Compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas

Summary

A genética química envolve a substituição de um resíduo de gatekeeper por um aminoácido contendo uma cadeia lateral diferente no locus alvo. Aqui, geramos um parasita mutante contendo um alelo hipomórfico de cdpk1 e identificamos vias compensatórias adotadas pelo parasita no fundo mutante.

Abstract

Um dos mecanismos para subverter o efeito das drogas pelo parasita da malária é através da religação de seu transcriptoma. O efeito é mais pronunciado para genes-alvo pertencentes à família multigênica. As proteínas quinases de Plasmodium falciparum pertencentes à família CDPK são essenciais para o desenvolvimento do estágio sanguíneo. Como tal, os CDPKs são considerados bons alvos para o desenvolvimento de compostos antimaláricos. A abordagem da genética química tem sido historicamente usada para elucidar a função das proteínas quinases em eucariotos superiores. Requer a substituição do resíduo do gatekeeper por outro aminoácido com uma cadeia lateral diferente por meio de manipulação genética. A substituição de aminoácidos na posição de gatekeeper modula a atividade de uma proteína quinase e altera sua suscetibilidade a uma classe específica de compostos conhecidos como inibidores de quinase colidida (BKIs) que ajudam na identificação funcional do gene alvo. Aqui, exploramos a abordagem da genética química para entender os mecanismos compensatórios evoluídos por um parasita mutante que abriga um alelo hipomórfico de cdpk1. No geral, nossa abordagem ajuda a identificar vias compensatórias que podem ser direcionadas simultaneamente para prevenir o desenvolvimento de resistência a medicamentos contra quinases individuais.

Introduction

A malária é uma das principais doenças infecciosas responsáveis por milhões de mortes todos os anos, especialmente em crianças menores de 5 anos^{de idade 1}. Não existe vacina clinicamente disponível contra a malária. Além disso, sabe-se que o Plasmodium falciparum, o parasita da malária humana mais mortal, adquiriu resistência contra o medicamento de primeira linha chamado artemisinina 2,3,4,5. Há uma necessidade urgente de identificar novos alvos de drogas e novas estratégias que possam ser rapidamente implantadas para evitar a disseminação da resistência à artemisinina em todo o mundo. Uma melhor compreensão do mecanismo de ação dos medicamentos e das bases moleculares das vias compensatórias pode ajudar na elaboração de melhores estratégias para evitar o desenvolvimento de resistência aos medicamentos.

As proteínas quinases pertencentes à família das Proteínas Quinases Dependentes de Cálcio (CDPKs) são cruciais em muitos estágios do desenvolvimento do parasita durante os estágios eritrocítico, sexual e pré-eritrocítico⁶. Durante a replicação assexuada de P. falciparum, CDPK5 é conhecido por desempenhar um papel crítico na saída de merozoítos de esquizontes maduros⁷. A deleção condicional de CDPK5 não permite que os esquizontes liberem merozoítos na corrente sanguínea, levando à morte do parasita. O mecanismo molecular da saída do parasita mediada por CDPK5 não é completamente compreendido e acredita-se que envolva a proteína quinase G (PKG) como um regulador a montante ^7,8. CDPK7 é essencial para a maturação de parasitas em estágio de anel para trofozoíto⁹. CDPK4 é outro membro da família CDPK que é crítico para o desenvolvimento do estágio sexual dentro dos mosquitos. Está envolvido em várias etapas durante o processo de exflagelação e, portanto, é crítico para a formação de gametas masculinos livres e móveis 10,11,12,13. CDPK1 fosforila componentes do complexo de membrana interna e rhoptry ^14,15. Além disso, a deleção condicional de CDPK1 resulta em hipofosforilação de proteínas envolvidas na invasão de hemácias¹⁶. Foi demonstrado que o CDPK1 regula a descarga de organelas apicais durante o processo de invasão¹⁷. O CDPK1 também ajuda na saída de merozoítos de hemácias infectadas, fosforilando a protease¹⁸ da SERA5. A CDPK1 fosforilada está preferencialmente localizada na extremidade apical do merozoíto, onde pode interagir com outras proteínas do parasita necessárias para o processo de invasão^19,20. O CDPK1 também está envolvido na formação de gametas masculinos e femininos, o que é uma etapa crítica para a transmissão da malária e o desenvolvimento sexual do parasita dentro dos mosquitos²¹.

A abordagem da genética química tem sido historicamente utilizada para a identificação dos papéis funcionais das quinases de mamíferos ^22,23. A abordagem utiliza a substituição de um resíduo na posição de gatekeeper por um aminoácido de uma cadeia lateral diferente. A mudança do resíduo do gatekeeper modula o tamanho de uma bolsa de ATP adjacente que, por sua vez, altera a acessibilidade de compostos químicos chamados inibidores de quinase colididos (BKIs) em direção à enzima mutante em comparação com o tipo selvagem. A substituição de um resíduo volumoso na posição de gatekeeper por um resíduo menor permite o acesso aos BKIs, enquanto a substituição reversa torna a quinase resistente aos BKIs. Em alguns casos, a substituição do resíduo gatekeeper está associada a uma diminuição na atividade quinase da enzima alvo, tornando a modificação intolerante para estudos funcionais^24,25. O efeito negativo da substituição do gatekeeper na atividade enzimática pode ser revertido pela geração de mutação supressora em um segundo local na quinase intolerante²⁵. Uma abordagem de genética química tem sido utilizada para estudar a função das proteínas quinases de Apicomplexan. O CDPK4 do tipo selvagem contendo um resíduo de gatekeeper menor foi inibido seletivamente pelos inibidores de quinase BKI-1 e 1294, levando a um bloqueio na gametogênese masculina e no desenvolvimento de oocistos^11,12. A substituição de um pequeno resíduo de gatekeeper em CDPK4 por um resíduo volumoso de metionina levou a uma diminuição na inibição mediada por BKI na exflagelação¹¹. A CDPK1 de Toxoplasma gondii, um parasita Apicomplexan intimamente relacionado ao parasita da malária, mostrou-se envolvida na motilidade e invasão das células hospedeiras por taquizoítos^26,27. Um bolso porteiro menor do TgCDPK1 do tipo selvagem foi explorado para projetar inibidores específicos que diminuíram a patogênese da doença em modelos animais^28,29. Envolvimento de P. Falciparum A proteína quinase G (PKG) no desenvolvimento esquizogônico tardio e na formação de gametas foi demonstrada pela inibição da atividade da enzima usando inibidores farmacológicos específicos^30,31. A substituição da treonina na posição de gatekeeper por glutamina (T618Q) diminuiu muito a sensibilidade da enzima mutante aos inibidores, resultando em gametogênese normal e progressão esquizonte-anel^30,31.

A maioria dos estudos anteriores utilizou uma abordagem de genética química para a caracterização funcional de quinases alvo 11,12,22,23,26,30,31 no entanto, adotamos essa abordagem para entender o desenvolvimento de mecanismos compensatórios em parasitas que abrigam alelo hipomórfico de uma proteína quinase. Mostramos anteriormente que a substituição do resíduo de gatekeeper do tipo selvagem em CDPK1 por metionina (T145M) resulta em ~ 47% de diminuição no potencial de transfosforilação da enzima mutante³². Um parasita mutante contendo o alelo hipomórfico de cdpk1 (cdpk1t145m) é pré-adaptado para a atividade reduzida de CDPK1 por religação transcricional de outros membros da família CDPK. Acreditamos que essa estratégia possa ser usada em geral para elucidar os mecanismos compensatórios em parasitas mutantes contendo alelos hipomórficos de proteínas quinases essenciais. Outras quinases que compensam parcialmente a função da quinase alvo podem ser inibidas simultaneamente junto com a quinase alvo para prevenir o desenvolvimento de resistência a medicamentos contra quinases individuais. Isso pode servir como uma estratégia melhor para o controle da malária.

Protocol

O P. falciparum (NF54) foi obtida de Alvaro Molina Cruz 21,32,33. Os glóbulos vermelhos humanos O⁺ usados para a cultura do parasita foram obtidos no Rotary Blood Centre, Nova Delhi, Índia. Os plasmídeos, pL6eGFP e pUF1, foram obtidos de Jose-Juan Lopez-Rubio. O DSM267 foi obtido de Margaret A. Phillips e Pradipsinh K. Rathod. WR99210 foi fornecido pela Jacobus Pharmaceutical Company.

1. Construção de plasmídeo para expressão de CDPK1 recombinante em Escherichia coli

1. Projete o par de primers de oligonucleotídeos para amplificar o CDS completo do gene cdpk1 (acesso PlasmoDB nº. PF3D7_0217500) usando software de análise de primer.
   1. Amplificar o CDS completo usando DNA polimerase com par de oligonucleotídeos específicos do gene: Pk1fpgex e Pk1rpgex (ver Tabela 1) usando cDNA preparado a partir de Plasmodium falciparum como molde em um volume de reação de 20 μL. Defina as condições de amplificação por PCR da seguinte forma: Desnaturação inicial a 98 °C por 2 min, (Desnaturação a 98 °C por 30 s, Recozimento a 52 °C por 20 s, Extensão a 62 °C por 20 s) x 36, Extensão final a 62°C por 10 min. Conservar o produto PCR a 4 °C até nova utilização.
2. Digerir 1 μg do produto de PCR amplificado e 1 μg do plasmídeo de expressão pGEX4T1 com endonucleases de restrição BamHI (20.000 U / mL) e NotI (20.000 U / mL) por 3-4 h a 37 ° C em um volume total de reação de 30 μL.
3. Para purificar o produto de PCR de digestão dupla e o plasmídeo, use um kit de limpeza de PCR baseado em coluna e siga as instruções do fabricante.
4. Ligue 100 ng de plasmídeo pGEX4T1 purificado e duplamente digerido com um inserto numa proporção molar vector-pastel de 1:5 utilizando 1 μL de DNA ligase T4 num volume total de reacção de 10 μL. Incubar a reacção de ligação a 16 °C durante a noite.
5. Transformar E. Coli DH5α com a mistura ligada seguindo o protocolo do fabricante e placa em placas de ágar LB contendo ampicilina (100 μg/mL).
6. Rastreie quatro clones bacterianos obtidos da transformação quanto à presença do plasmídeo recombinante, purificando o plasmídeo usando um kit de purificação de miniplasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Confirmar o plasmídeo recombinante por digestão por dupla restrição utilizando BamHI e NotI, conforme descrito no passo 1.3.
7. Verifique ainda mais os clones positivos para digestão de restrição para a sequência correta por sequenciamento de DNA de Sanger. Transformar E. Coli BLR (DE3) pLysS células competentes com a construção de plasmídeo verificada por sequência para expressão da proteína CDPK1.

2. Expressão e purificação da proteína CDPK1 recombinante em E. coli

1. Expressão de CDPK1 recombinante
   1. Inocular um único clone de E. Coli BLR (DE3) pLysS contendo a construção de plasmídeo verificada por sequência em 10 mL de meio LB contendo ampicilina (100 μg / mL). Incubar a cultura durante a noite a 37 °C com agitação a 200-250 rpm.
   2. Inocular a cultura secundária com 1% da cultura primária e deixar as células bacterianas crescerem até à fase de meio log a 37 °C. Quando a densidade óptica (DO) da cultura secundária atingir 0,7-0,9 a 600 nm, induzir a expressão do CDPK1 recombinante de comprimento total adicionando 1 mM de isopropilo ß-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e incubar por 10-12 h a 24 ° C.
   3. Após a incubação, colha o E. células de coli por centrifugação a 5.000 x g por 10 min. Decantar o sobrenadante e reter o sedimento celular.
   4. Prepare o tampão de lise com a seguinte composição: 1 mM de ditiotreitol (DTT), 0,1 mg/mL de lisozima, 1 mM de EDTA, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) e um coquetel de inibidor de protease 1x em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   5. Ressuspenda o pellet celular em 10 vezes o volume de peso do pellet do tampão de lise. Sonicar a suspensão celular por 15 min em intervalos de 9 s On, 15 s Off para evitar aquecimento localizado que pode levar à desnaturação da proteína.
   6. Centrifugar o lisado a 17.000 x g durante 1 h e incubar o sobrenadante límpido com grânulos de glutationa durante a noite a 4 °C. Siga o protocolo mencionado abaixo para obter a proteína CDPK1 recombinante purificada.
2. Cromatografia de afinidade usando grânulos de glutationa para purificação de CDPK1 marcada com GST
   1. Pegue 500 μL de grânulos de glutationa completamente ressuspensos para 250 mL de cultura bacteriana e centrifugue a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Decantar cuidadosamente o sobrenadante.
   2. Lave as esferas com 5 mL de tampão de ligação (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.3) e inverta para misturar.
   3. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C e remover o sobrenadante. Repita a lavagem e centrifugação por 3x-4x.
   4. Adicione as esferas ao lisado de células bacterianas e incube durante 12 h a 4 °C com uma ligeira agitação (20-30 rpm).
   5. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C e remover o sobrenadante. O sobrenadante pode ser salvo para estimar a quantidade de CDPK1 recombinante que permanece não ligada.
   6. Lave os grânulos ligados a CDPK1 pelo menos 5-6 vezes com PBS contendo 1 mM DTT seguido de uma lavagem com 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7.5.
   7. Eluir a proteína ligada 2x primeiro com 250 μL de tampão de eluição 1 (EB1) seguido de 2x com 250 μL de tampão de eluição 2 (EB2). A composição de EB1 e EB2 é glutationa reduzida de 10 mM em Tris 50 mM, NaCl 100 mM, glutationa reduzida de pH 7,5 e 20 mM em Tris 50 mM, NaCl 100 mM e pH 7,5, respectivamente.
   8. Incube os grânulos ligados a CDPK1 nos tampões de eluição 1 e 2 à temperatura ambiente (RT) por 5-10 min usando agitação suave ou rotação de ponta a ponta.
   9. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C e transferir cuidadosamente o sobrenadante contendo a proteína recombinante CDPK1 eluída para um tubo separado.
   10. Repita as etapas 2.2.8 e 2.2.9 para obter 2 eluições, cada uma com EB1 e EB2.

3. Mutagênese dirigida ao local para geração de proteínas mutantes recombinantes CDPK1 gatekeeper

1. Use o plasmídeo pGEX4T1 contendo o gene cdpk1 verificado por sequência. Preferimos usar o mesmo plasmídeo que foi usado para a transformação da cepa E . coli BLR (DE3) pLysS.
2. Projete os primers para introduzir uma mutação gatekeeper na sequência do gene cdpk1 do tipo selvagem. O resíduo de gatekeeper do tipo selvagem (T145) é codificado por um códon ACC no gene cdpk1 . Substitua o gatekeeper treonina por resíduos de gatekeeper pequenos (serina, T145S) e volumosos (metionina, T145M) que são codificados por códons AGC e ATG, respectivamente.
3. Siga as diretrizes mencionadas abaixo para projetar os primers direto e reverso para mutagênese dirigida ao local.
   1. Certifique-se de que ambos os primers sejam complementares um ao outro. Mantenha 15-20 nucleotídeos de sequência não modificada em ambos os lados da mutação. Certifique-se de que Tm seja de 50 °C a 55 °C para a sequência, excluindo o local mutado.
4. Use o kit de mutagênese direcionada ao local para gerar as construções mutantes gatekeeper de cdpk1. Siga as instruções do fabricante para introduzir a mutação desejada. Os primers usados para mutagênese dirigida ao local estão listados na Tabela 1.
5. Trate a mistura de reação com 0,5 μL de enzima DpnI (20.000 U / mL) para digerir o plasmídeo metilado parental. Incubar a mistura de reacção a 37 °C durante 3 h. Transformar as células competentes para E. coli DH5α com a mistura de reacção tratada com DpnI.
6. Rastreie quatro clones de cada uma das construções de plasmídeo T145M e T145S para verificar a introdução da mutação desejada na sequência do gene cdpk1 por meio do sequenciamento de DNA.
7. Transforme os plasmídeos verificados de sequência na cepa pLysS de E. coli BLR (DE3) para expressão das proteínas CDPK1 T145M / S recombinantes, conforme descrito na etapa 1.5.
8. Expresse e purifique as proteínas mutantes do gatekeeper CDPK1 seguindo as etapas descritas na seção 2 para a proteína CDPK1 do tipo selvagem.

4. Ensaio de atividade de quinase in vitro de CDPK1

NOTA: A atividade quinase do CDPK1 recombinante do tipo selvagem e das proteínas mutantes gatekeeper é avaliada por uma abordagem de marcação de epítopos semissintéticos, conforme descrito por Allen et ^al.34.

1. Incubar 50 ng de proteína recombinante no tampão contendo 50 mM de Tris, 50 mM de MgCl₂, 1x coquetel de inibidor de fosfato com 2 μg de proteína básica de mielina (MBP) como substrato exógeno de CDPK1 na mistura de reação total de 50 μL.
2. Dependendo das condições que requerem a presença ou ausência de cálcio, adicione CaCl₂ ou EGTA, respectivamente, para fazer a concentração final de 2,5 mM cada no tampão do ensaio de quinase. Adicionar ATPγS à concentração final de 100 μM ao tampão para utilizá-lo como fonte do grupo fosfato terminal transferível.
3. Incubar a mistura de reacção a 30 °C em banho-maria durante 1 h, seguido do fim da reacção com a adição de 5 mM de EGTA. Adicionar 5 μl de mesilato de p-nitrobenzilo (PNBM) a 50 mM à mistura de reacção e deixar incubar a 20 °C em banho-maria durante 2 h para a alquilação dos resíduos de serina e treonina fosforilados na transfosforilação MBP e CDPK1 autofosforilada.
4. Ao total de 55 μL de mistura de reação, adicione 19 μL de tampão de amostra 4x SDS e aqueça a 95 °C por 5 min.

5. Análise de Western blot para detectar os produtos tiofosforilados do ensaio de quinase in vitro

1. Prepare o gel SDS-PAGE a 12% e carregue 15 μL de cada amostra. Separe a mistura de reação para visualizar CDPK1 autofosforilada e MBP transfosforilada.
2. Transfira as proteínas separadas do gel SDS-PAGE para uma membrana de PVDF usando o método de transferência úmida³².
3. Bloqueie os locais inespecíficos na membrana de PVDF incubando-a com 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris (20 mM Tris-HCL, pH 7,5, 150 mM NaCl) contendo 0,05% de Tween 20 por 1 h em RT.
4. Incubar a membrana de PVDF com o anticorpo primário de coelho contra adutos tiofosforilados alquilados a uma diluição de 1:2.500 durante a noite a 4 °C no tampão de bloqueio.
5. Após a incubação durante a noite, lave o blot 3x com solução salina tamponada com Tris com 0,05% de Tween 20 por 10 min cada.
6. Incubar ainda mais o blot com anticorpo secundário anti-coelho de cabra em tampão de bloqueio a uma diluição de 1:5.000 por 1 h em RT, seguido de lavagem com solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween 20.
7. Cubra o blot com substrato quimioluminescente misturando uma proporção igual de solução A e solução B de acordo com as instruções do fabricante e exponha em filme de raios-X em uma sala escura para obter sinais de autofosforilação de CDPK1 e transfosforilação de MBP.

6. Clonagem da sequência guia para direcionaro locuscdpk1 para introduzir a substituição do gatekeeper  

NOTA: A sequência guia de 20 nucleotídeos foi selecionada por curadoria manual e clonada no plasmídeo pL6eGFP no local BtgZI, empregando as seguintes etapas.

1. Digestão de pL6eGFP usando a enzima BtgZI
   1. Digerir 1 μg de plasmídeo pL6eGFP³⁵ com 1 μL de enzima BtgZI (5.000 unidades/mL) por 4 h a 60 °C em uma mistura de reação de 20 μL, seguindo o protocolo do fabricante da enzima para condições de reação.
   2. Após o período de incubação de 4 h, execute o plasmídeo digerido em um gel de agarose a 1% e excise o pedaço de gel (~ 9,8 kb) contendo o plasmídeo digerido. Purifique o plasmídeo digerido usando um kit de extração de gel baseado em coluna de acordo com as instruções do fabricante.
2. Recozimento de oligos
   1. Reconstituir os oligonucleotídeos (Ck1GUIDEFWD e Ck1GUIDEREV) em água livre de DNase/RNase para preparar uma solução estoque de 100 μM.
   2. Combine 20 μM de cada oligonucleotídeo em uma solução contendo 10 mM de Tris (pH 8,0), 50 mM de NaCl e 1 mM de EDTA. Incubar a mistura a 95 °C em banho seco durante 5 min e deixar arrefecer até à temperatura ambiente. Geralmente, leva 1 h para que a temperatura da mistura de reação atinja o RT.
   3. Diluir os oligonucleotídeos recozidos a 0,5 μM em Tris pH 8,0, resultando em um volume total de mistura de reação de 100 μL.
3. Reação de infusão
   1. Combine 1,5 μL de oligonucleotídeos diluídos com 100 ng de plasmídeo linearizado digerido por BtgZI em 5x pré-mistura enzimática In-Fusion em um volume total de reação de 10 μL para gerar um guia CDPK1 contendo plasmídeo pL6CK1G.
   2. Incubar a reação durante 15 min a 50 °C. Conservar a reacção a 4 °C até se proceder à transformação de E. coli.
      NOTA: Para armazenamento de longo prazo, a mistura de reação pode ser armazenada a -20 °C.
4. Transformação de E. Coli Células estelares competentes
   1. Adicione 2,5 μL da mistura de reação ao E. Coli Stellar competente e prossiga com o processo de transformação seguindo o protocolo do fabricante.
   2. Coloque as células competentes transformadas em uma placa de LB ampicilina (100 μg / mL) e deixe as bactérias transformadas crescerem a 37 ° C durante a noite.
   3. Selecione as colônias transformadas e extraia o plasmídeo usando um kit de minipreparação de plasmídeo disponível comercialmente. Siga as instruções do fabricante para purificação de plasmídeo. Valide a inserção do guia no plasmídeo por meio do sequenciamento de DNA de Sanger.

7. Clonagem do braço de homologia para reparo do locus cdpk1 restrito à endonuclease Cas9

NOTA: Um braço de homologia compreendendo os SNPs a serem introduzidos no locus alvo é sintetizado comercialmente. Geralmente tomamos um braço de homologia de 400-1000 pb de comprimento. O braço de homologia contém mutações silenciosas na região do RNA guia e PAM para evitar o recorte do locus modificado após a incorporação dos SNPs desejados. O braço de homologia (correspondente aos nucleotídeos 133 a 553 de CDPK1), incorporando mutação gatekeeper Met ou Ser e mutações silenciosas, é flanqueado por sítios de restrição AflII e SpeI.

1. Digerir duas vezes 1 μg de pL6CK1G e o plasmídeo contendo o braço de homologia usando 0,5 μL de enzimas de restrição AflII (20.000 U / ml) e SpeI (20.000 U / ml) por 4 h a 37 ° C em uma mistura de reação de 20 μL.
2. Execute a reação completa de plasmídeos de dupla digestão em gel de agarose a 1,5% e purifique as bandas correspondentes ao braço de homologia e à estrutura do plasmídeo de pL6CK1 usando um kit de extração de gel seguindo as instruções do fabricante.
3. Ligue o braço de homologia digerido com 100 ng de plasmídeo pL6CK1 em uma proporção vetor-inserção de 1:5 em um volume total de reação de 10 μL usando T4 DNA ligase. Incubar a reação de ligadura durante a noite a 16 °C. Transforme as células competentes para E. coli DH5α com a mistura completa de ligação de acordo com as instruções do fabricante.
4. Coloque as células transformadas em placas de ágar LB contendo ampicilina (100 μg / mL) para selecionar transformantes positivos. Selecione colônias únicas da placa de ampicilina LB e purifique o plasmídeo usando um kit de extração de plasmídeo.
5. Confirmar o clone quanto à presença do braço de homologia digerindo o plasmídeo purificado com as enzimas AflII e SpeI, utilizando as mesmas condições de digestão descritas no passo 7.3. Confirme os clones positivos de dupla digestão ainda mais por sequenciamento de DNA Sanger para validar a sequência completa do braço de homologia.

8. Purificação de plasmídeos pL6CK1Met, pL6CK1Ser e pUF1 para transfecção de parasitas da malária

1. Definir 5 mL de culturas primárias de clones verificados por sequência de pL6CK1Met, pL6CK1Ser e pUF1 em meio LB contendo ampicilina (100 μg/mL) e incubar por 10 h. Transferir a cultura primária para a cultura secundária na proporção de 1:1000 e incubar durante mais 12 h.
2. Pulverizar a cultura bacteriana por centrifugação a 5000 x g durante 10 min num frasco de centrifugação.
3. Isole os plasmídeos usando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. Dissolva o DNA do plasmídeo em água livre de DNase / RNase para transfecção direta do parasita.

9. Cultura in vitro de Plasmodium falciparum e sincronização de sorbitol para transfecção

NOTA: A cultura in vitro de P. falciparum em hemácias humanas (hemácias) é realizada de acordo com o método descrito por Trager e Jensen³⁶.

1. Propagar a estirpe NF54 de P. falciparum por cultura em hemácias humanas O⁺ a um hematócrito de 2% em meio RPMI completo (cRPMI) contendo RPMI 1640 suplementado com L-glutamina, HEPES 25 mM, bicarbonato de sódio 25 mM e 50 μg/mL de hipoxantina. Suplementar o meio com 0,5% de AlbuMAX II e 10 μg/ml de gentamicina e manter a cultura a 37 °C sob uma atmosfera de 5% de O₂, 5% de CO₂ e 90% de N₂.
2. Para a sincronização do sorbitol para obter o parasita em estágio de anel, peletize os parasitas assíncronos em um tubo cônico de 50 mL por centrifugação a 2.300 x g por 3 min em RT. Descarte o sobrenadante.
3. Incubar as hemácias parasitadas com 9 volumes de sorbitol a 5% por 10 min a 37 °C. Após a incubação, desça as hemácias por centrifugação a 2.300 x g por 3 min e descarte o sorbitol.
4. Lave os parasitas tratados com sorbitol com RPMI incompleto, iRPMI (meio RPMI sem albumax e bicarbonato de sódio) e, posteriormente, incube-os em cRPMI. Use os parasitas do estágio de anel no próximo ciclo para transfecção de plasmídeo.

10. Transfecção do parasita em estágio de anel com plasmídeos pL6CK1Met, pL6CK1Ser e pUF1

NOTA: As etapas a seguir são empregadas para a transfecção direta de parasitas em estágio de anel com DNA de plasmídeo.

1. Prepare 2x tampão citomix³⁷ dissolvendo-se em 30 mL de água, 240 mM KCl, 0,3 mM CaCl₂, 4 mM EGTA, 10 mM MgCl₂, 20 mM K₂HPO₄ / KH₂PO₄ e 50 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,6. Ajuste o volume final para 50 mL. Esterilize o tampão usando um filtro de seringa de 0,22 μm. Em seguida, dilua o tampão citomix 2x com água estéril para obter um tampão citomix 1x.
2. Em um tubo cônico estéril de 15 mL, adicione 100 μL de hemácias parasitadas em estágio anelar e lave-as 2x com 5 mL de 1x tampão citomix. Efectuar as lavagens por centrifugação a 994 x g durante 3 min à RT.
3. Após a lavagem, remova o tampão e adicione 50 μg de cada plasmídeo (pL6CK1Met / pUF1 para gerar a mutação T145M e pL6CK1Ser / pUF1 para gerar a mutação T145S) nas hemácias parasitadas embaladas. Em seguida, adicione 2x tampão de acordo com o volume do plasmídeo e ajuste o volume para 400 μL com 1x concentração de tampão.
4. Transferir 400 μL da solução acima para cubetas de 0,2 cm para cada transfecção. Eletroporar usando as seguintes condições: 0,31 kV, 950 μF e resistência definida como Infinita.
5. Após a eletroporação, remova os parasitas transfectados da cubeta, misture-os com cRPMI e transfira-os para um frasco T25 com um volume total de 15 mL. Incubar os parasitas durante 2 h nas condições mencionadas no passo 9.1.
6. Após a incubação, transfira os parasitas transfectados para um tubo cônico de 50 mL e centrifugue a 994 x g por 3 min. Remova o sobrenadante e lave os parasitas com 10 mL de RPMI incompleto. Cultive-os com cRPMI fresco por 2 dias, reabastecendo o meio de cultura após 24 h.
7. Após 48 h, remova o cRPMI de cada frasco e ressuspenda a cultura em cRPMI contendo 2 nM de WR99210 e 150 nM de DSM267³⁸. Em seguida, transfira a cultura para um frasco T75 adicionando 400 μL de hemácias frescas. Reabasteça o meio diariamente com cRPMI contendo WR99210 e DSM267 por 7 dias. Em seguida, adicione cRPMI contendo ambos os medicamentos em dias alternados até o dia 14 após a transfecção.
8. No dia 14, alíquota de 200 μL de cultura transfectada em 1,5 mL de tubo de microcentrífuga (MCT) para preparo da lâmina. Pulverizar as células por centrifugação a 500 x g durante 5 minutos à RT. Aspirar o sobrenadante e transferir as células para a lâmina. Faça um esfregaço usando outra lâmina, colocando-a em um ângulo de 45°.
9. Fixe a lâmina em metanol e prepare a coloração de Giemsa diluindo-a 1:10 em água ultrapura. Em seguida, manche a lâmina mergulhando-a completamente na mancha de Giemsa por 20 min. Lave o escorregador em água corrente e seque-o bem. Em seguida, observe a lâmina sob um microscópio de luz com ampliação de 100x aplicando óleo de imersão.
10. Assim que os parasitas forem visualizados, reabasteça a mídia diariamente e deixe-os crescer por 2-3 dias. Em seguida, remova os parasitas para verificar a modificação desejada na sequência do gene alvo no locus alvo.
    NOTA: Se os parasitas não forem visíveis no dia 14, reabasteça a mídia (contendo ambos os medicamentos) após 4 dias. Corte o parasita em 30% e adicione sangue fresco para manter o hematócrito a 2% a cada 7 dias até que os parasitas reapareçam.

11. Verificação por PCR do parasita transgênico com modificação desejada do locus cdpk1

1. Após 2-3 dias de crescimento do parasita, retire 500 μL de cultura e transfira-o para um MCT de 1,5 mL.
2. Pulverize as células por centrifugação a 2.400 x g por 5 min. Em seguida, lise as hemácias por tratamento com saponina.
   1. Para o tratamento com saponina, adicione 10 μL de solução de saponina a 10% a 1 mL de pellet de parasita ressuspenso e mantenha a 4 °C por 5 min. Centrifugar as células a 2.400 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Repita esta etapa até que a vermelhidão desapareça completamente e uma pelota de parasitas de cor preta seja obtida.
3. Lave o pellet do parasita com 1 mL de 1x PBS por centrifugação a 2.400 x g por 5 min. Em seguida, ressuspenda o pellet em 50 μL de água livre de DNase/RNase. Aqueça o pellet de parasita ressuspenso a 95 ° C por 5 min, seguido de centrifugação a 16.200 x g por 10 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante contendo DNA do parasita para um novo tubo.
4. Utilize o material genético acima para amplificar o gene de comprimento total empregando o conjunto de primers ck1f1 e ck1r3wt (consulte a Tabela 1), visando especificamente a região fora do braço de homologia, conforme descrito acima na etapa 1.2. Sequencie a região de homologia contendo a mutação T145M usando o primer ck1f1 .

12. Diluição limitante para obtenção de parasitas transgênicos clonais

1. Após a verificação da sequência, diluir a cultura do parasita transfectado para atingir uma concentração final de 1 parasita por 200 μL. Em seguida, adicione 100 μL da cultura diluída aos poços de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Execute as etapas a seguir (12,2-12,4) para atingir 1 parasita/200 μL.
2. Prepare 10 mL de hemácias parasitadas com hematócrito a 2%. Estime a porcentagem de parasitemia da cultura usando o método de coloração de Giemsa descrito acima. Em seguida, conte o número total de hemácias em uma cultura diluída a 1:100 usando um hemocitômetro.
   Número total de hemácias/ml = Número médio de hemácias contadas x Fator de diluição x^10,4
   Número de hemácias parasitadas/mL = (porcentagem de parasitemia x número total de hemácias/mL)/100
3. Prepare a diluição 1:10.000 de hemácias parasitadas diluindo em série a cultura inicial 2x (diluição 1:100 cada).
4. Adicionar um volume apropriado (em microlitros) da cultura diluída para obter um total de 50 parasitas em 10 mL de meio, garantindo 2% de hematócrito. Em seguida, adicione 100 μL do meio contendo 50 parasitas a cada poço da placa de 96 poços. Colocar a placa num secador hermético e lavado com gás misturado (composição descrita no passo 9.1) e incubar a 37 °C. Substitua a mídia a cada 2 dias.
5. Substitua o meio por cRPMI contendo 2% de hematócrito a cada^{7 dias até} que os parasitas apareçam.
   1. Incline a placa de 96 poços em um ângulo de 45° e deixe os eritrócitos se acomodarem. Usando uma pipeta sorológica, remova cuidadosamente o meio de cada poço e observe uma mudança de cor para amarelo em poços contendo parasitas, contrastando com a cor rosa do meio em poços livres de parasitas. Essa mudança de cor ocorre porque os parasitas acidificam o meio.
6. Depois de observar a mudança de cor, retire uma pequena quantidade de cultura do poço que exibe a mudança de cor e prepare um esfregaço em uma lâmina, rotulando-a com um número correspondente à posição do poço. Pinte a lâmina com a coloração de Giemsa e observe-a ao microscópio conforme descrito acima.
7. Transfira o conteúdo do poço para um frasco T25, onde os parasitas foram observados ao microscópio. Deixe os parasitas crescerem no frasco T25 por 4-5 dias e reabasteça a mídia em dias alternados.
8. Quando a parasitemia atingir 2-3%, extraia 500 μL de cultura do parasita. Em seguida, lise as hemácias com saponina e proceda à extração do material genético do parasita usando o método descrito na seção 11.
9. Para confirmar a geração de parasitas transgênicos clonais, configure uma reação de PCR conforme descrito acima na etapa 1.1.1 e envie o produto de PCR para sequenciamento de DNA para confirmar a introdução dos SNPs desejados no locus alvo.

13. Análise de transcrição usando PCR em tempo real

1. Purificação de Percoll/Sorbitol e sincronização dos parasitas
   1. Prepare um gradiente de Percoll / Sorbitol^39,40 colocando sequencialmente 3 mL cada de 70% seguido de soluções de 40% de percoll / sorbitol em um tubo cônico de 15 mL.
   2. Coloque suavemente 1-2 mL de cultura de parasitas contendo predominantemente o parasita em estágio esquizonte de WT e CDPK1 T145M no topo do gradiente.
   3. Centrifugue o gradiente a 2.300 x g por 15 min em RT usando a desaceleração definida para 4 na centrífuga em um rotor de caçamba oscilante.
   4. Colete o anel médio contendo os estágios trofozoíto e esquizonte do parasita da interface do gradiente em um tubo cônico fresco de 50 mL.
   5. Lave os parasitas adicionando um volume igual de 9:1 (cRPMI:10xPBS) e centrifugue a 994 x g por 3 min para peletar os parasitas.
   6. Lave o pellet novamente com uma solução de 19:1 (cRPMI:10xPBS) e centrifugue a 994 x g por 3 min.
   7. Adicione cada pellet de parasita a frascos separados contendo cRPMI com 2% de hematócrito (pré-incubado a 37 °C). Incubar os frascos durante 4 h nas condições acima descritas no passo 9.1 para permitir a invasão de merozoítos dos esquizontes enriquecidos em eritrócitos frescos.
   8. Após 4 h, trate os parasitas com sorbitol conforme descrito acima nas etapas 9.2-9.4 para obter parasitas em estágio de anel de 0 a 4 h altamente sincronizados.
   9. Incubar os parasitas sincronizados por 44 h após o tratamento com sorbitol para obter o estágio esquizonte de 44 a 48 h do parasita.
2. Isolamento de RNA de esquizontes de parasitas WT e CDPK1 T145M
   1. Colha os parasitas WT e CDPK1 T145M 44-48 h após a invasão. Lave os pellets do parasita com 1x PBS a 994 x g por 5 min a 4 °C.
   2. Ressuspenda os grânulos do parasita em 1 mL de 1x PBS e trate-os com saponina para lisar as hemácias circundantes, conforme descrito na etapa 11.2.1.
   3. Ressuspenda o pellet do parasita em 1 mL de reagente de extração de RNA e armazene a -80 ° C até processamento posterior.
   4. Descongele o pellet congelado a 15-30 °C para dissociação completa dos complexos de nucleoproteínas.
   5. Adicione 200 μL de clorofórmio por mL de reagente de extração de RNA e agite os tubos vigorosamente com a mão por 15 s. Incubar em RT por 2-3 min.
   6. Centrifugue a mistura a 16.200 x g por 15 min a 4 ° C. O RNA permanecerá exclusivamente na camada aquosa superior incolor. Isole o RNA usando um kit de acordo com as instruções do fabricante.
3. Síntese de cDNA a partir do RNA do parasita WT e CDPK1 T145M
   1. Trate as amostras contendo RNA com um kit de remoção de DNA seguindo as instruções do fabricante para remover o DNA contaminante.
   2. Sintetize o cDNA a partir das amostras de RNA isoladas usando um kit de síntese de cDNA de acordo com o protocolo do fabricante. Usamos primers hexâmeros aleatórios para o processo de transcrição reversa em vez de primers oligo-dT.
   3. Garantir que NO-RT (reações configuradas sem adição da enzima transcriptase reversa) controla cada amostra de RNA usada para preparação de cDNA para excluir a transferência de contaminação de DNA genômico do RNA purificado durante a preparação de cDNA.
   4. Teste o cDNA amplificando qualquer segmento de gene que contenha uma sequência intrônica intermediária, como o gene cdpk1 de comprimento total, para descartar a contaminação do DNA genômico. Use a condição de PCR conforme descrito na etapa 1.1.1.
4. Análise da expressão de transcritos do parasita WT e CDPK1 T145M
   1. Use o cDNA preparado a partir dos parasitas WT e CDPK1 T145M para realizar a análise da expressão de transcritos de 11 genes diferentes por meio de PCR em tempo real. Os 11 genes-alvo incluem 7 membros da família CDPK e 4 quinases envolvidas na invasão de hemácias (consulte a Tabela 2 para genes e primers correspondentes usados para PCR em tempo real).
   2. Projete primers usando software de síntese de primers. Amplificar aproximadamente 120 pb de cada gene selecionado usando primers específicos do gene com temperaturas de fusão semelhantes.
   3. Amplificar os genes-alvo usando uma pré-mistura e executar a placa em um sistema de PCR em tempo real usando os seguintes parâmetros de ciclagem: desnaturação inicial a 95 ° C por 3 min seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 10 s, recozimento a 52 ° C por 20 s e extensão a 62 ° C por 30 s.
   4. Normalize o nível de expressão de cada gene usando dois genes de manutenção, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e treonina tRNA ligase (ThrRS) ³² . Calcule a expressão relativa de cada quinase alvo no parasita CDPK1 T145M em comparação com o controle WT.
   5. Execute a análise estatística usando o pacote de análise estatística R. Como alternativa, use qualquer outro software de análise.
      NOTA: Métodos transcriptômicos globais, como RNA-Seq ou microarray, são abordagens superiores para obter uma visão mais ampla da religação do transcriptoma em parasitas mutantes em comparação com WT.

Results

WT CDPK1 recombinante é expresso como uma proteína de fusão com uma etiqueta N-terminal de glutationa S-transferase (GST) e purificado usando cromatografia de afinidade GST. A proteína CDPK1 purificada foi detectada por Western blot usando anticorpos anti-CDPK1 e anti-GST (Figura 1). O resíduo de gatekeeper treonina (T145) em WT CDPK1 foi substituído por Met e Ser usando mutagênese dirigida ao local para gerar proteínas recombinantes mutantes CDPK1T145M e CDPK1T145S, respectivamente (Figura 2). O ensaio de quinase in vitro foi feito para avaliar a atividade da quinase de todas as proteínas CDPK1 recombinantes. A atividade da quinase foi testada usando uma abordagem de marcação de epítopos semissintéticos³⁴ , detectando o grupo éster tiofosfato usando um anticorpo específico em um formato de Western blot (Figura 3). O impacto da substituição do gatekeeper na atividade de autofosforilação de CDPK1 e na transfosforilação de MBP usado como substrato exógeno de CDPK1 foi avaliado quantificando a intensidade das respectivas bandas de autofosforilação e transfosforilação. O CDPK1 mutante com gatekeeper de metionina reteve ~ 53% da atividade de transfosforilação, enquanto a presença de uma serina na posição de gatekeeper levou à revogação completa da transfosforilação do substrato (Figura 3). Os SNPs que levam à substituição do gatekeeper de Thr para Met (T145M) foram projetados no locus endógeno cdpk1 através do CRISPR-Cas9 usando um sistema de dois plasmídeos (Figura 4 e Figura 5). Parasitas mutantes com substituição T145S não puderam ser gerados, possivelmente devido ao efeito letal do gatekeeper Ser na atividade de CDPK1. Os CDPK1T145M parasitas mutantes foram subclonados usando o método de diluição limitante, e a substituição do gatekeeper foi confirmada por meio de sequenciamento de Sanger para verificar a geração do parasita CDPK1T145M mutante. Os níveis de transcrição de 11 quinases diferentes, incluindo 7 membros da família CDPK e 4 outras quinases envolvidas no desenvolvimento esquizogônico tardio do parasita, foram testados usando PCR em tempo real (Figura 6). Os níveis de expressão de 11 quinases diferentes foram comparados entre os parasitas CDPK1T145M mutantes e selvagens (WT), normalizados para os genes housekeeping. A expressão do transcrito dos membros da família CDPK foi alterada no mutante CDPK1T145M em comparação com o parasita WT (Figura 6). Os transcritos que mostram maior expressão no mutante CDPK1T145M podem estar compensando a função de CDPK1 no parasita mutante CDPK1T145M.

Figura 1: Caracterização do tipo selvagem recombinante de comprimento total (WT) PfCDPK1. A proteína WT CDPK1 de comprimento total fundida com a etiqueta N-terminal de glutationa S transferase (GST) foi purificada por cromatografia de afinidade e separada em 10% de SDS-PAGE. CDPK1 migrou para a massa molecular prevista de ~ 87 kDa, conforme mostrado no gel de poliacrilamida corado Coomassie Brilliant Blue R-250. A proteína recombinante separada no SDS-PAGE foi transferida para uma membrana de PVDF e processada para análise de Western blot com anticorpos anti-CDPK1 e anti-GST. A banda correspondente ao CDPK1 recombinante de comprimento total em SDS-PAGE foi detectada com ambos os anticorpos, confirmando a identidade da proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Caracterização de proteínas mutantes gatekeeper CDPK1 recombinantes purificadas. (A) Alinhamento da sequência de aminoácidos primários de TgCDPK1 e PfCDPK1 (Plasmodb acesso nº. PF3D7_0217500). A treonina na posição 145 de PfCDPK1 corresponde à glicina 128, a posição de gatekeeper em TgCDPK1 (destacada em vermelho). (B) Representação do cartunista do resíduo do porteiro Thr (destacado em vermelho) codificado pelo códon triplo ACC (círculo preto) em WT CDPK1. Substituição do resíduo do gatekeeper por mutagênese dirigida ao local para gerar proteínas CDPK1 mutantes recombinantes com Met (destacado em amarelo) em CDPKT145M e Ser (destacado em azul) em CDPKT145S. (C) Perfil SDS-PAGE de WT recombinante e proteínas mutantes de CDPK1. As proteínas mutantes WT recombinantes e gatekeeper foram purificadas por cromatografia de afinidade GST e separadas em SDS-PAGE. Todas as proteínas recombinantes estão em conformidade com o peso molecular esperado de ~ 87 kDa. M- escada de peso molecular. (D) Caracterização de CDPK1 WT recombinante e proteínas mutantes por Western blotting. As proteínas mutantes WT e gatekeeper recombinantes de CDPK1 foram separadas em SDS-PAGE e transferidas para a membrana de PVDF para Western blotting. Bandas correspondentes às proteínas WT recombinantes de comprimento total e CDPK1 mutantes em SDS-PAGE foram detectadas com anticorpos anti-CDPK1 e anti-GST, confirmando a identidade de todas as proteínas recombinantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A substituição do gatekeeper em CDPK1 leva a uma diminuição na atividade quinase de enzimas mutantes. (A) Representação do cartunista da abordagem de marcação de epítopos semi-sintéticos para detectar a atividade da quinase da proteína CDPK1. Apenas a atividade de transfosforilação é representada aqui. A proteína CDPK1 tiofosforila um substrato exógeno (S, quadrado verde sólido) na presença de ATPγS (triângulo amarelo sólido), uma fonte de grupo tiofosfato terminal transferível). O resíduo tiofosforilado é alquilado por tratamento com mesilato de p-nitrobenzila (PNBM), formando um éster de tiofosfato que é então detectado com um anticorpo que reconhece especificamente o aduto de tiofosfato alquilado. (B) O ensaio de atividade de quinase in vitro usando uma abordagem de marcação de epítopos semissintéticos foi usado para testar o efeito da substituição do gatekeeper no potencial de autofosforilação e transfosforilação de proteínas mutantes CDPK1 recombinantes. Todas as proteínas recombinantes exibem atividade quinase dependente de cálcio. A autofosforilação de CDPK1 e a transfosforilação da proteína básica da mielina (MBP), um substrato exógeno, foram evidentes apenas na presença de cloreto de cálcio (Ca²⁺), enquanto nenhuma fosforilação foi detectada na presença de EGTA, um quelante específico de íons Ca²⁺ . Os mutantes gatekeeper mostram atividade de autofosforilação reduzida, enquanto a transfosforilação de MBP foi completamente anulada em CDPK1T145S. CDPK1T145M retém o potencial de transfosforilação (~ 53%), conforme relatado anteriormente³². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Construção de plasmídeos para introdução de SNPs na posição de gatekeeper no locus cdpk1 usando CRISPR-Cas9. Uma sequência guia de 20 nucleotídeos correspondentes a 432 a 451 pb foi clonada no sítio de restrição BtgZI no plasmídeo pL6eGFP para gerar pL6CK1G. Um braço de homologia (421 pb) incorporando os SNPs desejados (T145M ou T145S, códon correspondente mostrado em verde) junto com mutações de escudo (mostrado em vermelho) foi clonado em pL6CK1G dentro dos locais de enzimas de restrição AflII e SpeI para gerar pL6CK1G^T145M e pL6CK1G^T145M, respectivamente. As mutações do escudo impedem o recorte do locus modificado após a edição desejada. Cas9 endonuclease codificada em um segundo plasmídeo, pUF1 é direcionada para o local alvo dentro do locus cdpk1 com a ajuda do RNA guia expresso do plasmídeo pL6CK1G^{T145M / S} . Cas9 introduz quebra de fita dupla no local alvo em direção ao lado 5' da sequência PAM. O DSB é reparado usando braço de homologia no plasmídeo pL6CK1G^{T145M / S} . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Representação esquemática de P. transfecção de falciparum com plasmídeos CRISPR para a introdução da mutação gatekeeper (T145M) no locus cdpk1 . i) P. assíncrono. A cultura de falciparum é tratada com sorbitol para obter parasitas sincronizados em estágio de anel. ii) Os parasitas sincronizados em estágio de anel são coletados em uma cubeta de eletroporação junto com os plasmídeos pL6CK1G^{, T145M / S} e pUF1 ressuspensos em solução tampão. iii) Os parasitas são eletroporados a 310 volts, 950 μF e resistência infinita. iv) Após a transfecção, os parasitas são transferidos para um frasco T25 contendo meio RPMI completo fresco (cRPMI) e cultivados por 48 h. Após 48 h, os parasitas transfectados são trocados para cRPMI suplementado com as drogas WR99210 e DSM267 e expandido no frasco T75. v) No dia 14, as lâminas são preparadas e coradas com a coloração de Giemsa. vi) Posteriormente, o esfregaço de sangue é visualizado ao microscópio óptico para avaliar a presença de hemácias parasitadas. vii) Após a visualização, os parasitas podem crescer na presença de drogas. Posteriormente, os parasitas são processados para obter o molde para PCR e sequenciamento de DNA para verificação da modificação desejada do locus cdpk1 alvo. viii) Após a verificação, os parasitas transgênicos clonais são obtidos estabelecendo diluição limitante em uma placa de 96 poços. ix) Parasitas transgênicos clonais de poços positivos são transferidos para frascos T25 e deixados crescer. x) Os parasitas transgênicos clonais são validados por PCR e presença de SNPs desejados na posição de gatekeeper por meio de sequenciamento de DNA e análise do cromatograma. O número é modificado de³². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Representação esquemática das etapas usadas para análise de transcrição de genes-alvo por meio de PCR em tempo real (RT-PCR). A cultura de falciparum com parasitas predominantemente maduros no estágio Schizonte é obtida através do tratamento com sorbitol no mesmo ciclo. ii) Os parasitas são suavemente colocados em camadas em um gradiente de 70/40 Percoll / sorbitol em um tubo cônico de 15 mL para enriquecimento de parasitas maduros em estágio esquizonte. iii) O anel de cor preta na interfase de 40% e 70% pessoal/sorbitol é transferido para um tubo novo de 50 mL, processado e ressuspenso em cRPMI. Os parasitas enriquecidos em estágio esquizonte são incubados com hemácias frescas pré-incubadas a 37 ° C para invasão. iv) Os parasitas são cultivados por 4 h e depois tratados com 5% de sorbitol para obter parasitas em estágio de anel de 0-4 h altamente sincronizados. v) Os parasitas são cultivados por mais 44 h após o tratamento com sorbitol para obter parasitas altamente sincronizados no estágio esquizonte de 44-48 h. vi) Os parasitas sincronizados são tratados com saponina para liberá-los das hemácias e armazenados em reagente de extração de RNA. O RNA total é isolado dos parasitas ressuspensos da extração de RNA. vii) o cDNA é preparado a partir do RNA isolado. viii) Um experimento de PCR em tempo real é configurado com o modelo de cDNA para amplificar os genes-alvo usando primers específicos do gene. A placa é executada em um sistema de PCR em tempo real. ix) Os dados de expressão do transcrito são analisados usando um software de análise. O gráfico representa os níveis diferenciais de expressão de transcritos de 11 quinases em parasitas CDPK1 T145M em comparação com o tipo selvagem (WT). Este número é modificado de³². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome do gene	Sequência de primer
Pk1fpgex	ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG
Pk1rpgex	ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCACAAATTTTGTGCATC
Ck1T145S	GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145S_antisense	TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
CK1T145M	GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATTTTTATTTTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145M_antisense	TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
Ck1GUIDEFWD	TAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA
Ck1GUIDEREV	TTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA
ck1f1	ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG
ck1r3wt	TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG

Tabela 1: Lista de primers usados no estudo.

Nome do gene	Primer Direto		Primer reverso
CDPK1 (PF3D7_0217500)	GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC		ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT
CDPK2 (PF3D7_0610600)	GGAACAGGAGAATTTACAACGAC		TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG
CDPK3 (PF3D7_0310100)	CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG		CAGCGTCCATTGTAAG ACATCTTTTTATTAAATC
CDPK4 (PF3D7_0717500)	ATACTTCTCTCAGGGTGCCC		CTTATCACTAATTTTTTT GAATTGTGGTAAATCG
CDPK5 (PF3D7_1337800)	GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG		TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG
CDPK6 (PF3D7_1122800)	CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCG		ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC
CDPK7 (PF3D7_1123100)	AGTCCTAAAAAAGATATA TAAAGAACTAGGTAGTAG		TTTAAAAATAATCTTTCCCCACAACCC
PKA (PF3D7_0934800)	AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG		CTTTTGTTTCTTCTTAAA AATGTAAAAAATTCTCC
PACOTE (PF3D7_1436600)	AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGC		CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC
PKB (PF3D7_1246900)	CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG		GAGAGCGCAATTAGCCATATTG
PI3K (PF3D7_0515300)	CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG		ATCACATTTGTTATACTT ATTATCATCACATTTGTT
GAPDH (PF3D7_1462800)	GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG		GGGTTACCTCACATGG
ThrRS (PF3D7_1126000)	CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT		TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC

Tabela 2: Lista de genes-alvo (número de identificação do PlasmoDB) juntamente com a sequência dos primers usados para a análise de PCR em tempo real.

Discussion

A geração de um parasita transgênico mutante contendo um alelo hipomórfico de cdpk1 é baseada nos dados de atividade de quinase in vitro com enzimas recombinantes. É melhor gerar o maior número possível de proteínas recombinantes mutantes com diferentes resíduos de gatekeeper. Como o genoma de P. falciparum é altamente rico em AT, portanto, a expressão de proteínas recombinantes em E. coli pode exigir otimização de códon. Isso ajudará em uma avaliação abrangente da substituição do gatekeeper na atividade da quinase da enzima mutante. A substituição do gatekeeper que resulta na redução do potencial de transfosforilação é selecionada para gerar um parasita transgênico de troca alélica. Paralelamente, uma substituição de gatekeeper que anule completamente a atividade de transfosforilação da quinase deve ser tomada como um controle negativo. Outra consideração importante ao gerar o parasita de troca alélica é introduzir uma mutação sinônima junto com a mutação teste e o controle negativo. A geração do parasita contendo uma mutação sinônima no locus cdpk1 serve como um importante controle interno para descartar quaisquer erros técnicos durante a introdução da mutação de teste. Além disso, o parasita transgênico portador da mutação sinônima pode ser empregado como controle para todos os estudos comparativos em vez do parasita WT.

Empregamos um sistema de dois plasmídeos para gerar o parasita mutante gatekeeper^32,35. No entanto, a eficiência da introdução do SNP no locus alvo pode ser aumentada usando um único sistema de plasmídeo em vez de um sistema de dois plasmídeos⁴¹. No sistema de plasmídeo único, todos os elementos críticos necessários para a edição de genes mediada por CRISPR-Cas9 são incorporados em um único plasmídeo em vez de dois. O plasmídeo único codifica a endonuclease Cas9, transcreve o sgRNA constituído de tracrRNA e RNA guia e contém um braço de homologia para o reparo da quebra de fita dupla introduzida pela endonuclease Cas9 no local alvo. Em um sistema de dois plasmídeos, os parasitas são co-transfectados com ambos os plasmídeos. Como o número de parasitas que recebem ambos os plasmídeos simultaneamente em um sistema de dois plasmídeos será baixo em comparação com um sistema de plasmídeo único, a eficiência da edição de genes mediada por CRISPR é menor em um sistema de dois plasmídeos em comparação com um sistema de plasmídeo único. Alternativamente, uma estratégia de resgate suicida⁴² também pode ser empregada em que o braço de homologia é fornecido como um fragmento linear ou em um plasmídeo sem um marcador de seleção de drogas (plasmídeo de resgate). A endonuclease Cas9 e o RNA guia que codifica o sgRNA são fornecidos em um plasmídeo contendo um de seleção de drogas (plasmídeo suicida). Uma vez que um fragmento linear ou um plasmídeo sem um de seleção de drogas tem maior probabilidade de ser perdido durante a replicação do parasita, a quebra de fita dupla introduzida pela endonuclease Cas9 no locus alvo deve ser prontamente reparada usando o braço de homologia que pode estar disponível por um período limitado. Essa estratégia tem algumas vantagens sobre um sistema de dois plasmídeos, pois é mais eficiente e não há necessidade de subclonar o braço de homologia em um plasmídeo diferente. Outras variações da edição do gene CRISPR-Cas9 também podem ser consideradas para a introdução de SNP no locus alvo⁴³.

Selecionamos manualmente a região guia para introduzir a substituição T145M no locus cdpk1 . Uma sequência de guia apropriada para introduzir a quebra de fita dupla no locus alvo pode ser selecionada usando vários softwares on-line disponíveis gratuitamente, como Chopchop⁴⁴, CRISPOR⁴⁵, CCTop⁴⁶, Cas-OFFinder⁴⁷. Esses softwares, além de fornecer a eficiência de cada sequência guia, também fornecem as pontuações fora do alvo e de especificidade, que aumentam a taxa de sucesso de um experimento de edição de genes mediado por CRISPR-Cas9.

Existem diferentes métodos disponíveis para a transfecção de parasitas da malária. Usamos parasitas em estágio de anel para experimentos de transfecção^48,49, no entanto, o pré-carregamento de hemácias com plasmídeos também tem sido usado com sucesso para estudos de transfecção de parasitas⁵⁰. Neste método, as hemácias são transfectadas com plasmídeos sob um conjunto específico de parâmetros por meio de eletroporação e são posteriormente usadas para infecção com parasitas purificados em estágio avançado. Os parasitas invadem hemácias pré-carregadas com plasmídeos. Durante seu crescimento dentro das hemácias pré-carregadas com plasmídeos, o parasita absorve o DNA do plasmídeo por meio de um mecanismo desconhecido⁵⁰. Existe outro método que pode ser empregado para a transfecção de parasitas que requer parasitas em estágio esquizonte purificados muito maduros para transfecção direta com os plasmídeos. O instrumento usado para a transfecção dos esquizontes purificados é o nucleofector 4D⁵¹. A escolha de um método de transfecção varia entre os diferentes grupos de pesquisa, dependendo dos recursos disponíveis e da taxa de sucesso. É uma boa ideia verificar qual dos três métodos funciona para um grupo e empregá-lo para experimentos de transfecção subsequentes. Dois métodos podem ser aplicados consecutivamente para aumentar ainda mais a eficiência da transfecção. Por exemplo, a primeira etapa de transfecção pode empregar parasitas em estágio de anel, seguidos pela adição de hemácias frescas pré-carregadas com os plasmídeos.

Selecionamos apenas alguns genes para análise de transcrição nos CDPK1T145M parasitas em comparação com o controle baseado na literatura anterior ou na presença de membros da família CDPK. No entanto, para obter uma visão abrangente da religação transcricional global no parasita transgênico contendo um alelo hipomórfico de CDPK1 , abordagens como RNA-Seq ou microarray podem ser empregadas.

O método utilizado neste estudo pode ser aplicado a outras quinases do parasita da malária para entender o desenvolvimento de mecanismos compensatórios sob pressão de drogas. As informações obtidas por meio dessa técnica podem ser úteis na implantação estratégica de medicamentos combinados para evitar o desenvolvimento e a disseminação da resistência aos medicamentos. Direcionar duas ou várias quinases que mostram complementação funcional é uma estratégia melhor do que direcionar quinases individuais para controle e eliminação da malária.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x coquetel inibidor de fosfato	Sigma-Aldrich	04906 845001
AflII	NEB	R0520S
Albumax II	Gibco	11021-037
Anti-GST anticorpo	ThermoFisher Scientific	G7781
Anti-Mouse HRP	Sigma-Aldrich	A4416
Anti-Coelho HRP	Sigma-Aldrich	A6154
BamHI	NEB	R3136S
BtgZ1	NEB	R0703S
Centrífuga	ThermoFisher Centrífuga	micro 17R
legend (Para peletização de células bacterianas)	Centrífuga ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R
(Para peletização/processamento de parasitas)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R (rotor TX-400)
DpnI	NEB	RO1765
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
E. coli BLR(DE3) pLysS células competentes	Sigma-Aldrich	69956
E. coli DH5a Células competentes	Takara Bio	9057
Cubetas de eletroporação, espaço de 0,2 cm		BioRad 1652086
Electroporator	BioRad	GenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP reagente quimioluminescente	G-Bioscience	7860-003
Gentamicina	ThermoFisher Scientific	15750078
Giemsa Mancha	Himedia	S011-100ML
Glutationa Sepharose 4B	GE Healthcare	17075601
HEPES, Ácido Livre	Merck	391338
Hipoxantina	Merck	4010CBC
Kit de clonagem HD em fusão	Takara Bio	1711641A
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708880EDU
MBP, desfosforilado	Merck	13-110
NotI	NEB	R3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF	Takara Bio	740424
NucleoSpin Gel e PCR kit Mini	Takara Bio	740609
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
mesilato de p-nitrobenzila (PNBM)	Abcam	Ab138910
Primestar Max DNA Polimerase	Takara Bio	R045A
Coquetel de inibidores de protease	Roche
Kit de Minipreparação Spin Qiaprep	Qiagen	27106
QuikChange II XL kit de mutagênese dirigida ao local	Agilent	200521
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	31800-105
Saponina	Sigma-Aldrich	47036
Bicarbonato de Sódio	Sigma-Aldrich	S5761
SpeI-HF	NEB	R3133S
SuperScript III	ThermoFisher Scientific	18080-051
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	15224017
anticorpo éster de tiofosfato	Abcam	Ab92570