É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Modelo in vitro integrando rigidez e fluxo do substrato para estudar as respostas das células endoteliais

1.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/67081

⸱

19 de julho de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Chemical Engineering Department, Northeastern University, 2Bioengineering Department, Northeastern University, 3Laboratoire de BioMécanique et BioIngénierie (BMBI), UMR CNRS, Sorbonne Universités, Université de Technologie of Compiègne (UTC), 4Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 5Neuroscience Department, Albert Einstein College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Sintetizamos e caracterizamos um substrato ajustável à base de gelatina para cultura de células endoteliais vasculares (CEs) sob condições relevantes de fluxo vascular. Esta superfície biomimética replica condições fisiológicas e patológicas, permitindo o estudo de forças mecânicas no comportamento da CE e avançando nossa compreensão da saúde vascular e dos mecanismos de doença.

Resumo

Apresentamos um modelo in vitro inovador com o objetivo de investigar os efeitos combinados da rigidez tecidual e do estresse de cisalhamento na função das células endoteliais (CE), que são cruciais para a compreensão da saúde vascular e o aparecimento de doenças como a aterosclerose. Tradicionalmente, os estudos têm explorado os impactos da tensão de cisalhamento e da rigidez do substrato nos CEs, de forma independente. No entanto, este sistema integrado combina esses fatores para fornecer uma simulação mais precisa do ambiente mecânico da vasculatura. O objetivo é examinar a mecanotransdução de EC em vários níveis de rigidez tecidual e condições de fluxo usando ECs humanos. Detalhamos o protocolo para sintetizar hidrogéis de metacrilato de gelatina (GelMA) com rigidez ajustável e semeá-los com CEs para obter confluência. Além disso, descrevemos o projeto e a montagem de uma câmara de fluxo econômica, complementada por simulações computacionais de dinâmica de fluidos, para gerar condições fisiológicas de fluxo caracterizadas por fluxo laminar e níveis apropriados de tensão de cisalhamento. O protocolo também incorpora marcação de fluorescência para microscopia confocal, permitindo a avaliação das respostas do EC às condições de complacência do tecido e fluxo. Ao submeter CEs cultivados a múltiplos estímulos mecânicos integrados, este modelo permite investigações abrangentes sobre como fatores como hipertensão e envelhecimento podem afetar a função da CE e as doenças vasculares mediadas pela CE. Os insights obtidos com essas investigações serão fundamentais para elucidar os mecanismos subjacentes às doenças vasculares e desenvolver estratégias de tratamento eficazes.

Introdução

O endotélio, que reveste a superfície interna dos vasos sanguíneos, desempenha um papel fundamental na manutenção da saúde vascular. As células endoteliais (CEs) são fundamentais para regular várias funções cardiovasculares, incluindo controle do tônus dos vasos, permeabilidade seletiva, hemostasia e mecanotransdução 1,2. A pesquisa ligou firmemente a disfunção da CE a um papel primário no desenvolvimento da aterosclerose. Notavelmente, os CEs encontram diversas forças mecânicas nas interfaces onde interagem com o fluxo sanguíneo e os tecidos dos vasos subjacentes 3,4. Vários estudos associaram a disfunção da CE a alterações anormais em fatores mecânicos dentro do ambiente vascular, como a tensão de cisalhamento do fluido do fluxo sanguíneo e a rigidez do tecido 5,6,7.

No entanto, pesquisas anteriores receberam atenção limitada na compreensão dos efeitos combinados da rigidez do tecido e da tensão de cisalhamento na função do CE. Para aumentar a capacidade de traduzir os resultados da pesquisa em tratamentos eficazes para aterosclerose e outras doenças cardiovasculares, é essencial melhorar os modelos celulares usados no campo. Um progresso significativo foi feito na humanização de modelos celulares, empregando CEs humanos e submetendo-os a tensões de cisalhamento ou substratos com níveis de rigidez variados 8,9,10. No entanto, a adoção e o refinamento de modelos celulares que integram ambientes de fluxo dinâmico com substratos EC que possuem propriedades de rigidez ajustáveis progrediram lentamente. O desafio está na criação de substratos de EC sem inchamento para evitar alterações nos parâmetros de fluxo dentro do canal de fluxo, ao mesmo tempo em que facilita o cultivo de monocamadas de EC intactas e bem aderidas. Um modelo in vitro capaz de superar esses obstáculos poderia facilitar investigações mais eficazes sobre como a hipertensão, o envelhecimento e as condições de fluxo influenciam de forma colaborativa a mecanotransdução da CE, a saúde vascular e, em última análise, o desenvolvimento da aterosclerose. Vários métodos foram desenvolvidos para aplicar tensão de cisalhamento nas células enquanto controla a rigidez do substrato, incluindo placas rotativas e dispositivos microfluídicos. No método da placa rotativa, as células são colocadas entre duas placas e a tensão de cisalhamento é aplicada através do movimento rotacional das placas. Este método é menos complicado e fornece um modelo rápido; no entanto, sofre de variação espacial da tensão de cisalhamento, com tensão de cisalhamento zero no centro e tensão de cisalhamento máxima na periferia11.

Por outro lado, os dispositivos microfluídicos representam a nova geração de ferramentas com a capacidade de controlar a rigidez do substrato e as condições de fluxo. Esses sistemas são adequados para imitar microvasculaturas sob condições de fluxo laminar. No entanto, o estudo da aterosclerose com esses dispositivos é impraticável, pois a aterosclerose ocorre em grandes vasos com fluxo perturbado11. Este artigo tem como objetivo contribuir para o domínio crítico de pesquisa dos estudos de EC, apresentando um sistema econômico capaz de examinar os efeitos de níveis variáveis de rigidez em substratos de EC sob diferentes condições de fluxo. O sistema integra substratos com diferentes rigidezes para emular vasos sanguíneos patológicos e fisiológicos. Este protocolo descreve o método para a criação de hidrogéis à base de gelatina sem níveis de inchaço e rigidez de 5 kPa e 10 kPa, representando rigidez fisiológica e patológica, respectivamente. Além disso, é detalhada a construção de uma câmara de fluxo de placas paralelas capaz de integrar esses substratos. A fluidodinâmica computacional (CFD) foi empregada para avaliar a tensão de cisalhamento e as condições de escoamento. A preparação de hidrogéis para cultura de CE e a execução de um experimento de fluxo de 6 h são descritas, seguidas de uma discussão sobre a imunomarcação pós-experimento.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Síntese de GelMA

  1. Preparar uma solução 0,2 M de carbonato de sódio anidro e uma solução 0,2 M de bicarbonato de sódio.
  2. Misture 46 mL de solução de bicarbonato de sódio com 15 mL de solução de carbonato de sódio e adicione 139 mL de água deionizada (DI). Ajuste o pH para 9,5 usando NaOH 0,1 M e HCl, se necessário.
  3. Adicione 10 g de gelatina tipo A, 300 bloom de pele suína, a 100 mL de tampão carbonato-bicarbonato a uma concentração de 10% p/v.
  4. Dissolver a gelatina em banho-maria a 55 °C, agitando a solução a 700 rpm com um agitador magnético. Depois de totalmente dissolvido, ajuste o pH da solução de gelatina para 9,5 usando NaOH 0,1 M.
  5. Para iniciar a metacrilação, adicione 938 μL de anidrido metacrílico (MAH) gota a gota à solução. Melhore a distribuição inicial de MAH na solução de gelatina injetando-a em vários locais, incluindo diferentes profundidades e distâncias radiais do centro.
  6. Enrole o recipiente de reação em papel alumínio para evitar a exposição à luz. Manter a temperatura a 55 °C e agitar a solução a 500 rpm durante 1 h para completar a reacção (Figura 1A)12.
    NOTA: A reação pára em um pH abaixo de 7,4.
  7. Prepare um copo de 2 L contendo 1,8 L de acetona e um copo de 0,6 L contendo 0,3 L de acetona.
  8. Adicionar a solução de GelMA resultante gota a gota ao copo de 2 L, agitando a 200 RPM para induzir a precipitação13. Para maximizar a coleta do produto precipitado, coloque uma haste ou espátula de aço inoxidável como local de nucleação para facilitar a transferência.
  9. Transfira o produto do copo maior para o menor e deixe-o descansar por 10 minutos antes de prosseguir para a etapa de secagem. O GelMA precipitado deve aparecer como fibras brancas.
  10. Recolha o produto em papel absorvente, seque-o em forno a vácuo à temperatura ambiente (RT) e guarde-o a -20 °C até nova utilização.
    NOTA: Detalhes adicionais sobre a caracterização química do produto por ressonância magnética nuclear de prótons (RMN de 1H) podem ser encontrados em um trabalho publicado anteriormente8.

2. Salinização do vidro

NOTA: A fixação de hidrogéis em lâminas de vidro fornece uma superfície plana e uniforme, facilitando o manuseio e garantindo estabilidade sob tensão de cisalhamento derivada do fluxo. A funcionalização do vidro com metacrilato de 3-(trimetoxissilil)propila é necessária para melhorar as propriedades da superfície e permitir a fixação covalente de hidrogéis durante o processo de polimerização.

  1. Corte com precisão lâminas de microscópio simples (1 mm de espessura) em pedaços semelhantes às dimensões finais do hidrogel usando um cortador de vidro. Lave as lâminas cortadas com sabão para remover contaminantes e detritos da superfície que possam obstruir o tratamento da superfície do vidro.
    NOTA: Se necessário, sonicar as lâminas de vidro durante 5 min em etanol e depois secar ao ar.
  2. Preparar uma solução a 0,5% de metacrilato de 3-(trimetoxissilil)propilo em etanol absoluto. Prepare uma solução de ácido acético glacial a 10% em água DI. Misture as soluções para obter uma concentração final de ácido acético glacial a 3%.
    NOTA: A solução de ácido acético glacial pode ser preparada em grandes quantidades e armazenada.
  3. Organize as lâminas de vidro em um recipiente de vidro para garantir que as superfícies de vidro não fiquem obstruídas. Despeje a solução resultante sobre as lâminas de vidro e mantenha-as por aproximadamente 5 min em um balancim a 80 rpm para que a reação seja concluída. Certifique-se de que ambos os lados das lâminas de vidro sejam modificados removendo quaisquer bolhas de ar presas.
  4. Após a reacção estar completa, aspirar a solução e lavar as lâminas de vidro com etanol 2x. Seque as lâminas ao ar livre e guarde-as no escuro em RT.
    NOTA: As lâminas de vidro mantêm sua modificação por 1 mês nessas condições.

3. Preparação de hidrogel

  1. Fabrique hidrogéis usando um método de polimerização de radicais livres induzido por redox.
    1. Monte moldes de politetrafluoretileno (PTFE) de duas peças com profundidade adequada e janelas de abertura de 10 mm2 para moldar o substrato final. Responsável por um encolhimento de 25% na altura do hidrogel após a polimerização durante o processo de design. Certifique-se de que os moldes estejam planos e bem presos nas placas inferior e superior para evitar vazamentos.
      NOTA: As dimensões do molde projetadas são intencionalmente 10% maiores do que o tamanho pretendido do hidrogel. Este design serve a vários propósitos: evita danos nas laterais após a separação do molde, aumenta a uniformidade da superfície do hidrogel empurrando impurezas ou bolhas para os lados e compensa o encolhimento previsto de 25% após o equilíbrio devido ao efeito de sinérese, onde hidrogéis altamente reticulados repelem a água após o equilíbrio, causando encolhimento. A quantidade de encolhimento é especificada no protocolo8.
    2. Para garantir que os hidrogéis tenham uma superfície uniforme e altura constante, suspenda as lâminas de vidro modificadas da placa superior do molde, permitindo uma abertura estreita para injetar a solução de polímero. Use uma lamínula para suspender as lâminas de vidro modificadas (Figura 1B).
    3. Para criar o vidro de cobertura, corte o vidro microscópico liso 20% maior que o molde. Prenda dois espaçadores nos lados mais curtos. Calcule a espessura do espaçador da seguinte forma:
      Espessura do espaçador = 1,33 x espessura final do gel + 1 (espessura do vidro modificado) - profundidade do molde
    4. Aplique uma fina camada de graxa de vedação compatível com células nos lados mais longos da lamínula, na mesma face onde os espaçadores estão fixados.
    5. Prenda a lâmina de vidro modificada à lamínula entre os dois espaçadores.
    6. Coloque a lamínula no molde de forma que os espaçadores fiquem no molde e o vidro modificado se estenda para dentro do molde. Essa configuração fornece uma folga de 1,33 da altura final do hidrogel entre o vidro modificado e o fundo do molde.
    7. Dissolva o GelMA em água DI a 4% e 10% p / v para hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa, respectivamente, e coloque-o em banho-maria a 45 ° C.
      NOTA: O GelMA é um polímero termossensível e manter a temperatura da solução a 45 °C evita a solidificação antes da polimerização e reduz a viscosidade da solução, o que é crucial para a fabricação de hidrogéis planos.
    8. Adicione TEMED (24 mM para hidrogel de 5 kPA, 6,25 mM para hidrogel de 10 kPa) à solução de polímero e misture bem.
      NOTA: O TEMED sozinho não inicia a polimerização, portanto, certifique-se de que moldes, pipetas e soluções sejam preparados antes de prosseguir.
    9. Adicione APS (24 mM para hidrogel de 5 kPA, 24,5 mM para hidrogel de 10 kPa) à solução de GelMA e misture bem.
      NOTA: A adição de APS inicia a polimerização e os hidrogéis podem se formar rapidamente, exigindo ação imediata para evitar hidrogéis defeituosos. Mais detalhes sobre as medidas de rigidez podem ser encontrados em um trabalho publicado anteriormente8.
    10. Pipetar cuidadosamente a solução resultante para a abertura entre a lâmina de vidro suspensa e o molde à RT e deixá-la reticular. A força capilar impulsiona a solução de polímero para o molde. Evite adicionar bolhas aos géis e pare de pipetar quando uma pequena quantidade de solução permanecer na ponta da pipeta.
      NOTA: Durante a polimerização, os grupos metacrilato de GelMA reagem com resíduos de metacrilato nas lâminas de vidro modificadas, resultando na ligação química do hidrogel ao vidro.
    11. Após 15 minutos, a reação está completa. Separe o substrato do molde usando um objeto pontiagudo, como uma agulha, e deslize o substrato para longe da lamínula para separá-lo.
    12. Transferir os hidrogéis para 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) numa placa de Petri de 100 mm selada com película plástica e equilibrar a 37 °C para remover os reagentes e subprodutos restantes.
    13. Como o hidrogel é ligeiramente maior do que as dimensões finais, apare o excesso de gel nas laterais para corresponder às dimensões necessárias para a janela da câmara de fluxo.
    14. Use a câmara de fluxo para verificar as dimensões do hidrogel. Certifique-se de que o hidrogel se encaixe corretamente na câmara de fluxo, sem lacunas entre o hidrogel e o molde ou quaisquer defeitos que possam afetar os padrões de fluxo. Se houver irregularidades de forma que possam afetar o padrão de fluxo na câmara de fluxo, levando a um comportamento celular adverso, guarde o hidrogel para condições estáticas.
    15. Transfira quatro hidrogéis para uma placa de Petri contendo 1x PBS para esterilização.
  2. Esterilize o hidrogel conforme descrito abaixo usando etanol a 70%.
    1. Prepare soluções alcoólicas a 25%, 50% e 70% para desidratação gradual do hidrogel.
      NOTA: Se a desidratação gradual não for realizada, os hidrogéis mais rígidos podem encolher e quebrar, enquanto rugas podem se formar na superfície dos hidrogéis mais macios.
    2. Aspire a solução 1x PBS da placa de Petri contendo hidrogéis. Adicione solução de etanol a 25% a cada placa de Petri para submergir os hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa por 15 min.
    3. Aspire a solução de álcool a 25%. Adicione a solução de álcool a 50% a cada placa de Petri para submergir os hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa por 15 min.
    4. Aspire a solução de álcool a 50%. Adicione solução de álcool a 70% a cada placa de Petri, submergindo os hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa por 5 min. Coloque a placa de Petri em uma coqueteleira a 100 rpm.
    5. Deixe os hidrogéis de 5 kPa submersos por 40 min e os hidrogéis de 10 kPa por 20 min.
      NOTA: Observou-se que os hidrogéis de 5 kPa são mais propensos à contaminação em comparação com os hidrogéis de 10 kPa.
    6. Transfira as amostras para uma placa de 6 poços em um gabinete de biossegurança e lave os hidrogéis 2x-3x usando PBS estéril.

4. Hidrogéis de revestimento

  1. Prepare uma solução de gelatina de 60 μg / mL dissolvendo 3 mg de gelatina em 50 mL de PBS estéril (1x com magnésio e sal de cálcio). Aquecer a solução em banho-maria a 37 °C durante 30 min ou até que toda a gelatina esteja totalmente dissolvida.
  2. Filtrar estéril a solução de revestimento utilizando um filtro de seringa de 0,2 μm. Aspire a solução 1x PBS de cada placa de poço e adicione solução de gelatina a cada poço, garantindo a cobertura completa de cada hidrogel. Para minimizar o risco de contaminação, adicione 40 unidades/mL de penicilina e 10 μg/mL de estreptomicina à solução de revestimento.
  3. Incubar cada placa de poço em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 45 min. Lave os hidrogéis com 1x solução PBS.
  4. Aspirar PBS e adicionar meios de cultura celular.
  5. Por no máximo dois dias, manter os hidrogéis em meios de cultura de células e incubá-los em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5% até a semeadura celular.
    NOTA: Apesar das excelentes propriedades de fixação celular da fibronectina, existe uma preocupação com seu uso devido aos CEs depositarem fibronectina endógena em condições ateroscleróticas, o que pode levar a uma resposta pró-inflamatória. Para evitar respostas celulares quimicamente estimuladas, evitamos o uso de fibronectina. Além disso, Orr et al. demonstraram que o revestimento de fibronectina, em comparação com o revestimento de colágeno I, regulava positivamente os genes aterogênicos. Especificamente, eles observaram níveis aumentados de expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), molécula de adesão de células vasculares 1 (VCAM-1) e fator nuclear-κB (NF-κB)14.

5. Semeando células nos substratos

  1. Preparar a suspensão celular seguindo os protocolos de descolamento disponíveis e contar as células com hemocitômetro8.
  2. Aspire completamente o meio dos hidrogéis. Adicione 50.000 células/cm2 a cada amostra. Adicione um volume adequado de suspensão celular a cada amostra para evitar o transbordamento celular.
    NOTA: Substratos mais rígidos são mais hidrofóbicos; portanto, minimize o tempo entre as etapas para melhorar a molhabilidade e a dispersão da suspensão celular na superfície do substrato.
  3. Incubar hidrogéis semeados por células em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5% por 2 h. Adicione meios de cultura de células às amostras assim que as células estiverem ligadas aos géis.

6. Fabricação da câmara de fluxo

NOTA: A abordagem para projetar a câmara de fluxo é econômica e requer experiência mínima para fabricação e utilização.

  1. Use poli (metacrilato de metila) para fabricação de câmaras para avaliar visualmente a qualidade do fluxo, a integridade do hidrogel sob tensão de cisalhamento e possíveis estudos de biomarcadores em tempo real durante experimentos de fluxo. O projeto da câmara foi criado usando software de design auxiliado por computador (CAD). A câmara de fluxo foi registrada para patente e detalhes sobre este dispositivo não podem ser divulgados no presente protocolo.
  2. Avaliação computacional das condições de escoamento na câmara de escoamento
    1. Monte os componentes individuais da câmara de fluxo projetada (. SLDPRT) para criar a configuração final da câmara.
    2. Desenhe uma linha ao longo da linha central do fluxo tangencial à superfície do hidrogel para analisar a tensão de cisalhamento. Feche as aberturas de entrada e saída para definir um volume de controle fechado.
    3. Abra o Flow Simulation na guia Add-Ins no software CAD. Na guia Simulação de fluxo, abra o recurso Assistente para inserir as propriedades. Especifique o sistema de unidades e ajuste a pressão e as unidades de tensão para dyne/cm2.
    4. Verifique o fluxo de fluido e a gravidade nas características físicas. Defina a gravidade para -9,8 no componente Z; Os componentes X e Y devem ser zero.
    5. Escolha Interno para o tipo de análise em Tratamento de geometria. Selecione Água como o fluido padrão.
      NOTA: Suponha que o meio se comporte como água.
    6. Escolha Laminar e Turbulento para o tipo de fluxo. Defina a parede como uma parede adiabática e insira a rugosidade da superfície em Condição da parede.
    7. Defina a temperatura para 37.5 °C (310.65 K) nas condições iniciais. Definir o domínio computacional em projetos de Simulação de Escoamento, garantindo que ele cubra todo o volume de controle.
    8. Selecione todas as paredes que fazem interface com o fluido para definir o subdomínio do fluido. Em Condição de limite, designe a superfície interna da tampa de entrada como Fluxo de volume de entrada e especifique a taxa de fluxo (Q) e o fluxo uniforme. Em seguida, atribua a superfície interna da vedação da tampa de saída como pressão estática.
    9. Determine o tamanho da malha global com base nos recursos computacionais disponíveis. Clique em Executar para iniciar a simulação.
    10. Após a conclusão, revise os resultados desejados, incluindo gráficos de tensão de cisalhamento e simulações de fluxo.
    11. Repita as etapas 6.2.8 a 6.2.10 com várias taxas de fluxo para calcular a tensão de cisalhamento aplicada em taxas diferentes. Use a análise de regressão para estabelecer a relação taxa de fluxo-tensão de cisalhamento.
    12. Avalie a tolerância do sistema a variações nas dimensões do hidrogel para aumentar o realismo da simulação.

7. Execute o fluxo laminar uniforme

  1. Após a cultura das células nos hidrogéis de 5 kPa e 10 kPa, assegurar a confluência da monocamada celular numa incubadora de CO2 a 37 °C e 5%. Uma monocamada de células em cada hidrogel deve ser alcançada.
  2. Esterilize os componentes autoclaváveis do sistema de câmara de fluxo de placa paralela (parafusos de aço inoxidável, espátula, pinça, junta e reservatório de mídia) com um ciclo de autoclave por gravidade de 30 minutos. Esterilize outras peças (componentes de acrílico e reservatório/dampers) com exposição à luz UV.
  3. Monte o dispositivo da câmara de fluxo em um gabinete de biossegurança. Proteja as amostras de hidrogel no dispositivo, garantindo uniformidade. Use um enchimento de tamanho igual aos hidrogéis se um número insuficiente de amostras estiver disponível para o fluxo.
  4. Umedeça previamente a superfície interna da câmara e as superfícies de hidrogel para minimizar a formação de bolhas e evitar o ressecamento das células durante a montagem.
  5. Adicione mídia suficiente ao reservatório de entrada, permitindo que 20% a 30% da mídia flua para o reservatório de saída após a montagem. Sele o reservatório de entrada hermeticamente usando um damper/selador.
    NOTA: O acúmulo de pressão no reservatório de entrada impulsiona o fluxo e qualquer vazamento de ar altera as taxas de fluxo. Verifique se há defeitos no selante se formarem bolhas na tubulação externa.
  6. Defina a saída damper para pressão atmosférica para estabelecer a diferença de pressão. Coloque o dispositivo e os reservatórios em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 . Conecte a tubulação do dispositivo a uma bomba peristáltica colocada fora da incubadora (Figura 1C).
  7. Ligue a bomba para começar a aplicar 3,6 dinas/cm2. Aumente gradualmente a taxa de fluxo em incrementos de 2 mL / min (por exemplo, atinja 85 mL / min de 65 mL / min após 10 min) até aplicar aproximadamente 8 dinas / cm2.
  8. Aumente ainda mais a taxa de fluxo em incrementos de 2,5 mL / min até atingir 12 dinas / cm2 de tensão de cisalhamento.
    NOTA: Dê tempo para que as células se adaptem à condição dinâmica, pois aumentos rápidos da taxa de fluxo podem separar as células e danificar a monocamada.
  9. Após 6 h, pare o fluxo, remova o dispositivo da incubadora e desmonte a câmara de fluxo. Posteriormente, transfira amostras de hidrogel para uma placa de seis poços.
  10. Lave as amostras com PBS gelado e fixe as células para imunocoloração ou lise-as para isolamento de proteínas.

8. Configuração de imunocoloração para microscopia confocal com alta ampliação

NOTA: Para aumentar a eficiência do estudo, foi desenvolvido um método para imunomarcação de pequenas porções de hidrogéis, permitindo o exame de múltiplos alvos biológicos em uma única amostra.

  1. Prepare punções de biópsia ou ferramentas de corte preferidas com diâmetros de 3 ou 4 mm.
  2. Use uma caixa de ponteira de pipeta como câmara de coloração. Umidifique a câmara para controlar a evaporação da solução de coloração durante a incubação prolongada, colocando uma toalha de papel úmida no fundo da caixa da ponteira da pipeta.
  3. Reduza o consumo de anticorpos criando pequenos conjuntos de soluções para amostras individuais. Cubra o rack da caixa de pontas com filme transparente, pressionando suavemente o filme contra os orifícios do rack com a ponta do dedo para fazer covinhas. Preencha as covinhas com 70 μL de PBS.
  4. Transfira um hidrogel individual para uma placa de Petri vazia e corte-o usando um punção de biópsia ou ferramenta de corte preferida. Use um microscópio para cortar uma área de amostra representativa. Corte um cilindro de gel cheio para evitar problemas de microscopia confocal.
  5. Coloque as amostras de hidrogel cortadas nas covinhas criadas na etapa 8.3. Realize a coloração seguindo o protocolo padrão15. Após a lavagem final da coloração, obtenha uma folha de borracha de silicone que corresponda à espessura do hidrogel.
    NOTA: De preferência, use uma folha com um lado adesivo para melhorar a vedação. Neste estudo, as fibras de actina foram coradas usando um anticorpo secundário fluorescente conjugado à faloidina em uma diluição de 1:20.
  6. Corte a folha de borracha em quadrados de 15 mm x 15 mm. Faça um furo de 6 mm usando um punção de biópsia ou ferramenta de corte preferida.
  7. Crie um recipiente de amostra anexando a borracha a uma lamínula de microscopia (nº 1.5). Adicione 10 μL de mídia de montagem úmida às covinhas enquanto a amostra ainda está presente e incube-a no escuro por 10-15 min.
    NOTA: Para este estudo, o meio de montagem continha 0,9 μg/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para encurtar o protocolo de coloração.
  8. Retirar a amostra da câmara de coloração e colocá-la no recipiente criado no passo 8.7. Aplique 1-2 μL de mídia de montagem em cima da amostra.
    NOTA: A quantidade de mídia de montagem afeta a qualidade da imagem em grandes ampliações. Mídia de montagem excessiva ou insuficiente pode comprometer a clareza da imagem.
  9. Posicione outra lamínula na parte superior e pressione suavemente para garantir que a amostra entre em contato com o vidro. Armazenar as amostras a 4 °C no escuro até à obtenção de imagens microscópicas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A Figura 1 mostra a configuração experimental, descrevendo o processo de síntese de GelMA por meio de uma reação de metacrilação. O produto resultante foi então usado para fabricar o substrato de hidrogel, no qual os CEs foram semeados. Posteriormente, as células foram introduzidas na câmara de fluxo para um experimento de fluxo de 6 h a 12 dinas/cm2.

1A espectroscopia de RMN H foi usada para avaliar o sucesso da reação de metacrilação

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O sistema vascular é um ambiente dinâmico onde várias forças influenciam significativamente o comportamento celular. Estudar eventos biológicos em doenças cardiovasculares sem considerar essas forças seria impreciso. Assim, modelos celulares capazes de emular o ambiente mecânico vascular são cruciais. Os pesquisadores já fizeram progressos significativos ao destacar o efeito dessas forças no comportamento celular11. No entanto, para entender o comportamento celular em condições patológicas e fisio...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram que um pedido provisório de patente (nº 63/634.853) foi depositado com o título Câmara de Fluxo com Substrato Mecanicamente Sintonizável, e que não existem outros interesses conflitantes.

Agradecimentos

Os autores estendem sua gratidão a Robert Egan por sua ajuda na fabricação da câmara de fluxo. Os autores agradecem a Lucas McCauley por sua ajuda durante os experimentos. Além disso, eles gostariam de agradecer às instalações centrais do Instituto de Imagens Químicas de Sistemas Vivos (CILS) da Northeastern University por conceder acesso a microscópios confocais. Os autores reconhecem o apoio financeiro fornecido pelo National Institutes of Health (NIH 1R01EB027705 concedido ao SB) e pela National Science Foundation (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 ao SB e CMMI 1846962 ao EE).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(trimetoxissilil)metacrilato de propil, tetrametiletilenodiamina (TEMED)Invitrogen15524-010Fabricação de hidrogel
3-(trimetoxissilil)metacrilato de propilaSalinizaçãode vidro 440159Sigma-Aldrich
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) - contendo mídia de montagem VectorLaboratoriesH-1200Immunostaining
AcetonaThermo Fisher ScientificsA18-4GelMA Synthesis
Alexa Fluor 555 Faloidina Tecnologia de Sinalização Celular8953SPersulfato de
Amônio Imunocolorido (APS)Bio-Rad1610700Fabricação de Hidrogel
Folha de Acrílico Fundido Transparente Resistente a Arranhões e UV (45/64'')McMaster-CARR8560K165Fabricação de Câmara de
Fluxo Microscópio ConfocalCarl Zeiss Meditex AGZeiss LSM 800Imunocoloração
Seringas Rígidas Covidien Monoject 60 mL sem AgulhasFisher   22-031-375Kit de crescimento EC Flow Experiment
Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC)PCS-100-041Etanol de Cultura
Células 200 ProvaDecon Labs2701Gelatina de Salinização
de Vidro Tipo A (300 bloom) de pele suínaSigma-AldrichG1890GelMA Síntese
Ácido Acético GlacialThermo Fisher Scientifics9526-33Salinização de Vidro
Silicone de Alta Pureza e Alta Temperatura Folha de borrachaMcMaster-Carr87315K74Fabricação de câmara de fluxo
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)Coleção de cultura de tipo americano (ATCC)PSC-100-010 Parafusos decultura celular
M3x30mm Parafuso de cabeça redonda de soquete hexagonal 304 Parafusos de fixação de aço inoxidável 20pcsUxcellB07Q5RM2TPFabricação de
câmara de fluxoDrive Digital Masterflex L/S com Easy-Load® 3 Cabeça de bomba para tubulação de precisão; 115/230 VACVWR#MFLX77921-65Experiência de Fluxo 
Tubulação de Bomba de Precisão Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25; 25 ftVWR#MFLX96419-25Flow Experiment 
Anidrido metacrílico (MAH)Sigma-Aldrich276685GelMA Síntese
ParaformaldeídoThermo Fisher Scientifics043368.9MCultura de células
Salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco14080-055
Bicarbonato de sódioFisher ChemicalS233-3GelMA Síntese
Carbonato de sódioFisher ChemicalS263-500GelMA Synthesis
educacional do SOLIDWORKS
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023SolidWorksN/AFlow Chamber Design
Vascular Basal MediumAmerican Type Culture Collection (ATCC)PCS-100-030Cell Culture
de máquina de geral Versão

Referências

  1. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  2. Suowen, X., et al. Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies. Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).
  3. Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. Mechanotransduction at the cell-matrix interface. Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).
  4. Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. Mechanotransduction and the glycocalyx. J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).
  5. Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress. Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).
  6. Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events. Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).
  7. Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. Endothelial dysfunction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).
  8. Hamrangsekachaee, M., et al. Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).
  9. Mensah, S. A., et al. Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity. FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).
  10. Russell-Puleri, S., et al. Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38. Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).
  11. Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research. Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).
  12. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).
  13. Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system. Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).
  14. Orr, A. W., et al. The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis. J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).
  15. Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels. ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).
  16. Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications. Materials. 11 (8), 1374(2018).
  17. Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. Cortical actin dynamics in endothelial permeability. Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).
  18. Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels. Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).
  19. Jin, Q., et al. Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process. Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).
  20. Villard, P., et al. Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications. Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).
  21. Bencherif, S. A., et al. Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels. J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).
  22. Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives. Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).
  23. James, B. D., Allen, J. B. Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments. ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).
  24. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), e4688(2012).
  25. Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate. J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).
  26. Geemen, D. v, et al. F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).
  27. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Comm Biol. 4 (1), 764(2021).
  28. Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions. Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).
  29. Inglebert, M., et al. The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton. Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).
  30. Noria, S., et al. Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress. Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).
  31. Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing. Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Células EndoteliaisTensão de CisalhamentoHidrogéis de GelMACâmara de FluxoFluxo LaminarMicroscopia ConfocalMecanotransduçãoDoenças Vasculares
Modelo in vitro integrando rigidez e fluxo do substrato para estudar as respostas das células endoteliais
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.