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Imagem longitudinal in vivo de células da retina com sorotipos de vírus adeno-associados personalizados por meio de oftalmoscopia a laser de varredura confocal

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DOI:

10.3791/67106

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11 de outubro de 2024

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1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o uso de vetores de vírus adeno-associados (AAV) para marcação específica de células e imagens in vivo usando um oftalmoscópio a laser de varredura confocal (CSLO). Este método permite a investigação de diferentes tipos de células da retina e suas contribuições para a função e doença da retina.

Resumo

A natureza dinâmica dos processos celulares da retina requer avanços na entrega de genes e técnicas de monitoramento ao vivo para melhorar a compreensão e o tratamento de doenças oculares. Este estudo apresenta uma abordagem otimizada de vírus adeno-associado (AAV), utilizando sorotipos e promotores específicos para alcançar a eficiência ideal de transfecção em células retinianas direcionadas, incluindo células ganglionares da retina (RGCs) e glia de Müller. Aproveitando a precisão da oftalmoscopia a laser de varredura confocal (CSLO), este trabalho apresenta um método não invasivo para imagens in vivo que captura a expressão longitudinal da proteína fluorescente verde mediada por AAV (GFP). Essa abordagem elimina a necessidade de procedimentos terminais, preservando a continuidade da observação e o bem-estar do sujeito. Além disso, o sinal GFP pode ser rastreado em RGCs infectados com AAV ao longo da via visual até o colículo superior (SC) e o núcleo geniculado lateral (LGN), permitindo o potencial para mapeamento direto da via visual. Essas descobertas fornecem um protocolo detalhado e demonstram a aplicação dessa poderosa ferramenta para estudos em tempo real do comportamento das células da retina, patogênese da doença e eficácia das intervenções de terapia genética, oferecendo informações valiosas sobre a retina viva e suas conexões.

Introdução

Sendo a única parte opticamente acessível do sistema nervoso central, a retina serve como um modelo valioso para a pesquisa em neurociência1. As células ganglionares da retina (RGCs), os neurônios de saída da retina que transmitem informações visuais ao cérebro, desempenham um papel crucial na função visual. Sua perda ou disfunção leva à deficiência visual e cegueira irreversível, como visto no glaucoma e outras neuropatias ópticas2. A glia de Müller, as principais células gliais da retina, são essenciais para manter a homeostase retiniana, fornecendo suporte estrutural e metabólico aos neurônios, regulando os níveis de neurotransmissores e contribuindo para o reparo e regeneração da retina3. Sua disfunção está implicada em várias doenças da retina, incluindo retinopatia diabética4, degeneração macular relacionada à idade5 e síndrome isquêmica ocular6. RGCs e Müller glia exibem interações próximas e interdependência; A glia de Müller fornece suporte essencial aos RGCs, enquanto a atividade do RGC pode influenciar a função da glia de Müller 3,7. Estudar os RGCs e a glia de Müller é crucial para entender a função da retina e desenvolver tratamentos eficazes para várias doenças da retina.

As avaliações atuais na pesquisa da retina utilizam principalmente técnicas como a tomografia de coerência óptica (OCT) para medir a espessura da camada de fibras nervosas da retina ou as trajetórias dos feixes de axônios 8,9. Embora esses métodos sejam inestimáveis para detectar a perda de RGC, eles não fornecem uma visão detalhada da morfologia do RGC e das células gliais devido à resolução limitada. Da mesma forma, embora técnicas avançadas como a oftalmoscopia a laser de varredura de óptica adaptativa (AO-SLO) permitam imagens em nível celular de RGCs, fotorreceptores e células gliais na retina humana viva10, sua complexidade técnica e acessibilidade limitada limitam seu uso principalmente a ambientes de pesquisa especializados. Dadas essas restrições, há uma necessidade contínua de desenvolver métodos mais acessíveis e confiáveis para o estudo aprofundado de populações específicas de células da retina in vivo.

Assim, este protocolo visa introduzir uma abordagem de imagem alternativa adequada para aplicações de pesquisa em células da retina. Ele combina o poder da marcação específica do tipo de célula mediada por AAV com a natureza não invasiva da imagem CSLO. Os vírus adeno-associados (AAVs) são vetores versáteis de entrega de genes, conhecidos por sua baixa imunogenicidade e capacidade de transduzir uma ampla gama de tipos de células, incluindo células em divisão e não em divisão11. Isso os torna ferramentas ideais para atingir populações de células específicas dentro do complexo ambiente retiniano. Ao utilizar vetores AAV com sorotipos e promotores cuidadosamente selecionados, a expressão seletiva de proteínas fluorescentes pode ser alcançada em vários tipos de células de interesse, como RGCs e glia de Müller. Por exemplo, o AAV2 é conhecido por sua maior eficiência de transdução em RGCs12,13, enquanto o AAV8 é marcadamente eficaz no direcionamento de fotorreceptores14, e o AAV9 demonstra fortes capacidades de transfecção na glia de Müller15, mostrando ampla eficiência em várias camadas de células da retina. É importante notar que a eficácia do AAV depende não apenas da escolha do sorotipo, mas também dos promotores, que ditam a intensidade e a especificidade celular da expressão do transgene, ressaltando a importância da seleção cuidadosa para alcançar a transdução ideal.

Para a marcação RGC, este protocolo emprega AAV2 com o promotor da sinapsina humana (hSyn). AAV2 exibe transdução eficiente de RGCs após injeção intravítrea13, e o promotor hSyn, um promotor neuronal onipresente, impulsiona a expressão transgênica forte e específica dentro dessas células16. Para a glia de Müller, o protocolo utiliza vetores AAV9 impulsionados pelo promotor GfaABC1D17, que demonstra forte expressão transgênica nessas células15. Essa abordagem de rotulagem direcionada permite que os pesquisadores distingam essas células do tecido retiniano circundante e as rastreiem ao longo do tempo, fornecendo uma base para a vigilância in vivo das células da retina e suas respostas às mudanças bioambientais.

A oftalmoscopia confocal a laser de varredura (CSLO) é uma técnica de imagem não invasiva que fornece imagens de alta resolução da retina viva, permitindo a visualização em tempo real de populações de células retinianas marcadas com fluorescência 18,19,20. Um feixe de laser focalizado varre a retina, capturando a luz emitida que passa por um orifício para eliminar sinais fora de foco, resultando em imagens mais nítidas com contraste aprimorado. Este protocolo utiliza um sistema Heidelberg Spectralis CSLO, que tem sido amplamente utilizado para imagens de células da retina em animais vivos, incluindo estudos que visualizam RGCs marcados transgênicos21,22 e microglia23. Ao empregar a unidade HRA CSLO com um laser de 488 nm e filtros apropriados, os pesquisadores podem obter imagens de RGCs marcados com fluorescência ou glia de Müller em animais vivos após injeção intravítrea de vetores AAV portadores de genes repórteres fluorescentes. O protocolo de imagem longitudinal, com sessões semanais cobrindo a retina central e periférica, rastreia as mudanças ao longo do tempo. Para priorizar o bem-estar animal, o protocolo utiliza o sistema automático de rastreamento ocular (ART) da unidade HRA CSLO, permitindo a aquisição precisa de imagens sem a necessidade de anestesia geral ou lentes de contato.

Este protocolo aproveita o poder combinado do AAV e do CSLO para permitir o monitoramento longitudinal de tipos específicos de células da retina in vivo. Ao emparelhar a especificidade do tipo de célula da marcação mediada por AAV com os recursos de imagem não invasivos e de alta resolução do CSLO, esse método permite que os pesquisadores estudem as mudanças dinâmicas nos RGCs e na glia de Müller em resposta a vários estímulos ou intervenções. Esses insights têm um potencial significativo para informar o desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para doenças da retina.

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Capital Medical University, Pequim. Camundongos C57BL/6J machos adultos de quatro semanas de idade (pesando entre 15-20 g) foram usados para todos os experimentos e alojados em salas com temperatura controlada com um ciclo claro/escuro de 12/12 horas. Ração e água padrão para roedores estavam disponíveis ad libitum. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Transfecção de células da retina mediada por AAV

NOTA: Para transdução direcionada de RGCs, este protocolo usa AAV2-hSyn-eGFP, que incorpora o promotor hSyn para conduzir a expressão robusta de GFP aprimorada. A glia de Müller é direcionada usando AAV9-GfaABC1D-eGFP. Para alcançar a eficiência de transdução ideal e a expressão transgênica robusta, recomenda-se um título mínimo de AAV de 1 x 1012 genomas virais (vg) / mL para injeções intravítreas em camundongos13.

  1. Siga protocolos de segurança rigorosos ao realizar procedimentos de transfecção de células da retina mediados por AAV para evitar exposição acidental e garantir um ambiente de trabalho seguro.
  2. Realize todos os procedimentos envolvendo vetores virais em um gabinete de biossegurança certificado (BSC). Equipe o pessoal com equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo jalecos, luvas e proteção para os olhos, durante todo o procedimento.
  3. Descarte todos os materiais perfurocortantes e de risco biológico adequadamente de acordo com os protocolos de segurança institucionais para manter a conformidade e proteger todo o pessoal do laboratório.

2. Preparação de vetores virais e animais

  1. Obtenha os vetores AAV2-hSyn-eGFP ou AAV9-GfaABC1D-eGFP armazenados a -80 °C. Descongele os vetores no gelo imediatamente antes do uso para preservar a integridade viral.
  2. Anestesiar os camundongos com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico na dose de 50 mg / kg. Confirme a profundidade da anestesia testando os reflexos do pé traseiro antes de outras ações.
  3. Apare os bigodes para evitar interferência na área cirúrgica durante o procedimento. Desinfete a órbita com uma solução de iodopovidona a 20% por 2 s e, em seguida, enxágue abundantemente com solução salina normal estéril.
  4. Aplique uma gota de proparacaína a 0,5% topicamente para minimizar o desconforto e evitar movimentos oculares involuntários.

3. Manuseio e injeção intravítrea de vetores virais

  1. Transfira 1 μL de solução de AAV selecionada (AAV2-hSyn-eGFP ou AAV9-GfaABC1D-eGFP) para um pedaço de filme de parafina limpo e pré-resfriado para evitar flutuações de temperatura que possam afetar a atividade viral.
  2. Aspire a solução de AAV usando uma seringa de vidro Hamilton com uma agulha chanfrada de 33 G sob o microscópio cirúrgico oftálmico.
  3. Coloque o mouse em decúbito ventral sob o microscópio. Incline ligeiramente a cabeça para elevar o lado ocular pretendido para injeção. Ajuste e otimize a ampliação do microscópio para identificar claramente a região superior da órbita do mouse.
  4. Insira a agulha 1-2 mm posterior ao limbo na margem escleral superior do olho na cavidade vítrea. Injete as soluções de AAV lentamente para evitar refluxo ou danos induzidos por pressão.
    NOTA: Localização do local da injeção: Realize a injeção no quadrante temporal superior do olho, aproximadamente 1 mm posterior ao limbo. Escolha este local para evitar grandes vasos sanguíneos e minimizar o risco de danos ao cristalino. Evite locais de injeção muito próximos ao limbo para evitar a penetração da íris ou abrasão do cristalino. Evitando vasculatura: Use um microscópio cirúrgico para examinar cuidadosamente o local de injeção planejado para vasos sanguíneos visíveis antes da injeção. Se houver embarcações, ajuste ligeiramente o ponto de entrada para evitá-las. Insira a agulha em um ângulo raso, paralelo à íris, para reduzir ainda mais o risco de danos vasculares. Evite injeções repetidas na mesma área para reduzir o risco de hemorragia sub-retiniana.
  5. Mantenha a agulha no lugar por 30 s para permitir que os vetores se dispersem dentro da câmara vítrea e se depositem na superfície da retina, maximizando assim as chances de transdução bem-sucedida.
  6. Retire a agulha lentamente para minimizar o risco de refluxo vítreo.
  7. Aplique uma pomada antibiótica tópica no local da injeção imediatamente após a injeção. Certifique-se de que a pomada seja aplicada uniformemente para cobrir totalmente a superfície ocular, evitando infecções e inflamações oculares.
    NOTA: A pomada antibiótica contém 1 mg / g de dexametasona, 3500 UI / g de sulfato de neomicina e 6000 UI / g de sulfato de polimixina B.
  8. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal durante a recuperação da anestesia e monitore-o de perto quanto a quaisquer sinais de angústia ou anormalidades. Uma vez totalmente recuperados e sem complicações, devolva-os às suas gaiolas com acesso a comida e água normais.

4. Imagens in vivo com CSLO

  1. Preparação animal
    1. Selecione o camundongo infectado com AAV2-hSyn-eGFP ou AAV9-GfaABC1D-eGFP após 4 semanas de injeção intravítrea. Aplicar uma gota de uma solução ocular contendo tropicamida a 0,5% e fenilefrina a 0,5% na superfície ocular para dilatar a pupila até aproximadamente 2 mm de diâmetro22.
      NOTA: Recomenda-se um intervalo de tempo mínimo de 4 semanas de transdução de AAV para a marcação fluorescente ideal das células da retina após a injeção intravítrea13. Além disso, em nossos experimentos de esmagamento do nervo óptico (ONC), as retinas foram fotografadas 4 semanas após a infecção, bem como nos dias 7 e 14 após a lesão por esmagamento. Esses pontos de tempo foram escolhidos para capturar a expressão inicial de AAV e a progressão das alterações retinianas após ONC.
    2. Cubra a plataforma de imagem com um pedaço da almofada limpa para evitar a possível contaminação de excrementos de animais durante o processo de operação.
      NOTA: A plataforma de imagem personalizada oferece amplo espaço para o animal deitar de bruços, garantindo estabilidade e minimizando o movimento durante a contenção manual para uma aquisição de imagem ideal.
    3. Transfira cuidadosamente o mouse para a plataforma de imagem e permita um período de aclimatação de 2 a 5 minutos antes da imagem para minimizar o estresse e facilitar a adaptação ao ambiente de imagem.
    4. Com a ajuda de um segundo técnico, contenha suavemente o animal, mantendo um estado consciente durante todo o procedimento. Forneça um intervalo de descanso de 10 s após 15 s de imagem para permitir o piscar dos olhos e manter a umidade da córnea.
      NOTA: Esfregue suavemente a pele do couro cabeludo para induzir o levantamento espontâneo das pálpebras, evitando o uso de contenção forçada das pálpebras ou dispositivos adicionais, como clipes, reduzindo assim o risco de lesões oculares. A anestesia geral não é empregada para preservar a clareza óptica durante sessões de imagem prolongadas, pois tem o potencial de exacerbar a opacidade transitória do cristalino. Equilibre a aquisição de imagens de alta qualidade com conforto e segurança animal durante todo o procedimento. Conclua todo o procedimento em 5 minutos para garantir o bem-estar do animal e manter a qualidade da imagem.
    5. Ajuste a postura da cabeça e alinhe a lente da câmera ajustando o botão de foco (Figura 1B) e o micromanipulador (Figura 1C) para direcionar a região de interesse (ROI) para imagens in vivo subsequentes.
  2. Configuração do sistema
    1. Conecte uma lente grande angular de 55° sem contato na câmera para expandir o campo de view da área do fundo de olho.
    2. Coloque a roda do filtro na posição A (angiografia) para permitir a aquisição do modo de imagem de infravermelho (IR) e angiografia fluorescente (FA) (Figura 1A). Ligue o laser e a fonte de alimentação para ativar o sistema de imagem CSLO.
    3. Abra o software Heidelberg Eye Explorer e crie um novo exame clicando no ícone Novo Paciente na parte superior da barra de menus. Insira as informações relevantes do animal e aceite a curvatura padrão da córnea de 7,7 mm na janela pop-up.
    4. Selecione o botão amarelo Iniciar (Figura 1E) na tela do painel de controle para iniciar o modo de imagem ao vivo.
  3. Imagem CSLO in vivo
    1. Selecione o modo IR (Figura 1G) com autofluorescência no comprimento de onda de excitação de 820 nm no painel de controle. Para obter imagens de alta resolução, o Filtro de Alta Resolução. O modo (HR) é ativado através da interface da janela ou do painel de controle manual (Figura 1F).
      NOTA: A imagem de refletância infravermelha (IR) é normalmente o primeiro passo na imagem oftálmica CLSO, adquirida antes da angiografia com fluoresceína (FA), para fornecer uma visão de linha de base. Mesmo iluminação, artefatos mínimos e foco nítido nos principais vasos da retina são cruciais para a confiabilidade do foco no plano z e a obtenção de imagens IR de alta qualidade.
    2. Mova a lente em direção ao olho do mouse usando o joystick com o micromanipulador XYZ para ajuste fino. Examine a transparência óptica e gire o botão de sensibilidade (Figura 1D) no sentido anti-horário para diminuir o brilho da imagem do fundo para 40% -60%, evitando assim a superexposição do fundo e melhorando a visualização dos detalhes da retina.
    3. Ajuste o botão de foco e o micromanipulador até que o disco óptico e os vasos da retina sejam identificados de forma inequívoca no fundo.
      NOTA: Critérios do plano focal ideal: (1) Vista do fundo de olho uniformemente iluminada sem cantos escuros. (2) Iluminação uniforme ao redor do disco óptico sem manchas escuras focais ou distorção. (3) Forma clara do lúmen dos grandes vasos da retina com o movimento visível do fluxo sanguíneo.
    4. Mudar para o modo FA (figura 1H) com um laser azul de estado sólido a um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um filtro de barreira a 500 nm. Gire o botão de sensibilidade (Figura 1D) no sentido horário para aumentar o brilho da imagem do fundo de olho para 50% -107% para iluminar a área retiniana alvo.
    5. Defina o valor médio do ART (uma barra azul na parte inferior esquerda da interface do software) para pelo menos 15 para melhorar a relação sinal-ruído. Esta função calcula a média de uma série de B-scans adquiridos no mesmo local, melhorando a qualidade da imagem.
      NOTA: Embora um valor médio de ART mais alto geralmente melhore a qualidade da imagem por meio da média, ele também estende a duração da digitalização. Essa duração prolongada pode aumentar o risco de desidratação da córnea e fadiga animal, fatores que precisam ser cuidadosamente considerados, especialmente em imagens de animais acordados.
    6. Realinhe-se ao plano interno da retina, visando especificamente os RGCs que expressam GFP ou as células gliais de Müller. Ajustes finos são feitos para garantir uma iluminação nítida da população de células desejada, como soma RGC e axônios, ou o corpo celular de Müller. A sensibilidade da imagem é equilibrada para obter uma visualização ideal e evitar a supersaturação das células GFP-positivas.
      NOTA: Para obter as imagens com clareza e brilho comparáveis do sinal GFP, a aquisição de sensibilidade deve ser constante para todos os camundongos no experimento.
    7. Pressione o botão de sensibilidade (Figura 1D) para iniciar o modo ART, que gera uma imagem média ao vivo online. Aguarde até que a barra azul (representando o valor médio do ART) na parte inferior esquerda da interface do software atinja o valor de ART definido (≥ 20 quadros) e toque no botão Adquirir na interface de controle para capturar as imagens do fundo de olho.
      NOTA: Para o modo ART, o rastreamento ocular é incorporado para compensar automaticamente pequenos movimentos oculares durante a imagem in vivo , permitindo um foco consistente no plano focal retiniano selecionado.
    8. Depois de adquirir as imagens desejadas, saia do modo ART pressionando o botão de sensibilidade no painel de toque.
      NOTA: Para evitar o ressecamento da córnea e permitir o piscar espontâneo dos olhos, foram implementadas pausas de 10 s a cada 15 s durante o processo de imagem.
    9. Para navegar pelas áreas nasais e temporais da retina, mova a cabeça da câmera horizontalmente enquanto observa a imagem ao vivo na tela. Quando a região alvo for alcançada, ajuste o foco e inicie o processo de imagem conforme descrito nas etapas 2.3.1-2.3.8.
      NOTA: Mantenha movimentos lentos e controlados da câmera, garantindo uma iluminação consistente e brilhante do fundo. Se aparecerem áreas escuras, utilize o micromanipulador para ajustar a posição da câmera verticalmente e centralizar novamente a retina.
    10. Para obter imagens da retina superior, ajuste suavemente a postura da cabeça do mouse para a posição voltada para cima. Incline moderadamente a cabeça da câmera para cima para alinhar com a região superior da retina. Reajuste o foco conforme necessário e prossiga com a imagem.
    11. Após a conclusão da imagem, todas as regiões retinianas desejadas saem da janela de aquisição e as imagens são salvas automaticamente. Aplique lubrificante tópico no olho fotografado para manter a hidratação da córnea.
    12. Para iniciar o exame do olho contralateral, reposicione o animal para o lado oposto da plataforma e repita os passos 2.3.1-2.3.11.

5. Processamento e análise de imagem

  1. Exportação e preparação de imagens
    1. Abra o software Heidelberg Eye Explorer e selecione a sessão de imagem CSLO desejada com boa qualidade. Escolha imagens únicas ou consecutivas da mesma localização da retina com configurações de sensibilidade consistentes ao longo do tempo.
    2. Exclua imagens borradas com foco ruim ou clareza da córnea, garantindo que apenas imagens com visualização clara das estruturas da retina sejam usadas para análise. Exporte essas imagens no formato TIFF para processamento posterior.
  2. Alinhamento e corte de imagem
    1. Agrupe imagens por olho de camundongo com base na mesma região da retina.
      NOTA: As imagens originais adquiridas do sistema CSLO são salvas no seguinte formato: TIFF, com uma dimensão de 1536 x 1536 pixels, uma resolução de 5,69 um/pixel e um valor ART de ≥15.
    2. Para exames de acompanhamento, importe imagens para um software de processamento de imagem adequado. Gire e alinhe as imagens conforme necessário para corresponder à orientação da imagem de linha de base. Ao salvar ou exportar as imagens processadas, use configurações que mantenham a mais alta qualidade de imagem possível para minimizar possíveis artefatos de compactação.
    3. Alinhe as imagens CSLO de uma série temporal do mesmo olho, girando-as para corresponder à respectiva imagem de linha de base usando a vasculatura e o disco óptico como pontos de referência.
      NOTA: Examine cuidadosamente cada imagem alinhada e, antes de prosseguir com o corte, certifique-se de que elas atendam aos seguintes critérios: (1) Captura completa da região da retina: A imagem deve abranger totalmente a região retiniana de interesse pretendida, incluindo pontos de referência importantes como o disco óptico e os principais vasos sanguíneos; (2) Ausência de artefatos de movimento: A imagem deve estar livre de desfoque, listras ou duplicação de estruturas causadas pelo movimento dos olhos durante a imagem; (3) Distorção mínima: A imagem deve representar com precisão a estrutura da retina sem artefatos de deformação, alongamento ou compressão que possam surgir de ângulos de imagem ou efeitos de lente. (4) Equilíbrio das métricas de qualidade de imagem: Avaliações dos níveis de ruído de fundo (desvio padrão das intensidades de pixel em áreas livres de estrutura < 5 (escala de 0-255)); relação sinal-ruído (SNR >20), consistência de iluminação (Coeficiente de variação entre seis quadrantes da imagem <10%) e uniformidade da imagem (Coeficiente de variação em regiões homogêneas <15%).
    4. Selecione a imagem girada e exporte-a no formato TIFF. Para cada ponto de tempo, use a ferramenta de corte para selecionar e cortar aleatoriamente de 5 a 10 áreas (300 x 300 pixels cada) contendo células GFP positivas das imagens com qualidade aprovada. Exporte cada imagem cortada individualmente no formato TIFF para análise posterior.
  3. Medição da intensidade de fluorescência
    1. Abra as imagens CSLO cortadas (escala de cinza de 8 bits, 300 x 300 pixels) no ImageJ/Fiji.
    2. Para examinar as alterações gerais nos sinais fluorescentes, meça a intensidade total de fluorescência por imagem recortada usando Analisar > Medir (ou Ctrl + M). Registre o valor "Médio", representando a intensidade média de fluorescência GFP de toda a imagem recortada.
  4. Quantificação de RGC
    1. No ImageJ/Fiji, ajuste o limite de intensidade das imagens CSLO recortadas usando Image > Adjust > Brightness/Contrast para obter a visualização ideal de corpos de soma brancos individuais contra o fundo preto.
      NOTA: Determine um limite individualizado após revisar o lote de imagens cortadas ou aplique um algoritmo de limite consistente (por exemplo, o método5 de Huang em ImageJ/Fiji). Para o método de Huang: (1) Converta imagens em tons de cinza de 8 bits (Tipo de > de imagem > 8 bits). (2) Acesse a ferramenta de limite (Imagem > Ajustar > limite). (3) Selecione Huang como o método de limiar. (4) Visualize a segmentação e clique em Aplicar. O limite será calculado automaticamente e exibido no histograma da imagem.
    2. Ative o plug-in Cell Counter e clique em cada soma RGC positivo para GFP para contagem. Registre o número total de células marcadas na região analisada. Repita esse processo para todas as imagens cortadas de cada ponto de tempo de acompanhamento.
  5. Análise de dados
    1. Exporte os dados de contagem de células e intensidade de fluorescência para uma planilha ou software estatístico (por exemplo, GraphPad Prism).
    2. Realizar testes estatísticos apropriados com base no desenho experimental e nas hipóteses correspondentes. Interprete os resultados e conclua.

Resultados

Seguindo o protocolo apresentado, diferentes células da retina foram visualizadas e rastreadas com sucesso in vivo usando uma combinação de entrega de genes mediada por AAV e CSLO. AAV2-hSyn-eGFP transduziu efetivamente RGCs, resultando em expressão robusta de eGFP em toda a retina, conforme confirmado por CSLO e colocalização com o marcador específico de RGC, proteína de ligação a RNA com splicing múltiplo (RBPMS), encontrada especificamente na camada de células ganglionares (Figura 2 e Figura 3). O protocolo também confirmou a capacidade de atingir a glia de Müller usando AAV9-GfaABC1D-eGFP. A visualização do CSLO revelou expressão generalizada de eGFP, especificamente nas camadas internas da retina, consistente com o segmento de distribuição principal conhecido da glia de Müller. O sinal positivo de GFP também foi altamente colocalizado com o marcador de glia de Müller, glutamina sintetase (GS), confirmando ainda mais a especificidade dessa abordagem (Figura 2E, F e Figura 3B). Essas descobertas reafirmaram a versatilidade da entrega de genes auxiliada por AAV para estudar diferentes tipos de células da retina. Para confirmar a capacidade de atingir a glia de Müller, AAV9-GfaABC1D-eGFP foi usado. A imagem CSLO revelou expressão generalizada de eGFP, especificamente nas camadas internas da retina, consistente com a distribuição conhecida da glia de Müller (Figura 2E, F). Esse padrão de expressão seletiva foi ainda validado pelo alto grau de colocalização observado entre o sinal GFP e o marcador de glia de Müller, glutamina sintetase (GS) ( Figura 3B ).

Para quantificar a especificidade e a eficiência da abordagem de direcionamento viral para RGCs e glia de Müller, uma análise de colocalização foi realizada para comparar a fluorescência de GFP com marcadores de tipo de célula padrão ( Figura 3B, D ). Um total de 6 olhos de camundongo foram analisados. Para RGCs direcionados com AAV2-hSyn-GFP, a eficiência de transdução foi de 64% ± 3%, enquanto a especificidade de transdução foi de 68% ± 3%. Para a glia de Müller direcionada com AAV9-GfaABC1D-GFP, a eficiência de transdução foi de 58% ± 2% e a especificidade de transdução foi de 71% ± 2%. Esses resultados demonstram que essa abordagem de entrega de genes mediada por AAV permite a marcação seletiva de tipos distintos de células da retina, destacando sua versatilidade para estudar processos celulares e moleculares na retina.

Para avaliar a adequação do CSLO para monitoramento longitudinal de perturbações das células da retina, um modelo ONC transitório foi realizado em camundongos infectados com AAV2-hSyn-eGFP. Um declínio progressivo no sinal eGFP e nos números RGC foi observado ao longo de duas semanas (Figura 4). A sobrevivência do RGC foi quantificada com três métricas: intensidade de fluorescência CSLO, contagem de células in vivo para imagens CSLO e contagem ex vivo de células positivas para RBPMS. Após o processamento da imagem, conforme descrito na etapa 4, pelo menos 10 regiões de interesse (ROIs) foram cortadas de cada retina (6 olhos no total), garantindo que cada ROI abrangesse a mesma localização da retina e exibisse sinais de células claras em cada ponto de tempo. A intensidade de fluorescência do CSLO foi então quantificada medindo a intensidade média dentro de cada ROI recortado em cada ponto de tempo. In vivo, as contagens de células foram obtidas contando manualmente RGCs individuais positivos para GFP dentro do mesmo ROI cortado em cada ponto de tempo. Por fim, as retinas foram colhidas para imunocoloração RBPMS, e as células positivas para RBPMS foram contadas em 24 áreas definidas visualizadas por setor retiniano para cada retina. Correlações negativas significativas foram encontradas entre todas as três métricas de sobrevivência do RGC (intensidade de fluorescência CSLO, contagens de células in vivo e contagens de células positivas para RBPMS ex vivo ) e o tempo pós-ONC (p < 0,001 para todos, Figura 4C), demonstrando perda e degeneração progressivas do RGC. É importante ressaltar que não foram observadas diferenças significativas entre os diferentes grupos experimentais em termos de densidade inicial de RGC ou taxa de declínio, indicando uma consistência grosseira no modelo ONC e na abordagem de imagem. Esses achados são consistentes com estudos anteriores sobre danos ao RGC após ONC e validam a eficácia deste protocolo baseado em CSLO como uma ferramenta não invasiva e confiável para monitorar a saúde do RGC.

Para investigar ainda mais as projeções axonais do RGC dentro da via visual, uma abordagem de marcação dupla foi usada com a combinação da marcação eGFP mediada por AAV com o traçador anterógrado da toxina da cólera subunidade B (CTB) 24 . Os camundongos receberam uma injeção intravítrea de CTB e foram sacrificados 2 dias depois para análise histológica. A colocalização dos sinais de eGFP e CTB nos nervos ópticos confirmou o rastreamento positivo dos axônios RGC (Figura 5A). Para estudar melhor as mudanças de sinais após a lesão axonal, os camundongos foram submetidos ao esmagamento unilateral do nervo óptico (ONC), um modelo de dano agudo do RGC25. Resumidamente, os camundongos foram anestesiados e um nervo óptico foi exposto e esmagado aproximadamente 1 mm atrás do globo usando uma pinça fina por 5 s, induzindo axotomia significativa do RGC e subsequente degeneração. Após a lesão de ONC, foi observada uma redução acentuada na intensidade de eGFP e CTB, indicando perda substancial de fibras nervosas e interrupção do transporte axonal. Uma análise mais aprofundada das seções cerebrais revelou projeções RGC para o Colículo Superior (SC), uma estrutura do mesencéfalo envolvida na integração sensório-motora e nos movimentos oculares, e o Núcleo Geniculado Lateral (LGN), o principal centro de retransmissão de informações visuais para o córtex visual. Após a ONC, uma diminuição da intensidade da GFP foi revelada no lado contralateral da lesão (Figura 5B-E). Esses achados demonstram a utilidade desse método para estudar a degeneração axonal RGC e mapear seus padrões de projeção in vivo, oferecendo uma alternativa potencial aos métodos tradicionais de rastreamento invasivo.

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Figura 1: Sistema de imagem de oftalmoscópio a laser de varredura confocal (CSLO) e interface do painel de controle para imagens de retina ao vivo. (A-D) Componentes do sistema de imagem: Essas imagens retratam os principais componentes do dispositivo HRA CSLO. (A) A alavanca do filtro está na posição "A" para imagens combinadas de refletância infravermelha (IR) e angiografia fluoresceínica (FA). (B) O botão de foco ajusta o foco fino da lente objetiva. (C) O micromanipulador permite o posicionamento, alinhamento e iluminação precisos do feixe de luz para a retina por meio de vários graus de liberdade (por exemplo, eixos X, Y, Z) e rotação. (D) O botão de sensibilidade controla o brilho das imagens IR e FA ajustando a amplificação do sinal de luz detectado. Pressionar o botão inicia a média da imagem, que combina vários quadros para reduzir o ruído e melhorar a relação sinal-ruído. (E-H) Interface do painel de controle: As capturas de tela exibem o painel de controle CSLO com as configurações usadas para aquisição e visualização de imagens ao vivo. (E) O painel de controle de aquisição é iniciado. (F) O modo de alta resolução é recomendado para uma qualidade de imagem ideal. (G) As configurações de imagem IR são destacadas, permitindo a visualização das estruturas da retina e dos vasos sanguíneos. (H) As configurações de imagem FA exibem opções para imagens de fluorescência de ponto único e multiponto, permitindo a detecção de sinais fluorescentes nas células da retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagem CSLO in vivo de células retinianas marcadas com fluorescência após transfecção de AAV em camundongos C57. (A) A linha do tempo experimental da imagem longitudinal auxiliada por CSLO após a transfecção de AAV no olho do camundongo. (B) Imagens CSLO representativas das regiões superior e central de uma retina de camundongo C57 após 4 semanas de expressão de AAV2-hSyn-eGFP. Barra de escala: 500 μm. (C) Uma montagem retiniana costurada manualmente de (B) mostra a distribuição de células retinianas que expressam eGFP. Barra de escala: 500 μm. (D) Uma imagem CSLO ampliada da área encaixotada em (C) e a imagem de microscopia confocal correspondente de um flatmount retiniano. A colocalização de eGFP (verde) com o marcador RGC RBPMS (vermelho) confirma a expressão mediada por AAV em células ganglionares da retina (exemplos circulados). Barra de escala: 50 μm. (E) Uma montagem costurada manualmente de uma retina de camundongo C57 4 semanas após a injeção com AAV9-GfaABC1D-eGFP, demonstrando a expressão de eGFP específica da glia de Müller. Barra de escala: 500 μm. (F) Uma imagem CSLO ampliada da área encaixotada em (E) e a imagem de microscopia confocal correspondente de um flatmount retiniano. A colocalização de eGFP (verde) com o marcador de glia de Müller glutamina sintetase (GS, vermelho) confirma a expressão mediada por AAV em células gliais de Müller (exemplos circulados). Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Especificidade do tipo de célula da entrega de genes mediada por AAV na retina de camundongos. (A) Imuno-histoquímica de uma seção retiniana e flatmount de camundongos C57 após 4 semanas de infecção por AAV2-hSyn-eGFP. A colocalização de GFP (verde) com RBPMS (vermelho) confirma a expressão específica do RGC. Barra de escala: 50 μm. (B) Quantificação da eficiência e especificidade da transdução AAV2-hSyn-GFP em RGCs. A eficiência é representada como a porcentagem de RGCs positivos para RBPMS que também expressam GFP no flatmount retiniano. A especificidade é representada como a porcentagem de células positivas para GFP que também são positivas para RBPMS na seção retiniana (n = 6 olhos de 4 camundongos). (C) Coloração por imunofluorescência de uma seção da retina e flatmount de camundongos C57 após 4 semanas de infecção por AAV9-GfaABC1D-eGFP. A colocalização de GFP (verde) com GS (vermelho) confirma a expressão específica da glia de Müller. Barra de escala: 50 μm. (D) Quantificação da eficiência e especificidade da transdução AAV9-GfaABC1D-GFP na glia de Müller. A eficiência é representada como a porcentagem de glia de Müller positiva para GS que também expressa GFP no flatmount retiniano. A especificidade é representada como a porcentagem de células positivas para GFP que também são positivas para GS na seção retiniana (n = 6 olhos de 3 camundongos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Monitoramento longitudinal de CSLO da sobrevivência do RGC após esmagamento agudo do nervo óptico (ONC) em camundongos AAV2-hSyn-eGFP. (A) Um diagrama esquemático da linha do tempo experimental da lesão aguda do nervo óptico após a infecção por AAV. (B) Imagem CSLO longitudinal da mesma retina em um camundongo AAV2-hSyn-eGFP no início do estudo, 7 dias e 14 dias pós-ONC, visualizando RGCs expressando sinais GFP. Imagens ampliadas das áreas encaixotadas são mostradas à direita, ao lado de imagens de microscopia confocal representativas de flatmounts retinianos demonstrando a morfologia e distribuição do RGC. Barras de escala: 100 μm. (C) A quantificação da sobrevida do RGC ao longo de duas semanas após o ONC foi avaliada medindo a alteração percentual no número de células e na intensidade fluorescente do CSLO em relação à linha de base (média ± SEM). Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos em cada momento (ANOVA de uma via). A análise de regressão linear revelou correlações negativas significativas entre o tempo pós-lesão e as métricas de sobrevivência do RGC com base na fluorescência da GFP (r² = 0,945, p < 0,001), coloração RBPMS (r² = 0,888, p < 0,001), contagem de células CSLO (r² = 0,511, p < 0,001) e intensidade fluorescente CSLO (r² = 0,7486, p < 0,001). n = 6 camundongos/grupo/ponto de tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Mapeamento auxiliado por AAV das projeções axonais RGC ao longo da via visual. (A) Imagens representativas de microscopia de fluorescência de um par de nervos ópticos de um camundongo AAV2-hSyn-eGFP, demonstrando axônios RGC marcados com GFP (verde) e colocalização com o traçador axonal anterógrado toxina da cólera B (CTB, magenta). O painel superior fornece uma visão geral de todos os nervos ópticos (barra de escala: 1000 μm), enquanto o painel inferior oferece visualizações ampliadas das regiões em caixa (barra de escala: 100 μm). Duas semanas após a lesão de ONC, os sinais GFP e CTB mostram uma redução acentuada em todo o nervo óptico (lado esquerdo), indicando perda axonal RGC e interrupção ao longo da via visual. (B) Projeções axonais RGC para o colículo superior (SC). Seções cerebrais coronais de um camundongo AAV2-hSyn-eGFP 2 semanas após a ONC destacam axônios RGC marcados com GFP (verde) e coloração CTB (magenta) dentro do SC. Esquerda (L): SC contralateral; Direito (R): SC ipsilateral (lado lesionado por ONC). Barra de escala: 1000 μm. (C) Uma visão ampliada da região encaixotada em (B) demonstra a colocalização dos sinais GFP e CTB (imagem mesclada), destacando os feixes axonais RGC e seus padrões de projeção dentro do SC. Barra de escala: 100 μm. (D) Projeções axonais RGC para o núcleo geniculado lateral (LGN) após ONC, revelando axônios RGC marcados com GFP (verde) e coloração CTB (magenta) dentro do LGN. Esquerda (L): LGN contralateral; Direito (R): LGN ipsilateral (lado lesionado por ONC). Barra de escala: 1000 μm. (E) Uma visão ampliada da região encaixotada em (D) destaca os feixes axonais RGC e seus padrões de projeção dentro do LGN. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo apresentado detalha um método robusto e acessível para vigilância in vivo de populações específicas de células da retina, aproveitando o poder da entrega de genes mediada por AAV e da imagem CSLO. Essa abordagem oferece várias vantagens em relação aos métodos tradicionais, facilitando estudos longitudinais da dinâmica das células da retina e suas respostas a lesões ou doenças em condições fisiológicas ou patológicas.

O sucesso desse método depende de várias etapas críticas. Em primeiro lugar, alcançar a eficiência ideal de transdução de AAV é fundamental para a expressão robusta e específica do repórter fluorescente na população de células-alvo. Isso pode ser influenciado por fatores como seleção do sorotipo do AAV, título viral e técnica de injeção 13,15,16. Em segundo lugar, o manuseio e a contenção adequados dos animais durante a imagem CSLO são essenciais para minimizar os artefatos de movimento e manter a qualidade da imagem. Empregar uma plataforma de imagem personalizada e evitar a anestesia geral contribui para obter uma visualização clara e consistente das estruturas da retina. Em terceiro lugar, é necessária uma otimização cuidadosa dos parâmetros de imagem do CSLO, incluindo configurações de foco, sensibilidade e média, para obter imagens de alta resolução com ruído mínimo e relação sinal-ruído ideal26. Por fim, para abordar as possíveis limitações e garantir a confiabilidade dos dados, implementamos medidas rigorosas de controle de qualidade de imagem e aumentamos o número de animais em nosso desenho de estudo.

O sistema Spectralis HRA CSLO possui rastreamento ocular automático que aprimora a imagem longitudinal clínica. Sua função de rastreamento automático em tempo real (ART) pode travar em uma área específica da retina durante a imagem, reduzindo os artefatos de movimento. Para imagens clínicas humanas, o sistema também inclui um algoritmo para rastreamento de longo prazo da mesma localização anatômica da retina27. No entanto, essas tecnologias não são otimizadas para estudos com roedores devido a diferenças anatômicas significativas entre olhos humanos e de roedores. Os olhos dos roedores são muito menores (3-4 mm de diâmetro em comparação com 24 mm em humanos) e carecem de certos pontos de referência como a mácula, apresentando desafios únicos para o rastreamento automatizado28. Consequentemente, os pesquisadores que estudam modelos de roedores dependem principalmente de métodos manuais, usando pontos de referência anatômicos, como padrões de vasos e a cabeça do nervo óptico, para localizar regiões específicas da retina e manter planos de imagem consistentes nas sessões13,22. Essa abordagem é necessária não apenas devido a pontos de referência limitados nos olhos de roedores, mas também devido a possíveis alterações retinianas substanciais induzidas por manipulações experimentais, que podem confundir sistemas automatizados não projetados para esses desafios específicos. Assim, o desenvolvimento de algoritmos especializados de rastreamento ocular e alinhamento para imagens de retina de roedores representa uma direção futura crucial. Particularmente, a adaptação de algoritmos de rastreamento de longo prazo para uso em pequenos animais pode aumentar significativamente a precisão e a reprodutibilidade de estudos longitudinais.

Embora as técnicas histológicas tradicionais exijam o sacrifício de animais e impeçam estudos longitudinais, este método de imagem CSLO auxiliado por AAV oferece uma abordagem não invasiva para monitorar a dinâmica das células da retina in vivo. Essa abordagem se baseia em trabalhos anteriores que demonstram a utilidade da imagem cSLO para rastrear alterações longitudinais em células específicas da retina após lesões, particularmente em modelos animais que utilizam marcação de proteínas fluorescentes transgênicas 19,21,22,29. Esses estudos destacaram a capacidade do CSLO de visualizar uma série de eventos de células da retina in vivo, incluindo morte celular, sobrevivência e potencialmente até migração ou crescimento de processo. Este protocolo estende a aplicação desta técnica para estudar a transdução mediada por AAV de populações específicas de células da retina, permitindo-nos monitorar os efeitos a longo prazo da entrega de AAV e da expressão do transgene na retina e fornecendo informações cruciais sobre a progressão de doenças da retina e a eficácia de intervenções terapêuticas. As avaliações clínicas atuais usando OCT concentram-se principalmente na perda do axônio RGC medindo a espessura da camada de fibras nervosas da retina9, mas carecem de resolução para avaliar a morfologia individual do RGC ou o envolvimento das células gliais. Embora o AO-SLO permita imagens em nível celular na retina humana viva10, sua complexidade e disponibilidade limitada restringem seu uso principalmente em ambientes de pesquisa. Além disso, a diferenciação dos tipos de células gliais dentro do AO-SLO geralmente requer métodos de rotulagem adicionais30. Este método supera essas limitações, fornecendo uma abordagem mais abrangente e acessível para visualizar e rastrear RGCs individuais e outras populações de células da retina marcadas com fluorescência ao longo do tempo. Isso abre caminhos para investigar as respostas celulares sob várias condições, auxiliando no desenvolvimento de terapias direcionadas. Além disso, a combinação de imagens CSLO auxiliadas por AAV com optogenética31 ou imagens de cálcio32 pode aprofundar ainda mais a compreensão da função das células da retina e seus papéis no processamento visual, desenvolvimento de circuitos e regeneração.

Apesar da força dessa abordagem, algumas limitações e possíveis considerações de solução de problemas devem ser reconhecidas. Pode ocorrer variabilidade na eficiência da transdução de AAV, necessitando de otimização dos parâmetros de injeção ou título viral para tipos específicos de células ou condições experimentais. A imagem CSLO pode ser afetada por fatores como opacidades da córnea, instabilidade do filme lacrimal e movimentos oculares, exigindo monitoramento e ajustes cuidadosos durante a aquisição da imagem. Além disso, a profundidade de penetração limitada do CSLO restringe a visualização às camadas internas da retina, potencialmente excluindo estruturas mais profundas como fotorreceptores33. O sistema Spectralis cSLO permite a visualização clara de características e padrões celulares distintos dentro da retina34. Embora essa modalidade de imagem possa facilitar a observação de uma única célula sob certas condições, conforme demonstrado em um trabalho anterior visualizando RGCs individuais em camundongos Thy1-YFP22 escassamente marcados, ela pode representar desafios para quantificar células individuais em cenários densamente marcados. Por exemplo, neste estudo, a marcação em massa de RGCs com eGFP após infecção retiniana mediada por AAV às vezes pode dificultar a visualização clara de células individuais, particularmente em áreas com variações nos níveis de expressão e sobreposição celular. Esse desafio é ainda mais agravado ao obter imagens da glia de Müller, pois sua morfologia alongada, abrangendo toda a espessura da retina35, dificulta a captura de uma única célula dentro de um único plano focal usando cSLO. A avaliação da eficiência da infecção da glia de Müller mediada por AAV9, portanto, depende principalmente da avaliação dos padrões gerais de transdução e distribuição usando imagens CSLO.

Além disso, embora a média de ART no sistema HRA melhore a qualidade da imagem, o aumento da duração da varredura apresenta limitações práticas, especialmente em imagens de animais acordados. O valor médio de ART selecionado de 15 é para equilibrar a qualidade da imagem com o tempo de digitalização, proporcionando redução de ruído suficiente e mantendo uma duração de digitalização razoável. Para minimizar o desconforto e o estresse dos animais, os procedimentos de imagem precisam ser otimizados para eficiência, empregar pessoal treinado e qualificado no manuseio e geração de imagens de animais acordados e monitorar diligentemente os animais quanto a sinais de desconforto ou ressecamento da córnea durante as sessões de imagem. Essas medidas foram cruciais para garantir a qualidade dos dados e o bem-estar animal, destacando a importância de considerar ambos os fatores ao empregar a média de ART para imagens retinianas in vivo em modelos animais acordados.

Ao reconhecer essas limitações e fontes potenciais de variabilidade, os pesquisadores podem tomar as medidas apropriadas para otimizar os protocolos de imagem, minimizar artefatos e garantir a confiabilidade e a reprodutibilidade de seus dados.

No geral, este método acessível e prontamente implementável oferece um meio poderoso para investigar a complexa interação entre RGCs e glia de Müller, especialmente em resposta a lesões ou doenças. Ao permitir que os pesquisadores visualizem e quantifiquem essas interações dinâmicas, essa abordagem facilita a descoberta de novos mecanismos celulares e moleculares subjacentes às patologias da retina. Isso, por sua vez, lança luz sobre o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas e melhores contramedidas de doenças.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130029). A Figura 2A e a Figura 4A foram criadas com BioRender.com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha de 33 GaugeHamilton Corp., Reno, NV, EUA7803-05Para injeção intravítrea
0,5% proparacaína Fornecedor:Santen Pharmaceutical Co., Ltd.Anestesióticos tópicos
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., ChinaTítulo de vírus: 2,7 x 1012 genomas virais (vg)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., ChinaTítulo de vírus: 4,5 x 1012 genomas virais (vg)/mL 
BetadineHealthy medical company001651Anti-sépticos tópicos
Pinça escelar da córnea (dentada)Mingren Eye Instruments, ChinaMR-F301APara pálpebra segura durante injeção intravítrea
Dumont 05# fórcepsFST51-AGT5385Para esmagamento do nervo óptico
PrismaGraphPad Prisma GraphPad, EUADesenho gráfico e análise estatística
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, AlemanhaModo"IR" e "FA" para imagens CSLO
Imagem J/FijiNational Institutes of Health, EUAProcessamento de imagem
Pomada antibiótica MaxitrolAlcon Laboratories, INC. EUA0065-0631Antibióticos tópicos
Seringa de microlitroHamilton Corp., Reno, NV, EUA7633-01Para injeção intravítrea
Mydrin-P Solução oftálmicaSanten Pharmaceutical Co.,Ltd, JapãoDilatação da pupila
Microscópio cirúrgico oftálmico Leica AG, Heerbrugg, SuíçaM220Para operações cirúrgicas
Pentorbarbitol SódioSigma Aldrich, EUA57-33-0Anestesia Genérea
PowerpointMicrosoft Corporation, EUAAlinhamento e corte de imagens
VISCOTEARS Gel Líquido (Carbômero)Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, AlemanhaLubrificante tópico 

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