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Artigo de método

Modelagem da hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade em ratos

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DOI:

10.3791/67082

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28 de março de 2025

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1Division of Pediatric Neurosurgery, Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Neurosciences Intensive Care Nursery, Johns Hopkins Children's Center, 5Kennedy Krieger Institute

Neste artigo

Resumo

A hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade (PHHP) pode ser modelada em ratos neonatais combinando corioamnionite e hemorragia intraventricular. A combinação desses eventos pré-natais e pós-natais recapitula com precisão as características clínicas da PHHP, incluindo macrocefalia, ventriculomegalia e pressão intracraniana elevada, ao longo da vida.

Resumo

A hidrocefalia da prematuridade pós-hemorrágica (PHHP) é uma sequela grave de hemorragia intraventricular grave (HIV) em recém-nascidos muito prematuros com menos de 32 semanas de idade gestacional (IG). A PHHP é definida pelo acúmulo de líquido cefalorraquidiano (LCR) associado a sintomas clínicos de pressão intracraniana (PIC) elevada. Bebês com PHHP sofrem dependência de shunt ao longo da vida, com metade exigindo cirurgia repetida no primeiro ano de vida e muitos exigindo várias cirurgias adicionais ao longo da vida. A corioamnionite pré-natal predispõe os prematuros à HIV grave e a necessidade de tratamento cirúrgico do PHHP tende à sepse neonatal. Essas características clínicas sugerem que a inflamação sistêmica é um componente integral da fisiopatologia do PHHP.

Aqui, definimos um modelo animal que recapitula todos os aspectos clínicos e características essenciais do PHHP em ratos. O objetivo deste protocolo é ilustrar como a corioamnionite in utero e a HIV pós-natal usando glóbulos vermelhos lisados podem ser combinados para produzir PHHP. Essa abordagem pré-clínica produz macrocefalia progressiva e crânios abobadados, pressão intracraniana elevada e ventriculomegalia que podem ser detectadas por ressonância magnética (RNM) ou microscopia. Além da interrupção sustentada na dinâmica do LCR, os ratos também apresentam atraso cognitivo e incapacidade funcional na idade adulta. Assim, esta plataforma pré-clínica facilita estudos translacionais únicos e incomparáveis de PHHP que podem incorporar medidas moleculares, celulares, bioquímicas, histológicas, de imagem e de resultados funcionais. Também pode ser usado para análise rigorosa do plexo coroide, cílios móveis ependimários e sistema glinfático em paralelo. Por último, também pode ser uma ferramenta pré-clínica inestimável para a investigação de novas estratégias de intervenção cirúrgica e abordagens terapêuticas não cirúrgicas para o tratamento da hidrocefalia.

Introdução

A hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade (PHHP) continua sendo um problema substancial de saúde pública. Definida pelo acúmulo sintomático de líquido cefalorraquidiano (LCR) concomitante com pressão intracraniana (PIC) elevada secundária à hemorragia intraventricular (HIV), a PHHP é uma manifestação grave de encefalopatia da prematuridade e contribui significativamente para a carga global de prematuridade e hidrocefalia adquirida 1,2. Globalmente, aproximadamente 400.000 bebês a cada ano nascem ou adquirem a carga vitalícia da hidrocefalia3 e muitos morrem devido à falta de tratamento3. A PHHP é comum em países desenvolvidos em bebês muito prematuros (<32 semanas de gestação) com HIV grave, e muitas vezes afeta os bebês mais doentes que já sofrem de outras comorbidades com risco de vida 4,5.

O único tratamento disponível para a hidrocefalia é a cirurgia6. Os procedimentos cirúrgicos proporcionam melhor longevidade quando os bebês têm mais de 6 meses no momento da primeira intervenção permanente, seja para um shunt ventriculoperitoneal (VP) para desviar o líquido cefalorraquidiano (LCR), terceira ventriculostomia endoscópica (ETV) ou ETV com coagulação do plexo coróide (ETV-CPC)7. A opção mais comum, os shunts VP, geralmente falham em um ano e predispõem as crianças a uma vida inteira de complicações, cirurgias repetidas e hospitalizações a um custo tremendo para a criança, a família e a sociedade. 8 Em particular, a ansiedade de um shunt potencialmente falhando a qualquer momento é onerosa para as famílias9. O cuidado de crianças com hidrocefalia sintomática, incluindo cirurgias frequentes, é uma das principais causas de gastos com saúde pediátrica 10,11,12,13,14. O custo anual estimado para gastos relacionados a shunts em crianças foi de US$ 2 bilhões em 200315. Enquanto as crianças com shunts representam apenas 0,6% das internações hospitalares, elas geram 3,1% dos encargos hospitalares pediátricos15. Assim, a descoberta de terapias seguras e não cirúrgicas para o tratamento da PHHP é fundamental.

Em bebês, o PHHP se desenvolve após a HIV durante um período clínico que dura de semanas a meses após a identificação inicial do sangramento cerebral. Um estudo realizado pela Hydrocephalus Clinical Research Network (HCRN) confirmou que os shunts VP continuam sendo a melhor opção cirúrgica para neonatos com PHHP16. Mesmo para crianças com PHHP em países de alta renda com acesso a cuidados neurocirúrgicos pediátricos qualificados, os resultados estão longe de ser ideais, com >50% dos shunts colocados em bebês com PHHP exigindo revisão cirúrgica nos primeiros 2 anos8. Apesar da clara necessidade de identificar tratamentos mais seguros e eficazes para o PHHP, a pesquisa tem enfrentado obstáculos. O progresso tem sido dificultado em parte porque a literatura pré-clínica sobre PHHP muitas vezes não consegue distinguir adequadamente a ventriculomegalia causada por hidrocefalia ex vacuo 17,18 da hidrocefalia sintomática com macrocefalia19,20. De fato, os modelos de desenvolvimento da hidrocefalia devem incluir macrocefalia progressiva e/ou medições de PIC1 elevada.

A fusão de insights clínicos e pré-clínicos melhorou o desenho do estudo e impulsionou nossa compreensão do PHHP2. Estudos realizados em diversos centros em todo o mundo mostraram que a HIV é mais comum em neonatos muito prematuros secundários à corioamnionite 21,22,23,24,25,26,27,28. Além da infecção e inflamação placentária, a sepse neonatal é um importante fator de risco adicional e pode desempenhar um papel central na progressão de HIV para ventriculomegalia, PHHP sintomática e subsequente intervenção cirúrgica29. Dados pré-clínicos e clínicos sustentam que a inflamação transmitida pelo sangue pode causar hidrocefalia20, e a inflamação sistêmica aumenta a secreção de LCR pelo plexo coróide30. Além disso, adultos com hemorragia subaracnóidea e HIV que também sofrem de sepse são muito mais propensos a necessitar de um shunt31. A literatura mais recente confirmou que a inflamação reduz a propulsão do LCR dos cílios móveis ependimários 19,20,32 e a reabsorção do LCR pelo sistema glinfático 33,34,35,36. No geral, a inflamação sistêmica é um fator fisiopatológico e clínico chave no PHHP1.

Considerando esses achados, criamos um modelo pré-clínico de PHHP adequado à idade. Esse modelo combina a HIV no período pós-natal imediato e precoce com a corioamnionite, principal causa de parto prematuro19. Essa abordagem experimental inicia-se no útero, com a insuficiência placentária, inflamação placentária e inflamação intraamniótica que definem a corioamnionite 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22,
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,
43,44,45. Especificamente, recapitulamos uma síndrome da resposta inflamatória fetal, neutrofilia placentária e microambiente pró-inflamatório do SNC no período pré-termo por laparotomia abdominal em mães de ratos prenhes no dia embrionário 18 (E18) 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45. A lesão intrauterina é induzida pela oclusão bilateral temporária da artéria uterina levando à hipóxia-isquemia sistêmica transitória (TSHI) seguida de injeção intraamniótica de lipopolissacarídeo (LPS)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Posteriormente, para perturbar a dinâmica do LCR e catalisar o desenvolvimento de hidrocefalia nos filhotes nascidos vivos, a HIV é induzida no dia 1 pós-natal. Isso é realizado com injeção intracerebroventricular bilateral (ICV) de hemácias lisadas (hemácias) nos ventrículos laterais 19,37,44. Os filhotes são então estudados à medida que a hidrocefalia se desenvolve e ao longo de sua vida.

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Protocolo

O Comitê de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) da Universidade Johns Hopkins aprovou todos os procedimentos experimentais aqui descritos. Este protocolo utiliza mães de ratos Sprague-Dawley grávidas e filhotes de ambos os sexos.

1. Indução de corioamnionite em E18

NOTA: A parte do insulto in utero deste protocolo foi publicada anteriormente em detalhes, está resumida acima e é o assunto de um protocolo JOVE separado e vídeo 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. Resumidamente, ratas Sprague-Dawley fêmeas grávidas são submetidas a laparotomia abdominal no dia embrionário 18 (E18) para induzir corioamnionite, que inclui TSHI e administração intraamniótica de LPS.

  1. Anestesia
    1. Induzir anestesia na mãe de ratos prenhes E18 com 2-4% de isoflurano.
    2. Retirar a mãe grávida da câmara de indução e colocar o rato em decúbito dorsal sobre uma manta cirúrgica de água circulante ajustada a 37 °C.
    3. Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento da córnea. Aperte suavemente uma pata para confirmar a ausência de reflexo de pinça do dedo do pé. Monitore a profundidade do anestésico a cada 15-20 min e aumente o isoflurano em caso de resposta positiva ao pinçamento do dedo do pé.
    4. Administre buprenorfina de liberação prolongada (0,1 mg / kg SC) na nuca.
  2. Preparação cirúrgica e esfrega
    1. Usando a técnica estéril padrão, raspe o abdômen.
    2. Esfregue o abdômen 3x com betadina alternada e etanol a 70%.
    3. Cubra o animal usando campos cirúrgicos estéreis.
  3. Laparotomia abdominal
    1. Faça uma incisão na linha média de 3 cm na pele abdominal preparada com um bisturi.
    2. Use fórceps e tesouras cirúrgicas para segurar a camada fascial abdominal e faça uma incisão da linha alba avascular da camada muscular para acessar a cavidade peritoneal.
    3. Exteriorize o útero.
    4. Isole e clampeie as artérias uterinas com clipes de aneurisma por 60 min. Mantenha a temperatura e mantenha o conteúdo intra-abdominal úmido com solução salina estéril.
    5. Remova os clipes e injete 100 μL de LPS (4 μg/saco de solução de LPS) em cada saco amniótico de cada feto. Não perturbe o feto ou a placenta.
    6. Irrigue os cornos uterinos e o campo generosamente 3x com solução salina estéril.
  4. Fechando a laparotomia
    1. Substitua os cornos uterinos na cavidade peritoneal.
    2. Reaproxime as bordas da camada musculofascial e feche usando uma sutura 3-0 em execução.
    3. Aproxime novamente a camada de pele e feche a pele usando uma sutura 3-0 em execução.
    4. Use uma agulha 26 G para injetar subcutaneamente bupivacaína a 0,125% ao redor das bordas da ferida.
    5. Para controles simulados, realize a laparotomia pelo mesmo período de tempo para controlar durante a anestesia. Não aperte as artérias e não administre injeções intraamnióticas. Ao final do procedimento, feche a laparotomia em duas camadas (fáscia muscular abdominal e pele) com sutura 3-0. Em todos os casos, os filhotes nascem a termo (E21/22) e são cuidados pela mãe.

2. Preparação de glóbulos vermelhos lisados em P1

  1. Coleta de sangue
    1. Pegue um filhote de rato Sprague-Dawley macho e uma fêmea no dia 1 pós-natal (P1) de uma ninhada que sofreu corioamnionite em E18. Decapite rapidamente cada filhote doador com uma tesoura cirúrgica dedicada.
      NOTA: Usamos 1 filhote macho e 1 fêmea para coleta de sangue para eliminar um possível viés sexual, representando cada um nas coortes de doadores. Além disso, usamos um par compatível com o sexo para garantir volume e rendimento suficientes de hemácias lisadas para injetar seus irmãos de ninhada. Normalmente, cada filhote doador produz hemácias lisadas suficientes para realizar a injeção de ICV em um máximo de 4-5 irmãos de ninhada.
    2. Colete o sangue imediatamente em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo 0,2 mL de solução salina estéril, tomando cuidado para coletar apenas sangue de fluxo livre após a decapitação e não raspar ou apertar para produzir mais sangue, pois isso leva à hemólise prematura. Vórtice bem.
      NOTA: A quantidade exata de sangue varia de acordo com o animal doador e o peso individual, mas deve ser máxima, mantendo as precauções acima.
    3. Pique / pique coágulos sanguíneos com uma pequena tesoura cirúrgica.
    4. Centrifugue a suspensão de sangue a 500 × g por 10 min a 4 oC, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 0,2 mL de solução salina estéril. Vórtice bem.
    5. Pique / pique coágulos sanguíneos residuais pós-vórtice com uma pequena tesoura cirúrgica.
    6. Repita as etapas 2.1.4-2.1.5 mais duas vezes para um total de 3x, limpando a tesoura cirúrgica com spray de etanol a 70% entre cada rodada de lisagem.
  2. Lise de glóbulos vermelhos
    1. Após a centrifugação final, adicione 0,25 mL de solução salina estéril ao pellet; vórtice bem.
    2. Coloque a suspensão em gelo seco por 5 min.
    3. Remova a suspensão do gelo seco, coloque-a em uma incubadora ajustada a 37,5 oC por 5 min até que esteja completamente descongelada e vortex bem.
    4. Repita os ciclos de congelamento e descongelamento para um total de 3x (três congelamentos e três descongelamentos).
    5. Na conclusão do último degelo, vortex e execute um giro rápido. As hemácias agora estão lisadas e prontas para uso.
      NOTA: A mistura deve ter uma cor opaca semelhante ao suco de tomate e ser facilmente transformada em seringas.

3. Injeções intracerebroventriculares de glóbulos vermelhos lisados em P1

  1. Anestesia com hipotermia
    1. Coloque uma pequena plataforma no gelo úmido para esfriar.
    2. Coloque um lenço seco de laboratório por cima para proteger a pele do filhote.
      NOTA: Esta superfície plana e fria é usada para anestesiar e injetar os filhotes.
    3. Transfira o filhote (P1 envelhecido) da almofada de aquecimento para a limpeza de tarefas sobre a plataforma fria para induzir a anestesia por hipotermia.
    4. Confirme a profundidade da anestesia apertando uma pata e confirmando a ausência do reflexo de pinça do dedo do pé.
    5. Defina uma lâmpada cirúrgica externa para suas configurações mais brilhantes.
    6. Com um assistente usando o indicador e o dedo médio para manter suavemente a linha média da cabeça do animal, transilumine o crânio para visualizar os ventrículos laterais através do crânio. Identifique o bregma visualizando o seio sagital superior (linha média) através da pele e palpando a sutura coronal com pinças finas como pontos de referência de interseção.
  2. Injeção de ICV
    1. Limpe a cabeça do filhote anestesiado com um cotonete embebido em etanol a 70%.
    2. Identifique e marque o local da injeção como 1 mm lateral da sutura sagital, a meio caminho entre lambda e bregma.
    3. Após a visualização, use uma seringa de insulina de 0,3 mL, 8 mm de comprimento e 31 G com uma agulha percutânea ultrafina para injetar 20 μL de hemácias lisadas no ventrículo lateral direito. Insira a agulha diretamente para baixo usando a técnica à mão livre até uma profundidade de aproximadamente metade do comprimento da agulha e injete e remova a agulha lentamente (processo de injeção e remoção em aproximadamente 10-15 s).
    4. Deixe a agulha no lugar por vários segundos após a injeção para evitar a saída das hemácias lisadas injetadas.
    5. Repita com o ventrículo lateral esquerdo e injete 20 μL de hemácias lisadas.
    6. Coloque o filhote em uma almofada de aquecimento ajustada a 37,5 oC para se recuperar da anestesia.
    7. Registre o sexo do filhote e atribua um identificador único de animal.
    8. Retorne o filhote para a gaiola de casa somente após a recuperação total na almofada de aquecimento e a recuperação da consciência, de modo que o animal possa manter a decúbito esternal com segurança.
    9. Monitore todos os filhotes de ratos diariamente quanto à saúde e bem-estar.

4. Confirmação de hemorragia intraventricular bilateral bem-sucedida em P2

  1. Ultrassonografia de cabeça
    1. Para se preparar para o ultrassom da cabeça, remova os filhotes P2 de sua gaiola doméstica.
    2. Coloque o gel de ultrassom na sonda de ultrassom e posicione a sonda sobre a parte superior do crânio.
    3. Com pressão extremamente leve, mova a sonda para visualizar os ventrículos. Confirme a hiperecogenicidade bilateral nos ventrículos laterais representando a HIV.

5. Confirmação de hidrocefalia pós-hemorrágica bem-sucedida

  1. Medição da distância intraaural (IAD), um substituto para o perímetro cefálico, para confirmar a macrocefalia
    1. Para se preparar para a medição, adquira uma pequena fita métrica apropriada para medir a circunferência da cabeça, de preferência com designações milimétricas claramente visualizadas.
    2. Peça a um observador mascarado que remova o filhote de sua gaiola doméstica.
    3. Enquanto segura suavemente o filhote, meça a distância de orelha a orelha (distância intraaural, IAD) e registre o valor em milímetros.
    4. Repita o IAD diariamente de P1 a P15 e represente graficamente os valores. Rastreie o IAD em série e meça novamente em P21 ao realocar os filhotes para novas gaiolas fisicamente separadas da mãe (que é o ponto de tempo padrão para o desmame do filhote). Repita o IAD posteriormente a cada 5 dias, começando em P25 até P60.
  2. Medição da pressão de abertura para confirmar a pressão intracraniana elevada
    1. Peça a um observador mascarado que remova o filhote de sua gaiola doméstica.
    2. Anestesiar com 75-100 mg/kg de cetamina intraperitoneal (IP) e 5-10 mg/kg de xilazina IP em preparação para a eutanásia.
    3. Verifique a profundidade da anestesia apertando uma pata e confirmando a ausência do reflexo de pinça / pedal do dedo do pé.
    4. Insira uma pequena agulha (31 G) conectada a um manômetro no espaço do LCR da junção cervicomedular.
    5. Registre a pressão de abertura no manômetro.
    6. Retire a agulha e decapite o rato com uma tesoura afiada e prossiga com a coleta de tecidos.
  3. Ressonância magnética (RM) ex-vivo para avaliação da ventriculomegalia
    1. Anestesiar com 75-100 mg/kg de cetamina intraperitoneal (IP) e 5-10 mg/kg de xilazina IP em preparação para a eutanásia.
    2. Verifique a profundidade da anestesia apertando uma pata e confirmando a ausência do reflexo de pinça / pedal do dedo do pé.
    3. Perfundir os ratos com solução salina tamponada com fosfato (PBS), seguido de paraformaldeído a 4% (PFA) até ficar bem fixado.
    4. Remova o cérebro e fixe o cérebro em 4% de PFA
    5. Incorpore o cérebro em agarose a 2% em um tubo cônico de 50 mL. Deixe repousar em temperatura ambiente.
    6. Transfira o cérebro para o scanner de ressonância magnética para ressonância magnética ex vivo .
    7. Execute 11.7T MRI da seguinte forma: T2 Turbo RARE; TE/TR = 30,0/3000 ms; média = 2; Espaçamento entre eco = 10.000 ms; Fator RARO = 8; número de fatias = 30; espessura do corte = 1 mm; tamanho da imagem = 128 x 128; FOV = 28 mm x 28 mm; resolução de corte = 0,219 x 0,219 mm2; FA = 90,0°.
      NOTA: Embora a ressonância magnética forneça evidências de modelagem bem-sucedida do PHHP, não é necessário escanear todos os cérebros em uma determinada coorte para verificar o PHHP. A medição do IAM e do ICP é suficiente para verificar conforme descrito acima. Em última análise, a capacidade de um investigador de realizar ressonância magnética in vivo ou ex vivo dependerá de uma variedade de fatores, como acesso ao scanner de ressonância magnética, fundos e capacidade técnica. Esta etapa é particularmente útil para validação ao incorporar recentemente o modelo PHHP. É fundamental observar que, na ausência de sinais documentados de aumento da pressão intracraniana, como pressão de abertura elevada, achados isolados de ventriculomegalia na ressonância nuclear magnética (RNM) não representam hidrocefalia.

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Resultados

Usando este modelo, a hidrocefalia se desenvolve nos dias e semanas após a injeção de glóbulos vermelhos lisados. Uma representação de um desenho experimental típico e progressão da hidrocefalia é fornecida na Figura 1. Foram avaliados 5-6 animais sham e 6-8 animais PHHP por grupo. Quando juvenis, os ratos com PHHP exibiram macrocefalia (Figura 2), pressão intracraniana elevada (Figura 3) e ventricu...

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Discussão

Este protocolo para a indução de PHHP permite medidas de resultados rigorosas, quantificáveis e clinicamente traduzíveis da estrutura e função cerebral concomitantes com características fenotípicas da hidrocefalia, incluindo elevação crônica da PIC, ventriculomegalia e macrocefalia, desde o nascimento até a idade adulta4. Ensaios bioquímicos, histológicos e funcionais podem ser usados para avaliar a saúde do plexo coróide, ependima e sistema glinfático, bem como d...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem o financiamento fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL139492), pelo Programa de Pesquisa Médica Dirigido pelo Congresso (W81XWH1810166, W81XWH1810167, W81XWH2210461 e W81XWH2210462), pela Associação de Hidrocefalia e pelo Instituto de Pesquisa Rudi Schulte.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
70% etanol  Pharmco 111000200Diluído para 70% 
Esfoliante cirúrgico BetadineSaúde CardinalNDC-67618-151-17
Pinça ContundenteRobozRS-8100
Aparador Recarregável Sem Fio Bravmini Plus  Wahl 41590-0438
Lâminas cirúrgicas de aço carbono & nbsp;Bard-Parker371151-11
centrífuga Eppendorf5424R
Esponja de Gaze de AlgodãoFisherbrand22-362-178Pequena, 6 polegadas estéril
Aplicadores com ponta de algodãoFisherbrand23-400-11430 G 1
Lubrificante para OlhosRefresh Lacri Lube75929
Base de aquecimento infravermelha distanteKent ScientificRT-0501 
Incubadora -  Agitador Temporário Genie 100 Indústrias CientíficasSI-G100
Seringas de insulinaBD3284380,3 cc 3 mm 31 G, ultrafino 
IsofluranoCovetrus 11695067772 
Injeção de cloridrato de cetaminaDechra 17033-101-10
KimwipesCiência KimtechBXTNI141300
LPS 011B4SigmaL2630
Tubos microcentrífugasThermo Fisher Scientific34532,0 mL
AgulhaBD3051221 mL
AgulhaBD30512825 G 5/8
Suportes de agulhaKent Scientific Corp.INS1410912,5 CM STR
Toalhas ORSaúde Cardinal287000-008
Fita métrica de papelSaúde CardinalSKU  
Solução salina, 0,9%SigmaS8776
TesouraRobozRS-6808
SomnoSuiteKent ScientificSS6823B 
Absorventes Estéreis de Preparação para ÁlcoolFisherbrand06-669-62Estéril
Luvas cirúrgicasBiogel40870
Tesoura CirúrgicaRobozRS-5880
Tesoura CirúrgicaEST14002-16
SeringaBD309628
T/Bomba (Bomba de Terapia de Calor)Stryker Medical & nbsp;TP700
Clipes de EmbarcaçõesKent Scientific Corp.INS14120Pressão de 30 G
Injeção de xilazina & nbsp;veterinário um NDC 13985-704-10

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