticos
Solução de azul de tripano (0,4%)	Solução de	corante	15250061
Enzima TrypLE Express	dissociação celular	12604013 Gibco
Tripsina 0,5% - EDTA (10X)	Organoides hepáticos da dissociação	do 15400054	de Gibco
Ácido valpróico, sal de sódio	R& D Systems	2815/100	Diferenciação de organoides hepáticos
Vari-Mix Plataforma Rocker	Thermo Fisher científico	M79735Q	dissociação hepática organoides
Y-27632 dicloridrato R	& D Systems	1254	Diferenciação de organoides hepáticos