Artigo de método

Um modelo de camundongo para comprometimento cognitivo vascular e demência baseado em estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum guiada por agulha

2.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/67092

⸱

22 de novembro de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Pittsburgh, 2Geriatric Research Education and Clinical Center, VA Pittsburgh Healthcare System, 3School of Arts & Sciences, Washington University in St. Louis, 4Animal Imaging Center, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

O método da agulha de estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum é proposto para criar um modelo de camundongo para comprometimento cognitivo vascular e demência. Isso resulta em resultados de longo prazo em comparação com modelos previamente estabelecidos e é compatível com ressonância magnética ao vivo. A representação visual demonstrando o procedimento fornece orientação para o domínio da cirurgia.

Resumo

O comprometimento cognitivo vascular e demência (VCID) resulta de lesão cerebral vascular. Dada a alta incidência do VCID, que deve continuar aumentando à medida que a população envelhece, é fundamental estabelecer um modelo animal robusto para a doença. Este artigo apresenta um novo método de criação de um modelo de camundongo de VCID baseado na estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum, que imita a hipoperfusão cerebral crônica humana causada pela aterosclerose carotídea.

Resumidamente, as artérias carótidas comuns (ACCs) são ligadas a agulhas de calibre diferentes (32 G para a ACC direita e 34 G para a ACC esquerda) usando pontos de seda 7-0 seguidos de remoção imediata da agulha. Os anéis de sutura restantes causam redução persistente do fluxo sanguíneo e comprometimento cognitivo de longo prazo associado a lesão da substância branca, microinfartos e gliose reativa, imitando assim de perto a patogênese da VCID. É importante ressaltar que, neste modelo de agulha, as representações clínicas não se revertem com o tempo, proporcionando comprometimento cognitivo confiável a longo prazo. Além disso, a taxa de sobrevida 24 semanas após a cirurgia foi de 81,6%, o que é maior em comparação com os outros modelos estabelecidos de VCID com um nível semelhante de redução do fluxo sanguíneo.

As vantagens adicionais incluem baixo custo de material e compatibilidade com ressonância magnética para monitorar lesões cerebrais em animais vivos, uma vez que nenhum metal é implantado. O principal desafio no emprego do modelo de agulha de VCID é a necessidade de desenvolver habilidades cirúrgicas avançadas, uma vez que os CCAs de camundongos têm menos de 0,6 mm de diâmetro e são muito frágeis. A representação visual de alta qualidade da cirurgia ajudará, portanto, os pesquisadores a dominar essa técnica e avançar nossa compreensão do VCID, potencialmente levando ao desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para diminuir o declínio cognitivo devastador associado ao VCID.

Introdução

O comprometimento cognitivo vascular e demência (VCID) é a segunda principal causa de declínio cognitivo. Apesar do progresso inegável que foi feito para entender a patogênese da VCID e seus fatores de risco, o mecanismo de como a disfunção neurovascular contribui para o declínio da capacidade cognitiva permanece vago. Vários modelos de roedores de várias complexidades foram estabelecidos para induzir isquemia cerebral para mimetizar as representações clínicas da VCID1 humana. Alguns desses modelos são baseados na criação de hipoperfusão cerebral transitória; no entanto, a maioria deles é gerada pela indução de hipoperfusão cerebral crônica, o principal mecanismo que leva à VCID em pacientes humanos2.

A hipoperfusão cerebral crônica pode ser introduzida usando a oclusão bilateral da artéria carótida (BCAO), que causa resultados graves, mas muitas vezes fatais, ou estenose bilateral da artéria carótida (BCAS). O BCAS é geralmente realizado usando um de dois métodos: colocando microbobinas idênticas em torno de ambos os CCAs, resultando em estenose simétrica3; ou implantando um constritor ameróide e uma micromola ao redor dos CCAs esquerdo e direito, respectivamente, causando oclusão gradual e redução de ~ 50% do fluxo sanguíneo nos CCAs esquerdo e direito, respectivamente4. As desvantagens de ambos os métodos são a alta taxa de mortalidade se a estenose for muito grave ou se o CCA estiver ocluído e a incompatibilidade com a ressonância magnética de animais vivos devido à presença de metal no corpo. Alguns modelos genéticos de camundongos também foram estabelecidos 1,5,6,7,8. Opções adicionais incluem arteriopatia cerebral autossômica dominante com infartos subcorticais e modelos de camundongos com leucoencefalopatia 9,10. No entanto, nenhum dos modelos propostos mimetiza toda a gama de danos isquêmicos apresentados em pacientes humanos e, portanto, a busca por modelos VCID atualizados continua.

Este trabalho apresenta um novo método cirúrgico de indução de estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum (ABCS) em camundongos, onde a estenose CCA é realizada usando suturas de seda e é controlada pela ligação de CCAs a agulhas de vários diâmetros, seguida de remoção imediata da agulha11. Como resultado, anéis de sutura de diâmetros precisos são deixados permanentemente nos CCAs para garantir a estenose crônica. O benefício de usar o ABCS em relação a um método simétrico é que a hipoperfusão moderada à direita garante melhor sobrevida, enquanto a hipoperfusão mais pronunciada à esquerda garante representações neurológicas e patológicas de longo prazo. Esse modelo de agulha apresenta várias vantagens sobre os modelos tradicionais de BCAS11 , como resultados persistentes, menor mortalidade, custo ultrabaixo, flexibilidade e possibilidade de usar abordagens analíticas especiais.

Para elaborar essas vantagens, três ligações causam um fragmento de estenose CCA em vez de estenose de ponto focal, levando a hipoperfusão persistente, lesão da substância branca e declínio cognitivo em ~ 90% dos camundongos. A mortalidade dos camundongos agulha foi de ~ 17%, menor do que a do restritor ameróide / microbobina modelo4 de Hattori, que tem ~ 30% de mortalidade em 16 semanas com base em nossa experiência. Cada modelo BCAS normalmente custa cerca de US$ 100 devido às caras microbobinas ou restritores ameróides, enquanto o modelo de agulha custa apenas cerca de US$ 1 por mouse. Além disso, o calibre das agulhas pode ser modificado dependendo dos requisitos específicos da pesquisa para a restrição do fluxo sanguíneo em ambos os lados. Na variação apresentada no presente trabalho, o modelo de agulha mimetiza a fisiopatologia da estenose carotídea grave, causada por estenose permanente unilateral sem oclusão, que é a representação mais comum da doença na clínica11. Além disso, os restritores ameróides e as micromolas usados nos modelos tradicionais de BCAS são feitos de metal, o que pode causar artefatos significativos se a ressonância magnética in vivo for realizada, mesmo que o metal seja implantado não no cérebro, mas no tórax. Pode ser difícil prever como exatamente a presença de metal afetaria a imagem.

Geralmente, a ressonância magnética in vivo realizada após o implante da micromola é geralmente uma imagem anatômica simples, não adequada para análise quantitativa de múltiplos insultos, o que é altamente desejável para a pesquisa do VCID. Em contraste, o modelo de agulha apresentado aqui usa apenas suturas de seda e é totalmente compatível com qualquer tipo de ressonância magnética in vivo. Isso é significativo por dois motivos: (1) a ressonância magnética é extremamente sensível a pequenas lesões cerebrais, microssangramentos ou siderose superficial12, portanto, é preferida aos outros métodos de análise, como tomografia computadorizada (2) a ressonância magnética in vivo deve ser preferida à ressonância magnética ex vivo , pois a pesquisa VCID pode, sem dúvida, se beneficiar do rastreamento da dinâmica da progressão/cicatrização da lesão, especialmente em resposta aos novos tratamentos propostos. Além disso, o funcional (fMRI) pode ser realizado no modelo de agulha para fornecer informações críticas sobre a integridade do acoplamento neurovascular em resposta à hipoperfusão cerebral. Assim, a possibilidade de uso de RM in vivo abre um caminho para a análise aprofundada da intrincada correlação entre o tamanho e a localização das lesões e a função cognitiva, bem como o acoplamento neurovascular, especialmente em estudos farmacodinâmicos.

Protocolo

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh e realizados de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Técnicas estéreis devem ser mantidas em todas as cirurgias de sobrevivência. Camundongos C57BL/6J machos de doze semanas de idade com peso corporal de 25-30 g foram utilizados nos experimentos apresentados.

1. Preparação dos materiais e espaço de trabalho

  1. Preparar os fragmentos da agulha (~4 mm de comprimento; 32 G para o CCA direito e 34 G para o CCA esquerdo). Romba levemente a ponta afiada das agulhas batendo cuidadosamente a ponta afiada contra uma superfície dura e separe cuidadosamente as agulhas das peças de plástico usando um porta-agulha. Suturas de seda 7-0 pré-cortadas em pedaços de 1-2 cm de comprimento.
  2. Esterilize instrumentos cirúrgicos, fragmentos de agulha e suturas em autoclavagem ou qualquer outro método apropriado.

2. Realização da cirurgia

  1. Pese o camundongo e induza a anestesia colocando-o por 2-3 min em uma câmara ventilada com isoflurano a 3% em uma mistura de 25% O2 e 72% N2O.
  2. Coloque o rato (com o lado ventral para cima) numa almofada de aquecimento coberta por uma folha cirúrgica estéril para manter uma temperatura corporal constante (37 °C) e fixe uma máscara facial para ventilação com isoflurano a 1% numa mistura de 25% O2 e 74% N2O. Prenda os membros do rato com fita adesiva.
  3. Raspe o pelo do pescoço com um barbeador elétrico. Limpe os cabelos finos com fita adesiva ou aspirador de teclado.
  4. Desinfete o local da cirurgia com solução de Betadine (iodo a 10%). Desiodizar a pele com etanol a 70%. Repita a infecção por dinsinfection 3x. Certifique-se de que o nível de anestesia seja adequado por falta de resposta a um beliscão firme do dedo do pé (reflexo pedal).
  5. Cubra a área cirúrgica. Em seguida, faça uma incisão vertical na linha média ao longo da traqueia e separe as glândulas tireóides bilaterais com uma micropinça. Retire a pele e o tecido com pequenos afastadores de pele estéreis.
  6. Sob o microscópio, use uma pinça angular para expor cuidadosamente e dissecar sem corte um dos CCAs do nervo vago e da bainha. Use água estéril ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) para molhar o local da incisão se o CCA tende a grudar na pinça. Coloque uma pequena seringa de plástico sob o pescoço para apoiar a postura, se necessário.
    NOTA: Tome cuidado extra para não romper o CCA.
  7. Passe três fragmentos de sutura de seda pré-cortados (tamanho 7-0) sob o CCA (1 mm de distância) usando uma pinça angular.
  8. Desenhe um nó duplo muito frouxo ao redor do CCA em um dos fragmentos de sutura.
    NOTA: Molhar o local da cirurgia e as suturas com água estéril ou PBS pode ajudar a dar um nó.
  9. Coloque um fragmento de agulha (32 G para o CCA direito e 34 G para o CCA esquerdo) paralelo ao CCA, dentro do nó solto (Figura 1A). Aperte cuidadosamente o nó primário ao redor da agulha e do CCA até que nenhum fluxo sanguíneo seja observado e prenda-o com um nó secundário. Retire imediatamente a agulha para restaurar o fluxo sanguíneo parcial e apare as extremidades da sutura.
    NOTA: O cirurgião deve ter muito cuidado ao aparar as extremidades da sutura após a conclusão dos nós. Cortar muito perto do nó pode resultar no afrouxamento do nó. Além disso, é fundamental observar o CCA após remover a agulha para garantir que o fluxo sanguíneo ainda esteja habilitado a jusante do nó. Se o CCA parecer muito pálido após a remoção da agulha, significa que o CCA está supercomprimido.
  10. Repita as etapas 2.8-2.9 para o2º e3º fios de sutura no mesmo CCA, aproximadamente 1 mm de distância um do outro (Figura 1B).
  11. Repita as etapas 2.6-2.10 com o CCA oposto usando um fragmento de agulha de 32 G.
  12. Examine cuidadosamente se ambos os CCAs estão ligados de forma eficiente: confirme se todas as três bandas de sutura estão firmemente amarradas no lugar, mas não tão apertadas a ponto de bloquear completamente o fluxo sanguíneo (verifique se os CCAs não estão pálidos a jusante dos nós). Verifique se as três bandas de sutura em cada CCA estão separadas por aproximadamente 1 mm uma da outra.
  13. Feche a pele usando suturas de monofilamento estéreis.
  14. Imediatamente após a cirurgia, injete 100-150 μL de cetoprofeno (estoque de 1 mg/mL; 5 mg/kg de peso corporal) por via intraperitoneal para aliviar a dor pós-operatória. Repita esta injeção 24 h e 48 h após a cirurgia.
  15. Colocar o rato numa manta homeotérmica a 37 °C para monitorização contínua durante 2 h antes de devolver o animal ao biotério.
    NOTA: Para procedimento simulado, as etapas 2.7-2.12 devem ser omitidas.

3. Validação do modelo

NOTA: A lesão cerebral foi analisada com ressonância magnética in vivo e posteriormente verificada com coloração Luxol fast blue (LFB) e testes comportamentais.

  1. Imagem da perfusão sanguínea cerebral.
    1. Anestesiar o mouse usando isoflurano a 1-1,5%. Esterilize o local da cirurgia com solução Betadine (iodo a 10%). Em seguida, desiodize a pele com etanol 70%.
    2. Prenda o crânio do animal em uma moldura estereotáxica. Faça uma incisão sagital na linha média no couro cabeludo do osso frontal ao occipital para expor o crânio e limpar a superfície do crânio com solução salina estéril.
    3. Coloque uma câmera de dispositivo acoplado carregado 10 cm acima do crânio usando um sistema de manchas a laser bidimensional. Coloque um suporte de sonda sobre o local da craniectomia e prenda-o firmemente.
    4. Faça imagens de perfusão sanguínea 5 minutos antes da cirurgia e imediatamente após a liberação da agulha ou 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias após a cirurgia.
    5. Feche a pele usando suturas de monofilamento estéreis. Injete 100-150 μL de cetoprofeno (estoque de 1 mg/mL; 5 mg/kg de peso corporal) por via intraperitoneal para aliviar a dor pós-operatória. Repita esta injeção 24 h e 48 h.
  2. In vivo RESSONÂNCIA
    1. Anestesiar os camundongos com isoflurano a 1-1,5%, com respiração monitorada continuamente e temperatura mantida a 37 °C com ar quente durante a aquisição da imagem.
    2. Realize a ressonância magnética in vivo usando um scanner 9.4T, uma bobina Tx de 86 mm e um conjunto de receptores cerebrais de camundongo de 4 canais, executando o software associado. Após o posicionamento e varreduras piloto, adquirir imagens ponderadas em T2 (T2WI) usando uma sequência de Aquisição Rápida com Aprimoramento de Relaxamento (RARE), com os seguintes parâmetros: Tempo de Eco/Tempo de Repetição (TE/TR) = 40/4.000 ms, média = 8.256 × matriz de 256, 16 cortes com espessura de corte de 0,5 mm, fator RARE = 4 e campo de visão (FOV) de 20 x 20 mm.
    3. Colete dados de imagem por tensor de difusão (DTI) usando uma sequência de imagem de imagem ecoplanar (EPI)-DTI usando a mesma geometria e parâmetros do T2WI com as seguintes exceções: TR/TE = 2.300/22 ms, matriz de aquisição = 128 x 128, 2 segmentos, 5 imagens A0 e 30 imagens de difusão não colinear, Δ/δ = 10/3 ms e um valor b = 1.000 s/mm2.
    4. Analisar os dados de DTI usando o software DSI Studio (http://dsistudio.labsolver.org/), procurando diferenças nos parâmetros escalares de difusão (Anisotropia Fracionária (FA), Difusividade Média (MD), Difusividade Axial (AD) e Difusividade Radial (RD)). Desenhe regiões de interesse (ROIs) para o corpo caloso (CC), cápsula externa (EC), cápsula interna (IC), fímbria, comissura anterior (AC), cíngulo (Cing), hipocampo (hipopótamo), córtex (C) e estriado (Str) de ambos os hemisférios.
  3. Coloração azul rápido Luxol (LFB)
    1. Prepare as seções cerebrais: fixe o cérebro com 4% de PFA por 24 h e, em seguida, mergulhe o cérebro em sacarose a 30% até que o cérebro afunde. Incorpore o cérebro no composto OCT em gelo seco. Corte uma fatia de cérebro coronal de 20 μm de espessura em um micrótomo deslizante. Armazene as fatias de cérebro em solução de armazenamento (30% de glicerol / 30% de etilenoglicol em PBS).
    2. Mergulhe as seções cerebrais em LFB (solução de álcool a 0,1%), mantenha a 56 ° C durante a noite e lave com água destilada.
    3. Incube seções cerebrais em carbonato de lítio a 0,05% e desidrate através de álcoois graduados.
    4. Manchar as seções com violeta de cresil a 0,5% por 5 min, diferenciadas com etanol a 70%.
    5. Monte as seções cerebrais manchadas com meio de montagem.
  4. Avaliação da função cognitiva com um teste de labirinto aquático de Morris modificado
    1. Encha um tanque circular com água (25 oC, profundidade 33 cm) e mergulhe uma plataforma quadrada ~ 10 x 10 cm2 de plexiglass 1,2 cm abaixo do nível da água, 31 cm da borda norte, leste, sul ou oeste da piscina.
      NOTA: Esta plataforma deve permanecer no mesmo local durante todo o teste.
    2. Ligue uma câmera de vídeo montada no teto. Coloque um rato no tanque (não solte no nível da água), de frente para a parede e começando no nordeste, sudeste, sudoeste ou noroeste. Deixe o mouse nadar por no máximo 90 s para encontrar uma plataforma submersa.
    3. Deixe o mouse permanecer na plataforma submersa por 30 s se a plataforma for encontrada. Se a plataforma não for encontrada, coloque o mouse lá por 30 s.
    4. Deixe o mouse descansar por 5 min e repita a tentativa de natação (etapas 3.4.2 - 3.4.3) 2x.
    5. Seque o mouse com um pedaço de pano e devolva-o à gaiola sob uma lâmpada de aquecimento.
    6. Repita três testes de natação todos os dias por 5 dias sequenciais.
    7. Usando imagens de vídeo, calcule a latência para escapar (quanto tempo leva para encontrar a plataforma em cada teste).
    8. No último dia de teste, remova a plataforma e registre o tempo que o mouse passa no quadrante, onde a plataforma estava localizada anteriormente.

Resultados

Hipoperfusão cerebral assimétrica de longo prazo
O fluxo sanguíneo da ACC foi medido antes e imediatamente após a liberação da agulha da última (terceira) ligadura, conforme descrito anteriormente11. O fluxo sanguíneo foi reduzido em ~ 70% na CCA esquerda e ~ 50% na CCA direita. A perfusão sanguínea cerebral foi monitorada dinamicamente usando speckle laser bidimensional. A cirurgia causou hipoperfusão cerebral em ambos os hemisférios, sendo o hemisfério esquerdo mais gravemente acometido (Figura 2). A hipoperfusão cerebral é mantida por pelo menos 24 semanas após a cirurgia11.

Menor mortalidade
A taxa de sobrevivência para camundongos machos em 6 semanas foi de 81,6% (Figura 3); Os camundongos foram mais propensos à morte na primeira semana após a cirurgia.

Detecção de lesão cerebral por ressonância magnética in vivo
As imagens ponderadas em T2 revelaram regiões hipo ou hiperintensas no hipocampo (Hippo), cápsula externa (EC), cápsula interna (IC), corpo caloso (CC) e estriado (Str) em camundongos submetidos à cirurgia ABCS, indicando lesão cerebral (Figura 4A). Danos estruturais foram observados nos mapas coloridos codificados direcionalmente (DEC) do DTI de camundongos ABCS quando comparados com o sham (Figura 4B).

As análises quantitativas mostraram que os camundongos ABCS apresentaram anisotropia fracionada (FA) significativamente menor no hipopótamo esquerdo, CI, comissura anterior (AC), cíngulo (Cg) e fímbria (Fi) quando comparados ao sham (P < 0,05 versus sham), indicando comprometimento da microestrutura da substância branca no hemisfério esquerdo (painel superior esquerdo, Figura 4C). A FA no Cg e Fi direito em camundongos ABCS também foram reduzidas (P < 0,05 versus sham). A AF no CI esquerdo e no Fi foi significativamente menor do que a do direito nos camundongos ABCS (P < 0,05, esquerda versus direita).

Da mesma forma, a difusividade axial (AD) significativamente menor foi exibida no EC, IC, Str e Fi esquerdos em camundongos ABCS em comparação com a simulação, sugerindo lesão axonal (painel superior direito, Figura 4C (P < 0,05 versus simulação)). Apenas o Str esquerdo mostrou redução média da difusividade (MD) em camundongos ABCS em comparação com o sham (painel inferior esquerdo, Figura 4C). A diferença de difusividade radial (RD) foi observada em CC esquerdo, Str e Fi em camundongos ABCS (painel inferior direito, Figura 4C), sugerindo inflamação e aumento da celularidade nessas regiões13.

Lesão cerebral assimétrica nos dois hemisférios e danos nas regiões da substância branca no hemisfério esquerdo
A lesão cerebral foi adicionalmente analisada com coloração LFB usando o procedimento descrito anteriormente14 (Figura 5). Imagens de menor potência mostraram coloração azul mais clara em EC e Str, sugerindo desmielinização nessas regiões. Imagens de alta definição mostraram que camundongos simulados exibiam axônios bem organizados e mielinizados com oligodendrócitos orientados linearmente em EC; no entanto, os axônios desapareceram e células penetrantes e coradas de azul foram observadas na CE em camundongos ABCS. Os camundongos simulados mostraram estruturas de feixes de fibras bem organizadas e manchadas de azul profundo em Str. No entanto, os feixes de fibras ficaram mais claros e menores, e sua integridade foi comprometida; alguns feixes de fibras foram vacuolados em camundongos ABCS. Os feixes de fibras foram distorcidos e a matriz inter-feixe foi significativamente espessada em AC em camundongos ABCS. Em resumo, a cirurgia ABCS causa desmielinização axonal e danos; Os danos na substância branca ocorrem principalmente no hemisfério esquerdo.

Aprendizagem e disfunção da memória
A cirurgia ABCS com agulha resultou em significativa dificuldade de aprendizagem, conforme indicado por um aumento do tempo para encontrar uma plataforma submersa (latência para escapar) durante um teste de labirinto aquático de Morris (Figura 6). Essa deficiência durou pelo menos 24 semanas após a cirurgia. A memória também foi significativamente afetada, conforme indicado por uma diminuição do tempo gasto no quadrante alvo após a remoção da plataforma.

figure-results-1
Figura 1: Etapas da cirurgia com agulha para criar ABCS. (A) A ACC esquerda é exposta e três suturas de seda são enfiadas sob a CCA. Um nó frouxo é esboçado em um dos fragmentos de sutura e a agulha é posicionada paralelamente à CCA. (B) Três anéis de sutura são posicionados a aproximadamente 1 mm de distância. Abreviaturas: ABCS = estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum; CCA = artéria carótida comum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Hipoperfusão cerebral assimétrica persistente no modelo ABCS com agulha. Monitoramento dinâmico do fluxo sanguíneo cerebral após a cirurgia. Hipoperfusão cerebral persistente pode ser observada em ambos os hemisférios, sendo mais profunda à esquerda. Asteriscos pretos indicam regiões de hipoperfusão. Abreviatura: ABCS = estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Taxa de sobrevida após cirurgia de ABCS com agulha. A cirurgia resultou em uma taxa de sobrevida de 81,6% em 6 semanas; O óbito ocorreu principalmente durante a primeira semana de pós-operatório. Abreviatura: ABCS = estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Detecção de lesão cerebral por ressonância magnética in vivo no modelo ABCS de agulha. (A) Imagens representativas ponderadas em T2 de camundongos simulados e ABCS. As setas vermelhas indicam regiões hipo ou hiperintensas. (B) Mapa DEC representativo de DTI in vivo 2 semanas após a cirurgia de ABCS com agulha. As cores indicam a direcionalidade do eixo principal de difusão (vermelho = esquerda/direita, verde = dorsal/ventral e azul = rostral/caudal). (C) Análise quantitativa em camundongos simulados e ABCS (ANOVA unidirecional). * representa p < 0,05 ABCS versus sham (hemisfério esquerdo). # representa p < 0,05 esquerda versus direita. & representa p < 0,05 ABCS versus sham (hemisfério direito). Os dados são apresentados como média ± EPM; n = 4 para camundongos sham, n = 4 para camundongos ABCS. Abreviaturas: ABCS = estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum; Hipopótamo = hipocampo; EC = cápsula externa; IC = cápsula interna; CC = corpo caloso; Str = estriado; DEC = cor codificada direcionalmente; DTI = imagem por tensor de difusão; FA = anisotropia fraccionada; DM = difusividade média; AD = difusividade axial; RD = difusividade radial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Coloração LFB representativa de fatias cerebrais 6 semanas após a cirurgia ABCS com agulha. (A) Imagens de baixa potência da coloração LFB de camundongos simulados e ABCS. As caixas brancas denotam o local correspondente às imagens de alta definição em B. (B) Imagens de alta definição (200x) de EC (painel superior) e Str locais 1 e 2 (painel do meio) e AC (painel inferior). A ponta da seta preta mostra um feixe de fibras normal. As pontas das setas azuis apontam para um feixe de fibras danificado. As pontas das setas vermelhas denotam fibras vacuolizadas. Barras de escala = 1 mm (A), 100 μm (B). Abreviaturas: ABCS = estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum; LFB = Luxol azul rápido; EC = cápsula externa; Str = estriado; AC = comissura anterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Aprendizagem espacial e avaliação da memória no teste do labirinto aquático. O aprendizado espacial foi avaliado (A) 3 semanas e (B) 24 semanas após a cirurgia, medindo o tempo para localização da plataforma em dias consecutivos. A memória foi avaliada (C) 4 semanas e (D) 24 semanas após a cirurgia, medindo o tempo gasto no quadrante alvo após a remoção da plataforma. A cirurgia resultou em interrupção a longo prazo das funções cognitivas. Os dados foram expressos como média ± EPM, *p < 0,05 agulha versus sham; **p < 0,01 versus sham; ANOVA de duas vias e Neuman-Keuls post hoc. n = 10 para sham, n = 10 para grupos de agulhas. Essa figura foi modificada a partir de Weng et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Vários métodos de indução de VCID usando estenose assimétrica da CCA foram descritos, e todos eles compartilham uma etapa cirúrgica importante e crítica - isolamento da CCA do nervo vago e da bainha e exposição da CCA para torná-la acessível para estenose. Embora forneçamos orientação visual de boa qualidade sobre a exposição cirúrgica de CCAs antes da ligadura, também gostaríamos de orientar os pesquisadores a assistir a vídeos adicionais sobre o isolamento de CCA que estão disponíveis online no contexto de outras cirurgias de camundongos e ratos 15,16,17,18. Deve-se tomar cuidado extra para não comprimir ou romper o CCA, pois é a principal artéria que fornece sangue oxigenado ao cérebro.

Outra etapa crítica da cirurgia que precisa ser dominada é esboçar um nó solto e apertá-lo ainda mais ao redor do CCA com a agulha, seguido pela remoção da agulha. É altamente recomendável praticar esta etapa apenas com a agulha antes de tentar executá-la em um camundongo anestesiado. Isso permitirá dominar movimentos delicados de fórceps e aperfeiçoar manipulações com as suturas sem o risco de machucar o mouse. O nó precisa ser bem preso sem se desfazer durante a remoção da agulha, apertado o suficiente para segurar a agulha, mas solto o suficiente para permitir o deslizamento da agulha para longe da sutura com nó usando uma pinça.

É importante ressaltar que uma única ligadura de cada ACC não é suficiente para diminuir o fluxo sanguíneo de forma confiável e manter a hipoperfusão cerebral a longo prazo11. Uma possível explicação pode ser que uma única ligadura causa estenose pontual, que provavelmente causará um aumento local da pressão, levando ao aumento da velocidade do fluxo sanguíneo para compensar a redução do fluxo sanguíneo. Recomendamos realizar três ligaduras com ~ 1 mm de distância uma da outra para criar um fragmento de estenose. Um benefício adicional do uso de três ligaduras é que os nós servem como um mecanismo de prova caso um dos nós se solte durante a remoção adicional da agulha. De fato, um fragmento de estenose causado por três ligações separadas do mesmo CCA aumenta a consistência do modelo, levando à hipoperfusão cerebral persistente em cerca de 90% dos camundongos. Além disso, a estenose do fragmento mimetiza a estenose CCA causada pela aterosclerose em pacientes humanos com mais precisão em comparação com a estenose do ponto focal, aumentando assim a relevância clínica do modelo de agulha.

Recomendamos fortemente a remoção imediata da agulha após o término da primeira ligadura para garantir que o fluxo sanguíneo da CCA seja parcialmente recuperado e só então passe para a segunda e terceira ligaduras sequencialmente. Não é recomendado terminar as três ligaduras com a agulha dentro dos três nós, pois isso aumentaria significativamente o tempo de obstrução completa do fluxo sanguíneo. Normalmente, não recomendamos mais de 1 min de oclusão completa do CCA antes de remover a agulha. Esta recomendação é baseada no relato de que os camundongos não apresentaram sinais de comprometimento funcional após 3 sessões de oclusão de 60 s de ambos os CCAs19. Em nosso modelo, o cirurgião trabalha em um CCA de cada vez, o que é mais tolerante do que a oclusão de ambos os CCAs simultaneamente, mas ainda recomendamos seguir esse cronograma para excluir quaisquer artefatos causados por oclusão prolongada em vez de hipoperfusão crônica em ambos os lados.

Embora esse modelo de agulha permita ajustar os diâmetros das suturas com nós usando agulhas de vários diâmetros (com base no peso corporal ou nos requisitos específicos de restrição do fluxo sanguíneo), em nossa experiência, os camundongos tiveram taxas de sobrevivência mais altas quando a hipoperfusão no hemisfério direito foi moderada em vez de grave. Por outro lado, a hipoperfusão grave persistente no hemisfério esquerdo produziu desfechos patológicos e neurológicos a longo prazo. Assim, recomendamos realizar uma ligadura assimétrica usando uma agulha mais grossa para ligar a ACC direita (causando hipoperfusão moderada no hemisfério direito) e uma agulha mais fina para ligar a ACC esquerda (causando hipoperfusão grave no hemisfério esquerdo).

Por fim, os pesquisadores devem estar cientes de que diferentes cepas de camundongos podem produzir diferentes resultados do insulto isquêmico ou traumático, principalmente devido a diferenças na anatomia vascular cerebral20,21. Como muitos estudos hoje em dia exigem a geração de novos camundongos transgênicos, a cepa de fundo deve ser cuidadosamente considerada se a cirurgia de BCAO for necessária em qualquer estágio do projeto experimental. Por exemplo, as cepas C57BL / 6 e SV129 são uma escolha comum de fundo para gerar animais transgênicos para pesquisa de AVC21. No entanto, foi bem documentado que os camundongos C57BL/6 são muito mais sensíveis à isquemia em comparação com as outras cepas testadas, incluindo camundongos SV12920,21. De fato, há evidências de que o efeito da cepa murina pode ser ainda mais importante do que o efeito da técnica usada para induzir VCID21. Assim, torna-se extremamente importante manter os fundos dos camundongos consistentes em todos os experimentos que envolvem a indução de lesão cerebral isquêmica em roedores. É importante ressaltar que os pesquisadores podem avaliar a eficiência do resultado da cirurgia em animais vivos usando sistemas de pontuação neurológica22 com uma pontuação de 0,5 como critério de inclusão. A lesão cerebral pode ser confirmada usando a imunocoloração Iba1, que é muito sensível a danos cerebrais, mesmo após um pequeno insulto focal.

Em resumo, é importante lembrar que VCI é um termo complexo que une muitas representações clínicas e causas sob o mesmo guarda-chuva. Portanto, os pesquisadores devem sempre ter em mente qual modelo deve ser selecionado com base nos aspectos do VCI que gostariam de estudar. Nunca pode haver um único modelo universal para todas as manifestações da VCI. Os modelos de estenose CCA limitam severamente o fluxo sanguíneo das artérias principais, imitando assim os pacientes com estenose arteriosclerótica. O novo método de agulha para criar BCAS assimétrico em camundongos C57BL/6J é um método confiável para imitar o VCID que oferece várias vantagens sobre os métodos relatados anteriormente (particularmente alta flexibilidade, baixa mortalidade, resultados de longo prazo, custo mínimo e monitoramento de ressonância magnética ao vivo). Devido às suas vantagens sobre os outros modelos, ele pode ser usado para avançar ainda mais nosso conhecimento sobre a progressão da VCID, bem como servir como base para a triagem de potenciais agentes terapêuticos para curar ou retardar a progressão da VCID. Semelhante a outros métodos relatados de BCAS, o modelo de agulha requer habilidades cirúrgicas avançadas que podem ser dominadas com o tempo, usando esta demonstração visual como guia.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este projeto foi apoiado por bolsas do National Institutes of Health/NINDS RF1NS117509 (G. Cao) e VA Merit Review BX003923 and BX006454 (G. Cao).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de 1 mLBD309659injeção IP de cetoprofeno
2,5 mm pontas retráteis rombasKent Scientific CorporationSURGI-5016-22 necessários
Andis Ion T-Blade Pet TrimmerAndisBTF3Para barbear a pele
Solução Betadine Avrio Saúde LPNDC 67618-150-17
Sutura de seda trançada, 5-0Teleflex Medical106-SPara sutura de pele
Sutura de seda trançada, 7-0Teleflex Medical103-SPara ligadura CCAs
CameraMed Associates, IncVID-CAM-MONO-7Para vidro de cobertura de validação de modelo
Fisherbrand12-541-012Para crista de validação de modelo
violetaThermo ScientificC581-25Para validação
do modelo Ponta de Dispensação, Agulha, Flex, Calibre 34, 1/4" OALJensen GlobalJG34-0.25HPXPara o https://dsi-studio.labsolver.org esquerdo CCA
DSIStudio; para análise de dados DTI
Pinças Dumont; Padrão #1Roboz Surgical Instrument CoRS-49602 necessários
Pinças Dumont; Padrão #5, Ângulo de 45 GrausRoboz Surgical Instrument CoRS-50582 necessários
EtanolFisher Scientific64-17-5Diluir a 70%
de etilenoglicolThermo ScientificE178-4Para validação do modelo
Agulha de Olho, Tamanho #4; Círculo de 3/8, Borda de Corte, 11 mm de Comprimento da CordaRoboz Surgical Instrument CoRS-7981-4Para sutura de pele
E-Z Sistemas clássicos de anestesiaEZ-7000
glicerolThermo ScientificAAA16205APpara validação de modelo
Sistema de monitoramento homeotérmicoHarvard BioscienceK 022258
Sistema de imagem EVOS FL AutoLife TechnologiesAMAFD2000Para validação de modelo
IsofluranoCovetrus11695-6777-2
CetoprofenoZoetis5487
Leica M320 F12 microscópio clínico e cirúrgicoLeicaM320 F12
Lidocaína e Prilocaína Creme, USP 2,5% / 2,5%PadagisNDC 0574-2042-30Genérico para EMLA creme
carbonato de lítioThermo ScientificL119-500Para validação do modelo
Luxol azul rápidoThermo ScientificAC212170250Para
lâminas de microscópioFisherbrand12-550-403Para validação de modelo
MicrótomoLeicaSM2010RPara validação
de modelo Morris Water Maze com a plataforma ocultaMaze Engineershttps://maze.conductscience.com/portfolio/morris-water-maze/
M-Prove Balança PortátilSartoriusAY711Balanças para weiging a ressonância magnética do rato
com ParaVision 6.0.1 BrukerAV3HD 9.4TPara validação de modelo
Medidor de fluxo multigás Aalborg InstrumentsGMR2-010334para mistura de gás de baixa vazão (N2O e O2)
Nano Ultra Fine Pen Needles - 32G 4mmBD58320883Para o CCA
O.C.T. certo.Thermo Scientific23-730-571Para validação do modelo
Paraformaldeído, 4%Thermo ScientificJ61899. AKPara validação de modelo
PBSThermo ScientificBP399500Para validação de modelo
Sistema PeriCam PSI com suporte de sonda Aperiflux Perimed IncPeriCam PSI HRPara validação de modelo
permountThermo ScientificSP15-100Para validação de modelo
Pinça de Cabo Redondo; Micro Sutura com Plataforma de Amarração; InstrumentoCirúrgico RobozCo RS-5264Para ajudar a cortar e suturar a pele
Lâmpada de Calor para Pequenos Animais, 75 WattsMorganville ScientificHL0100Para validação de modelo
Aplicadores pequenos com ponta de algodãoFisher Scientific23-400-118
- Ferramentas de Ciência Fina de Ponta de 8mm15024-10
Estudante Halsey Porta-agulhasFerramentas Fine Science91201-133 necessários: 2 para segurar afastadores de pele e 1 para suturar a pele
SacaroseThermo ScientificA15583.36Para validação de modelo
Câmera Universal Suporte de TetoMed Associates, IncENV-598Para validação
de modelo banho-mariaVWR89032-226Para validação de modelo
validação de modelo Curvo Tesoura de Mola

Referências

  1. Tuo, Q. Z., Zou, J. J., Lei, P. Rodent models of vascular cognitive impairment. J Mol Neurosci. 71 (5), 1-12 (2021).
  2. Zhou, Z., et al. Deeper cerebral hypoperfusion leads to spatial cognitive impairment in mice. Stroke Vasc Neurol. 7 (6), 527-533 (2022).
  3. Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
  4. Hattori, Y., et al. A novel mouse model of subcortical infarcts with dementia. J Neurosci. 35 (9), 3915-3928 (2015).
  5. Janson, J., et al. Increased risk of type 2 diabetes in Alzheimer disease. Diabetes. 53 (2), 474-481 (2004).
  6. Herzig, M. C., et al. Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis. Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).
  7. Miao, J., et al. Cerebral microvascular amyloid beta protein deposition induces vascular degeneration and neuroinflammation in transgenic mice expressing human vasculotropic mutant amyloid beta precursor protein. Am J Pathol. 167 (2), 505-515 (2005).
  8. Moechars, D., et al. Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain. J Biol Chem. 274 (10), 6483-6492 (1999).
  9. Wallays, G., et al. Notch3 Arg170Cys knock-in mice display pathologic and clinical features of the neurovascular disorder cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (12), 2881-2888 (2011).
  10. Cognat, E., Cleophax, S., Domenga-Denier, V., Joutel, A. Early white matter changes in CADASIL: evidence of segmental intramyelinic oedema in a pre-clinical mouse model. Acta Neuropathol Commun. 2, 49(2014).
  11. Weng, Z., et al. A novel needle mouse model of vascular cognitive impairment and dementia. J Neurosci. 43 (44), 7351-7360 (2023).
  12. Biesbroek, J. M., Biessels, G. J. Diagnosing vascular cognitive impairment: Current challenges and future perspectives. Int J Stroke. 18 (1), 36-43 (2023).
  13. Winklewski, P. J., et al. Understanding the physiopathology behind axial and radial diffusivity changes-what do we know. Front Neurol. 9, 92(2018).
  14. Jing, Z., et al. Neuronal NAMPT is released after cerebral ischemia and protects against white matter injury. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (10), 1613-1621 (2014).
  15. Yang, S. T., et al. Adult mouse venous hypertension model: common carotid artery to external jugular vein anastomosis. J Vis Exp. (95), e50472(2015).
  16. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral common carotid artery occlusion as an adequate preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to focal cerebral ischemia. J Vis Exp. (75), e4387(2013).
  17. Lee, D., et al. A murine model of ischemic retinal injury induced by transient bilateral common carotid artery occlusion. J Vis Exp. (165), (2020).
  18. Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. J Vis Exp. (69), e4124(2012).
  19. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral common carotid artery occlusion as an adequate preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to focal cerebral ischemia. J Vis Exp. (75), e4387(2013).
  20. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  21. Wellons, J. C., et al. A comparison of strain-related susceptibility in two murine recovery models of global cerebral ischemia. Brain Res. 868 (1), 14-21 (2000).
  22. Cao, G., et al. In Vivo delivery of a Bcl-xL fusion protein containing the TAT protein transduction domain protects against ischemic brain injury and neuronal apoptosis. J Neurosci. 22 (13), 5423-5431 (2002).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Modelo de Camundongo para Dem nciaHipoperfus o Cerebral Cr nicaLes o da Subst ncia BrancaImagem Cerebral por RMLabirinto Aqu tico de MorrisCamundongo com Comprometimento CognitivoEstenose Guiada por AgulhaImagem por Tensor de Difus o

Artigos relacionados