Method Article

Um método integrado para criar otérios eletrofisiológicos flexíveis e convenientes para gravação in vivo em várias regiões

DOI:

10.3791/67071

⸱

November 21st, 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desenvolvemos uma abordagem simplificada e econômica para a fabricação de eletrodos e realizamos gravações de sinais em várias regiões em camundongos em movimento livre. A utilização da optogenética, juntamente com a eletrofisiologia multirregional e o registro do sinal de cálcio, permitiu a revelação de atividades neuronais em todas as regiões do modelo de acendimento de convulsões.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A epilepsia é um distúrbio neurológico caracterizado por descargas anormais sincronizadas envolvendo várias regiões do cérebro. As lesões focais facilitam a propagação de sinais epilépticos através de circuitos neurais associados. Portanto, o registro in vivo do potencial de campo local (LFP) das regiões críticas do cérebro é essencial para decifrar os circuitos envolvidos na propagação das convulsões. No entanto, os métodos atuais para fabricação e implantação de eletrodos carecem de flexibilidade. Aqui, apresentamos um dispositivo útil projetado para registros eletrofisiológicos (LFPs e eletroencefalografia [EEG]) em várias regiões. Além disso, integramos perfeitamente a manipulação optogenética e o registro de sinalização de cálcio com o registro LFP. Pós-descargas robustas foram observadas em várias regiões separadas durante crises epilépticas, acompanhadas por aumento da sinalização de cálcio. A abordagem usada neste estudo oferece uma estratégia conveniente e flexível para gravações neurais síncronas em diversas regiões do cérebro. Ele tem o potencial de avançar na pesquisa sobre distúrbios neurológicos, fornecendo insights sobre os perfis neurais de várias regiões envolvidas nesses distúrbios.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A epilepsia é uma condição neurológica comum caracterizada por convulsões recorrentes, que se manifestam como convulsões, distúrbios sensoriais e perda de consciência1. Os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à epilepsia são complexos e envolvem múltiplas regiões cerebrais interconectadas 2,3. Avanços recentes em neuroimagem lançaram luz sobre as redes de grande escala envolvidas na epilepsia 4,5. No entanto, a compreensão dos intrincados circuitos e mecanismos de rede subjacentes à geração e propagação da epilepsia permanece limitada, em parte devido à aplicação insuficiente de técnicas de registro neural multirregional6. Portanto, é imperativo desenvolver um método flexível e integrado capaz de monitorar simultaneamente a atividade neural em regiões cerebrais díspares.

Registros eletrofisiológicos são realizados para capturar convulsões e determinar a presença de epilepsia7. Exceto para registrar a atividade eletrofisiológica, há uma ênfase crescente na atividade precisa do cálcio de populações neurais específicas em estudos de epilepsia 8,9. Avanços na síntese de indicadores de cálcio e vários projetos de sondas levaram os pesquisadores a adotar a fotometria de fibra para capturar mudanças na atividade neuronal e substâncias neurais dentro do cérebro10,11. Os dois métodos independentes de detecção da atividade neuronal, ou seja, eletrofisiologia e registro de fotometria de fibra, complementam-se, facilitando uma compreensão mais abrangente dos processos neuronais dinâmicos.

Além disso, o registro síncrono e a modulação da atividade neural são fundamentais para obter insights sobre o funcionamento do cérebro nos níveis de rede e celular. Essa abordagem permite que os pesquisadores observem e manipulem os processos complexos do cérebro em tempo real. A optogenética emergiu como uma ferramenta indispensável para sondar a sinalização neural, devido à sua capacidade distinta de estimulação ou inibição seletiva12. Apesar das aplicações generalizadas de registro eletrofisiológico em vários locais na neurociência13, a integração do registro eletrofisiológico multirregional com fotometria de fibra e manipulação optogenética permanece limitada. Mais importante, os métodos atuais para fabricar e implantar eletrodos multirregionais carecem de flexibilidade14. Essas limitações dificultam nossa capacidade de dissecar funções e interações específicas do circuito em várias regiões. Aqui, apresentamos uma abordagem de gravação in vivo multirregional econômica e conveniente que lança luz sobre os processos neuronais em todas as regiões em convulsões induzidas por kindling e outros distúrbios neuropsiquiátricos.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo recebeu aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Fudan e foi conduzido seguindo as diretrizes e regulamentos elaborados pelo Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. Todas as medidas possíveis foram implementadas para minimizar o número de animais utilizados neste estudo. O tempo necessário para executar cada etapa está incluído nas respectivas etapas.

1. Preparação dos eletrodos (Figura 1)

  1. Corte um comprimento apropriado de fio de tungstênio (~ 20 mm) e queime a camada de isolamento em uma extremidade para expor o fio de tungstênio (1,6-2 mm). Dobre a outra extremidade do fio em forma de "L" (veja a Figura 1A, ~ 1 min)
  2. Coloque cuidadosamente a extremidade "L" do fio de tungstênio na fibra óptica (consulte a Figura 1B, ~ 1 min).
    NOTA: O fio de tungstênio deve ser 0,2-0,4 mm mais longo que a ponta da fibra óptica.
  3. Mergulhe uma gota de adesivo e aplique-a na interface da fibra óptica e do fio de tungstênio (veja a Figura 1C, ~ 1 min). Devido à tensão superficial do líquido, o fio de tungstênio se conectará à fibra óptica.
  4. Aplique o adesivo uma vez e deixe secar. Em seguida, aplique uma segunda camada. Isso apertará ainda mais a ligação entre o fio de tungstênio e a fibra óptica (consulte a Figura 1C, ~ 1 min).
    NOTA: Durante o processo de aplicação, deve-se tomar cuidado para evitar que o adesivo escorra para a ponta da fibra óptica, pois isso pode afetar sua transmitância.
  5. No canto da forma de "L", use adesivo para unir a base da fibra óptica e o fio de tungstênio (~ 1 min).
    NOTA: O aumento da área de contato e a solidificação esférica da gota adesiva garantem uma ligação firme entre a fibra óptica e o fio de tungstênio.
  6. Use solda para estabelecer uma conexão entre o fio de tungstênio e o pino do conector fêmea (consulte a Figura 1D, ~ 3 min para cada)
    NOTA: Como o fio de tungstênio não é sensível ao calor, a taxa de sucesso da soldagem pode ser aumentada para quase 100% por uma luva de metal formada cortando a localização do slot do pino para unir fisicamente os dois componentes. Posteriormente, o preenchimento da luva pela solda garante uma conexão estável entre o fio de tungstênio inserido e o pino.
  7. De acordo com o projeto experimental, solde o número necessário de optrodes (veja a Figura 1E, ~ 10 min)
    NOTA: Três optrodes foram utilizados neste estudo.
  8. Corte o fio esmaltado no comprimento apropriado (~30 mm) e queime o isolamento em ambas as extremidades. Enrole uma extremidade do fio esmaltado ao redor da base do parafuso e solde-o. Conecte a outra extremidade do fio esmaltado aos pinos do conector fêmea por meio de um ferro de solda, servindo como registro de EEG e conexão de aterramento para o eletrodo do crânio (consulte a Figura 1F, ~ 5 min)
    NOTA: Devido à flexibilidade do fio esmaltado, é conveniente conectar o crânio e os pinos do conector fêmea. A soldagem após enrolar o fio esmaltado em torno de um parafuso é mais confiável do que a soldagem de montagem em superfície.
  9. Aplique adesivo hot-melt na matriz de pinos do conector fêmea para encapsular o conector fêmea e garantir que as juntas de solda estejam totalmente envolvidas. Durante a solidificação do adesivo hot-melt, molde o adesivo usando uma placa plástica para minimizar a ocupação do espaço durante a implantação (consulte a Figura 1F, ~ 3 min)
    NOTA: Devido aos riscos potenciais de queimadura associados ao uso de cola termofusível, o adesivo AB é considerado uma alternativa mais segura.
  10. Em seguida, use um medidor de intensidade de luz e um multímetro digital para medir a luminosidade e a condutividade. Ao passar nesses testes, a configuração está pronta para uso (consulte a Figura 1G, ~2 min)
    NOTA: Ao trabalhar com lasers, use sempre óculos de proteção adequados ao comprimento de onda e potência específicos da luz laser. Fibras de alta qualidade são necessárias para transmitir pelo menos 80% da luz da extremidade do patch cord para a ponta da fibra implantável. Além disso, a resistência da ponta do fio de tungstênio até a ranhura do cabeçalho do pino foi medida com uma faixa aceitável de 1-5 Ω.
  11. Antes de usar, mergulhe os eletrodos preparados em álcool 75% por 15 min e, em seguida, transfira-os para solução salina estéril (~ 16 min).
    NOTA: O peso total do dispositivo de eletrodo encapsulado (0,6701 ± 0,01123 g, n = 4) não afeta a atividade dos camundongos. Os eletrodos são esterilizados antecipadamente usando esterilização por plasma.

2. Protocolo para implante de eletrodos (Figura 2)

  1. Anestesiar os camundongos com isoflurano (2%-4%) e prendê-los em um aparelho estereotáxico (ver Figura 2A, ~ 2 min). Use pomada para os olhos dos olhos do camundongo para evitar o ressecamento durante a anestesia. Aplique lidocaína na pele ao redor do perímetro da incisão craniana e uma injeção subcutânea de carprofeno na dose de 5 mg / kg.
    NOTA: A anestesia adequada é confirmada pela ausência do reflexo de endireitamento e pela perda de resposta ao beliscão do dedo do pé. Para procedimentos cirúrgicos prolongados, o uso de um anestésico injetável é mais apropriado.
  2. Depois de prender o animal no aparelho estereotáxico, apare o couro cabeludo ao longo da borda do crânio e limpe a superfície do crânio com álcool 75% para expor as posições do bregma e lambda (ver Figura 2B, ~ 3 min).
    NOTA: O procedimento pré-cirúrgico inclui cortar o cabelo, desinfetar o local da cirurgia, pré-esterilizar os instrumentos e ferramentas cirúrgicas.
  3. Nivele o cérebro e faça furos (~ 0,8 mm) acima das regiões de interesse (ROI) usando uma microbroca. Injete os vírus relevantes com uma bomba de seringa (ver Figura 2C - F, ~ 20 min).
    NOTA: Informações detalhadas sobre os vírus e ROIs neste estudo são mostradas na Tabela de Materiais e na Figura 3.
  4. Segure os optrodes com um suporte e mova sua ponta para o ponto bregma, definindo esta posição como 'zero'. Usando o ponto bregma como coordenada de referência, mova os optrodes para as regiões alvo (veja a Figura 2G, ~ 3 min). Posicione os optrodes 0,3 mm acima do local de injeção do vírus.
    NOTA: Na estratégia de implantação vertical, a distância mínima entre os dois eletrodos é de aproximadamente 2 mm, dependendo da espessura da luva de fibra óptica e do diâmetro externo da ponteira. Um método de inserção angular pode ser usado para gravação simultânea de regiões próximas.
  5. Depois de inserir as fibras ópticas nas áreas cerebrais correspondentes, aplique uma pequena quantidade de adesivo tecidual ao redor delas para cobrir o tecido exposto. Em seguida, aplique sequencialmente adesivo adicional e um pouco de cimento dental. Depois que o cimento dentário solidificar, solte o suporte com cuidado (veja a Figura 2H, ~5 min).
  6. Antes de cada novo implante de optrodo, execute a recalibração, que envolve a repetição da etapa 2.4 (consulte a Figura 2I).
    NOTA: Para cada implante, posicione o optrodo no bregma como o ponto 'zero'.
  7. Depois de implantar todos os optrodes, faça os furos atrás do ponto lambda para 'Terra' e acima do neocórtex para 'EEG' usando uma microbroca (~ 1 min).
    NOTA: O tamanho do furo perfurado (~1.1 mm) precisa corresponder ao diâmetro do parafuso.
  8. Insira os parafusos do crânio no orifício acima do córtex e atrás do ponto lambda (ver Figura 2J, ~ 5 min).
    NOTA: Os parafusos de caveira são usados para gravação e aterramento de EEG, respectivamente.
  9. Organize os fios de tungstênio e os fios esmaltados para que fiquem posicionados acima da área de implantação e não expostos fora do crânio. Fixe a posição do conector fêmea usando um suporte (consulte a Figura 2K, ~2 min).
  10. Preencha o local de implantação com cimento dentário para garantir uma conexão estável entre o dispositivo de eletrodo e o crânio. Encapsule os fios internos, deixando os orifícios de inserção do conector fêmea expostos para conexão ao headstage (consulte a Figura 2L, ~ 6 min).
  11. Após o endurecimento do cimento dentário, aplique iodo na pele ao redor do perímetro do couro cabeludo exposto e, em seguida, coloque o animal em uma almofada de aquecimento (~1 min).
    NOTA: Certifique-se de que o animal não seja deixado sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Condições estéreis devem ser mantidas durante toda a cirurgia de sobrevivência.
  12. Administre antibióticos e analgésicos para apoiar a recuperação pós-cirúrgica.
    NOTA: Os animais que foram submetidos a cirurgia não são reintroduzidos na companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados. Os animais receberam injeções intraperitoneais de ceftriaxona sódica (180 mg/kg) e injeções subcutâneas de carprofeno (5 mg/kg), e gel de lidocaína foi aplicado nas feridas cirúrgicas diariamente por 3 dias. Os animais são obrigados a sobreviver por um período designado para completar o teste comportamental. Posteriormente, serão eutanasiados com isoflurano a 4%-5%, seguido de perfusão e secção tecidual para avaliação da infecção viral e dos locais de implantação do eletrodo.

3. Protocolo para registro de cérebro in vivo

  1. Antes de realizar o registro de sinais e testes comportamentais (teste de campo aberto)15, certifique-se de que o mouse seja submetido a um período de 3 dias de manuseio suave para aclimatá-lo ao ambiente.
    NOTA: Neste estudo, os camundongos foram colocados em campo aberto (42 cm × 42 cm) para se movimentarem livremente, permitindo observar seu comportamento convulsivo.
  2. Após anestesiar os camundongos com isoflurano (2%-4%), conecte as fibras ópticas sequencialmente na ordem do local de gravação antes de inserir o headstage.
  3. Defina o pulso de luz de 635 nm com um ciclo de trabalho de 10% a 20 Hz. Configure a estimulação de luz por 10 s (200 pulsos) durante a gravação. Defina a intensidade nas pontas da fibra óptica em 3 mW.
  4. Use um sistema de fotometria de fibra para registrar o período de teste comportamental dos sinais Gcamp6m a uma taxa de amostragem de 30 Hz por canal de LED de 470 nm.
  5. Registre simultaneamente sinais de cálcio, LFPs e EEG sob estimulação optogenética, juntamente com os desempenhos comportamentais correspondentes (ver Figura 3).
  6. Empregue a marcação de sincronização de sinal da lógica transistor-transistor (TTL) para garantir a consistência temporal nos dados registrados.

4. Processamento de dados

  1. Carregue os dados de fotometria no software MATLAB. Em seguida, use a codificação personalizada (Arquivo Suplementar 1) para reduzir a tendência do sinal de cálcio.
  2. Defina as mudanças na intensidade de fluorescência com a equação (1):
    ΔF/F = (Ft - F0)/ F0 (1)
    Onde Ft representa os valores de fluorescência do sinal de cálcio em tempo real e F0 denota a intensidade média de fluorescência basal antes do evento.
  3. Importe os dados eletrofisiológicos, taxa amostrada de 1000 Hz, para o MATLAB (Arquivo Suplementar 2).
  4. Coordene a exibição de sinalização de cálcio e dados eletrofisiológicos em alinhamento com marcadores sincronizados.

Results

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Combinamos optogenética com registro eletrofisiológico multirregional e imagens de cálcio para observar a atividade neuronal em várias regiões do cérebro durante convulsões optogenéticas. Para isso, um vírus adeno-associado (AAV) expressando ChrimsonR sob o controle do promotor CaMKIIα (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)16 foi injetado em um sítio epileptogênico clássico, o córtex piriforme (ROI 1)17, em roedores. Além disso, AAV-hsyn-Gcamp6m18 foi injetado em três regiões (ROI 1-3, conforme mostrado na Figura 3A). Posteriormente, optrodes personalizados foram implantados nessas regiões e eletrodos de EEG foram implantados no crânio contralateral (Figura 3B).

ChrimsonR e Gcamp6m foram altamente expressos nas regiões cerebrais alvo (Figura 3C) 4 semanas depois. Os camundongos exibiram comportamentos convulsivos generalizados após uma breve fotoestimulação de 10 s a 20 Hz para ativar os neurônios ChrimsonR-positivos. Coletamos as atividades de cálcio e os sinais LFP das ROIs em camundongos em movimento livre, empregando técnicas simultâneas de fotometria e eletrofisiologia multifibras (Figura 3D). Pós-descargas robustas, juntamente com aumentos notáveis nas atividades de Ca2+ , foram provocados nessas regiões por breve estimulação optogenética (Figura 3E). Uma resposta de 30 Hz foi observada na região optoestimulante, induzida pela ativação de proteínas optogenéticas por meio de um LED de luz azul em uma frequência de amostragem de 30 Hz. Nenhuma interferência da linha de energia de 50 Hz foi observada nos canais de gravação. Esses resultados demonstraram o registro confiável de respostas eletrofisiológicas e de sinalização de cálcio sincronizadas em várias regiões sob estimulação optogenética.

figure-results-1
Figura 1: Projeto esquemático de optrode flexível. (A) Preparação dos fios de tungstênio em forma de "L" e fibras ópticas. (B) As fibras ópticas e os fios de tungstênio foram posicionados na fita adesiva. (C) A fibra óptica e o fio de tungstênio foram colados usando cola. (D, E) Os fios de tungstênio foram soldados ao conector. (F) Os parafusos foram soldados ao conector e o conector foi encapsulado com adesivo hot melt. (G) Foram realizadas inspeções de qualidade no conjunto optrodo. G representa o orifício para o eletrodo de aterramento; R representa o orifício para o eletrodo de referência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Fluxo de trabalho da cirurgia de implantação. (A) O camundongo foi preso em um aparelho estereotáxico. (B) O couro cabeludo foi removido e o crânio foi adequadamente exposto. (C) O tubo de injeção de vidro foi conectado à bomba. (D) A cabeça do rato foi ajustada para uma posição horizontal. (E, F) Buracos foram perfurados e o vírus foi injetado. (G) O optrode foi agarrado pelo titular. (H) O optrodo foi implantado em uma área relacionada e fixado com cimento dentário. (I) Reajustar a posição zero antes de cada implante. (J) Os eletrodos de EEG foram implantados após o implante do optrodo. G/R: o eletrodo terra e o eletrodo de referência foram curto-circuitados nas posições dos pinos. (K) Os fios foram dispostos em ordem e o conector foi fixado. (L) O dispositivo de eletrodo foi envolto e fixado com cimento dentário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Registro eletrofisiológico e de cálcio síncrono in vivo . (A) Projeto experimental para injeções virais. (B) Esquema experimental de implantação de optrodo. (C) Imagens confocais mostram a expressão do vírus nas áreas-alvo. Barra de escala = 200 μm. (D) Esquema de estimulação optogenética, eletrofisiológico síncrono e registro de cálcio em um estado de movimento livre. (E) Traços representativos de sinais de cálcio (superior), sinais LFP (médio), EEG (inferior) e espectrogramas de potência correspondentes. Linha vermelha: luz de 10 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Arquivos de codificação para sinal de cálcio. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Arquivos de codificação para sinal LFP. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, empregamos um dispositivo optrode feito por nós mesmos para gravação de sinais neurais in vivo em várias regiões. A viabilidade deste sistema para estimulação optogenética simultânea, registro de sinal de cálcio e registro eletrofisiológico foi validada. O método de preparação do eletrodo aqui descrito é eficiente e econômico. De acordo com o projeto experimental, poderíamos registrar sinais de regiões cerebrais relevantes. O arranjo estratégico de optrodes permite a extração potencial de informações abundantes de várias regiões do cérebro. A integração de paradigmas de detecção multimodal oferece oportunidades para dissecar circuitos neurais intrincados, elucidando as relações entre as regiões do cérebro.

Nos dados representativos do presente estudo, os sinais de cálcio e os sinais eletrofisiológicos de neurônios de amplo espectro de toda a região local do cérebro foram registrados simultaneamente. Seguindo os avanços na tecnologia de construção de animais transgênicos19,20, a combinação de camundongos Cre e FlpO com o vírus expressing-Gcamp permite o registro da atividade neural de neurônios específicos. Portanto, esse método nos permite decodificar as respostas de neurônios específicos em diferentes regiões do cérebro por meio dessas abordagens integradas. Além disso, diversos métodos analíticos serão benéficos na análise dos sinais eletrofisiológicos e de cálcio coletados de várias regiões do cérebro. Por exemplo, a análise de coerência e a análise de causalidade de Granger podem ser empregadas para obter novas características teóricas de comunicação entre diferentes regiões cerebrais 21,22,23. Além disso, os avanços nas técnicas de rastreamento de circuitos ajudam a desvendar as conexões estruturais entre as regiões do cérebro24. Essas tecnologias integradas melhoraram a compreensão das respostas associadas em várias áreas do cérebro e revolucionaram a compreensão da conexão e interação em circuitos e redes.

Neste estudo, empregamos modelagem optogenética de epilepsia. A optogenética oferece não apenas maior resolução temporal, mas também maior especificidade celular em comparação com a estimulação elétrica no modelo de epilepsia25,26. Além disso, permite que a entrega de luz e o registro de cálcio sejam realizados através da mesma fibra óptica. As detecções de atividade multirregional e modulações optogenéticas complementarão os métodos de intervenção em epilepsia de circuito fechado, permitindo intervenções regulatórias em várias regiões do cérebro por meio de modulação inibitória, aumentando assim os efeitos antiepilépticos27,28. Também é importante que esses dispositivos sejam combinados com outras tecnologias de neuromodulação existentes para a detecção e intervenção em circuito fechado da dor crônica29,30. Além disso, essa abordagem pode se estender a outros distúrbios neurológicos, como distúrbios do sono31 e doença de Alzheimer, onde fenômenos como oscilações de 40 Hz e processamento de informações após entrada sensorial requerem elucidação por meio de gravação in vivo multirregional32. Portanto, a aplicação hábil dessa abordagem multifacetada aprofundará nossa compreensão das interações entre várias regiões e fornecerá informações valiosas para terapias de precisão em várias doenças.

Existem limitações neste método de detecção de optrodos, que podem ser melhoradas em pesquisas futuras. Embora os sinais LFP tenham sido prontamente adquiridos, a detecção de atividades de pico permaneceu um desafio com o método atual33. Nosso objetivo é substituir o fio de tungstênio por eletrodos flexíveis multicanal. A espessura da fibra e a segurança do adesivo de cola devem ser cuidadosamente consideradas.

Disclosures

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31871085), Fundação de Ciências Naturais de Xangai (21ZR1407300), Projeto Principal de Ciência e Tecnologia Municipal de Xangai (2018SHZDZX01), ZJ Lab e Centro de Ciência do Cérebro e Tecnologia Inspirada no Cérebro de Xangai.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Adaptador 8-32PlexonPersonalizado Conecteo conector fêmea e o headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherryTaitool BioscienceS0371-94 x 1012 VG/mL 
AAV-hsyn-Gcamp6mTaitool BioscienceS0471-94 x 1012 VG/mL 
DAPISigma236276Titered 1:500
Dental CementNew Century Dental430205
Sistema de registros eletrofisiológicosPlexonOmniplex
Fio esmaltadoN/APersonalizado encomendadoDiâmetro = 0,2 mm
Conector fêmeaN/APersonalizado encomendadopasso de 1,25 mm
ColaLoctite45282
LaserChangchun New IndustriesBH81563635 nm 
MATLABMathWorksR2021b
MicrodrillRWD78001
Fotometria de fibra multicanalThinkerTechFPS-SS-MC-LED
Fibra ópticaXi'an BogaoL-200UMSelecione o comprimento de fibra apropriado com base na profundidade das regiões cerebrais alvo.
Fio de tungstênio revestido com PFAA-M System795500Nu 0,002"; Revestido 0,0040 "
de potênciaThorlabsPM100D
Estereotáxico FxrameRWD68807
Adesivo de tecido3M1469SB
medidor

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Devinsky, O., et al. Epilepsy. Nat Rev Dis Primers. 4, 18024(2018).
  2. Piper, R. J., et al. Towards network-guided neuromodulation for epilepsy. Brain. 145 (10), 3347-3362 (2022).
  3. Bertram, E. H. Neuronal circuits in epilepsy: Do they matter. Exp Neurol. 244, 67-74 (2013).
  4. Goodman, A. M., Szaflarski, J. P. Recent advances in neuroimaging of epilepsy. Neurotherapeutics. 18 (2), 811-826 (2021).
  5. Caciagli, L., Bernhardt, B. C., Hong, S. J., Bernasconi, A., Bernasconi, N. Functional network alterations and their structural substrate in drug-resistant epilepsy. Front Neurosci. 8, 411(2014).
  6. Dai, Y., et al. In vivo microelectrode arrays for detecting multi-region epileptic activities in the hippocampus in the latent period of rat model of temporal lobe epilepsy. Micromachines (Basel). 12 (6), 659(2021).
  7. Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A. Electrophysiological biomarkers of epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 334-346 (2014).
  8. Grienberger, C., Giovannucci, A., Zeiger, W., Portera-Cailliau, C. Two-photon calcium imaging of neuronal activity. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 67(2022).
  9. Akerboom, J., et al. Optimization of a gcamp calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive gcamp calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615 (7954), 884-891 (2023).
  11. Wu, Z., Lin, D., Li, Y. Pushing the frontiers: Tools for monitoring neurotransmitters and neuromodulators. Nat Rev Neurosci. 23 (5), 257-274 (2022).
  12. Vierock, J., et al. Bipoles is an optogenetic tool developed for bidirectional dual-color control of neurons. Nat Commun. 12 (1), 4527(2021).
  13. Luo, W., et al. Acquiring new memories in neocortex of hippocampal-lesioned mice. Nat Commun. 13 (1), 1601(2022).
  14. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  15. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods Mol Biol. 1916, 99-103 (2019).
  16. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  17. Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Front Neural Circuits. 9, 27(2015).
  18. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  19. Birling, M. C., Dierich, A., Jacquot, S., Herault, Y., Pavlovic, G. Highly-efficient, fluorescent, locus directed cre and flpo deleter mice on a pure c57bl/6n genetic background. Genesis. 50 (6), 482-489 (2012).
  20. Huang, T., et al. Identifying the pathways required for coping behaviours associated with sustained pain. Nature. 565 (7737), 86-90 (2019).
  21. Likhtik, E., Stujenske, J. M., Topiwala, M. A., Harris, A. Z., Gordon, J. A. Prefrontal entrainment of amygdala activity signals safety in learned fear and innate anxiety. Nat Neurosci. 17 (1), 106-113 (2014).
  22. Tavares, L. C. S., Tort, A. B. L. Hippocampal-prefrontal interactions during spatial decision-making. Hippocampus. 32 (1), 38-54 (2022).
  23. Lu, Y., et al. Optogenetic dissection of ictal propagation in the hippocampal-entorhinal cortex structures. Nat Commun. 7, 10962(2016).
  24. Liu, Q., Wu, Y., Wang, H., Jia, F., Xu, F. Viral tools for neural circuit tracing. Neurosci Bull. 38 (12), 1508-1518 (2022).
  25. Christenson Wick, Z., Krook-Magnuson, E. Specificity, versatility, and continual development: The power of optogenetics for epilepsy research. Front Cell Neurosci. 12, 151(2018).
  26. Paschen, E., et al. Hippocampal low-frequency stimulation prevents seizure generation in a mouse model of mesial temporal lobe epilepsy. Elife. 9, e54518(2020).
  27. Gummadavelli, A., Zaveri, H. P., Spencer, D. D., Gerrard, J. L. Expanding brain-computer interfaces for controlling epilepsy networks: Novel thalamic responsive neurostimulation in refractory epilepsy. Front Neurosci. 12, 474(2018).
  28. Vandekerckhove, B., et al. Technological challenges in the development of optogenetic closed-loop therapy approaches in epilepsy and related network disorders of the brain. Micromachines (Basel). 12 (1), 38(2020).
  29. Li, Z. J., Zhang, L. B., Chen, Y. X., Hu, L. Advancements and challenges in neuromodulation technology: Interdisciplinary opportunities and collaborative endeavors. Sci Bull (Beijing). 68 (18), 1978-1982 (2023).
  30. Zhang, Q., et al. A prototype closed-loop brain-machine interface for the study and treatment of pain. Nat Biomed Eng. 7 (4), 533-545 (2023).
  31. Varela, C., Wilson, M. A. Mpfc spindle cycles organize sparse thalamic activation and recently active ca1 cells during non-rem sleep. Elife. 9, e48881(2020).
  32. Adaikkan, C., et al. Gamma entrainment binds higher-order brain regions and offers neuroprotection. Neuron. 102 (5), 929-943.e8 (2019).
  33. Muthmann, J. O., et al. Spike detection for large neural populations using high density multielectrode arrays. Front Neuroinform. 9, 28(2015).

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