Procedimentos Operacionais e de Biocontenção de uma Instalação para Camundongos de Laboratório com Microbioma Natural: Procedimento de Imunofenotipagem

Resumo

Aqui, descrevemos a estrutura e os procedimentos operacionais, incluindo medidas de contenção microbiana de uma instalação para "camundongos selvagens" usando amostragem de sangue para imunofenotipagem como exemplo.

Resumo

O uso de camundongos de laboratório com um microbioma natural, como "camundongos selvagens", oferece uma ferramenta de pesquisa promissora para a ciência básica e aplicada devido à sua grande semelhança com o superorganismo humano. No entanto, a criação e manutenção desses camundongos, que abrigam um microbioma diversificado, incluindo bactérias, vírus e parasitas, representam desafios significativos para as instalações de criação de animais em instituições de pesquisa. Para enfrentar esses desafios, um conceito de instalação especializada foi desenvolvido para abrigar "ratos selvagens" na Charité - Universitätsmedizin Berlin. Essa abordagem envolveu o projeto de uma instalação com características estruturais específicas e protocolos operacionais para conter efetivamente o microbioma natural, protegendo assim áreas com padrões de higiene mais elevados.

Uma metodologia para amostragem de sangue de camundongos livres de patógenos especificados (SPF) e "Wildling" para imunofenotipagem é demonstrada, destacando o fluxo de trabalho e as medidas de biocontenção implementadas na instalação. Resultados notáveis revelam que "camundongos selvagens" expostos a um microbioma natural desenvolvem populações distintas de células imunológicas, que são significativamente reduzidas em camundongos criados e mantidos sob condições rigorosas de higiene.

A importância deste estudo reside em seu potencial para fornecer aos pesquisadores acesso a camundongos que possuem um microbioma natural e um sistema imunológico maduro semelhante ao dos adultos humanos. Essa abordagem pode melhorar a traduzibilidade dos achados pré-clínicos para a prática clínica, avançando assim no campo da pesquisa biomédica.

Introdução

A experimentação em camundongos ainda é indispensável na ciência básica e aplicada, como a pesquisa pré-clínica e toxicológica. No entanto, a padronização da higiene em ambientes laboratoriais, visando reduzir o ruído biológico e minimizar a variabilidade nos resultados experimentais, levou à exclusão da microbiota natural em grande medida. Assim, as condições sob as quais camundongos de laboratório higienicamente padronizados e livres de patógenos especificados (SPF) nascem e são mantidos diferem das condições do mundo real às quais humanos e animais são normalmente expostos. Essa incompatibilidade entre as condições laboratoriais e os ambientes naturais em que ocorrem as doenças humanas dá origem à "falácia da padronização": supor que minimizar a variação nas condições experimentais melhora os resultados translacionais. No entanto, na realidade, limita a relevância biológica dos achados ^1,2. Por exemplo, pesquisas mostraram que a ausência de diversidade microbiana e ambiental em camundongos com FPS pode resultar em um sistema imunológico subdesenvolvido, prejudicando a validade de estudos imunológicos e pré-clínicos³.

Várias abordagens foram propostas para lidar com a variação biológica em modelos de camundongos, cada uma com suas próprias vantagens e limitações, incluindo co-abitação com camundongos selvagens e pet shop 3,4,5,6,7,8, exposição sequencial a comensais 9, mantendo os animais em recintos ao ar livre¹⁰ ou em camas de animais grandes¹¹ e transplantes fecais de camundongos selvagens¹². Um novo modelo de camundongo promissor para pesquisa pré-clínica e toxicológica é o modelo "camundongos selvagens", que consiste em linhagens de camundongos de laboratório padrão que abrigam um microbioma natural¹³. Esses "camundongos selvagens" são gerados pelo transplante de embriões de linhagens de camundongos de laboratório para camundongos capturados na natureza. Durante o nascimento, as linhagens de camundongos de laboratório adquirem o microbioma natural de suas mães de aluguel, imitando a inoculação natural que ocorre durante o parto humano¹³. "Camundongos selvagens" podem ser criados como qualquer outra linhagem de camundongos de laboratório, com seu microbioma natural preservado ao longo de gerações.

"Camundongos selvagens" hospedam uma microbiota diversificada - incluindo bactérias, vírus e parasitas - que normalmente são excluídos das instalações de camundongos SPF. Consequentemente, manter um microbioma natural em instalações de pesquisa apresenta desafios, pois esses micróbios devem ser contidos sem comprometer os padrões gerais de higiene do FPS.

Na Charité - Universitätsmedizin Berlin, foi estabelecida uma instalação dedicada a "camundongos selvagens", separada das áreas SPF por medidas rígidas de biocontenção. A instalação inclui salas de reprodução e experimentação, garantindo que o microbioma natural dos "camundongos selvagens" seja mantido enquanto as áreas SPF são protegidas (Figura 1).

Os pares fundadores da colônia de Charité foram importados da colônia de "camundongos selvagens" estabelecida no Departamento de Pesquisa de Microbioma, Hospital Universitário de Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Alemanha. Eles são fornecidos com um certificado sanitário e monitorados com um painel estendido para patógenos zoonóticos antes da importação dos fundadores da colônia. Sentinelas serão usadas para monitorar o microbioma ao longo do tempo. Tanto o SPF quanto os "camundongos selvagens" são alojados nas mesmas condições. Os camundongos são criados e mantidos preferencialmente em gaiolas ventiladas individualmente (IVC) tipo II por muito tempo em grupos de cinco camundongos. A temperatura dentro da instalação é de 22 °C e o ciclo claro/escuro é de 12 h. Os ratos recebem ração padrão à base de grãos e água da torneira. A esterilização de itens de cama e enriquecimento é desnecessária para "camundongos selvagens". No entanto, a autoclavagem desses itens evita misturas de materiais em áreas onde os mouses SPF estão alojados.

Neste protocolo, os procedimentos de imunofenotipagem para SPF e "camundongos selvagens" são demonstrados, destacando os rigorosos protocolos de contenção microbiana na instalação "Camundongo selvagem". Essas medidas garantem a integridade dos ambientes SPF, ao mesmo tempo em que oferecem os benefícios de trabalhar com camundongos portadores de um microbioma natural.

Figura 1: Layout da instalação para camundongos selvagens. E1 = acesso à instalação. As setas indicam a rota de entrada na instalação. E2 = acesso à cabina de fluxo de ar laminar a partir do exterior da instalação. PA = câmara de ar pessoal com chuveiro de ar. AS = chuveiro de ar. R1, R2 = salas para reprodução de ratos selvagens. R3 = espaço para manter ratos selvagens. R4 = espaço para manter camundongos SPF. PR1 = sala de procedimentos para camundongos SPF. PR2 = sala de procedimentos para camundongos selvagens. SB = bancada de trabalho estéril. EE = saídas de emergência. CR = vestiário em frente à cabine LAF. LAF = cabine de fluxo de ar laminar para intervenções sob fluxo de ar protetor. A = autoclave. ER = sala de equipamentos. As setas verdes representam rotas acessíveis ao trabalhar com animais SPF e as setas amarelas indicam caminhos disponíveis para trabalhar com camundongos selvagens após o banho de ar. As setas azuis indicam o acesso apenas para a equipe de criação. A linha vermelha marca a parede de vidro dentro da cabine LAF, que divide o espaço em duas seções que podem ser acessadas a partir de E1 via PR2 ou de E2 via CR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

A instalação para "camundongos selvagens" e os procedimentos envolvendo animais vivos foram aprovados pelo escritório estadual responsável pela experimentação animal, "Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin" (LAGeSo). As etapas mais importantes do protocolo estão resumidas na Figura 2.

1. Obtendo acesso às instalações da Wilding

1. Obtenha uma introdução pessoal aos procedimentos operacionais e de biocontenção da instalação com o oficial responsável pelo bem-estar animal.
2. Obtenha a chave do transponder para entrar nas instalações para "ratos selvagens" e reserve as salas de procedimentos através do sistema de reservas online.

2. Entrando nas instalações para "ratos selvagens"

1. Deposite as roupas no vestiário.
2. Coloque roupas da área: calças, kasak e capas de sapato descartáveis (Figura 3).

3. Amostragem de sangue de camundongos SPF na área SPF

1. Transferir os ratinhos SPF (machos e fêmeas, 8-20 semanas) da sala onde são mantidos (R4) para a sala de procedimentos para animais SPF (PR1) numa gaiola fechada para VCI.
2. Ligue a bancada de fluxo laminar e desinfete a superfície do espaço de trabalho com 70% de etanol Vol. Trabalhe dentro do banco.
3. Inspecione os tubos capilares quanto a seções quebradas ou lascadas para evitar aumento do risco de quebra ou dano.
4. Sob breve anestesia geral com isoflurano (indução a 5% de isoflurano em ar medicinal enriquecido com oxigênio, seguido de 1,5%-2,0% para manutenção), após perda do reflexo de retirada do pedal (conforme indicado por pinça do dedo do pé), comprima as veias do pescoço dos camundongos segurando a nuca.
5. Usando uma mão, prenda a cabeça do animal usando o polegar e o indicador. Insira um capilar fresco no canto medial do olho sob a membrana nictitante em um ângulo de 45°. Certifique-se de que o capilar esteja posicionado entre o globo ocular e a órbita óssea do olho.
   NOTA: Para evitar traumas, não deixe a ponta do tubo capilar tocar a superfície do olho.
6. Insira o capilar através da membrana sinusal com um movimento suave de rotação axial. Continue girando o tubo na parte de trás da órbita até que o sangue flua. Colete um mínimo de 15 μL de sangue em um tubo de coleta de sangue contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (aproximadamente 1 gota).
7. Antes de remover o capilar, afrouxe o aperto na nuca do pescoço para manter o sangramento no tecido ao mínimo. Para garantir uma boa hemostasia, use uma gaze limpa ou cotonete para estancar o sangramento.
8. Gire levemente o tubo para misturar sangue e EDTA. Não agite o tubo. Armazene a amostra de sangue no gelo.
9. Desinfete a superfície de trabalho e desligue a bancada de fluxo laminar. Retorne os camundongos SPF em uma VCI fechada para a sala de alojamento SPF (R4).

4. Entrando na área para "Ratos selvagens"

1. Retire os sapatos e as meias na ante-sala do chuveiro de ar (PA). Coloque meias e equipamentos de proteção individual (EPI) de corpo inteiro consistindo de macacão Tyvek, rede de cabelo, se necessário, luvas de algodão, luvas de nitrilo e máscaras faciais (Figura 3).
2. Entre no chuveiro de ar de meias através do revestimento adesivo do piso. Durante o banho de ar, levante os braços e faça um giro de 360°.
3. Saia do chuveiro de ar e calce os sapatos da área do outro lado.

5. Amostragem de sangue de "camundongos selvagens"

1. Transfira "camundongos selvagens" (machos e fêmeas, 8 a 20 semanas) da sala onde são mantidos (R3) em uma gaiola fechada de VCI para a sala de procedimentos (PR2).
2. Ligue a bancada de fluxo laminar e desinfete a superfície do espaço de trabalho.
3. Siga os procedimentos descritos para amostragem de camundongos SPF na seção 3, etapas 2-8.
4. Depois de completar a coleta de sangue, troque as luvas. Desinfete todos os materiais e superfícies. Desligue a bancada de fluxo laminar.

6. Exportação de amostras de sangue da área de "camundongos selvagens" através do gabinete de fluxo de ar laminar (LAF)

NOTA: A sala de procedimentos (PR2) contém um gabinete LAF, que serve como fechadura de material e sala de intervenção estéril. As amostras são transferidas através da cabine LAF. O interior é acessível tanto por dentro (via E1 e PR2) quanto por fora (via E2 e CR) da área Wildling e é dividido ao meio por uma parede de vidro com uma porta deslizante (Figura 1). Duas pessoas são necessárias para exportar materiais: A Pessoa 1 (dentro da área Wildling [via PR2]) executará as etapas 6.1 e 6.2. A pessoa 2 (fora da área dos Selvagens [via E2]) executará as etapas 6.3 a 6.5.

1. Desinfete os recipientes de amostra. Remova os recipientes de amostra através da porta deslizante na parede de vidro da cabine LAF.
2. Após a conclusão da transferência dos recipientes de amostra para a pessoa 2, receba roupas de proteção da pessoa 2 (usa roupas de proteção na trava da bata da cabine) do outro lado da cabine LAF e descarte-as. Desinfete todas as superfícies.
3. Coloque roupas de proteção no LAF de acesso em frente à cabine do LAF (CR, Figura 1).
4. Receba recipientes de amostra desinfetados da área Wildling sem contato através da porta deslizante na parede de vidro da cabine LAF.
5. Remova a roupa de proteção e passe-a pela porta deslizante para a área interna da cabine LAF para descarte.

7. Saindo da instalação para "ratos selvagens"

1. Deixe macacões descartáveis e sapatos de área dentro da área. Descarte a rede de cabelo, luvas de borracha e máscara facial.
   NOTA: Sapatos e macacões podem ser reutilizados.
2. Entre no chuveiro de ar imediatamente na área meias. Levante os braços e faça um giro de 360° durante o banho de ar.
3. Deixe o chuveiro de ar e coloque as meias da área no coletor de roupas. Coloque as meias e sapatos e capas de sapato descartáveis. Depósito de roupas na área do vestiário no coletor de lavanderia. Troque de roupa no vestiário

8. Processamento e análise de amostras de sangue

1. Traga amostras de sangue para o laboratório.
   1. Prepare o coquetel de coloração de anticorpos conjugados com fluoróforo: Para cada amostra, adicione 0,25 μL de Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45, 0,25 μL de cadeia anti-camundongo TCR-β Brilliant Violet 605, 0,25 μL de APC anti-camundongo CD4, 0,25 μL de Brilliant Violet 785 anti-mouse CD8, 0,25 μL de FITC anti-camundongo CD44 e 0,25 μL de PerCP/Cyanine5.5 anti-camundongo CD62L a 50 μL de tampão de citometria de fluxo (solução salina tamponada com fosfato, 2 mM EDTA, 0,1% de albumina de soro bovino, 4 °C). Mantenha no escuro no gelo até a etapa 8.8.
      NOTA: Os fluoróforos utilizados podem ser adaptados à configuração do citômetro de fluxo que será utilizado para a aquisição da amostra.
2. Desinfete os tubos de coleta de sangue. Adicione 2 mL de tampão de citometria de fluxo gelado a um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL. Coloque o tubo no gelo.
3. Abra o tubo de coleta de sangue. Adicione 10 μL de sangue ao tubo que contém o tampão de citometria de fluxo e o vórtice de pulso.
4. Gire para baixo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
5. Aspire o sobrenadante. Adicione 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC), vórtice de pulso e incube por 3 min em temperatura ambiente (RT).
6. Adicione 100 μL de PBS 10x. Gire para baixo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
7. Repita as etapas 8.5-8.6.
8. Aspire o sobrenadante. Adicione 50 μL de coquetel de coloração de anticorpos, vórtice e incube por 20 minutos em gelo no escuro.
9. Adicione 1 mL de tampão de citometria de fluxo. Gire para baixo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
10. Aspire o sobrenadante. Adicione 180 μL de tampão de citometria de fluxo.
11. Adicione 20 μL de SYTOX Blue Dead Cell Stain (concentração final 1:1000) para discriminação de vivos / mortos.
12. Adquira amostras em um citômetro de fluxo e analise os dados usando o software de aquisição de citômetro de fluxo ou o programa de análise de dados de citometria de fluxo.

Resultados

Os "camundongos selvagens" potencialmente abrigam microrganismos normalmente excluídos das instalações do SPF, o que representa um desafio para as práticas de criação de animais dentro de instituições de pesquisa que mantêm padrões rigorosos de higiene. Nos últimos 4 anos, cientistas e veterinários da Charité - Universitätsmedizin Berlin e do Centro Alemão de Proteção de Animais de Laboratório (Bf3R) desenvolveram uma instalação dedicada a camundongos com um microbioma natural, incorporando medidas rigorosas de biocontenção por meio de um esforço colaborativo (Figura 1). Para realizar esse projeto, uma instalação de mouse existente passou por uma extensa reconstrução, incluindo a instalação de um chuveiro de ar e uma cabine de fluxo de ar laminar. As áreas onde os "camundongos selvagens" e os camundongos SPF são criados e mantidos são separadas pelo chuveiro de ar e ambas as áreas têm salas de procedimentos designadas. O material termoestável deixa a área para "camundongos selvagens" apenas através da autoclave, enquanto os materiais termolábeis, como amostras, podem ser exportados através do gabinete LAF para processamento posterior em áreas de laboratório (Figura 2). A adesão estrita a todas as medidas de biocontenção é essencial para evitar a contaminação das áreas onde as condições de higiene do FPS são mantidas (Figura 3). Coletivamente, o projeto e as medidas de biocontenção da instalação para "camundongos selvagens" na Charité - Universitätsmedizin Berlin oferecem aos cientistas a oportunidade de realizar pesquisas com camundongos que abrigam um microbioma natural, evitando efetivamente a propagação de microrganismos para áreas da instalação animal com níveis de higiene mais altos.

A citometria de fluxo é o método padrão-ouro em imunologia celular e é usada para interrogar populações de células imunes no sangue e nos tecidos em resposta a condições ambientais alteradas. Por exemplo, humanos adultos têm um número substancial de células T de memória circulando no sangue, que se desenvolvem após a exposição a microrganismos do ambiente³. Aqui, a citometria de fluxo foi usada para sondar células T de memória no sangue de camundongos criados e mantidos em condições de FPS e no sangue de "camundongos selvagens" (Figura 4). "Camundongos selvagens" colonizados com um microbioma natural, apresentam uma população distinta de células T de memória. Em contraste, camundongos criados e mantidos sob condições de FPS reduziram muito as células T de memória na circulação sanguínea. Assim, a citometria de fluxo pode caracterizar o impacto de diferentes ambientes microbianos no compartimento imunológico. A granulação de dados pode ser aumentada com a inclusão de marcadores adicionais de células imunes. Abordagens recentemente desenvolvidas em citometria de fluxo, como a citometria por tempo de voo (CyTOF) e a citometria de fluxo espectral, permitem a aquisição de informações sobre uma infinidade de parâmetros e, assim, expandir o número de (sub)populações de células imunes que podem ser quantificadas na mesma amostra de sangue e tecido. Além disso, a produção de citocinas celulares também pode ser avaliada por citometria de fluxo, fornecendo informações sobre a função das células em resposta a um microbioma natural.

Figura 2: Fluxo de trabalho nas instalações do Wildling. A coleta de sangue e o processamento de amostras são exemplos, mas podem ser substituídos por outros procedimentos, como intervenções cirúrgicas com amostragem de tecido e histologia. Para abreviações, consulte a legenda da Figura 1 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparação dos requisitos de equipamentos de proteção individual (EPI) para áreas SPF e Wildling. Na área SPF (esquerda), o EPI padrão consiste em uma única camada de roupas de proteção. Em contraste, a área Wildling (à direita) requer um processo de EPI de três etapas antes de entrar no chuveiro de ar: um kasac (roupa íntima protetora = etapa 1) é usado sob o macacão (etapa 2). Essa camada adicional ajuda a manter a higiene e evitar a contaminação cruzada entre as áreas. Após o banho de ar, devem ser usados sapatos designados para a área Wildling (etapa 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imunofenótipo de "camundongos selvagens". Amostras de sangue de camundongos machos SPF (n = 5 camundongos e "camundongos selvagens" (n = 5 camundongos), com 14 semanas de idade, foram coradas com um coquetel de anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD45, cadeia TCR-β, CD4, CD8, CD44 e CD62L. Os números são a proporção de portão parental ± desvio padrão. A estratégia de gating é mostrada para camundongos SPF, exceto para os dois últimos borrões de SPF e "camundongos selvagens". Em "camundongos selvagens", as células T de memória central e efetora são aumentadas em comparação com camundongos que são criados e mantidos sob condições de FPS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Camundongos com um microbioma natural são uma ferramenta de pesquisa promissora para a ciência básica e aplicada devido à sua maior semelhança com o superorganismo humano 3,9,10,11,12. As tentativas de incorporar a complexidade biológica em modelos de camundongos levaram ao desenvolvimento de várias abordagens, cada uma com suas próprias vantagens e limitações 3,7,8,9,10,11,12. "Ratos selvagens" combinam os benefícios de um ambiente de laboratório controlado com um microbioma natural. Essa abordagem mantém a estabilidade em condições experimentais, preservando a diversidade microbiana natural necessária para estudar interações biológicas complexas. Consequentemente, as terapias biomédicas desenvolvidas e testadas em "camundongos selvagens" têm grande potencial para uma tradução bem-sucedida em aplicações clínicas.

No entanto, ainda precisa ser determinado em quais modelos de doenças pré-clínicas "camundongos selvagens" são superiores aos camundongos SPF. Além disso, camundongos com microbioma natural abrigam microorganismos, como vermes altamente transmissíveis, que normalmente são excluídos das instalações institucionais. Portanto, a criação e o trabalho com esses camundongos apresentam desafios para as práticas de criação de animais dentro das instituições de pesquisa.

O estabelecimento de uma instalação para "camundongos selvagens" envolveu um esforço colaborativo de cientistas, veterinários e funcionários institucionais da Charité - Universitätsmedizin, do Centro Alemão de Proteção de Animais de Laboratório (Bf3R) e da Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU). Depois de desenvolver o conceito da instalação, uma instalação de camundongos existente passou por uma extensa reconstrução para incorporar medidas rigorosas de biocontenção. A instalação é certificada para operações de nível de biossegurança 2 (BSL-2) em relação à pesquisa com patógenos humanos.

Aqui, os procedimentos operacionais e de biocontenção na instalação para "camundongos selvagens" são descritos usando amostragem de sangue para imunofenotipagem por citometria de fluxo como exemplo. A adesão estrita às medidas de biocontenção durante o trabalho na instalação para "camundongos selvagens" é obrigatória para evitar a propagação de microrganismos para outras áreas da instalação animal. Isso inclui a restrição de acesso às instalações ao menor número possível de pessoas pelo grupo de pesquisa. Além disso, é necessária uma sessão introdutória obrigatória conduzida pelo oficial de bem-estar animal institucional antes de obter acesso inicial às instalações. Informações gerais e Procedimentos Operacionais Padrão (SOP) para trabalhar nas instalações de Wildling também estão disponíveis em um site interno ("Wildling wiki")^14,15.

Ao trabalhar dentro da instalação, o EPI deve ser usado adequadamente. Por exemplo, é essencial garantir que nenhum cabelo seja exposto fora da rede capilar, pois os ovos dos parasitas podem se prender a ela. Se o experimento envolver "camundongos selvagens" e camundongos SPF, os camundongos SPF devem ser manuseados primeiro. As áreas para "camundongos selvagens" e camundongos SPF dentro da instalação são separadas por um chuveiro de ar, e cada área é equipada com salas de procedimentos designadas. Essas salas podem ser reservadas por meio de um sistema de reservas online, garantindo processos de trabalho tranquilos e um número limitado de pessoas dentro das instalações. Um máximo de duas pessoas por área por sala de procedimentos (PR1, PR2, LAF) podem trabalhar em cada barreira ao mesmo tempo. Exceções se aplicam a experimentos que requerem pessoal adicional para garantir a execução ética e proficiente dos procedimentos. Os camundongos são transferidos entre salas dentro de suas respectivas áreas em gaiolas fechadas de VCI, que só podem ser abertas sob uma bancada de fluxo laminar para garantir a contenção microbiana e a segurança no trabalho. A sala de procedimentos na área de "camundongos selvagens" também contém uma cabine de fluxo de ar laminar (LAF). Esta cabine LAF deve ser usada para a dissecação e cirurgia de "camundongos selvagens", incluindo transferência de embriões. A transferência de embriões é um procedimento crítico no contexto de "camundongos selvagens", pois é usada para gerar novos modelos de "camundongos selvagens". Por exemplo, a transferência de embriões de cepas de camundongos geneticamente modificados (OGM) para "camundongos selvagens" do tipo selvagem é usada para criar cepas de OGM selvagens. A cabine LAF também é usada para a exportação de amostras, o que requer coordenação com uma pessoa fora da área de "ratos selvagens". O processamento adicional de amostras pode ser realizado em um espaço de laboratório adjacente, permitindo que os pesquisadores manuseiem materiais sensíveis ao tempo no local, limitando os locais onde as amostras de "camundongos selvagens" são processadas.

Todos os outros materiais devem permanecer dentro da instalação Wildling ou precisam ser autoclavados antes de sair da instalação. Após o trabalho, todos os materiais e superfícies são desinfetados com desinfetantes apropriados para as condições BSL2. As pessoas que entraram na instalação para "ratos selvagens" estão proibidas de entrar em qualquer outra instalação de animais no mesmo dia.

A pesquisa na instalação é conduzida no âmbito do consórcio científico "The Wildling Mouse Model in Health and Disease (Wildling HeaD)", facilitando a comunicação entre os cientistas que trabalham com "camundongos selvagens", bem como a troca de métodos e conhecimentos. O consórcio é apoiado pelo Responsible PrecliniX no Berlin Institute of Health (BIH) QUEST Center for Responsible Research, que auxilia nos procedimentos de pré-registro de estudos em animais, design experimental robusto e gerenciamento de qualidade (www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix).

Em resumo, foi criada uma instalação de última geração, equipada com medidas rigorosas de biocontenção, para apoiar pesquisas pré-clínicas seguras e éticas. Essa instalação facilita o estudo de "camundongos selvagens", que abrigam um microbioma natural, preenchendo efetivamente a lacuna entre as condições controladas de laboratório e os ambientes microbianos semelhantes ao mundo real. Para construir uma instalação como a descrita, é essencial priorizar a ciência da equipe e a colaboração interdisciplinar, incorporando a experiência de cientistas, veterinários e funcionários institucionais para garantir o projeto e a operação eficazes de ambientes de alta biocontenção. Além disso, a implementação de medidas rigorosas de biocontenção, o fornecimento de treinamento abrangente e o desenvolvimento de Procedimentos Operacionais Padrão (SOPs) claros são cruciais. Estabelecer uma estrutura de comunicação eficiente, como um wiki interno, e monitorar e validar continuamente as condições experimentais aumentará ainda mais a eficácia e a segurança da instalação no gerenciamento de modelos complexos como "camundongos selvagens".

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 700 anti-camundongo CD45 anticorpo	BioLegend	103127	Clone 30F-11
Animal Chow	Altromin	1324
APC anticorpo CD4 anti-rato	BioLegend	100515	Clone RM4-5
Tubo de coleta de sangue	Greiner	450475	MiniCollect K3E, K3EDTA
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A9647-100G
Anticorpo anti-rato brilhante da cadeia do anti-rato TCR-beta Violet 605	Clone	H57-597 109241Clone H57-597
Anticorpo brilhante violeta 785 CD8 do anti-rato	BioLegend	100749	Clone 53-6.7
Minicaps capilares	Hirschmann	9000210	de Hirschmann,
EDTA	Corning	46-034-CI
FITC	BioLegend	103021	Clone IM7
PerCP/Cyanine5.5 anticorpo CD62L anti-camundongo	BioLegend	104431	Clone MEL-14
Solução salina tamponada com fosfato (10x)	Gibco	12579099
solução salina tamponada com fosfato (1x)	Tampão	Gibco 14190094
RBC	BioLegend	420302
Tubo de poliestireno de fundo redondo	Sarstedt	55.476.005
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Invitrogen	S34852
Tyvek em geral (DuPont)	Fisher Scientific	11371633