Artigo de método

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

DOI:

10.3791/67078

⸱

26 de julho de 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology, University of Saskatchewan

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma co-cultura microglia-neuronal estabelecida a partir de células neuronais primárias isoladas de embriões de camundongos nos dias embrionários 15-16 e microglia primária gerada a partir dos cérebros de camundongos neonatais nos dias pós-natais 1-2.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microglia são macrófagos residentes nos tecidos do sistema nervoso central (SNC), desempenhando inúmeras funções que apoiam a saúde neuronal e a homeostase do SNC. Eles são uma importante população de células imunes associadas à atividade da doença do SNC, adotando fenótipos reativos que potencialmente contribuem para a lesão neuronal durante doenças neurodegenerativas crônicas, como a esclerose múltipla (EM). Os mecanismos distintos pelos quais a microglia regula a função neuronal e a sobrevivência durante a saúde e a doença permanecem limitados devido aos desafios na resolução das complexas interações in vivo entre microglia, neurônios e outros fatores ambientais do SNC. Assim, a abordagem in vitro de co-cultura de microglia e neurônios continua sendo uma ferramenta valiosa para estudar as interações microglia-neuronais. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e co-cultura de micróglia primária e neurônios de camundongos. Especificamente, a microglia foi isolada após 9-10 dias in vitro de uma cultura mista de glia estabelecida a partir de homogeneizados cerebrais derivados de camundongos neonatais entre os dias pós-natais 0-2. As células neuronais foram isoladas do córtex cerebral de embriões de camundongos entre os dias embrionários 16-18. Após 4-5 dias in vitro, as células neuronais foram semeadas em placas de 96 poços, seguidas pela adição de microglia para formar a co-cultura. O tempo cuidadoso é fundamental para este protocolo, pois ambos os tipos de células precisam atingir a maturidade experimental para estabelecer a co-cultura. No geral, essa co-cultura pode ser útil para estudar as interações microglia-neurônio e pode fornecer várias leituras, incluindo microscopia de imunofluorescência, imagens ao vivo, bem como ensaios de RNA e proteínas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microglia são macrófagos residentes no tecido que facilitam a imunovigilância e a homeostase no sistema nervoso central (SNC)1,2,3. Originam-se de células progenitoras eritromieloides do saco vitelino que colonizam o cérebro durante o desenvolvimento embrionário 4,5,6 e são mantidas ao longo da vida do organismo por meio da auto-renovação, que envolve proliferação e apoptose7. No estado estacionário, a microglia em repouso tem morfologia ramificada e se envolve na vigilância tecidual 8,9,10.

A micróglia expressa numerosos receptores de superfície celular, o que lhes permite responder rapidamente a alterações no SNC11,12 e promover respostas inflamatórias em caso de infecções ou lesão tecidual 12,13,14, bem como durante doenças neurodegenerativas 9,15, como a esclerose múltipla (EM)16,17. A microglia também expressa receptores para vários neurotransmissores e neuropeptídeos 18,19,20, o que sugere que eles também podem responder e regular a atividade neuronal21,22. De fato, a microglia e os neurônios interagem em várias formas de comunicação bidirecional 8,23, como interações diretas mediadas por proteínas de membrana ou interações indiretas por meio de fatores solúveis ou células intermediárias23,24.

Por exemplo, vários neurotransmissores secretados pelos neurônios podem modular a atividade neuroprotetora ou inflamatória da microglia 25,26,27. Além disso, as interações diretas entre neurônios e microglia ajudam a manter a microglia em um estado homeostático28. Por outro lado, as interações diretas da micróglia com os neurônios podem moldar os circuitos neuronais29 e influenciar a sinalização neuronal 30,31,32. Como as interrupções dessas interações induzem hiperexcitabilidade dos neurônios30 e reatividade da microglia33,34, as interações microglia-neuronais desreguladas são implicadas como um fator contribuinte para doenças neurológicas33,35. De fato, doenças psicóticas23,26 e neurodegenerativas foram descritas como exibindo interações microglia-neuronais disfuncionais33. Embora essas observações destaquem a importância da comunicação microglia-neuronal no SNC, mecanismos específicos de como essas interações regulam as funções microgliais e neuronais na saúde e na doença são relativamente desconhecidos.

Dentro de um ambiente complexo como o SNC, vários fatores ambientais podem influenciar as interações microglia-neuronal, o que limita a capacidade de estudar interações celulares transitórias in vivo. Aqui, apresentamos um sistema de co-cultura microglia-neuronal in vitro que pode ser usado para estudar interações celulares diretas entre microglia e neurônios. Este protocolo descreve a geração de micróglia primária e neurônios a partir dos córtices de camundongos neonatais entre os dias 0-2 pós-natais e os dias 16-18 de camundongos embrionários, respectivamente. Neurônios e microglia são então co-cultivados em placas de 96 poços para experimentos de alto rendimento a jusante. Anteriormente, usamos essa abordagem para demonstrar que a fagocitose da microglia protege os neurônios da morte celular mediada por fosfatidilcolina oxidada37, sugerindo que esse método pode ajudar a entender os papéis da microglia no contexto da neurodegeneração e da EM. Da mesma forma, as co-culturas microglia-neuronais também podem ser úteis para investigar o impacto da diafonia microglia-neuronal em outros contextos, como infecções virais38 ou lesão e reparo neuronal39. No geral, os sistemas de co-cultura microglia-neuronal in vitro permitem que os pesquisadores estudem as interações microglia-neuronais em um ambiente manipulável e controlado, que complementa os modelos in vivo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os animais utilizados neste estudo foram alojados e manuseados com a aprovação do Comitê Universitário de Cuidados com Animais (UACC) da Universidade de Saskatchewan e do Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC). Dias pós-natais 0-2 camundongos CD1 machos e fêmeas e embriões embrionários dias 16-18 (E16-18) de camundongos CD1 prenhes foram usados para este estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura primária da microglia

NOTA: É crucial cronometrar as culturas mistas de glia e neuronais para que a microglia esteja madura e pronta para a colheita dentro de 2 dias após os neurônios serem semeados em uma placa de 96 poços.

  1. Preparação
    1. Meios de cultura completos pré-aquecidos da glia, que incluem o meio de águia modificado (DMEM) de Dulbecco com glicose alta suplementada com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor, 50 U/mL de penicilina/estreptomicina com 2,92 mg/mL de L-glutamina, 1mM de piruvato de sódio, 1x aminoácidos não essenciais e 20 mM de HEPES em banho-maria a 37 °C.
    2. Adicionar 5 ml de bromidrato de poli-L-ornitina (PO) a 10 μg/ml em cada balão T-75. Rode suavemente o balão para garantir que o PO cobre completamente o fundo do balão. Incubar a 37 °C em uma incubadora de CO5% 2 por pelo menos 1 h.
      NOTA: Esta etapa de revestimento é necessária para facilitar a adesão das células aos frascos T-75.
  2. Isolamento de cérebros de camundongos neonatais P0-P2
    NOTA: Esterilize todas as ferramentas de dissecação e mantenha a esterilidade dos reagentes. Garanta a adesão às técnicas assépticas em todo o processo.
    1. Antes de iniciar a dissecação, borrife a bancada com etanol 70% ou spray desinfetante onde a dissecação ocorrerá. Configure o microscópio de dissecção e coloque a placa de Petri sob o microscópio. Despeje 20 mL do meio L-15 de Leibovitz na placa de Petri. Mantenha a tampa da placa de Petri colocada enquanto o microscópio não estiver em uso para reduzir a contaminação.
    2. Coloque várias camadas de papel toalha e borrife bem as toalhas de papel com etanol 70%. Prepare as ferramentas de dissecção (tesoura de dissecação, um par de micropinças e pinças de tecido) borrifando-as completamente com etanol a 70% e colocando as ferramentas sobre as toalhas de papel.
    3. Transfira os dias pós-parto 0-2 para as toalhas de papel e borrife bem o camundongo com etanol 70%. Decapite o camundongo usando uma tesoura de dissecção (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
    4. Enquanto segura suavemente a cabeça, crie uma incisão na linha média do crânio, começando do pescoço ao nariz. Descasque o crânio com uma pinça de tecido para revelar o cérebro.
    5. Usando uma pinça de tecido, retire suavemente o cérebro inserindo a pinça sob o cérebro e levante o cérebro da cabeça. Coloque imediatamente o cérebro na placa de Petri contendo 20 mL de meio L-15 de Leibovitz.
    6. Sob um microscópio de dissecação, remova cuidadosamente o tronco cerebral e as meninges usando um par de micropinças. Colete os cérebros em um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mL de meio L-15 de Leibovitz.
  3. Dissociação cerebral, semeadura e manutenção de cultura de glia mista
    NOTA: Execute todas as etapas subsequentes em um gabinete de biossegurança.
    1. Pique os cérebros em pedaços de aproximadamente 1 mm2 com uma lâmina de bisturi descartável estéril. Transfira cuidadosamente os cérebros picados para um novo tubo estéril de 50 mL.
    2. Aos cérebros picados, adicione uma concentração final de tripsina a 0,25% e incube o tecido em banho-maria a 37 °C por 20 min. A cada 2-3 minutos, misture a solução invertendo suavemente o tubo para ajudar na dissociação do tecido.
    3. Da incubadora de CO5% 2 , transfira os frascos T-75 contendo 5 mL de PO para a cabine de biossegurança. Descarte o PO e enxágue os frascos 3 vezes com solução tampão fosfato 1x estéril (PBS). Certifique-se de enxaguar bem os frascos, pois o excesso de PO é tóxico para as células.
    4. Transferir o tecido digerido do banho-maria a 37 °C para a cabina de biossegurança. Adicione 5 mL de meios de cultura glia completos para neutralizar a tripsina. Misture suavemente a suspensão de tecido usando uma pipeta de 10 mL.
    5. Coloque um filtro de células de malha de nylon estéril de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL e molhe a malha despejando cerca de 5 mL de L-15. Transvase cuidadosamente a suspensão celular através do filtro celular. Remova o êmbolo de uma seringa estéril de 1 mL, triture o tecido na malha usando o êmbolo para se livrar dos aglomerados de tecido e gere uma suspensão celular homogeneizada.
    6. Periodicamente, despeje aproximadamente 5 mL do meio L-15 de Leibovitz na malha de náilon de 70 μm e continue triturando o tecido na malha com o êmbolo de seringa de 1 mL. Quando pouco ou nenhum tecido visível permanecer na tela, descarte a malha e deixe a suspensão celular de lado.
    7. Misture a suspensão celular pipetando suavemente para cima e para baixo. Em cada frasco, adicionar volumes iguais de suspensão celular contendo 1-2 cérebros com meios de cultura de glia até um volume final de 15 ml.
    8. Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% durante a noite. No dia seguinte, lave os frascos duas vezes com 1x PBS estéril para remover células soltas e detritos.
    9. Adicione 15 ml de meios de cultura de glia completos frescos à cultura e incube a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5%. Após 3 dias, troque metade do meio por 10 mL de meio de cultura de glia fresco suplementado com 40 ng/mL de fator estimulador de colônias de macrófagos (MCSF).
      NOTA: Depois disso, metade do meio é substituído por 10 mL de meio de cultura de glia fresco suplementado com 40 ng/mL de MCSF a cada 3 dias. A cultura é mantida por 8 a 10 dias antes da colheita da micróglia.

2. Cultura de neurônios primários

  1. Preparação
    1. Descongele o suplemento B-27 plus do sistema de cultura neuronal B-27 plus. Pré-aqueça o meio neurobasal mais do sistema de cultura neuronal B-27 plus, 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) e soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) a 37 °C em banho-maria.
    2. Cobrir os balões T-25 com 5 ml de 10 μg/ml PO e incubar os balões durante, pelo menos, 1 hora a 37 °C. Prepare instrumentos e suprimentos para dissecação.
      NOTA: Esta etapa de revestimento facilita a adesão da célula aos frascos T-25.
  2. Isolamento cerebral de embriões de camundongos E16-E18
    NOTA: Esterilize todas as ferramentas de dissecação e mantenha a esterilidade dos reagentes. Garanta a adesão às técnicas assépticas em todo o processo.
    1. Antes de iniciar a dissecação, borrife a bancada com etanol 70% ou spray desinfetante onde a dissecação ocorrerá. Configure o microscópio de dissecção e coloque a placa de Petri sob o microscópio. Despeje 20 mL de 1x HBSS na placa de Petri. Mantenha a tampa da placa de Petri colocada enquanto o microscópio não estiver em uso para reduzir a contaminação.
    2. Coloque várias camadas de papel toalha e borrife bem as toalhas de papel com etanol 70%. Prepare as ferramentas de dissecção (tesoura de mola, um par de micropinças e pinças de tecido) borrifando-as completamente com etanol a 70% e colocando as ferramentas sobre as toalhas de papel.
    3. Anestesiar um camundongo prenhe entre os dias 16-18 de gestação usando isoflurano e sacrificar o camundongo por luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
    4. Coloque o rato de costas em um pedaço de papel toalha embebido em etanol a 70%. Desinfete a área abdominal com etanol 70%. Levante a pele da parte inferior do abdômen com uma pinça de tecido e faça uma incisão em forma de V deste ponto até a caixa torácica inferior com uma tesoura de dissecação.
    5. Pegue os cornos uterinos contendo os embriões com uma pinça de tecido e remova suavemente os embriões da cavidade abdominal. Desinfete brevemente os cornos uterinos contendo embriões com etanol a 70%.
    6. Disseque um embrião de seu saco individual de cada vez. Usando uma tesoura de mola, crie uma incisão na linha média na parte superior do crânio, começando da nuca até o nariz. Em seguida, levante o crânio do local da incisão para revelar o cérebro. Retire suavemente o cérebro com uma pinça de tecido e transfira o cérebro para uma placa de Petri de 10 cm contendo 15 mL de 1x HBSS.
    7. Sob um microscópio de dissecação, remova cuidadosamente o tronco encefálico e as meninges em ambos os lados dos córtices cerebrais com um par de microfórceps. Transfira os córtices cerebrais para um tubo cônico de 50 mL contendo 10 mL de 1x HBSS e coloque no gelo.
  3. Dissociação cerebral e semeadura de neurônios corticais em cultura de células
    NOTA: Execute todas as etapas subsequentes em um gabinete de biossegurança.
    1. Pique os cérebros em aproximadamente 1 mm2 pedaços no tubo cônico de 50 mL com uma lâmina de bisturi descartável estéril. Transfira os cérebros picados para um novo tubo cônico estéril de 50 mL.
    2. Adicione tripsina ao tubo com uma concentração final de 0,25%. Mergulhe o tubo em banho-maria a 35-38 °C por 15 min e misture suavemente o tubo para homogeneizar o tecido a cada 2-3 min.
    3. Retire o tubo do banho-maria. Pipete suavemente a suspensão de tecido para cima e para baixo para dissociar ainda mais as células e, em seguida, adicione 0,5 mL de FBS inativado por calor à suspensão homogeneizada para neutralizar a atividade da tripsina. Evite bolhas de ar para minimizar a toxicidade para as células neuronais.
    4. Coloque um filtro de células de malha de náilon estéril de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL e molhe a malha adicionando cerca de 5 mL de meio neurobasal. Filtrar a suspensão celular através do filtro de células de malha de nylon de 70 μm. Usando um êmbolo de seringa de 1 mL, triture suavemente o tecido no filtro de células. Despeje periodicamente aproximadamente 5 mL de 1x HBSS enquanto continua a moer para lavar o filtro da célula.
    5. Centrifugar o tubo cónico a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Durante esse período, dilua o suplemento B-27 plus em meio neurobasal plus até 1x a concentração final para usar como meio neurobasal completo.
    6. Descarte o PO nos frascos T-25 e lave os frascos três vezes com 5 mL de 1x PBS.
    7. Transvase cuidadosamente para remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular pipetando suavemente para cima e para baixo 2-3 mL de meio neurobasal completo. Determine a concentração celular e o número total de células com um hemocitômetro e azul de tripano. Espere até 1,0 x 107 células por embrião.
    8. Plaquear as células nos frascos T-25 revestidos com PO com aproximadamente 2,0 x 107 células por frasco em 5 ml de meio neurobasal completo. Incubar a cultura de células a 37 °C em uma incubadora de CO5% 2 .
    9. Realize uma meia troca de meio a cada 2-3 dias, substituindo 2,5 mL de meio do frasco de cultura por meio neurobasal completo recém-feito.

3. Co-cultura de neurônios primários e microglia

NOTA: Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança estéril.

  1. Semeando neurônios em placas de 96 poços
    1. Adicionar 100 μL de 10 μg/ml PO por alvéolo e incubar os frascos durante, pelo menos, 1 h a 37 °C para revestir os alvéolos com PO. Lave a placa com 1x PBS 3 vezes antes de semear as células e aspire o líquido restante após a última lavagem.
    2. Os neurônios cultivados em frascos T-25 são colhidos para co-cultura após 2-5 dias em cultura. Substitua o meio por 5 mL de 1x solução Versene com 0,25% de tripsina e 1 mg/mL de DNase I para separar os neurônios do frasco. Coloque os frascos dentro da incubadora por 5-6 minutos para digestão e gire suavemente o frasco a cada 2-3 minutos para ajudar no descolamento celular.
    3. Retirar o balão da incubadora e verificar se as células estão separadas ao microscópio. Adicione 0,5 mL de FBS inativado por calor para neutralizar a tripsina e a DNase I. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Lave o frasco com 5 mL de meio neurobasal completo uma vez para maximizar os neurônios coletados. Colete todas as células no mesmo tubo cônico de 15 mL.
    4. Centrifugar a suspensão da célula a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet celular em 2-3 mL de meio neurobasal completo.
    5. Conte as células com um hemocitômetro e adicione meios neurobasais completos para atingir uma concentração final de 7,5 x 105 neurônios / mL. Semear 100 μL da suspensão celular para cada poço na placa de 96 poços revestida com PO para obter 7,5 x 104 neurônios / poço. Espera-se um rendimento de 5-6 milhões de neurônios por frasco.
    6. Incube os neurônios em uma placa de 96 poços durante a noite. Adicione 100 μL de meio neurobasal completo a cada poço no dia seguinte.
      NOTA: Uma vez que os neurônios exibem o crescimento apropriado do processo de neurite (por volta do dia 3-4 após a semeadura em placas de 96 poços), eles estão prontos para co-cultura com a microglia.
  2. Isolamento e co-cultura microglia-neuronal
    1. Entre 8 a 10 dias de cultivo de glia mista, colete a microglia lavando suavemente os frascos T-75 com meios de cultura de glia em cada frasco com uma pipeta de 10 mL e transfira as células e os meios para um tubo cônico estéril de 50 mL. Lave os frascos novamente com 10 mL de meio de cultura de glia fresco para separar microglia adicional dos frascos e coletar o meio. Espera-se um rendimento de 7,5 x 105 micróglias por frasco.
    2. Adicionar 20 ml de meios de cultura de glia frescos suplementados com 20 ng/ml de MCSF a cada frasco. A microglia pode ser colhida mais uma ou duas vezes se a cultura mista da glia for mantida.
    3. Centrifugar a recolha de células a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em 2 mL de meio neurobasal completo.
    4. Conte as células com um hemocitômetro e azul de tripano. Adicione meios neurobasais completos a uma concentração final de 2,5 x 105 células / mL.
    5. Da placa de cultura neuronal de 96 poços, remova 100 μL de meio neurobasal e adicione 100 μL de suspensão de células 2,5 x 105 células/mL para semear 2,5 x 104 microglia por poço de 7,5 x 104 neurônios. Incubar a cultura durante a noite a 37 °C em uma incubadora de CO5% 2 para permitir que a microglia se assente. A co-cultura pode agora ser usada para experimentos a jusante.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um fluxograma mostrando as principais etapas da cultura mista da glia para microglia é mostrado na Figura 1A. No geral, células esparsas e detritos celulares excessivos são esperados no dia 1 (Figura 1B). No dia 4, deve-se observar aumento do número de células, principalmente com a geração de astrócitos aderentes, conforme indicado por sua morfologia alongada (Figura 1C). Algumas micróglias podem ser observadas no topo dos astrócitos ou como pequenas células redondas flutuando no meio. No dia 8, uma camada confluente de astrócitos formará as camadas aderentes das células, enquanto a microglia aparecerá como células redondas e brilhantes que estão semi-ligadas aos astrócitos ou flutuando na mídia (Figura 1D). Se a densidade microglial for baixa no dia 8, a cultura pode ser incubada por mais dias antes da colheita.

Um fluxograma mostrando as principais etapas da cultura neuronal é mostrado na Figura 2A. Em uma cultura saudável, os neurônios se ligam e formam processos neuríticos após 1-3 dias in vitro (Figura 2B). Da mesma forma, ao semear neurônios em uma placa de 96 poços, eles aparecerão redondos inicialmente, mas no dia 3, os neurônios devem se tornar aderentes e formar processos neuríticos que se conectam com os neurônios vizinhos (Figura 2C). Por outro lado, as culturas de neurônios insalubres conterão aglomerados de células e detritos celulares, que podem resultar de dissociação celular deficiente ou manuseio incorreto de neurônios (Figura 2D).

Um fluxograma mostrando as principais etapas do protocolo de co-cultura microglia-neuronal é mostrado na Figura 3A. Depois de adicionar 2,5 x 104 microglia a 7,5 x 104 neurônios, microglia redonda e grande deve aparecer no topo ou entre os neurônios e os processos neuritos (Figura 3B). Para visualizar melhor a co-cultura microglia-neuronal, a microglia e os neurônios sozinhos ou em co-cultura foram marcados com anticorpos adaptadores ionizados de ligação ao cálcio 1 (IBA-1, vermelho) e tubulina βIII (TUJ1, verde)37 para microscopia de imunofluorescência (Figura 3C-F).

Processo de cultura celular: suspensão unicelular de córtices de camundongos; etapas mostradas no diagrama; imagens microscópicas.
Figura 1: Visão geral da cultura primária da microglia. (A) Fluxograma das principais etapas na geração de uma cultura mista da glia. (BD) Imagens representativas de microscópio de campo claro de 10x de cultura de glia mista no dia 1 (B), dia 4 (C) e dia 8 (D). Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Diagrama do processo de cultura neuronal; preparação e imagem de células embrionárias de camundongo em placas T25 de 96 poços.
Figura 2: Visão geral da cultura de neurônios primários. (A) Fluxograma das principais etapas na geração de neurônios. (B) Imagens representativas de microscópio de campo brilhante de 10x mostrando neurônios cultivados em frascos T-25. (C) Microscópio representativo de campo brilhante de 10x de neurônios cultivados em uma placa de 96 poços. (D) Microscópio de campo brilhante representativo de 10x de um cluster neuronal insalubre em uma placa de 96 poços. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Fluxo de trabalho de isolamento de microglia e análise de microscopia; As imagens de imunofluorescência exibem marcadores celulares.
Figura 3: Visão geral da co-cultura de microglia-neurônio. (A) Fluxograma das principais etapas para a co-cultura microglia-neuronal. (B) Imagens representativas de microscópio de campo claro de 10x da co-cultura microglia-neuronal em placas de 96 poços. Barras de escala: 100 μm. (C,D) Imagens representativas de microscopia de imunofluorescência de neurônios isolados (C), microglia isolada (D), cocultura de neurônios e micróglia de dia 2 (E) ou cocultura de neurônios e micróglia de 12 dias (F) em uma placa de 96 poços. A microglia e os neurônios são marcados com IBA-1 (vermelho) e tubulina βIII (verde), respectivamente. Os núcleos são corados com DAPI (azul). As imagens de imunofluorescência foram adquiridas usando uma objetiva de imersão em água de 25x, 0,8 NA, com um microscópio de fluorescência de campo amplo. Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve um protocolo para isolar e cultivar neurônios primários de camundongos e microglia primária, que são posteriormente usados para estabelecer uma co-cultura microglia-neuronal que pode ser usada para estudar como as interações entre microglia e neurônios regulam sua saúde e função celular. Essa abordagem relativamente simples e acessível pode fornecer insights críticos sobre os mecanismos e resultados funcionais das interações dos neurônios da microglia no SNC.

Para alcançar uma co-cultura ideal, vários aspectos críticos neste protocolo requerem cuidados extras. Durante os isolamentos cerebrais (etapas 1.2.6 e 2.2.7), as meninges presas à superfície dos cérebros embrionário e pós-natal devem ser removidas completamente antes da coleta dos tecidos. Como outros protocolos de neuroglia, a remoção incompleta das meninges pode resultar na contaminação da cultura de células com células endoteliais ou células derivadas do sangue 40,41,42. Além disso, ao cultivar neurônios primários (etapas 2.3.7 e 3.1.4), é crucial gerar uma suspensão unicelular e evitar aglomerados de células antes de semear neurônios em frascos ou placas de 96 poços. Os agregados neuronais não aderem adequadamente à cultura e levam ao estresse neuronal excessivo e à morte celular. Além disso, o tratamento prolongado de neurônios com tripsina ao tentar dissociá-los dos frascos T-25 pode causar morte celular indesejada (etapa 3.1.2). Para mitigar isso, os neurônios podem ser semeados diretamente em placas de 96 poços na densidade celular desejada após a dissociação dos cérebros embrionários (etapa 2.3.7). Além disso, neste protocolo, uma proporção neurônio: microglia de 3:1 foi selecionada para representar parcialmente uma quantidade elevada de microglia que pode estar presente no microambiente do SNC durante a neuroinflamação. Alternativamente, a proporção de células na co-cultura pode ser ajustada por necessidade experimental. Além disso, o ponto de tempo selecionado para neurônios de co-cultura pode ser estendido se alguém pretende avaliar estados neuronais mais maduros.

Notavelmente, ao dissociar neurônios de frascos T-25 para placas de 96 poços, o uso de tripsina sozinha pode resultar em dissociação incompleta e na formação de aglomerados de células em vez de uma cultura de monocamada em placas de 96 poços (Figura 2D). Para resolver esse problema, os neurônios podem ser dissociados do frasco T-25 usando 1x solução de Versene contendo 1 mg/mL de DNase I. Outros fatores que contribuem para a agregação neuronal e a viabilidade reduzida incluem trituração incompleta da suspensão celular, neutralização inadequada da tripsina com FBS inativado pelo calor, centrifugação excessiva ou formação prolongada de pellets celulares. Portanto, garantir a dissociação adequada do tecido e a geração de uma suspensão unicelular são essenciais para estabelecer uma co-cultura saudável de microglia e neurônios.

Este protocolo visa recapitular as interações microglia-neuronais in vitro para melhor compreender a importância funcional de suas interações no SNC. Embora outros tipos de sistemas de co-cultura tenham sido desenvolvidos, como a cultura de populações de células individuais em diferentes superfícies para permitir o tratamento independente de duas populações de células43,44, este sistema de cultura mista permite o contato direto e próximo de microglia e neurônios. Além disso, quando mantido adequadamente por meio de meias trocas de meio a cada 3 dias, esse sistema de cultura mista pode permanecer saudável de 12 dias (Figura 3F) a potencialmente 3 semanas, permitindo estudos de longo prazo das interações neuronal-microglia45.

Embora a relativa simplicidade do sistema de co-cultura seja vantajosa para a acessibilidade, uma limitação importante dessa abordagem é que a cultura de células bidimensional não representa totalmente o ambiente do tecido do SNC. De fato, uma tricultura de microglia, neurônios e astrócitos mostra imitar a resposta neuroinflamatória in vivo de forma mais confiável do que a microglia ou a cocultura astrócitos-neuronais46,47. Além disso, desenvolvimentos recentes em sistemas organoides cerebrais com microglia e outras células gliais, incluindo astrócitos e oligodendrócitos, são mais adequados para estudar a arquitetura do tecido tridimensional (3D) e as interações do SNC48. Da mesma forma, um sistema de tricultura 3D humano composto por neurônios, microglia e astrócitos mostra-se eficaz na modelagem da condição da doença de Alzheimer49. Outras co-culturas de micróglia humana e neurônios podem ser mais fisiologicamente relevantes para estudos de doenças neurodegenerativas. Por exemplo, a co-cultura de microglia e neurônios motores derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos50 pode ser útil para estudar doenças como a esclerose lateral amiotrófica51. No entanto, dada a abundância relativa e o baixo custo de geração de neurônios primários e microglia de camundongos, avaliar a co-cultura microglia-neuronal em placas de 96 poços pode ser uma abordagem de alto rendimento para estudar os mecanismos e implicações funcionais das interações microglia-neuronal. Os ensaios a jusante podem incluir o uso de imagens de células vivas para determinar alterações funcionais celulares em tempo real, sequenciamento de RNA para determinar alterações transcricionais celulares, microscopia de imunofluorescência para determinar alterações fenotípicas celulares, espectrometria de massa para determinar alterações celulares e proteômicas ou ensaio de imunoabsorção enzimática e western blot para medir a proteína secretada no sobrenadante de cocultura.

Como a microglia é importante mediadora da saúde e das doenças do SNC, essa co-cultura também pode ser usada para investigar o efeito de moléculas e compostos relacionados à doença na comunicação bidirecional microglia-neuronal. No contexto da EM, a microglia ativada pode assumir um papel destrutivo, contribuindo para o agravamento da patologia52,53. Por exemplo, eles podem secretar citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio, bem como promover a ativação de astrócitos45. Este protocolo pode ajudar a interrogar ainda mais o papel prejudicial da micróglia, tratando a micróglia na co-cultura com citocinas inflamatórias encontradas elevadas na EM e avaliando os resultados da saúde dos neurônios. Alternativamente, esta co-cultura microglia-neuronal tem sido usada para mostrar o efeito protetor da microglia nos neurônios em resposta à fosfatidilcolina oxidada, um produto oxidativo descoberto no MS54. Além disso, a apoptose neuronal remodela a expressão gênica da microglia durante o desenvolvimento, promovendo a sobrevivência da microglia e a fagocitose55. Portanto, este protocolo também pode ajudar a determinar o impacto da morte neuronal no fenótipo e na função da micróglia.

Em resumo, este protocolo descreve a geração e co-cultura de neurônios primários derivados de camundongos e microglia in vitro. A co-cultura microglia-neuronal configurada em placas de 96 poços pode ser uma abordagem de alto rendimento para interrogar os mecanismos e a função das interações da microglia com os neurônios no contexto da saúde e doença do SNC, incluindo a EM.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JP reconhece o apoio financeiro do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e da Faculdade de Medicina da Universidade de Saskatchewan. A YD reconhece o apoio financeiro do Fundo de Inicialização da Faculdade de Medicina da Universidade de Saskatchewan, do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant (1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) e Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. A Figura 1A, a Figura 2A e a Figura 3A foram criadas com BioRender.com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Petri de 10 cm Fisher07-202-011Estéril
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Sistema de Cultura Neuronal Gibco 
Microscópio de dissecçãoVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Soro Fetal Bovino ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
HemacitômetroHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz' s L-15 Médio (1x)Fisher Scientific 
Fator estimulador de colônias de macrófagos Peprotech315-02
Micro-FórcepsRWDF11020-11Autoclavado/Estéril
Aminoácidos não essenciaisCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Penicilina Estreptomicina Glutamina (100x)Gibco103780-16
Poli-L-ornitina hidrobrometo SigmaP3655-100MG
Piruvato de sódio (100 mM)Gibco11360-070
Tesoura de molaRWDS11008-42Autoclavada/Estéril
Lâmina cirúrgicaFeather08-916-5DFrascos estéreis
T-25Fisher10-126-9
T-75 frascos Pinça de tecido Fisher13-680-65
Codman30-4218Autoclavada/Estéril
Tesoura de tecidoRWDS12052-10Autoclavada/Estéril
Trypan Blue Thermofisher Sci 15250-061
Tripsina (2,5%)ThermoFisher Sci15090046
microscópio de imunofluorescência de campo amploZeiss
A365340121083027

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
  2. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  3. Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537(2015).
  4. Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
  5. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  6. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  7. Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
  8. Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786(2022).
  9. Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091(2022).
  10. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  11. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  12. Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977(2022).
  13. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
  14. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  15. Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer's disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48(2014).
  16. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  17. Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
  18. Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
  19. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  20. Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616(2017).
  21. Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
  22. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  23. Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
  24. Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, Á Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
  25. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  26. Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857(2013).
  27. Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677(2021).
  28. Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
  29. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
  30. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
  31. Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486(2014).
  32. Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
  33. Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323(2018).
  34. Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
  35. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  36. Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
  37. Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
  38. Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249(2019).
  39. Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
  40. Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954(2021).
  41. Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702(2020).
  42. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
  43. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
  44. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  45. Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201(2021).
  46. Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882(2021).
  47. Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534(2022).
  48. Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
  49. Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606(2022).
  50. Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
  51. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  52. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  53. Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853(2021).
  54. Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564(2022).
  55. Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Cocultura de Neur nios e MicrogliaCultura de Glia MistaIsolamento de Homogenato CerebralMicroscopia de Imunofluoresc nciaImagem em Tempo RealEnsaios de RNAEnsaios de Prote nasIntera es entre Neur nios e Microglia

Artigos relacionados