Modelo in vitro integrando rigidez e fluxo do substrato para estudar as respostas das células endoteliais

Resumo

Sintetizamos e caracterizamos um substrato ajustável à base de gelatina para cultura de células endoteliais vasculares (CEs) sob condições relevantes de fluxo vascular. Esta superfície biomimética replica condições fisiológicas e patológicas, permitindo o estudo de forças mecânicas no comportamento da CE e avançando nossa compreensão da saúde vascular e dos mecanismos de doença.

Resumo

Apresentamos um modelo in vitro inovador com o objetivo de investigar os efeitos combinados da rigidez tecidual e do estresse de cisalhamento na função das células endoteliais (CE), que são cruciais para a compreensão da saúde vascular e o aparecimento de doenças como a aterosclerose. Tradicionalmente, os estudos têm explorado os impactos da tensão de cisalhamento e da rigidez do substrato nos CEs, de forma independente. No entanto, este sistema integrado combina esses fatores para fornecer uma simulação mais precisa do ambiente mecânico da vasculatura. O objetivo é examinar a mecanotransdução de EC em vários níveis de rigidez tecidual e condições de fluxo usando ECs humanos. Detalhamos o protocolo para sintetizar hidrogéis de metacrilato de gelatina (GelMA) com rigidez ajustável e semeá-los com CEs para obter confluência. Além disso, descrevemos o projeto e a montagem de uma câmara de fluxo econômica, complementada por simulações computacionais de dinâmica de fluidos, para gerar condições fisiológicas de fluxo caracterizadas por fluxo laminar e níveis apropriados de tensão de cisalhamento. O protocolo também incorpora marcação de fluorescência para microscopia confocal, permitindo a avaliação das respostas do EC às condições de complacência do tecido e fluxo. Ao submeter CEs cultivados a múltiplos estímulos mecânicos integrados, este modelo permite investigações abrangentes sobre como fatores como hipertensão e envelhecimento podem afetar a função da CE e as doenças vasculares mediadas pela CE. Os insights obtidos com essas investigações serão fundamentais para elucidar os mecanismos subjacentes às doenças vasculares e desenvolver estratégias de tratamento eficazes.

Introdução

O endotélio, que reveste a superfície interna dos vasos sanguíneos, desempenha um papel fundamental na manutenção da saúde vascular. As células endoteliais (CEs) são fundamentais para regular várias funções cardiovasculares, incluindo controle do tônus dos vasos, permeabilidade seletiva, hemostasia e mecanotransdução ^1,2. A pesquisa ligou firmemente a disfunção da CE a um papel primário no desenvolvimento da aterosclerose. Notavelmente, os CEs encontram diversas forças mecânicas nas interfaces onde interagem com o fluxo sanguíneo e os tecidos dos vasos subjacentes ^3,4. Vários estudos associaram a disfunção da CE a alterações anormais em fatores mecânicos dentro do ambiente vascular, como a tensão de cisalhamento do fluido do fluxo sanguíneo e a rigidez do tecido ^5,6,7.

No entanto, pesquisas anteriores receberam atenção limitada na compreensão dos efeitos combinados da rigidez do tecido e da tensão de cisalhamento na função do CE. Para aumentar a capacidade de traduzir os resultados da pesquisa em tratamentos eficazes para aterosclerose e outras doenças cardiovasculares, é essencial melhorar os modelos celulares usados no campo. Um progresso significativo foi feito na humanização de modelos celulares, empregando CEs humanos e submetendo-os a tensões de cisalhamento ou substratos com níveis de rigidez variados ^8,9,10. No entanto, a adoção e o refinamento de modelos celulares que integram ambientes de fluxo dinâmico com substratos EC que possuem propriedades de rigidez ajustáveis progrediram lentamente. O desafio está na criação de substratos de EC sem inchamento para evitar alterações nos parâmetros de fluxo dentro do canal de fluxo, ao mesmo tempo em que facilita o cultivo de monocamadas de EC intactas e bem aderidas. Um modelo in vitro capaz de superar esses obstáculos poderia facilitar investigações mais eficazes sobre como a hipertensão, o envelhecimento e as condições de fluxo influenciam de forma colaborativa a mecanotransdução da CE, a saúde vascular e, em última análise, o desenvolvimento da aterosclerose. Vários métodos foram desenvolvidos para aplicar tensão de cisalhamento nas células enquanto controla a rigidez do substrato, incluindo placas rotativas e dispositivos microfluídicos. No método da placa rotativa, as células são colocadas entre duas placas e a tensão de cisalhamento é aplicada através do movimento rotacional das placas. Este método é menos complicado e fornece um modelo rápido; no entanto, sofre de variação espacial da tensão de cisalhamento, com tensão de cisalhamento zero no centro e tensão de cisalhamento máxima na periferia¹¹.

Por outro lado, os dispositivos microfluídicos representam a nova geração de ferramentas com a capacidade de controlar a rigidez do substrato e as condições de fluxo. Esses sistemas são adequados para imitar microvasculaturas sob condições de fluxo laminar. No entanto, o estudo da aterosclerose com esses dispositivos é impraticável, pois a aterosclerose ocorre em grandes vasos com fluxo perturbado¹¹. Este artigo tem como objetivo contribuir para o domínio crítico de pesquisa dos estudos de EC, apresentando um sistema econômico capaz de examinar os efeitos de níveis variáveis de rigidez em substratos de EC sob diferentes condições de fluxo. O sistema integra substratos com diferentes rigidezes para emular vasos sanguíneos patológicos e fisiológicos. Este protocolo descreve o método para a criação de hidrogéis à base de gelatina sem níveis de inchaço e rigidez de 5 kPa e 10 kPa, representando rigidez fisiológica e patológica, respectivamente. Além disso, é detalhada a construção de uma câmara de fluxo de placas paralelas capaz de integrar esses substratos. A fluidodinâmica computacional (CFD) foi empregada para avaliar a tensão de cisalhamento e as condições de escoamento. A preparação de hidrogéis para cultura de CE e a execução de um experimento de fluxo de 6 h são descritas, seguidas de uma discussão sobre a imunomarcação pós-experimento.

Protocolo

1. Síntese de GelMA

1. Preparar uma solução 0,2 M de carbonato de sódio anidro e uma solução 0,2 M de bicarbonato de sódio.
2. Misture 46 mL de solução de bicarbonato de sódio com 15 mL de solução de carbonato de sódio e adicione 139 mL de água deionizada (DI). Ajuste o pH para 9,5 usando NaOH 0,1 M e HCl, se necessário.
3. Adicione 10 g de gelatina tipo A, 300 bloom de pele suína, a 100 mL de tampão carbonato-bicarbonato a uma concentração de 10% p/v.
4. Dissolver a gelatina em banho-maria a 55 °C, agitando a solução a 700 rpm com um agitador magnético. Depois de totalmente dissolvido, ajuste o pH da solução de gelatina para 9,5 usando NaOH 0,1 M.
5. Para iniciar a metacrilação, adicione 938 μL de anidrido metacrílico (MAH) gota a gota à solução. Melhore a distribuição inicial de MAH na solução de gelatina injetando-a em vários locais, incluindo diferentes profundidades e distâncias radiais do centro.
6. Enrole o recipiente de reação em papel alumínio para evitar a exposição à luz. Manter a temperatura a 55 °C e agitar a solução a 500 rpm durante 1 h para completar a reacção (Figura 1A)¹².
   NOTA: A reação pára em um pH abaixo de 7,4.
7. Prepare um copo de 2 L contendo 1,8 L de acetona e um copo de 0,6 L contendo 0,3 L de acetona.
8. Adicionar a solução de GelMA resultante gota a gota ao copo de 2 L, agitando a 200 RPM para induzir a precipitação¹³. Para maximizar a coleta do produto precipitado, coloque uma haste ou espátula de aço inoxidável como local de nucleação para facilitar a transferência.
9. Transfira o produto do copo maior para o menor e deixe-o descansar por 10 minutos antes de prosseguir para a etapa de secagem. O GelMA precipitado deve aparecer como fibras brancas.
10. Recolha o produto em papel absorvente, seque-o em forno a vácuo à temperatura ambiente (RT) e guarde-o a -20 °C até nova utilização.
    NOTA: Detalhes adicionais sobre a caracterização química do produto por ressonância magnética nuclear de prótons (^{RMN de 1}H) podem ser encontrados em um trabalho publicado anteriormente⁸.

2. Salinização do vidro

NOTA: A fixação de hidrogéis em lâminas de vidro fornece uma superfície plana e uniforme, facilitando o manuseio e garantindo estabilidade sob tensão de cisalhamento derivada do fluxo. A funcionalização do vidro com metacrilato de 3-(trimetoxissilil)propila é necessária para melhorar as propriedades da superfície e permitir a fixação covalente de hidrogéis durante o processo de polimerização.

1. Corte com precisão lâminas de microscópio simples (1 mm de espessura) em pedaços semelhantes às dimensões finais do hidrogel usando um cortador de vidro. Lave as lâminas cortadas com sabão para remover contaminantes e detritos da superfície que possam obstruir o tratamento da superfície do vidro.
   NOTA: Se necessário, sonicar as lâminas de vidro durante 5 min em etanol e depois secar ao ar.
2. Preparar uma solução a 0,5% de metacrilato de 3-(trimetoxissilil)propilo em etanol absoluto. Prepare uma solução de ácido acético glacial a 10% em água DI. Misture as soluções para obter uma concentração final de ácido acético glacial a 3%.
   NOTA: A solução de ácido acético glacial pode ser preparada em grandes quantidades e armazenada.
3. Organize as lâminas de vidro em um recipiente de vidro para garantir que as superfícies de vidro não fiquem obstruídas. Despeje a solução resultante sobre as lâminas de vidro e mantenha-as por aproximadamente 5 min em um balancim a 80 rpm para que a reação seja concluída. Certifique-se de que ambos os lados das lâminas de vidro sejam modificados removendo quaisquer bolhas de ar presas.
4. Após a reacção estar completa, aspirar a solução e lavar as lâminas de vidro com etanol 2x. Seque as lâminas ao ar livre e guarde-as no escuro em RT.
   NOTA: As lâminas de vidro mantêm sua modificação por 1 mês nessas condições.

3. Preparação de hidrogel

1. Fabrique hidrogéis usando um método de polimerização de radicais livres induzido por redox.
   1. Monte moldes de politetrafluoretileno (PTFE) de duas peças com profundidade adequada e janelas de abertura de 10 mm² para moldar o substrato final. Responsável por um encolhimento de 25% na altura do hidrogel após a polimerização durante o processo de design. Certifique-se de que os moldes estejam planos e bem presos nas placas inferior e superior para evitar vazamentos.
      NOTA: As dimensões do molde projetadas são intencionalmente 10% maiores do que o tamanho pretendido do hidrogel. Este design serve a vários propósitos: evita danos nas laterais após a separação do molde, aumenta a uniformidade da superfície do hidrogel empurrando impurezas ou bolhas para os lados e compensa o encolhimento previsto de 25% após o equilíbrio devido ao efeito de sinérese, onde hidrogéis altamente reticulados repelem a água após o equilíbrio, causando encolhimento. A quantidade de encolhimento é especificada no protocolo⁸.
   2. Para garantir que os hidrogéis tenham uma superfície uniforme e altura constante, suspenda as lâminas de vidro modificadas da placa superior do molde, permitindo uma abertura estreita para injetar a solução de polímero. Use uma lamínula para suspender as lâminas de vidro modificadas (Figura 1B).
   3. Para criar o vidro de cobertura, corte o vidro microscópico liso 20% maior que o molde. Prenda dois espaçadores nos lados mais curtos. Calcule a espessura do espaçador da seguinte forma:
      Espessura do espaçador = 1,33 x espessura final do gel + 1 (espessura do vidro modificado) - profundidade do molde
   4. Aplique uma fina camada de graxa de vedação compatível com células nos lados mais longos da lamínula, na mesma face onde os espaçadores estão fixados.
   5. Prenda a lâmina de vidro modificada à lamínula entre os dois espaçadores.
   6. Coloque a lamínula no molde de forma que os espaçadores fiquem no molde e o vidro modificado se estenda para dentro do molde. Essa configuração fornece uma folga de 1,33 da altura final do hidrogel entre o vidro modificado e o fundo do molde.
   7. Dissolva o GelMA em água DI a 4% e 10% p / v para hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa, respectivamente, e coloque-o em banho-maria a 45 ° C.
      NOTA: O GelMA é um polímero termossensível e manter a temperatura da solução a 45 °C evita a solidificação antes da polimerização e reduz a viscosidade da solução, o que é crucial para a fabricação de hidrogéis planos.
   8. Adicione TEMED (24 mM para hidrogel de 5 kPA, 6,25 mM para hidrogel de 10 kPa) à solução de polímero e misture bem.
      NOTA: O TEMED sozinho não inicia a polimerização, portanto, certifique-se de que moldes, pipetas e soluções sejam preparados antes de prosseguir.
   9. Adicione APS (24 mM para hidrogel de 5 kPA, 24,5 mM para hidrogel de 10 kPa) à solução de GelMA e misture bem.
      NOTA: A adição de APS inicia a polimerização e os hidrogéis podem se formar rapidamente, exigindo ação imediata para evitar hidrogéis defeituosos. Mais detalhes sobre as medidas de rigidez podem ser encontrados em um trabalho publicado anteriormente⁸.
   10. Pipetar cuidadosamente a solução resultante para a abertura entre a lâmina de vidro suspensa e o molde à RT e deixá-la reticular. A força capilar impulsiona a solução de polímero para o molde. Evite adicionar bolhas aos géis e pare de pipetar quando uma pequena quantidade de solução permanecer na ponta da pipeta.
       NOTA: Durante a polimerização, os grupos metacrilato de GelMA reagem com resíduos de metacrilato nas lâminas de vidro modificadas, resultando na ligação química do hidrogel ao vidro.
   11. Após 15 minutos, a reação está completa. Separe o substrato do molde usando um objeto pontiagudo, como uma agulha, e deslize o substrato para longe da lamínula para separá-lo.
   12. Transferir os hidrogéis para 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) numa placa de Petri de 100 mm selada com película plástica e equilibrar a 37 °C para remover os reagentes e subprodutos restantes.
   13. Como o hidrogel é ligeiramente maior do que as dimensões finais, apare o excesso de gel nas laterais para corresponder às dimensões necessárias para a janela da câmara de fluxo.
   14. Use a câmara de fluxo para verificar as dimensões do hidrogel. Certifique-se de que o hidrogel se encaixe corretamente na câmara de fluxo, sem lacunas entre o hidrogel e o molde ou quaisquer defeitos que possam afetar os padrões de fluxo. Se houver irregularidades de forma que possam afetar o padrão de fluxo na câmara de fluxo, levando a um comportamento celular adverso, guarde o hidrogel para condições estáticas.
   15. Transfira quatro hidrogéis para uma placa de Petri contendo 1x PBS para esterilização.
2. Esterilize o hidrogel conforme descrito abaixo usando etanol a 70%.
   1. Prepare soluções alcoólicas a 25%, 50% e 70% para desidratação gradual do hidrogel.
      NOTA: Se a desidratação gradual não for realizada, os hidrogéis mais rígidos podem encolher e quebrar, enquanto rugas podem se formar na superfície dos hidrogéis mais macios.
   2. Aspire a solução 1x PBS da placa de Petri contendo hidrogéis. Adicione solução de etanol a 25% a cada placa de Petri para submergir os hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa por 15 min.
   3. Aspire a solução de álcool a 25%. Adicione a solução de álcool a 50% a cada placa de Petri para submergir os hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa por 15 min.
   4. Aspire a solução de álcool a 50%. Adicione solução de álcool a 70% a cada placa de Petri, submergindo os hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa por 5 min. Coloque a placa de Petri em uma coqueteleira a 100 rpm.
   5. Deixe os hidrogéis de 5 kPa submersos por 40 min e os hidrogéis de 10 kPa por 20 min.
      NOTA: Observou-se que os hidrogéis de 5 kPa são mais propensos à contaminação em comparação com os hidrogéis de 10 kPa.
   6. Transfira as amostras para uma placa de 6 poços em um gabinete de biossegurança e lave os hidrogéis 2x-3x usando PBS estéril.

4. Hidrogéis de revestimento

1. Prepare uma solução de gelatina de 60 μg / mL dissolvendo 3 mg de gelatina em 50 mL de PBS estéril (1x com magnésio e sal de cálcio). Aquecer a solução em banho-maria a 37 °C durante 30 min ou até que toda a gelatina esteja totalmente dissolvida.
2. Filtrar estéril a solução de revestimento utilizando um filtro de seringa de 0,2 μm. Aspire a solução 1x PBS de cada placa de poço e adicione solução de gelatina a cada poço, garantindo a cobertura completa de cada hidrogel. Para minimizar o risco de contaminação, adicione 40 unidades/mL de penicilina e 10 μg/mL de estreptomicina à solução de revestimento.
3. Incubar cada placa de poço em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ por 45 min. Lave os hidrogéis com 1x solução PBS.
4. Aspirar PBS e adicionar meios de cultura celular.
5. Por no máximo dois dias, manter os hidrogéis em meios de cultura de células e incubá-los em uma incubadora de CO₂ a 37 °C e 5% até a semeadura celular.
   NOTA: Apesar das excelentes propriedades de fixação celular da fibronectina, existe uma preocupação com seu uso devido aos CEs depositarem fibronectina endógena em condições ateroscleróticas, o que pode levar a uma resposta pró-inflamatória. Para evitar respostas celulares quimicamente estimuladas, evitamos o uso de fibronectina. Além disso, Orr et al. demonstraram que o revestimento de fibronectina, em comparação com o revestimento de colágeno I, regulava positivamente os genes aterogênicos. Especificamente, eles observaram níveis aumentados de expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), molécula de adesão de células vasculares 1 (VCAM-1) e fator nuclear-κB (NF-κB)¹⁴.

5. Semeando células nos substratos

1. Preparar a suspensão celular seguindo os protocolos de descolamento disponíveis e contar as células com hemocitômetro⁸.
2. Aspire completamente o meio dos hidrogéis. Adicione 50.000 células/cm2 a cada amostra. Adicione um volume adequado de suspensão celular a cada amostra para evitar o transbordamento celular.
   NOTA: Substratos mais rígidos são mais hidrofóbicos; portanto, minimize o tempo entre as etapas para melhorar a molhabilidade e a dispersão da suspensão celular na superfície do substrato.
3. Incubar hidrogéis semeados por células em uma incubadora de CO₂ a 37 °C e 5% por 2 h. Adicione meios de cultura de células às amostras assim que as células estiverem ligadas aos géis.

6. Fabricação da câmara de fluxo

NOTA: A abordagem para projetar a câmara de fluxo é econômica e requer experiência mínima para fabricação e utilização.

1. Use poli (metacrilato de metila) para fabricação de câmaras para avaliar visualmente a qualidade do fluxo, a integridade do hidrogel sob tensão de cisalhamento e possíveis estudos de biomarcadores em tempo real durante experimentos de fluxo. O projeto da câmara foi criado usando software de design auxiliado por computador (CAD). A câmara de fluxo foi registrada para patente e detalhes sobre este dispositivo não podem ser divulgados no presente protocolo.
2. Avaliação computacional das condições de escoamento na câmara de escoamento
   1. Monte os componentes individuais da câmara de fluxo projetada (. SLDPRT) para criar a configuração final da câmara.
   2. Desenhe uma linha ao longo da linha central do fluxo tangencial à superfície do hidrogel para analisar a tensão de cisalhamento. Feche as aberturas de entrada e saída para definir um volume de controle fechado.
   3. Abra o Flow Simulation na guia Add-Ins no software CAD. Na guia Simulação de fluxo, abra o recurso Assistente para inserir as propriedades. Especifique o sistema de unidades e ajuste a pressão e as unidades de tensão para dyne/cm².
   4. Verifique o fluxo de fluido e a gravidade nas características físicas. Defina a gravidade para -9,8 no componente Z; Os componentes X e Y devem ser zero.
   5. Escolha Interno para o tipo de análise em Tratamento de geometria. Selecione Água como o fluido padrão.
      NOTA: Suponha que o meio se comporte como água.
   6. Escolha Laminar e Turbulento para o tipo de fluxo. Defina a parede como uma parede adiabática e insira a rugosidade da superfície em Condição da parede.
   7. Defina a temperatura para 37.5 °C (310.65 K) nas condições iniciais. Definir o domínio computacional em projetos de Simulação de Escoamento, garantindo que ele cubra todo o volume de controle.
   8. Selecione todas as paredes que fazem interface com o fluido para definir o subdomínio do fluido. Em Condição de limite, designe a superfície interna da tampa de entrada como Fluxo de volume de entrada e especifique a taxa de fluxo (Q) e o fluxo uniforme. Em seguida, atribua a superfície interna da vedação da tampa de saída como pressão estática.
   9. Determine o tamanho da malha global com base nos recursos computacionais disponíveis. Clique em Executar para iniciar a simulação.
   10. Após a conclusão, revise os resultados desejados, incluindo gráficos de tensão de cisalhamento e simulações de fluxo.
   11. Repita as etapas 6.2.8 a 6.2.10 com várias taxas de fluxo para calcular a tensão de cisalhamento aplicada em taxas diferentes. Use a análise de regressão para estabelecer a relação taxa de fluxo-tensão de cisalhamento.
   12. Avalie a tolerância do sistema a variações nas dimensões do hidrogel para aumentar o realismo da simulação.

7. Execute o fluxo laminar uniforme

1. Após a cultura das células nos hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa, assegurar a confluência da monocamada celular numa incubadora de CO₂ a 37 °C e 5%. Uma monocamada de células em cada hidrogel deve ser alcançada.
2. Esterilize os componentes autoclaváveis do sistema de câmara de fluxo de placa paralela (parafusos de aço inoxidável, espátula, pinça, junta e reservatório de mídia) com um ciclo de autoclave por gravidade de 30 minutos. Esterilize outras peças (componentes de acrílico e reservatório/dampers) com exposição à luz UV.
3. Monte o dispositivo da câmara de fluxo em um gabinete de biossegurança. Proteja as amostras de hidrogel no dispositivo, garantindo uniformidade. Use um enchimento de tamanho igual aos hidrogéis se um número insuficiente de amostras estiver disponível para o fluxo.
4. Umedeça previamente a superfície interna da câmara e as superfícies de hidrogel para minimizar a formação de bolhas e evitar o ressecamento das células durante a montagem.
5. Adicione mídia suficiente ao reservatório de entrada, permitindo que 20% a 30% da mídia flua para o reservatório de saída após a montagem. Sele o reservatório de entrada hermeticamente usando um damper/selador.
   NOTA: O acúmulo de pressão no reservatório de entrada impulsiona o fluxo e qualquer vazamento de ar altera as taxas de fluxo. Verifique se há defeitos no selante se formarem bolhas na tubulação externa.
6. Defina a saída damper para pressão atmosférica para estabelecer a diferença de pressão. Coloque o dispositivo e os reservatórios em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ . Conecte a tubulação do dispositivo a uma bomba peristáltica colocada fora da incubadora (Figura 1C).
7. Ligue a bomba para começar a aplicar 3,6 dinas/cm². Aumente gradualmente a taxa de fluxo em incrementos de 2 mL / min (por exemplo, atinja 85 mL / min de 65 mL / min após 10 min) até aplicar aproximadamente 8 dinas / cm².
8. Aumente ainda mais a taxa de fluxo em incrementos de 2,5 mL / min até atingir 12 dinas / cm² de tensão de cisalhamento.
   NOTA: Dê tempo para que as células se adaptem à condição dinâmica, pois aumentos rápidos da taxa de fluxo podem separar as células e danificar a monocamada.
9. Após 6 h, pare o fluxo, remova o dispositivo da incubadora e desmonte a câmara de fluxo. Posteriormente, transfira amostras de hidrogel para uma placa de seis poços.
10. Lave as amostras com PBS gelado e fixe as células para imunocoloração ou lise-as para isolamento de proteínas.

8. Configuração de imunocoloração para microscopia confocal com alta ampliação

NOTA: Para aumentar a eficiência do estudo, foi desenvolvido um método para imunomarcação de pequenas porções de hidrogéis, permitindo o exame de múltiplos alvos biológicos em uma única amostra.

1. Prepare punções de biópsia ou ferramentas de corte preferidas com diâmetros de 3 ou 4 mm.
2. Use uma caixa de ponteira de pipeta como câmara de coloração. Umidifique a câmara para controlar a evaporação da solução de coloração durante a incubação prolongada, colocando uma toalha de papel úmida no fundo da caixa da ponteira da pipeta.
3. Reduza o consumo de anticorpos criando pequenos conjuntos de soluções para amostras individuais. Cubra o rack da caixa de pontas com filme transparente, pressionando suavemente o filme contra os orifícios do rack com a ponta do dedo para fazer covinhas. Preencha as covinhas com 70 μL de PBS.
4. Transfira um hidrogel individual para uma placa de Petri vazia e corte-o usando um punção de biópsia ou ferramenta de corte preferida. Use um microscópio para cortar uma área de amostra representativa. Corte um cilindro de gel cheio para evitar problemas de microscopia confocal.
5. Coloque as amostras de hidrogel cortadas nas covinhas criadas na etapa 8.3. Realize a coloração seguindo o protocolo padrão¹⁵. Após a lavagem final da coloração, obtenha uma folha de borracha de silicone que corresponda à espessura do hidrogel.
   NOTA: De preferência, use uma folha com um lado adesivo para melhorar a vedação. Neste estudo, as fibras de actina foram coradas usando um anticorpo secundário fluorescente conjugado à faloidina em uma diluição de 1:20.
6. Corte a folha de borracha em quadrados de 15 mm x 15 mm. Faça um furo de 6 mm usando um punção de biópsia ou ferramenta de corte preferida.
7. Crie um recipiente de amostra anexando a borracha a uma lamínula de microscopia (nº 1.5). Adicione 10 μL de mídia de montagem úmida às covinhas enquanto a amostra ainda está presente e incube-a no escuro por 10-15 min.
   NOTA: Para este estudo, o meio de montagem continha 0,9 μg/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para encurtar o protocolo de coloração.
8. Retirar a amostra da câmara de coloração e colocá-la no recipiente criado no passo 8.7. Aplique 1-2 μL de mídia de montagem em cima da amostra.
   NOTA: A quantidade de mídia de montagem afeta a qualidade da imagem em grandes ampliações. Mídia de montagem excessiva ou insuficiente pode comprometer a clareza da imagem.
9. Posicione outra lamínula na parte superior e pressione suavemente para garantir que a amostra entre em contato com o vidro. Armazenar as amostras a 4 °C no escuro até à obtenção de imagens microscópicas.

Resultados

A Figura 1 mostra a configuração experimental, descrevendo o processo de síntese de GelMA por meio de uma reação de metacrilação. O produto resultante foi então usado para fabricar o substrato de hidrogel, no qual os CEs foram semeados. Posteriormente, as células foram introduzidas na câmara de fluxo para um experimento de fluxo de 6 h a 12 dinas/^cm2.

¹A espectroscopia de RMN H foi usada para avaliar o sucesso da reação de metacrilação (Figura 2A). A presença de um grupo metil a 1,9 ppm e um pico vinílico entre 5,4-5,6 ppm em GelMA confirmou o sucesso da metacrilação. Além disso, a diminuição do pico de lisina a 3 ppm em GelMA indica o consumo de resíduos de lisina, que são substituídos por resíduos de metacrilato 12,13,16. A rigidez dos hidrogéis de GelMA foi avaliada por meio de um teste de compressão, que mostrou que os módulos de compressão aumentaram com as concentrações de GelMA (Figura 2B). Hidrogéis compostos por 4% e 8% (p/v) de GelMA foram usados para mimetizar a rigidez fisiológica (5 kPa) e patológica (10 kPa) da matriz, respectivamente⁸.

A câmara de fluxo foi projetada para ser econômica e fácil esterilização, utilizando polímero acrílico resistente aos raios UV. Sua transparência facilita o monitoramento em tempo real de hidrogéis e condições de fluxo durante os experimentos. Projetada com três camadas distintas, a câmara minimiza o risco de danos causados pelo hidrogel durante a carga ou descarga: a placa inferior fornece uma base robusta, a camada intermediária oferece suporte lateral para os hidrogéis e a placa superior, ao longo da junta, cria a folga necessária para o fluxo do fluido (Figura 3A). Simulações computacionais foram conduzidas usando CFD para avaliar as condições de fluxo e tensão de cisalhamento dentro da câmara. A seguinte equação - tensão de cisalhamento = 0,0558 x vazão - calculou a tensão de cisalhamento aplicada às células com base na vazão como entrada (Figura 3B). Notavelmente, mudanças nas propriedades do material, como rigidez, não alteraram a tensão de cisalhamento nas simulações. Para contar as diferenças no tamanho do hidrogel na configuração experimental final, os hidrogéis foram intencionalmente dimensionados um pouco menores no modelo computacional. Uma lacuna de 0,5 mm foi criada entre um lado dos hidrogéis e as paredes da placa intermediária da câmara, perpendicular à direção do fluxo. Essa configuração permitiu a análise dos efeitos das tensões de cisalhamento nessas lacunas. Embora irregularidades na tensão de cisalhamento tenham sido observadas nos locais das lacunas (Figura 3B), seu impacto foi confinado a uma pequena área adjacente às lacunas, com a superfície de hidrogel restante experimentando tensão de cisalhamento uniforme (Figura 3C). Esses insights sugerem descartar células das bordas dos hidrogéis para minimizar o impacto potencial de regiões turbulentas. Vale ressaltar que maior tensão de cisalhamento, de até 15 dina/cm², foi aplicada experimentalmente em CEs semeados em hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa sem vazamento no dispositivo (dados não incluídos). No entanto, aumentar ainda mais a tensão de cisalhamento pode resultar em descolamento celular e falha do hidrogel, enfatizando a necessidade de otimização cuidadosa das condições experimentais.

Para que as células de semeadura formem uma monocamada, é crucial usar uma densidade celular mais alta do que nas culturas tradicionais. Foi demonstrado que a baixa densidade de semeadura dificulta a formação de monocamada em hidrogéis mais macios⁸. Além disso, o pré-revestimento de hidrogéis com gelatina antes da semeadura celular aumenta a fixação inicial das células e a disseminação em hidrogéis mais macios. No entanto, é importante notar que o efeito benéfico desse revestimento é temporário, pois facilita principalmente a interação inicial entre as células e o substrato.

A Figura 4 demonstra como a rigidez e a tensão de cisalhamento influenciam a formação de fibras de actina. Sob tensão de cisalhamento, fibras de tensão mais espessas se formaram, sugerindo uma fixação mais forte à superfície. Nas amostras mais moles, havia mais fibras de actina periféricas, que são indicadores de condições fisiológicas. No entanto, em CEs em substratos mais rígidos, a presença de fibras de estresse mais fortes e menos fibras periféricas poderia potencialmente levar à disfunção do CE¹⁷. Esses dados confirmam a eficácia do sistema apresentado na modulação do comportamento da CE.

Figura 1: Visão geral do estudo atual. (A) Síntese de GelMA. A gelatina foi quimicamente modificada em metacrilato de gelatina (GelMA) por meio de uma reação entre gelatina e anidrido metacrílico (MAH) a 55 °C. O produto foi então precipitado em acetona e seco a vácuo. (B) Fabricação de hidrogel. O vidro de cobertura foi preparado anexando espaçadores. Em seguida, o vidro modificado foi anexado ao vidro de cobertura. A lamínula foi colocada no molde, com os espaçadores fornecendo a folga desejada entre o vidro modificado e o fundo do molde. A solução de GelMA contendo iniciadores foi adicionada à abertura entre o vidro modificado e o molde, polimerizando para formar um hidrogel ligado covalentemente ao vidro modificado. (C) Experimento de fluxo. O hidrogel resultante foi usado para semear CEs. Após a formação de uma monocamada, as células foram submetidas a um experimento de fluxo de 6 h a uma tensão de cisalhamento de 12 dina/cm². Esta figura foi criada com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: ¹Espectros de H-NMR para gelatina e pré-polimerização de GelMA. (A) Consulte as caixas tracejadas para ver os picos relevantes. Os picos de metacriloil (ou seja, grupos vinílico e metil) apareceram após a modificação química da gelatina, enquanto o grupo lisina foi usado para quantificar o grau de substituição após a reação química¹⁸. (B) O módulo de Young dos hidrogéis foi medido por um teste de compressão, e 4% (p/v) dos hidrogéis GelMA foram considerados como substratos fisiológicos e 10% (p/v) foram considerados como substrato patológico (n=4, média ± EPM). Este número foi modificado de⁸. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Projeto da câmara de fluxo de placas paralelas e simulação computacional. (A) Três placas separadas foram usadas para reduzir a possibilidade de danificar os hidrogéis durante o carregamento ou descarregamento; Onde a placa inferior fornecia uma superfície de apoio, a superfície intermediária oferecia suporte lateral para os hidrogéis, e a placa superior e a junta formavam a folga para o fluido fluir. (B) A câmara de fluxo passou por simulações computacionais¹¹. Quando a taxa de fluxo é de 215 mL / min, a tensão de cisalhamento ao longo da linha desenhada é de aproximadamente 12 dinas / cm^2, representando a tensão de cisalhamento fisiológica. (C) A influência da lacuna de 0,5 mm está confinada a uma pequena área adjacente à lacuna. A superfície restante do hidrogel sofre tensão de cisalhamento uniforme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A tensão de cisalhamento e o hidrogel rígido aumentam a formação de fibras de tensão. Mais fibras periféricas de actina são formadas em CEs em amostras de 5 kPa sob fluxo. Fibras de tensão mais fortes foram formadas quando as células foram expostas ao estresse de cisalhamento em hidrogéis de 10 kPa, mostrando a eficácia do modelo no comportamento do CE. As setas indicam actina periférica e os asteriscos indicam fibras estressadas. Barra de escala = 10 μm (Azul: DAPI, Vermelho: Fibras de Actina). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O sistema vascular é um ambiente dinâmico onde várias forças influenciam significativamente o comportamento celular. Estudar eventos biológicos em doenças cardiovasculares sem considerar essas forças seria impreciso. Assim, modelos celulares capazes de emular o ambiente mecânico vascular são cruciais. Os pesquisadores já fizeram progressos significativos ao destacar o efeito dessas forças no comportamento celular¹¹. No entanto, para entender o comportamento celular em condições patológicas e fisiológicas no corpo humano, é essencial desenvolver modelos mais precisos que se assemelhem mais ao ambiente do vaso sanguíneo. Portanto, nosso objetivo era desenvolver um sistema que replicasse com mais precisão o ambiente dos vasos sanguíneos, mantendo a facilidade de acesso e facilidade de uso.

O modelo pode aplicar tensão de cisalhamento derivada de fluxo controlado a células humanas em substratos com níveis variados de rigidez, produzindo condições mais próximas das realidades fisiológicas em comparação com os modelos existentes. O GelMA foi sintetizado e utilizado neste modelo para atender aos seguintes critérios: 1) propriedades mecânicas sintonizáveis, 2) comportamento sem inchaço, 3) compatibilidade e adesão celular e 4) capacidade de incorporar células vasculares para modelar os vasos sanguíneos com mais precisão. A ajustabilidade das propriedades mecânicas foi obtida variando a concentração do biopolímero⁸ para mimetizar condições fisiológicas e patológicas. O segundo critério foi o comportamento de não inchaço. É crucial ter um substrato sem inchaço para manter as dimensões consistentes da câmara de fluxo, as condições de fluxo relacionadas e a tensão de cisalhamento nas células. O GelMA com alto grau de metacrilação demonstrou propriedades não inchantes, preservando a forma do hidrogel e a suavidade da superfície ao longo do experimento⁸. É importante ressaltar que a concentração e a rigidez não afetaram o comportamento do inchaço, o que simplificou o modelo, eliminando a necessidade de ajustes separados para cada grupo experimental. O terceiro critério foi a adesão celular, pois a fixação adequada é necessária para evitar o descolamento celular e preservar a integridade da monocamada. O GelMA forneceu adesão celular, reduzindo assim a necessidade de etapas adicionais para conjugar moléculas adesivas celulares ao substrato, o que é essencial para muitos biopolímeros. Além disso, a capacidade do GelMA para encapsulamento celular foi considerada, embora não tenha sido testada diretamente neste estudo. O potencial de encapsulamento celular tem indicações para apoiar a cultura de células 3D e integrar camadas de células, como células musculares lisas vasculares ou pericitos, para aumentar a precisão do modelo¹⁹. Além disso, a síntese de GelMA é econômica e requer equipamento mínimo, tornando-o um excelente candidato como biomaterial para fabricação de substratos 20,21,22.

A câmara de fluxo de placa paralela é comumente usada para aplicar tensão de cisalhamento às células, mas tradicionalmente tem sido usada apenas com lamínulas de vidro ou materiais rígidos. No entanto, tais materiais carecem de relevância fisiológica²³. Em contraste, os dispositivos microfluídicos introduziram mais complexidade geométrica e substratos mais macios, utilizando materiais à base de polímeros. No entanto, esses dispositivos muitas vezes não podem controlar o regime de fluxo com precisão, e suas pequenas dimensões limitam sua capacidade de estudar apenas um pequeno número de células, limitando os resultados experimentais¹¹. O dispositivo proposto combina os benefícios de ambos os sistemas, integrando hidrogéis semeados de monocamada de células endoteliais com uma câmara de fluxo que aplica tensão de cisalhamento controlada com precisão.

O dispositivo demonstrou a capacidade de integrar forças mecânicas derivadas de fluxo e derivadas de sólidos. Quando uma tensão de cisalhamento de 12 dina/cm² foi aplicada por 6 h, observou-se uma formação de fibras de estresse citosólico, contrastando com a predominância de actina periférica no grupo de substrato mais macio. Isso está de acordo com muitos relatórios que mostram menos fibras de tensão formadas quando os CEs são cultivados em superfícies mais macias 24,25,26,27. Por outro lado, o fluxo laminar pode resultar na formação de fibras de tensão proeminentes. Foi demonstrado que a resposta do citoesqueleto às condições de fluxo começa dentro de 1 h após a exposição ao fluxo, mas requer um tempo notavelmente mais longo para completar a reorganização 28,29,30. A rede periférica de actina é essencial para várias funções do CE, incluindo adesão célula-célula e funcionalidade de barreira¹⁷. A regulação positiva dessa rede em um grupo experimental saudável em comparação com o grupo patológico com extensas fibras de estresse aprova a modelagem bem-sucedida do dispositivo de condições saudáveis e doentes.

Uma desvantagem deste dispositivo é o potencial de danos aos hidrogéis, o que pode interromper o fluxo e diminuir a taxa de sucesso dos experimentos. Esse problema surge principalmente de defeitos iniciais nos hidrogéis, que, sob tensão de cisalhamento, podem piorar, levando ao desprendimento da amostra e obstrução parcial do fluxo. Portanto, as etapas de preparação da amostra, incluindo polimerização, equilíbrio e corte, devem ser conduzidas com cuidado para evitar danos adicionais às amostras. Outro desafio neste sistema é alcançar e manter a integridade da monocamada. Embora o revestimento dos hidrogéis com gelatina possa melhorar a fixação celular inicial, nosso trabalho anterior mostrou que esse revestimento não afeta a proliferação celular⁸. Portanto, para aumentar a formação de monocamadas, especialmente considerando que a proliferação celular é mais lenta em hidrogéis mais macios³¹, aumentar a densidade de semeadura é benéfico. Além disso, as células podem se desprender devido à tensão de cisalhamento induzida pelo fluxo de fluido. Portanto, é crucial aumentar gradualmente a taxa de fluxo, permitindo que as células tenham tempo suficiente para se adaptar às novas condições ambientais.

Em conclusão, o dispositivo representa um avanço significativo na simulação do ambiente vascular com mais precisão devido à sua capacidade de simular simultaneamente forças mecânicas derivadas de fluidos e sólidos. Ele oferece uma plataforma abrangente para estudar o comportamento da CE sob várias condições fisiológicas e patológicas. Essa versatilidade o torna uma ferramenta valiosa para avançar nossa compreensão da biologia vascular e da progressão da doença. Este modelo pode contribuir para uma variedade de estudos de pesquisa, incluindo mecanobiologia, aterosclerose, desenvolvimento de metástases de câncer, engenharia de tecidos vasculares e angiogênese e administração e triagem de medicamentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(trimetoxissilil)metacrilato de propil, tetrametiletilenodiamina (TEMED)	Invitrogen	15524-010	Fabricação de hidrogel
3-(trimetoxissilil)metacrilato de propila	Salinização	de vidro 440159	Sigma-Aldrich
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) - contendo mídia de montagem Vector	Laboratories	H-1200	Immunostaining
Acetona	Thermo Fisher Scientifics	A18-4	GelMA Synthesis
Alexa Fluor 555 Faloidina	Tecnologia de Sinalização Celular	8953S	Persulfato de
Amônio Imunocolorido (APS)	Bio-Rad	1610700	Fabricação de Hidrogel
Folha de Acrílico Fundido Transparente Resistente a Arranhões e UV (45/64'')	McMaster-CARR	8560K165	Fabricação de Câmara de
Fluxo Microscópio Confocal	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 800	Imunocoloração
Seringas Rígidas Covidien Monoject 60 mL sem Agulhas	Fisher	22-031-375	Kit de crescimento EC Flow Experiment
	Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC)	PCS-100-041	Etanol de Cultura
Células 200 Prova	Decon Labs	2701	Gelatina de Salinização
de Vidro Tipo A (300 bloom) de pele suína	Sigma-Aldrich	G1890	GelMA Síntese
Ácido Acético Glacial	Thermo Fisher Scientifics	9526-33	Salinização de Vidro
Silicone de Alta Pureza e Alta Temperatura Folha de borracha	McMaster-Carr	87315K74	Fabricação de câmara de fluxo
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)	Coleção de cultura de tipo americano (ATCC)	PSC-100-010 Parafusos de	cultura celular
M3x30mm Parafuso de cabeça redonda de soquete hexagonal 304 Parafusos de fixação de aço inoxidável 20pcs	Uxcell	B07Q5RM2TP	Fabricação de
câmara de fluxoDrive Digital Masterflex L/S com Easy-Load® 3 Cabeça de bomba para tubulação de precisão; 115/230 VAC	VWR	#MFLX77921-65	Experiência de Fluxo
Tubulação de Bomba de Precisão Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft	VWR	#MFLX96419-25	Flow Experiment
Anidrido metacrílico (MAH)	Sigma-Aldrich	276685	GelMA Síntese
Paraformaldeído	Thermo Fisher Scientifics	043368.9M	Cultura de células
Salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	14080-055
Bicarbonato de sódio	Fisher Chemical	S233-3	GelMA Síntese
Carbonato de sódio	Fisher Chemical	S263-500	GelMA Synthesis
			educacional do SOLIDWORKS
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023	SolidWorks	N/A	Flow Chamber Design
Vascular Basal Medium	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-030	Cell Culture