Determinando a função ciliar e a impermeabilidade da membrana do epitélio pseudoestratificado das vias aéreas pulmonares

Summary

A cultura de interface ar-líquido é comumente usada para desenvolver epitélio pseudoestratificado das vias aéreas, diferenciando células epiteliais brônquicas humanas normais primárias que imitam o lado apical das vias aéreas pulmonares. Aqui, descrevemos um protocolo fácil para determinar sua qualidade monitorando suas propriedades biofísicas, como função ciliar e integridade da membrana.

Abstract

A diferenciação de células epiteliais primárias das vias aéreas pulmonares na interface ar-líquido (LPA) é uma técnica popular para desenvolver um epitélio pseudoestratificado multicelular das vias aéreas que imita o lado apical das vias aéreas pulmonares. Embora a diferenciação das células primárias das vias aéreas pulmonares seja esperada, a avaliação das propriedades biofísicas, como função ciliar e impermeabilidade da membrana, fornece uma avaliação da qualidade do epitélio das vias aéreas e garante a confiabilidade do experimento. Aqui, descrevemos um protocolo simples para o desenvolvimento de epitélio pseudoestratificado multicelular das vias aéreas em cultura de LPA e avaliamos duas propriedades biofísicas importantes: função ciliar e impermeabilidade da membrana. Para determinar a função ciliar, capturamos o movimento ciliar de um epitélio diferenciado das vias aéreas de 4 semanas usando uma câmera de alta velocidade acoplada a um microscópio invertido, seguido pela quantificação da frequência de batimento ciliar (CBF) usando o sistema Simon Amon Video Analysis (SAVA). Também medimos a resistência elétrica transepitelial (TEER) usando um volt-ohmímetro para determinar a integridade da barreira epitelial do epitélio das vias aéreas.

Introduction

Doenças respiratórias crônicas, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e fibrose cística, são alguns dos principais problemas de saúde em todo o mundo¹. A prevalência de doenças respiratórias causadas por vírus como o vírus da influenza A humana, o vírus sincicial respiratório (VSR) e o coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) também causam ônus econômico e de saúde pública². Portanto, há uma imensa necessidade de desenvolver regimes de tratamento para doenças respiratórias que levam a danos irreversíveis nos tecidos respiratórios. O próprio tecido ep....

Protocol

O protocolo deve ser realizado em estado estéril sob uma capela de fluxo laminar de nível 2 de biossegurança (gabinete de biossegurança). Todos os meios e soluções devem ser descongelados a 37 °C antes da utilização. A centrifugação deve ser realizada a 4 °C. Todos os materiais utilizados no experimento devem ser estéreis. As células primárias (doador não identificado) foram obtidas em colaboração com a Dra. Kristina Bailey no Centro Médico da Universidade de Nebraska (UNMC), Omaha, NE. As células primárias são de doadores não identificados e as células não se enquadram no sujeito humano do NIH. As células foram obtidas sob um Acordo....

Results

Avaliamos a função ciliar e a impermeabilidade da membrana do epitélio das vias aéreas obtidas da diferenciação de células NHBE primárias de dois doadores independentes não identificados (dois adultos saudáveis, não fumantes, ou adultos com DPOC, acima de 50 anos de idade). Para determinar a função ciliar, determinou-se o FSC do epitélio diferenciado das vias aéreas de 28 dias. Observamos que o FSC atingiu pelo menos 3 Hz para ambos os epitélios das vias aéreas, o que foi comparável aos resultados publicados anteriorment.......

Discussion

O epitélio primário das vias aéreas humanas (cultura de LPA) é cada vez mais usado como modelo pulmonar in vitro para avaliações biológicas para investigar a função e os mecanismos e reduzir o uso de animais¹⁴. O ALI tem várias vantagens sobre qualquer cultura submersa monocamada. Por exemplo, fornece um epitélio pseudoestratificado semelhante a um tecido que imita o lado apical das vias aéreas pulmonares ^{6,7,14.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, EUA	14190-144
Meio de crescimento de células epiteliais das vias aéreas	PromoCell, Alemanha	C-21060
Anfotericina B	Thermo Fisher Scientific, EUA	15290-026
EVOM2 volt Ohmímetro	World Precision Instruments, EUA	Não aplicável
Solução de heparina	Tecnologias STEMCELL, EUA	07980
Estoque de hidrocortisona	Tecnologias STEMCELL, EUA	07926
Microscópio: Leica DMI8 (Microscópio Leica) com câmera de alta velocidade de 120f/s (Basler) associada ao microscópio. Microsope também fixado com incubadora de câmara de estágio i8.	Leica, EUA	Não aplicável
Penicilina-Estreptomicina	Corning, EUA	30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium	Tecnologias STEMCELL, EUA	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, EUA	5005
Sistema de análise de vídeo Sisson-Ammons (SAVA). Software V.2.1.15	Amson Engineering, EUA	Não aplicável