Desenvolvemos uma abordagem simplificada e econômica para a fabricação de eletrodos e realizamos gravações de sinais em várias regiões em camundongos em movimento livre. A utilização da optogenética, juntamente com a eletrofisiologia multirregional e o registro do sinal de cálcio, permitiu a revelação de atividades neuronais em todas as regiões do modelo de acendimento de convulsões.
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Artigo de método
Um método integrado para criar otérios eletrofisiológicos flexíveis e convenientes para gravação in vivo em várias regiões
Neste artigo
Resumo
Resumo
A epilepsia é um distúrbio neurológico caracterizado por descargas anormais sincronizadas envolvendo várias regiões do cérebro. As lesões focais facilitam a propagação de sinais epilépticos através de circuitos neurais associados. Portanto, o registro in vivo do potencial de campo local (LFP) das regiões críticas do cérebro é essencial para decifrar os circuitos envolvidos na propagação das convulsões. No entanto, os métodos atuais para fabricação e implantação de eletrodos carecem de flexibilidade. Aqui, apresentamos um dispositivo útil projetado para registros eletrofisiológicos (LFPs e eletroencefalografia [EEG]) em várias regiões. Além disso, integramos perfeitamente a manipulação optogenética e o registro de sinalização de cálcio com o registro LFP. Pós-descargas robustas foram observadas em várias regiões separadas durante crises epilépticas, acompanhadas por aumento da sinalização de cálcio. A abordagem usada neste estudo oferece uma estratégia conveniente e flexível para gravações neurais síncronas em diversas regiões do cérebro. Ele tem o potencial de avançar na pesquisa sobre distúrbios neurológicos, fornecendo insights sobre os perfis neurais de várias regiões envolvidas nesses distúrbios.
Introdução
A epilepsia é uma condição neurológica comum caracterizada por convulsões recorrentes, que se manifestam como convulsões, distúrbios sensoriais e perda de consciência1. Os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à epilepsia são complexos e envolvem múltiplas regiões cerebrais interconectadas 2,3. Avanços recentes em neuroimagem lançaram luz sobre as redes de grande escala envolvidas na epilepsia 4,5. No entanto, a compreensão dos intrincados circuitos e mecanismos de rede subjacentes à geração e propagação da epilepsia permanece limitada, em parte devido à aplicação insuficiente de técnicas de registro neural multirregional6. Portanto, é imperativo desenvolver um método flexível e integrado capaz de monitorar simultaneamente a atividade neural em regiões cerebrais díspares.
Registros eletrofisiológicos são realizados para capturar convulsões e determinar a presença de epilepsia7. Exceto para registrar a atividade eletrofisiológica, há uma ênfase crescente na atividade precisa do cálcio de populações neurais específicas em estudos de epilepsia 8,9. Avanços na síntese de indicadores de cálcio e vários projetos de sondas levaram os pesquisadores a adotar a fotometria de fibra para capturar mudanças na atividade neuronal e substâncias neurais dentro do cérebro10,11. Os dois métodos independentes de detecção da atividade neuronal, ou seja, eletrofisiologia e registro de fotometria de fibra, complementam-se, facilitando uma compreensão mais abrangente dos processos neuronais dinâmicos.
Além disso, o registro síncrono e a modulação da atividade neural são fundamentais para obter insights sobre o funcionamento do cérebro nos níveis de rede e celular. Essa abordagem permite que os pesquisadores observem e manipulem os processos complexos do cérebro em tempo real. A optogenética emergiu como uma ferramenta indispensável para sondar a sinalização neural, devido à sua capacidade distinta de estimulação ou inibição seletiva12. Apesar das aplicações generalizadas de registro eletrofisiológico em vários locais na neurociência13, a integração do registro eletrofisiológico multirregional com fotometria de fibra e manipulação optogenética permanece limitada. Mais importante, os métodos atuais para fabricar e implantar eletrodos multirregionais carecem de flexibilidade14. Essas limitações dificultam nossa capacidade de dissecar funções e interações específicas do circuito em várias regiões. Aqui, apresentamos uma abordagem de gravação in vivo multirregional econômica e conveniente que lança luz sobre os processos neuronais em todas as regiões em convulsões induzidas por kindling e outros distúrbios neuropsiquiátricos.
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Protocolo
Este protocolo recebeu aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Fudan e foi conduzido seguindo as diretrizes e regulamentos elaborados pelo Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. Todas as medidas possíveis foram implementadas para minimizar o número de animais utilizados neste estudo. O tempo necessário para executar cada etapa está incluído nas respectivas etapas.
1. Preparação dos eletrodos (Figura 1)
- Corte um comprimento apropriado de fio de tungstênio (~ 20 mm) e queime a camada de isolamento em uma extremidade para expor o fio de tungstênio (1,6-2 mm). Dobre a outra extremidade do fio em forma de "L" (veja a Figura 1A, ~ 1 min)
- Coloque cuidadosamente a extremidade "L" do fio de tungstênio na fibra óptica (consulte a Figura 1B, ~ 1 min).
NOTA: O fio de tungstênio deve ser 0,2-0,4 mm mais longo que a ponta da fibra óptica. - Mergulhe uma gota de adesivo e aplique-a na interface da fibra óptica e do fio de tungstênio (veja a Figura 1C, ~ 1 min). Devido à tensão superficial do líquido, o fio de tungstênio se conectará à fibra óptica.
- Aplique o adesivo uma vez e deixe secar. Em seguida, aplique uma segunda camada. Isso apertará ainda mais a ligação entre o fio de tungstênio e a fibra óptica (consulte a Figura 1C, ~ 1 min).
NOTA: Durante o processo de aplicação, deve-se tomar cuidado para evitar que o adesivo escorra para a ponta da fibra óptica, pois isso pode afetar sua transmitância. - No canto da forma de "L", use adesivo para unir a base da fibra óptica e o fio de tungstênio (~ 1 min).
NOTA: O aumento da área de contato e a solidificação esférica da gota adesiva garantem uma ligação firme entre a fibra óptica e o fio de tungstênio. - Use solda para estabelecer uma conexão entre o fio de tungstênio e o pino do conector fêmea (consulte a Figura 1D, ~ 3 min para cada)
NOTA: Como o fio de tungstênio não é sensível ao calor, a taxa de sucesso da soldagem pode ser aumentada para quase 100% por uma luva de metal formada cortando a localização do slot do pino para unir fisicamente os dois componentes. Posteriormente, o preenchimento da luva pela solda garante uma conexão estável entre o fio de tungstênio inserido e o pino. - De acordo com o projeto experimental, solde o número necessário de optrodes (veja a Figura 1E, ~ 10 min)
NOTA: Três optrodes foram utilizados neste estudo. - Corte o fio esmaltado no comprimento apropriado (~30 mm) e queime o isolamento em ambas as extremidades. Enrole uma extremidade do fio esmaltado ao redor da base do parafuso e solde-o. Conecte a outra extremidade do fio esmaltado aos pinos do conector fêmea por meio de um ferro de solda, servindo como registro de EEG e conexão de aterramento para o eletrodo do crânio (consulte a Figura 1F, ~ 5 min)
NOTA: Devido à flexibilidade do fio esmaltado, é conveniente conectar o crânio e os pinos do conector fêmea. A soldagem após enrolar o fio esmaltado em torno de um parafuso é mais confiável do que a soldagem de montagem em superfície. - Aplique adesivo hot-melt na matriz de pinos do conector fêmea para encapsular o conector fêmea e garantir que as juntas de solda estejam totalmente envolvidas. Durante a solidificação do adesivo hot-melt, molde o adesivo usando uma placa plástica para minimizar a ocupação do espaço durante a implantação (consulte a Figura 1F, ~ 3 min)
NOTA: Devido aos riscos potenciais de queimadura associados ao uso de cola termofusível, o adesivo AB é considerado uma alternativa mais segura. - Em seguida, use um medidor de intensidade de luz e um multímetro digital para medir a luminosidade e a condutividade. Ao passar nesses testes, a configuração está pronta para uso (consulte a Figura 1G, ~2 min)
NOTA: Ao trabalhar com lasers, use sempre óculos de proteção adequados ao comprimento de onda e potência específicos da luz laser. Fibras de alta qualidade são necessárias para transmitir pelo menos 80% da luz da extremidade do patch cord para a ponta da fibra implantável. Além disso, a resistência da ponta do fio de tungstênio até a ranhura do cabeçalho do pino foi medida com uma faixa aceitável de 1-5 Ω. - Antes de usar, mergulhe os eletrodos preparados em álcool 75% por 15 min e, em seguida, transfira-os para solução salina estéril (~ 16 min).
NOTA: O peso total do dispositivo de eletrodo encapsulado (0,6701 ± 0,01123 g, n = 4) não afeta a atividade dos camundongos. Os eletrodos são esterilizados antecipadamente usando esterilização por plasma.
2. Protocolo para implante de eletrodos (Figura 2)
- Anestesiar os camundongos com isoflurano (2%-4%) e prendê-los em um aparelho estereotáxico (ver Figura 2A, ~ 2 min). Use pomada para os olhos dos olhos do camundongo para evitar o ressecamento durante a anestesia. Aplique lidocaína na pele ao redor do perímetro da incisão craniana e uma injeção subcutânea de carprofeno na dose de 5 mg / kg.
NOTA: A anestesia adequada é confirmada pela ausência do reflexo de endireitamento e pela perda de resposta ao beliscão do dedo do pé. Para procedimentos cirúrgicos prolongados, o uso de um anestésico injetável é mais apropriado. - Depois de prender o animal no aparelho estereotáxico, apare o couro cabeludo ao longo da borda do crânio e limpe a superfície do crânio com álcool 75% para expor as posições do bregma e lambda (ver Figura 2B, ~ 3 min).
NOTA: O procedimento pré-cirúrgico inclui cortar o cabelo, desinfetar o local da cirurgia, pré-esterilizar os instrumentos e ferramentas cirúrgicas. - Nivele o cérebro e faça furos (~ 0,8 mm) acima das regiões de interesse (ROI) usando uma microbroca. Injete os vírus relevantes com uma bomba de seringa (ver Figura 2C - F, ~ 20 min).
NOTA: Informações detalhadas sobre os vírus e ROIs neste estudo são mostradas na Tabela de Materiais e na Figura 3. - Segure os optrodes com um suporte e mova sua ponta para o ponto bregma, definindo esta posição como 'zero'. Usando o ponto bregma como coordenada de referência, mova os optrodes para as regiões alvo (veja a Figura 2G, ~ 3 min). Posicione os optrodes 0,3 mm acima do local de injeção do vírus.
NOTA: Na estratégia de implantação vertical, a distância mínima entre os dois eletrodos é de aproximadamente 2 mm, dependendo da espessura da luva de fibra óptica e do diâmetro externo da ponteira. Um método de inserção angular pode ser usado para gravação simultânea de regiões próximas. - Depois de inserir as fibras ópticas nas áreas cerebrais correspondentes, aplique uma pequena quantidade de adesivo tecidual ao redor delas para cobrir o tecido exposto. Em seguida, aplique sequencialmente adesivo adicional e um pouco de cimento dental. Depois que o cimento dentário solidificar, solte o suporte com cuidado (veja a Figura 2H, ~5 min).
- Antes de cada novo implante de optrodo, execute a recalibração, que envolve a repetição da etapa 2.4 (consulte a Figura 2I).
NOTA: Para cada implante, posicione o optrodo no bregma como o ponto 'zero'. - Depois de implantar todos os optrodes, faça os furos atrás do ponto lambda para 'Terra' e acima do neocórtex para 'EEG' usando uma microbroca (~ 1 min).
NOTA: O tamanho do furo perfurado (~1.1 mm) precisa corresponder ao diâmetro do parafuso. - Insira os parafusos do crânio no orifício acima do córtex e atrás do ponto lambda (ver Figura 2J, ~ 5 min).
NOTA: Os parafusos de caveira são usados para gravação e aterramento de EEG, respectivamente. - Organize os fios de tungstênio e os fios esmaltados para que fiquem posicionados acima da área de implantação e não expostos fora do crânio. Fixe a posição do conector fêmea usando um suporte (consulte a Figura 2K, ~2 min).
- Preencha o local de implantação com cimento dentário para garantir uma conexão estável entre o dispositivo de eletrodo e o crânio. Encapsule os fios internos, deixando os orifícios de inserção do conector fêmea expostos para conexão ao headstage (consulte a Figura 2L, ~ 6 min).
- Após o endurecimento do cimento dentário, aplique iodo na pele ao redor do perímetro do couro cabeludo exposto e, em seguida, coloque o animal em uma almofada de aquecimento (~1 min).
NOTA: Certifique-se de que o animal não seja deixado sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Condições estéreis devem ser mantidas durante toda a cirurgia de sobrevivência. - Administre antibióticos e analgésicos para apoiar a recuperação pós-cirúrgica.
NOTA: Os animais que foram submetidos a cirurgia não são reintroduzidos na companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados. Os animais receberam injeções intraperitoneais de ceftriaxona sódica (180 mg/kg) e injeções subcutâneas de carprofeno (5 mg/kg), e gel de lidocaína foi aplicado nas feridas cirúrgicas diariamente por 3 dias. Os animais são obrigados a sobreviver por um período designado para completar o teste comportamental. Posteriormente, serão eutanasiados com isoflurano a 4%-5%, seguido de perfusão e secção tecidual para avaliação da infecção viral e dos locais de implantação do eletrodo.
3. Protocolo para registro de cérebro in vivo
- Antes de realizar o registro de sinais e testes comportamentais (teste de campo aberto)15, certifique-se de que o mouse seja submetido a um período de 3 dias de manuseio suave para aclimatá-lo ao ambiente.
NOTA: Neste estudo, os camundongos foram colocados em campo aberto (42 cm × 42 cm) para se movimentarem livremente, permitindo observar seu comportamento convulsivo. - Após anestesiar os camundongos com isoflurano (2%-4%), conecte as fibras ópticas sequencialmente na ordem do local de gravação antes de inserir o headstage.
- Defina o pulso de luz de 635 nm com um ciclo de trabalho de 10% a 20 Hz. Configure a estimulação de luz por 10 s (200 pulsos) durante a gravação. Defina a intensidade nas pontas da fibra óptica em 3 mW.
- Use um sistema de fotometria de fibra para registrar o período de teste comportamental dos sinais Gcamp6m a uma taxa de amostragem de 30 Hz por canal de LED de 470 nm.
- Registre simultaneamente sinais de cálcio, LFPs e EEG sob estimulação optogenética, juntamente com os desempenhos comportamentais correspondentes (ver Figura 3).
- Empregue a marcação de sincronização de sinal da lógica transistor-transistor (TTL) para garantir a consistência temporal nos dados registrados.
4. Processamento de dados
- Carregue os dados de fotometria no software MATLAB. Em seguida, use a codificação personalizada (Arquivo Suplementar 1) para reduzir a tendência do sinal de cálcio.
- Defina as mudanças na intensidade de fluorescência com a equação (1):
ΔF/F = (Ft - F0)/ F0 (1)
Onde Ft representa os valores de fluorescência do sinal de cálcio em tempo real e F0 denota a intensidade média de fluorescência basal antes do evento. - Importe os dados eletrofisiológicos, taxa amostrada de 1000 Hz, para o MATLAB (Arquivo Suplementar 2).
- Coordene a exibição de sinalização de cálcio e dados eletrofisiológicos em alinhamento com marcadores sincronizados.
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Resultados
Combinamos optogenética com registro eletrofisiológico multirregional e imagens de cálcio para observar a atividade neuronal em várias regiões do cérebro durante convulsões optogenéticas. Para isso, um vírus adeno-associado (AAV) expressando ChrimsonR sob o controle do promotor CaMKIIα (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)16 foi injetado em um sítio epileptogênico clássico, o córtex piriforme (ROI 1)17, em roedores. Além disso, AAV-hsyn-Gcamp6m18 foi injet...
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Discussão
Aqui, empregamos um dispositivo optrode feito por nós mesmos para gravação de sinais neurais in vivo em várias regiões. A viabilidade deste sistema para estimulação optogenética simultânea, registro de sinal de cálcio e registro eletrofisiológico foi validada. O método de preparação do eletrodo aqui descrito é eficiente e econômico. De acordo com o projeto experimental, poderíamos registrar sinais de regiões cerebrais relevantes. O arranjo estratégico de optrodes permite a extra...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes a divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31871085), Fundação de Ciências Naturais de Xangai (21ZR1407300), Projeto Principal de Ciência e Tecnologia Municipal de Xangai (2018SHZDZX01), ZJ Lab e Centro de Ciência do Cérebro e Tecnologia Inspirada no Cérebro de Xangai.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Adaptador 8-32 | Plexon | Personalizado Conecte | o conector fêmea e o headstage |
| AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry | Taitool Bioscience | S0371-9 | 4 x 1012 VG/mL |
| AAV-hsyn-Gcamp6m | Taitool Bioscience | S0471-9 | 4 x 1012 VG/mL |
| DAPI | Sigma | 236276 | Titered 1:500 |
| Dental Cement | New Century Dental | 430205 | |
| Sistema de registros eletrofisiológicos | Plexon | Omniplex | |
| Fio esmaltado | N/A | Personalizado encomendado | Diâmetro = 0,2 mm |
| Conector fêmea | N/A | Personalizado encomendado | passo de 1,25 mm |
| Cola | Loctite | 45282 | |
| Laser | Changchun New Industries | BH81563 | 635 nm |
| MATLAB | MathWorks | R2021b | |
| Microdrill | RWD | 78001 | |
| Fotometria de fibra multicanal | ThinkerTech | FPS-SS-MC-LED | |
| Fibra óptica | Xi'an Bogao | L-200UM | Selecione o comprimento de fibra apropriado com base na profundidade das regiões cerebrais alvo. |
| Fio de tungstênio revestido com PFA | A-M System | 795500 | Nu 0,002"; Revestido 0,0040 " |
| de potência | Thorlabs | PM100D | |
| Estereotáxico Fxrame | RWD | 68807 | |
| Adesivo de tecido | 3M | 1469SB |
Referências
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Reimpressões e permissões
