Isolamento mitocondrial robusto de tecido cardíaco de roedores

Resumo

Estudos bioenergéticos e metabolômicos sobre mitocôndrias revelaram seu papel multifacetado em muitas doenças, mas os métodos de isolamento para essas organelas variam. O método detalhado aqui é capaz de purificar mitocôndrias de alta qualidade de várias fontes de tecido. A qualidade é determinada pelas taxas de controle respiratório e outras métricas avaliadas com respirometria de alta resolução.

Resumo

O isolamento mitocondrial é praticado há décadas, seguindo procedimentos estabelecidos por pioneiros nas áreas de biologia molecular e bioquímica para estudar deficiências metabólicas e doenças. A qualidade mitocondrial consistente é necessária para investigar adequadamente a fisiologia e a bioenergética mitocondrial; no entanto, muitos métodos de isolamento publicados diferentes estão disponíveis para os pesquisadores. Embora diferentes estratégias experimentais exijam diferentes métodos de isolamento, os princípios e procedimentos básicos são semelhantes. Este protocolo detalha um método capaz de extrair mitocôndrias bem acopladas de uma variedade de fontes de tecido, incluindo pequenos animais e células. As etapas descritas incluem dissecção de órgãos, purificação mitocondrial, quantificação de proteínas e várias verificações de controle de qualidade. A principal métrica de controle de qualidade usada para identificar mitocôndrias de alta qualidade é a taxa de controle respiratório (RCR). O RCR é a razão entre a frequência respiratória durante a fosforilação oxidativa e a taxa na ausência de ADP. Métricas alternativas são discutidas. Embora altos valores de RCR em relação à sua fonte de tecido sejam obtidos usando este protocolo, várias etapas podem ser otimizadas para atender às necessidades individuais dos pesquisadores. Este procedimento é robusto e resultou consistentemente em mitocôndrias isoladas com valores de RCR acima da média em modelos animais e fontes de tecido.

Introdução

As mitocôndrias são organelas subcelulares que estabelecem condições energéticas citoplasmáticas otimizadas para funções celulares específicas. Embora os estudos em nível celular, tecidual e de organismo possam fornecer informações sobre a função mitocondrial, o isolamento das organelas oferece um nível de controle experimental que não seria possível de outra forma. Isolamentos mitocondriais têm sido realizados desde a década de 1940, permitindo estudos mecanicistas do metabolismo e da respiração em uma variedade de células e tecidos ^1,2. A relevância histórica das mitocôndrias também está bem documentada³. Como principais produtoras de ATP, as mitocôndrias desempenham muitos papéis importantes que são vitais para a função celular e orgânica ideal⁴. Dentro da matriz mitocondrial, os substratos são oxidados pelo ciclo do TCA, produzindo equivalentes redutores e portadores de elétrons móveis, como NADH e UQH₂ ^5,6. O citocromo C é o terceiro principal transportador de elétrons móveis na rede de reação bioquímica mitocondrial⁷. Essas moléculas são então oxidadas pelos complexos transmembranares do sistema de transporte de elétrons (ETS) embutidos na membrana mitocondrial interna⁸. As reações redox do ETS são acopladas à translocação de prótons da matriz para o espaço intermembranar. Esses processos estabelecem um gradiente eletroquímico de prótons que é usado para fosforilar ADP com Pi por F₁F₀ ATP sintase para produzir ATP ^9,10. Os processos individuais que ocorrem em cada complexo podem ser explorados com respirometria de alta resolução usando eletrodos do tipo Clark ou ensaios de consumo de oxigênio em microplacas^11,12. Além disso, modelos de doenças e tratamentos usando mitocôndrias isoladas podem determinar o impacto ou a importância da função mitocondrial na progressão de certas patologias. Isso tem se mostrado frutífero no campo da cardiologia, onde alterações na liberação de combustível e substrato têm sido usadas para elucidar como a disfunção mitocondrial influencia a insuficiência cardíaca 13,14,15,16. As mitocôndrias também são conhecidas por impactar o desenvolvimento de outros estados de doença, como diabetes, câncer, obesidade, distúrbios neurológicos e miopatias^17,18. Portanto, o uso de mitocôndrias isoladas ou purificadas permite investigações mecanicistas do metabolismo oxidativo e da produção de ATP no tecido de origem.

Não faltam protocolos de isolamento mitocondrial devido à sua importância na pesquisa bioenergética. Além disso, métodos altamente específicos adaptados a subpopulações de mitocôndrias dentro de tecidos e células podem ser encontrados^19,20. As etapas processuais básicas são semelhantes entre os métodos de isolamento, mas variações podem ser feitas na composição do tampão, etapas de homogeneização e spins de centrifugação para melhorar a quantidade e a qualidade das mitocôndrias. As alterações nesses aspectos são baseadas na demanda metabólica do tecido, função geral do órgão, densidade mitocondrial e outros fatores. Em tecidos como fígado e músculo esquelético, homogeneizadores portáteis são usados para preservar a integridade mitocondrial e limitar os danos às membranas mitocondriais²¹. No entanto, ao isolar dos rins, alguns protocolos sugerem o uso de homogeneização manual ou kits comerciais para obter melhores resultados²². Embora ambos os métodos produzam mitocôndrias funcionais, a qualidade das organelas pode ser comprometida pelo tempo adicional necessário para concluir os isolamentos usando esses protocolos. A centrifugação também é vital para a extração da proteína mitocondrial, pois separa componentes celulares, como núcleos e outras organelas, das mitocôndrias²³. Durante o processo de isolamento, é debatido se a centrifugação diferencial ou baseada em densidade deve ser implementada para obter isolados mais puros²⁴. Embora a centrifugação por densidade possa separar as mitocôndrias de organelas de gravidade específica semelhante, como os peroxissomos, não está bem estabelecido se as mitocôndrias desses métodos representam melhor a função da organela in situ em comparação com as mitocôndrias isoladas usando centrifugação diferencial. No campo da fisiologia mitocondrial, a centrifugação baseada em densidade é preferida e pode ser facilmente alterada para aumentar a pureza do isolado. Se as mudanças nas forças g, na duração da centrifugação e no número de spins de centrifugação são incorporadas devem ser consideradas antes da experimentação devido à sua influência na purificação mitocondrial. Além disso, a ressuspensão mitocondrial, indiscutivelmente a etapa mais crucial durante o isolamento, difere muito entre os estudos, com o uso de raspagem, mistura baseada em vórtice ou homogeneização 23,25,26. A ressuspensão mecânica desses tipos pode ser muito abrasiva e prejudicar a integridade da membrana das mitocôndrias. Por esse motivo, deve-se realizar uma lavagem suave para corrigir isso. Apesar da infinidade de modulações e metodologias sugeridas, existem menos protocolos abrangentes com alta reprodutibilidade e adaptabilidade para modelos de roedores.

Os métodos aqui descritos descrevem um protocolo detalhado, robusto e altamente reprodutível que produz mitocôndrias purificadas e bem acopladas a partir de tecido cardíaco de pequenos animais. Conforme demonstrado, este método pode ser facilmente adaptado para acomodar as necessidades específicas de cada experimento e/ou ambiente de laboratório para isolar mitocôndrias de rins, fígado e células cultivadas. Outras modificações podem ser feitas para isolar as mitocôndrias de tecidos e outros animais não listados aqui. As receitas de buffer usadas para todos os isolamentos são fornecidas e podem ser modificadas, se necessário. Semelhante a outros protocolos publicados, a homogeneização motorizada e a centrifugação diferencial são implementadas; no entanto, são feitos ajustes no tempo de cisalhamento e na força com que as amostras são centrifugadas para fornecer consistentemente isolados mitocondriais de alta qualidade, dependendo da fonte de isolamento. Notavelmente, este protocolo difere de outros por usar lavagem suave por pipetagem para ressuspender as mitocôndrias peletizadas, o que ajuda a preservar a integridade da membrana mitocondrial e manter a funcionalidade geral das organelas. A proteína mitocondrial é quantificada pela determinação da proteína total ou pela medição da atividade da citrato sintase. A utilidade e a ampla aplicabilidade deste método de isolamento são ainda mais apoiadas pelos valores das taxas de controle respiratório (RCR) alcançados em vários organismos e fontes de tecido.

Protocolo

O uso e o tratamento de todos os animais vertebrados foram realizados de acordo com protocolos aprovados, revisados e aceitos pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Michigan State University. Este protocolo foi projetado usando cobaias albinas Hartley machos e fêmeas e ratos Sprague Dawley (SD). Para o isolamento das mitocôndrias cardíacas de cobaias, os animais foram sacrificados com idades entre 4-6 semanas (300-450 g). As mitocôndrias cardíacas de ratos SD de ambos os sexos foram obtidas entre as idades de 10-13 semanas (250-400 g). As receitas para tampões são descritas na Tabela 1 e devem ser preparadas com antecedência. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação experimental

1. Antes de iniciar o isolamento, rotule dois tubos de centrifugação de 50 mL como "Spins 1 e 2" e "Spin 3".
2. Coloque tubos, tampão de isolamento (IB) recém-descongelado, tesoura de picar afiada, sonda de homogeneização montada e um copo de 5 mL ou recipiente de tamanho equivalente no gelo.
3. Coloque o tampão respiratório (RB) recém-descongelado em uma incubadora para aquecer para ensaios respiratórios subsequentes.
4. Pré-arrefecer uma centrífuga refrigerada a 4 °C.
5. Certifique-se de que todo o equipamento esteja disposto e 20 μL de protease 7-15 U/mg de Bacillus licheniformis tenham sido adicionados ao tubo rotulado como "Spins 1 e 2".
6. Configure um sistema de pressão dependente da gravidade para perfusão por canulação usando tampão de cardioplegia (CB, Tabela 1), cânula de vidro e tubo de plástico com uma válvula de torneira acoplada.
7. Organize as ferramentas cirúrgicas e inclua tesouras e fórceps adequados para dissecção e canulação do coração.
   NOTA: Toda a água deve ser de qualidade pura (18,2 MΩ · cm)

2. Dissecção de tecido

1. Injetar os animais com sulfato de heparina estéril por via intraperitoneal na dose de 500 U/kg.
2. Deixe o animal sentar na câmara de indução por 15 minutos após a administração de heparina. Durante esse período, forneça 2 L/min de gás O₂ puro para oxigenar totalmente os animais, acalmá-los e minimizar qualquer estresse que possa ter consequências adversas no tecido de interesse.
3. Inicie a indução anestésica por um fluxo contínuo de isoflurano a 0,5%. Após 1 min, aumente para 1%. Continue a aumentar 1% a cada minuto até que 5% seja alcançado. Uma vez a 5%, aguarde 1 min e monitore o padrão respiratório do animal.
4. Uma vez que a respiração tenha diminuído e se torne difícil (aproximadamente na marca de 6,5 minutos), desligue o isoflurano e o fluxo de oxigênio.
5. Remova rapidamente o animal da câmara de indução e verifique a profundidade anestésica apropriada apertando uma pata e verificando o reflexo da córnea. Se o animal responder a qualquer um dos estímulos, coloque-o de volta na câmara de indução, readministre a anestesia e repita a verificação da profundidade do anestésico.
6. Uma vez atingida a profundidade adequada da anestesia, decapite rapidamente com uma guilhotina para cortar a coluna cervical e colocar o corpo em decúbito ventral no gelo.
7. Faça duas incisões verticais paralelas das clavículas ao longo da caixa torácica lateral ao longo do comprimento do tórax. Certifique-se de que as incisões sejam profundas o suficiente para cortar as costelas na lateral do tórax, mas evite danificar as estruturas intratorácicas, como o coração ou os grandes vasos.
   NOTA: Os tamanhos das incisões verticais dependem do animal que está sendo usado. Se estiver usando cobaias e ratos, corte no diafragma (aproximadamente 6,35 cm para ratos e 11 cm para porquinhos-da-índia). Se estiver usando camundongos, faça uma toracotomia padrão²⁷.
8. Exponha o coração usando um hemostático para deslocar o tórax anterior e encha a cavidade torácica exposta com gelo. Esta etapa minimiza o tempo de isquemia quente e aumenta a viabilidade das organelas isoladas.
9. Use uma pinça para dissecar sem rodeios o timo e o pericárdio e expor totalmente o coração.
10. Usando uma pinça, aplique uma tração inferior suave no coração para expor e identificar a aorta. A aorta é o grande vaso mais espesso que se ramifica da base do coração. Outros vasos grandes, como a veia pulmonar, são visivelmente mais translúcidos que a aorta.
11. Corte a aorta aproximadamente 4-6 mm acima da raiz da aorta, mas abaixo dos pontos de ramificação da carótida.
12. Canular a aorta e perfundir o coração ^28,29 com solução de cardioplegia (CB) gelada usando uma cabeça de pressão dependente da gravidade até que as artérias coronárias estejam livres de sangue e o órgão pareça pálido.
    NOTA: Para roedores grandes, um diâmetro de cânula de 1,8-2,2 mm funciona bem, enquanto para roedores menores, recomenda-se uma faixa de diâmetro de 1,4-1,8 mm. A retroperfusão não deve levar mais do que 15-30 s para que os vasos coronários limpem o sangue.
13. Isole o miocárdio ventricular dissecando os átrios, o tecido valvular cartilaginoso e os tecidos adiposos.
14. Coloque os ventrículos em um béquer pré-resfriado de 10 mL contendo 0,1-0,2 mL de IB gelado.
15. Pique o tecido com uma tesoura cirúrgica afiada até que as peças tenham aproximadamente 1 mm³.

3. Purificação mitocondrial e quantificação de proteínas

1. Transfira o tecido picado para o tubo de centrífuga pré-resfriado rotulado como "Spins 1 e 2" contendo a solução de protease.
2. Adicione IB gelado a um volume final de 25 mL.
3. Usando um homogeneizador rotor-estator portátil motorizado, disperse o tecido a 18.000 rpm em gelo por 20-25 s.
4. Centrifugue o tecido homogeneizado em um tubo rotulado como "Spins 1 e 2" a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C.
5. Descarte o sobrenadante (que contém protease) despejando-o no garrafão de resíduos e enxágue suavemente o pellet com 5 mL de IB para remover a protease residual.
6. Depois de descartar o enxágue, ressuspenda o pellet com IB fresco gelado até um volume final de 25 mL por vórtice suave.
7. Centrifugue a 800 x g durante 10 min a 4 °C.
8. Remova o sobrenadante (contém mitocôndrias) despejando-o suavemente em um tubo pré-resfriado de 50 mL rotulado como "Spin 3". Ao despejar, tome cuidado para evitar desalojar a parte superior solta do pellet. Como alternativa, uma pipeta ou stripette de transferência pode ser usada para coletar o sobrenadante.
9. Centrifugar o sobrenadante a 8000 x g durante 10 min a 4 °C.
10. Descarte o sobrenadante resultante e retenha o pellet contendo mitocôndrias.
11. Use um pano sem fiapos para absorver o excesso de sobrenadante da parede interna do tubo, tomando cuidado para evitar perturbar o pellet. Mantenha o pellet a 4 °C no gelo o máximo possível.
12. Para ressuspender as mitocôndrias, adicione 80 μL de IB gelado ao fundo do tubo. Ressuspenda suavemente o pellet lavando repetidamente o IB sobre o pellet.
13. Para evitar a criação de bolhas, defina uma micropipeta para aspirar e fornecer entre 40-60 μL de volume.
14. À medida que o pellet mitocondrial se dispersa, aumente o volume da micropipeta para ressuspender eficientemente as mitocôndrias peletizadas. Evite tocar no pellet com a ponta da pipeta e evite fazer bolhas.
15. Uma vez ressuspensas, transfira as mitocôndrias para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado e rotule-o como mitocôndrias padrão. Anote o volume total de ressuspensão.
16. Para determinar a concentração de proteína mitocondrial na amostra, realize um ensaio de proteína total usando os conhecidos ensaios de proteína BCA ou Bradford, conforme definido pelas instruções do fabricante.
    NOTA: Uma estratégia alternativa ou complementar para avaliar o rendimento é determinar a atividade da citrato sintase. Para referência, o conteúdo mitocondrial pode ser quantificado seguindo o protocolo descrito em Vinnakota et ^al.30.

4. Verificações de controle de qualidade

1. Em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado, dilua o estoque mitocondrial até a concentração de trabalho desejada com IB.
   NOTA: Os estoques mitocondriais são diluídos a 40 mg / mL para trabalhar na concentração final de 0,1 mg / mL para ensaios de respirometria ao usar isolados de tecido cardíaco.
2. Enxágue as câmaras do oxígrafo, as rolhas e as seringas de microlitros dez vezes com água destilada para limpá-las antes de usá-las em ensaios de respirometria.
3. Para testar a viabilidade e a qualidade dos isolados mitocondriais, carregue 2,3 mL de tampão respiratório (RB) nas câmaras do oxígrafo e permita que o sinal de consumo de oxigênio se equilibre a 37 ° C por cerca de 10 min ou quando a taxa estiver próxima de 0.
4. Uma vez que o sinal esteja equilibrado, empurre para baixo as rolhas e aspire o excesso de tampão que emerge do capilar da rolha.
5. Adicione 1 mM de EGTA usando uma seringa de microlitro para quelar qualquer cálcio residual nos tampões ou na amostra mitocondrial.
6. Para alimentar a respiração, adicione 5 mM de piruvato de sódio e 1 mM de L-malato.
7. Após a adição de substratos, adicione um bolo de mitocôndrias diluídas para atingir a concentração de trabalho e permitir que a respiração ocorra por 5 min. Este período é denominado VAZAMENTO ou respiração Estado 2.
8. Na marca de 5 minutos, adicione um bolus de 500 μM de ADP para iniciar a respiração do Estado 3, também denominado OXHPOS, e permita que as mitocôndrias respirem até a anóxia.
9. Calcule a taxa de controle respiratório (RCR) dividindo a taxa máxima de consumo de oxigênio durante o Estado 3 pela taxa de consumo de oxigênio imediatamente antes da adição de ADP no Estado 2 (ver Figura 1).
   NOTA: Uma expressão RCR alternativa de 1 - 1/RCR também pode ser usada como uma métrica de qualidade, que é limitada entre 0 e 1; no entanto, dificulta a diferenciação da qualidade usando essa métrica quando o RCR > 10 (consulte a Figura 2).
10. Enxágue as câmaras e rolhas 10 vezes com água pura para limpar o oxígrafo para ensaios subsequentes. Se a respirometria estiver completa, encha as câmaras com etanol a 70% e coloque as rolhas nas câmaras até o próximo uso.

Resultados

Após a conclusão do isolamento mitocondrial, a qualidade e a funcionalidade dos isolados devem ser testadas através da quantificação das taxas de consumo de oxigénio (J_O2) utilizando respirometria de alta resolução. Para isso, os estoques mitocondriais foram diluídos a 40 mg/mL para permitir concentrações de trabalho de 0,1 mg/mL em 2 mL de RB para todos os ensaios de respirometria usando mitocôndrias cardíacas isoladas. A respiração foi alimentada por piruvato de sódio 5 mM e L-malato 1 mM na presença de EGTA 1 mM, um quelante de cálcio, e foi deixada em equilíbrio por 5 min para estabelecer a respiração do Estado 2. Durante esse estado, as taxas de consumo de oxigênio devem ser em média 45-55 pmol/mL/s ou 27-33 nmol/mg/min. Esteja ciente da taxa de consumo de oxigênio dependente do eletrodo e execute as correções de fundo apropriadas quando necessário. A fosforilação oxidativa (Estado 3) é iniciada na marca de 5 minutos por um bolus de 500 μM de ADP. As adições de substrato e o rastreamento representativo são detalhados na Figura 1. As mitocôndrias funcionais terão um aumento imediato de J_O2 após a adição de ADP, que varia de acordo com a fonte tecidual, conforme mostrado na Figura 2. Sem o uso de EGTA, o cálcio residual tem efeitos variáveis nas taxas máximas de J_O2 durante o OXPHOS, dependendo da concentração mitocondrial, disponibilidade de substrato e outros fatores ambientais. A composição do tampão é importante para a preservação da integridade e funcionalidade da membrana mitocondrial. Todas as receitas tampão mencionadas ao longo do protocolo são detalhadas na Tabela 1 e podem ser utilizadas para todas as preparações mitocondriais aqui descritas.

O isolamento bem-sucedido das mitocôndrias é denotado pela obtenção de valores de RCR que estão dentro do intervalo determinado para cada espécie e fonte de tecido, conforme mostrado na Tabela 2. Com base nos dados coletados usando este protocolo, se isolar mitocôndrias cardíacas de cobaias, ratos ou camundongos, os RCRs devem ser ≥16, ≥8 e ≥5, respectivamente. Se estiver isolado do fígado ou rim de rato, os RCRs devem ser ≥6, enquanto os RCRs das células são considerados aceitáveis se estiverem acima de 3,8. Se os valores de RCR caírem abaixo dessas faixas ou se houver diferenças qualitativas nos traçados da respirometria, recomenda-se que um ensaio adicional com novo RB e substratos seja realizado para descartar problemas de contaminação. Embora a transformação 1-1/RCR limite valores entre 0 e 1, essa métrica não é recomendada ao comparar a qualidade mitocondrial entre sexos ou espécies quando o valor de RCR é maior que 10. Por esse motivo, os valores padrão de RCR (Estado 3/Estado 2 ou OXPHOS/LEAK) foram quantificados durante toda a experimentação. As informações sobre as modulações que podem ser feitas neste protocolo para isolar melhor as mitocôndrias de corações, fígado, rins e células de camundongos estão detalhadas na Tabela 3.

Figura 1: Regiões de interesse para verificações de controle de qualidade usando respirometria de alta resolução. As câmaras respiratórias foram carregadas com 2 mL de RB e deixadas em equilíbrio a 37 °C até que a taxa de consumo de oxigênio estivesse próxima de 0. Uma vez equilibrado, 1 mM de EGTA, um quelante de cálcio, foi adicionado junto com 5 mM de piruvato de sódio e 1 mM de L-malato. Após a adição desses substratos, as mitocôndrias foram adicionadas na concentração de trabalho desejada (0,1 mg / mL) e deixadas respirar por 5 min para atingir a respiração do Estado 2 (amarelo). Na marca de 5 minutos, 500 μM de ADP foi adicionado para iniciar a respiração do Estado 3 (vermelho). Os RCRs foram determinados pela média do tempo das taxas de consumo de oxigênio indicadas pelas caixas vermelha e amarela para comparar o Estado 3 com o Estado 2. O estado 4 é indicado pela caixa verde e representa o período de hidrolisação extramitocondrial da ATPase do ATP e pode ser usado para avaliar a integridade da membrana externa em ensaios do citocromo C. Os dados exibidos foram coletados usando mitocôndrias cardíacas de ratos SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Traçados representativos de J_O2 e taxas de controle respiratório em fontes animais e de tecidos. A qualidade das mitocôndrias isoladas foi testada quantificando as taxas de consumo de oxigênio usando respirometria de alta resolução. A respiração foi alimentada por piruvato de sódio 5 mM e L-malato 1 mM na presença de EGTA 1 mM. As mitocôndrias e substratos foram deixados respirar por 5 min para que a respiração do Estado 2 se estabilizasse. As taxas máximas de consumo de oxigênio após a adição de ADP foram comparadas com as taxas de consumo de oxigênio do Estado 2 antes do ADP para calcular as taxas de controle respiratório (RCRs) para cada tecido. A qualidade mitocondrial foi avaliada ainda mais pelo cálculo dos valores de 1-1 / RCR conforme caracterizado pelos padrões de eficiência de controle PL. Os gráficos de barras à direita de cada traçado denotam RCR médio masculino (azul) e feminino (verde) e os valores de RCR 1-1 / RCR ± DP para um determinado tecido. (A), (B) e (C) referem-se a dados coletados usando cobaias, ratos Sprague Dawley (SD) e corações de camundongos com vírus da leucemia amiga B (FVB), respectivamente. (D) e (E) detalham os resultados do fígado e rim de ratos SD, enquanto (F) se refere a células HEK293. Os três lobos maiores do fígado foram coletados, enquanto ambos os rins foram usados para isolamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Receitas de buffer. O tampão de cardioplegia (CB), o tampão de isolamento (IB) e o tampão respiratório (RB) usados durante todo o processo de isolamento devem ser preparados com antecedência de acordo com as instruções listadas. O CB pode ser armazenado por até um mês a 4 °C, enquanto o IB e o RB podem ser mantidos por 4 meses a -80 °C. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Análise da razão de controle respiratório. O isolamento mitocondrial para análises funcionais foi realizado em uma ampla gama de espécies e fontes de tecido em roedores machos e fêmeas, bem como em células HEK293. O tamanho da amostra de cada sexo, fonte de tecido e espécie é detalhado junto com os valores médios de RCR e 1-1 / RCR ± SD. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Modulações recomendadas para o protocolo de isolamento mitocondrial para diferentes tecidos para aumentar o rendimento de proteínas. As alterações nas quantidades de protease e centrifugações são exibidas de acordo com a fonte do tecido. As quantidades médias de proteína total (mg) foram calculadas a partir dos resultados do ensaio de proteína BSA e do volume de ressuspensão do pellet mitocondrial final. Os valores são relatados como a média ± DP. As instruções em negrito incluídas na coluna de centrifugação informam se o sobrenadante deve ser descartado, retido ou agrupado. O descarte refere-se ao descarte do sobrenadante em um recipiente de resíduos biológicos, enquanto a retenção e o agrupamento referem-se à transferência do sobrenadante para o tubo de centrifugação seguinte ou à coleta para a centrifugação final, respectivamente. Mais detalhes sobre alterações no protocolo podem ser encontrados na seção de discussão. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

A adesão aos métodos descritos de forma concisa neste protocolo garantirá o isolamento de mitocôndrias bem acopladas do tecido cardíaco de pequenos roedores, além de outros tipos e fontes de tecido. No geral, o processo deve levar um total de 3-3,5 h, durante o qual todos os tecidos animais, amostras e isolados devem permanecer no gelo a 4 ° C, tanto quanto possível, para limitar a degradação. Esse procedimento é robusto e pode ser alterado de várias maneiras para melhor se adequar aos objetivos experimentais e aos modelos utilizados. Uma modulação que pode ser feita durante o processo de dissecção tecidual é a exclusão da heparina. A heparina é administrada para prevenir a formação de coágulos sanguíneos³¹ , mas não é necessária se o coração for canulado e perfundido com rapidez suficiente (dentro de 1,5 min após a decapitação). Além disso, a perfusão do coração usando CB é recomendada para roedores maiores, portanto, ao trabalhar com corações de camundongos ou outros órgãos, é aconselhável incluir lavagens de IB antes da picagem e homogeneização inicial. Esta etapa permite que o sangue transportado do processo de dissecação seja descartado. Outras mudanças incluem alterações nas velocidades de homogeneização e centrifugação para aumentar o rendimento de proteína mitocondrial. Os descritos acima são para isolar mitocôndrias cardíacas de cobaias e ratos. É importante ressaltar que este protocolo pode ser adaptado para isolar mitocôndrias de fígado, rins, corações e células de roedores. As alterações recomendadas para o volume de protease, homogeneização e centrifugação com base em tipos específicos de tecidos e animais são detalhadas na Tabela 3.

Após a formação do pellet mitocondrial purificado a partir da etapa final de centrifugação, as mitocôndrias devem ser ressuspensas em IB pré-resfriado. O volume de IB adicionado depende do tamanho do pellet mitocondrial, mas é de cerca de 80 μL para cobaias e ratos. Se isolar de corações de camundongos, 60 μL de IB são adicionados para ressuspensão. Ao isolar as mitocôndrias pela primeira vez, é aconselhável adicionar volumes menores de IB para não diluir a solução estoque. Devido à consistência dos grânulos mitocondriais formados após a purificação de amostras do fígado e dos rins, muito menos IB (20 μL) deve ser adicionado para ressuspensão. Outros métodos sugerem o uso de ressuspensão mecânica por raspagem que pode ser abrasiva para as membranas mitocondriais e diminuir a integridade geral^32,33. Ao usar este protocolo, recomenda-se lavar suavemente o pellet com IB para melhorar a qualidade das mitocôndrias. Durante esse processo, tome cuidado para evitar a produção de bolhas ou perturbar o pellet com a ponta da pipeta, pois isso pode levar à ruptura da membrana e ao dobramento incorreto das proteínas³⁴. Apenas empurrar para a primeira parada da pipeta pode ajudar a reduzir a probabilidade de formação de bolhas. A lavagem suave da pipeta deve ser feita até que todo o pellet esteja em suspensão. O rendimento total de ressuspensão deve ser de 150-200 μL para mitocôndrias cardíacas de cobaias e ratos e aparecer na cor marrom claro. Amostras mais concentradas terão um tom mais escuro de marrom e podem ser diluídas para se adequar à faixa de concentração de trabalho desejada após a quantificação da proteína mitocondrial.

Os ensaios de proteína padrão usando BSA são ideais para quantificação de proteínas mitocondriais³⁵. Os ensaios de proteínas devem ser adiados e incubados durante as durações e temperaturas recomendadas, conforme definido pelo protocolo do fabricante. Para mitocôndrias isoladas, a incubação a 37 ° C por 30 min permite o desenvolvimento de cores bem espalhadas e a quantificação precisa de proteínas. Ao quantificar a quantidade total de proteína, recomenda-se inicialmente diluir as mitocôndrias ressuspensas e o IB nas proporções de 1:50, 1:100 e 1:200 para garantir que os resultados do ensaio de proteína estejam dentro da faixa de calibração. Mais detalhes sobre como conduzir ensaios de proteína usando BSA como padrão são fornecidos de acordo com o kit do fabricante, portanto, as recomendações listadas aqui podem não ser aplicáveis. Um ensaio de CS também deve ser realizado para determinar o conteúdo mitocondrial em cada amostra. Este ensaio está bem estabelecido e permite uma maior normalização se estudar as diferenças biológicas entre os subtipos mitocondriais³⁶.

Após a determinação das proteínas, o stock mitocondrial deve ser diluído para atingir a concentração final de trabalho desejada para os ensaios de respirometria. As mitocôndrias isoladas de corações de cobaias e ratos são diluídas a 40 mg / mL, e 5 μL desse estoque são adicionados à câmara respiratória para resultar em uma concentração de trabalho de 0,1 mg / mL. Se isolar de corações de camundongos individuais ou de rins e fígado, a diluição do estoque mitocondrial pode não ser necessária. Volumes maiores de mitocôndrias também podem ser adicionados para obter as concentrações desejadas. Taxas de consumo de oxigênio durante o Estado 2 entre 35-55 pmol/mL/s são aceitáveis para a maioria das análises de respirometria²⁸. Os detalhes relativos a como os RCRs são conduzidos e analisados são explicados na Figura 1 e na seção de resultados representativos; no entanto, é importante observar que a respiração é alimentada por piruvato e malato. Outras condições de substrato, como succinato e rotenona, resultarão em diferentes valores de RCR, uma vez que a relação P/O e outras variáveis bioenergéticas são diferentes³⁷. O uso de piruvato e malato como combustíveis respiratórios atinge uma rotatividade próxima da máxima do ciclo de TCA e a produção de equivalentes redutores; no entanto, a atividade máxima do ciclo de TCA e a função ETS acoplada são obtidas com 5 mM de piruvato, 1 mM de L-malato e 20 mM de succinato. Ao estimular a fosforilação oxidativa para quantificar as taxas de consumo de oxigênio durante o Estado 3, o ADP é adicionado em concentrações pelo menos 10 vezes o K_D estimado para ADP do translocador de nucleotídeo de adenina³⁸. Isso pode ser alcançado por bolus maiores que 350 μM ADP, e é por isso que 500 μM foi usado em todos os ensaios experimentais. Se a duração do Estado 3 for muito curta, concentrações mitocondriais mais baixas podem ser usadas para prolongá-lo. Para uma análise mais aprofundada da respiração, modulações podem ser feitas na concentração de ADP que é introduzida no sistema para melhor se ajustar aos parâmetros experimentais³⁹. Ao desenvolver este protocolo pela primeira vez, um ensaio de citocromo C foi usado para avaliar a integridade da membrana externa dos isolados mitocondriais⁴⁰. Se os valores de RCR estiverem abaixo dos intervalos esperados, realize o teste do citocromo C para avaliar se o dano à membrana externa é significativo. Para fazer isso, adicione 10 μM de citocromo C à câmara respiratória e confirme se o aumento da respiração está abaixo de 5 ou 10% da taxa do Estado 4. Os intervalos esperados são encontrados em estudos publicados anteriormente e são específicos de espécies, tecidos e substratos. Se a adição do citocromo c estimular a respiração do Estado 4 acima de 10%, o último giro de 8.000 x g pode ser repetido para remover as mitocôndrias danificadas. Dito isso, o dano à membrana externa pode fazer parte de um fenótipo de doença e, portanto, o teste do citocromo C deve ser interpretado com isso em mente⁴¹. Uma vez obtidos valores de RCR consistentemente altos com efeitos estimulados pelo citocromo C baixos (<10%), este teste só se torna necessário e recomendado se os valores de RCR estiverem fora dos intervalos aceitáveis. Se o teste do citocromo C for <10% e os valores de RCR estiverem fora da faixa esperada, conforme detalhado na Tabela 2, repita o ensaio de respirometria com novo RB após lavagem com água destilada 10 vezes. Se as taxas diminuídas ainda forem observadas, novos reagentes (piruvato, malato, EGTA e ADP) precisam ser feitos para diagnosticar o problema. Além disso, os ensaios do citocromo C podem ser conduzidos por meio de ELISAs e uso de corantes mitocondriais, como TMRE^33,42. Dependendo do tipo e fonte de tecido, essas opções podem ser mais adequadas para determinar a integridade da membrana externa.

Embora não haja grandes limitações deste protocolo sendo usado para isolar mitocôndrias cardíacas, é importante observar que certas considerações devem ser feitas ao utilizar esses métodos. A qualidade dos isolados mitocondriais é muito afetada pela temperatura e pelo tempo necessário para perfundir o coração e ressuspender o pellet purificado. Assim, a familiaridade com esses processos pode ser necessária para obter RCRs comparáveis aos relatados aqui. Além disso, a composição dos tampões e soluções utilizadas durante o processo de isolamento é importante, pois afeta diretamente a integridade e a função mitocondrial⁴³. Os tampões listados na Tabela 1 são fornecidos como referências e permitiram o isolamento de mitocôndrias bem acopladas em uma variedade de fontes de tecido, mas alterações podem ser feitas para limitar a quantidade de cloreto nas análises de respiração, pois isso pode interferir na translocação de nucleotídeos de adenina e na função ETS²⁸. A composição do tampão também pode ser alterada para isolar melhor as mitocôndrias do fígado. Como o fígado é rico em concentrações de ácidos graxos, é aconselhável que o órgão e o tecido picado sejam lavados com um tampão contendo concentrações elevadas de BSA se forem observados RCRs fora da faixa esperada. Embora a qualidade dos isolados mitocondriais obtidos de cortes hepáticos seja bem acoplada e consistente, essa alteração pode resultar em melhora da função das organelas. Também deve ser reconhecido que o isolamento de mitocôndrias de células utilizando esses métodos requer uma grande quantidade de células cultivadas, o que representa uma limitação potencial. Além disso, este protocolo não foi projetado especificamente para isolados celulares, mas provou ser bem-sucedido quando implementado. Portanto, métodos de isolamento direcionados para células cultivadas podem ser mais úteis. Alternativamente, para avaliar a qualidade mitocondrial, os pesquisadores podem optar por sondas fluorescentes para calcular RCRs. Os métodos espectrofluorométricos são uma escolha popular, especialmente se quantidades menores de proteína estiverem sendo extraídas^44,45.

No geral, este protocolo pode ser usado para isolar consistentemente mitocôndrias cardíacas bem acopladas de pequenos animais, como cobaias e ratos. Ele pode ser facilmente modificado para aumentar a produção de proteínas, alterando as velocidades de homogeneização, tempos de centrifugação e número de spins para permitir o isolamento mitocondrial de corações, fígado, rins e células de camundongos. Além disso, este protocolo é geral e robusto o suficiente para ter sido usado para investigar a função mitocondrial de espécies não mamíferas, como a lampreia marinha⁴⁶, bem como realizar análises estruturais usando microscopia clássica e crioeletrônica^40,47. Embora muitos estudos recentes se concentrem na exploração do comportamento mitocondrial em sistemas celulares e teciduais intactos, a amplitude e a profundidade das informações extraídas de mitocôndrias isoladas usando esses métodos revelam impactos na metabolômica, estresse oxidativo e produção de ATP que nunca serão sem mérito. O isolamento de mitocôndrias bem acopladas permite que os pesquisadores investiguem aspectos-chave do desenvolvimento e progressão da doença que não são possíveis em modelos de células inteiras. Devido à versatilidade deste protocolo, alterações na energética mitocondrial observadas em patologias como doenças cardiovasculares, diabetes e distúrbios neurológicos podem ser exploradas usando a metodologia aqui descrita.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL Copo
		de vidro de 10 mL	Para dissecação e picagem de órgãos
		centrífuga de 50 mL	Centrifugação
Adenosina 5'-difosfato monopotássio sal dihidratado	Sigma	A5285	Ensaios de Respirometria
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Quantificação de proteínas mitocondriais
Dextrose	Sigma	DX0145	Para tampão (CB)
Etilenoglicol-bis(2-amino-etiléter)-N,N,N',N'-ácido tetracético	Sigma	E4378	Para tampões (CB e IB) e ensaios de respirometria
Cânula de vidro	Radnoti		perfusão cardíaca de porquinhos da Índia e ratos
Heparina sódio mucosa suína	Sigma	SRE0027-250KU	Injeção IP animal
Respirômetro de alta resolução Eletrodo			tipo Clark; oxígrafo com câmaras de 2 mL
Câmara
Isoflurano	Sigma	792632	Anestésico
Ácido L-málico	Sigma	02288-50G	Ensaios de respirometria
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma	M9272	Para tampão (RB)
Manitol	Sigma	MX0214	Para seringas
		microlitros	Tamanhos variando de 5– 50 µ L
		de microplacas	Deve ser capaz de incubar a 37 > C
MOPS	Sigma	475898	Para todos os buffers
O2 tanque
Homogeneizador OMNI THQ OMNI	International	12-500	Homogeneizadores de estator de rotor semelhantes funcionarão
pipetas			Volumes de  2– 20 µ L; 20– 200 µ L; 200– 1000 µ L
Cloreto de potássio	Sigma	P3911	Para tampões (RB e CB)
Fosfato de potássio dibásico	Sigma	795496	Para tampões (IB e RB)
Protease de Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Cloreto de sódio	Sigma	S9888	Para tampão (CB)
Piruvato de sódio	Biorreagentes Fisher	BP356-100	Ensaios de respirometria
Sacarose	Sigma	8510-OP	Para tampão (IB)
		de dissecção cirúrgica	Depende da fonte animal e do tecido
Centrífuga			Deve esfriar a 4 &graus; C