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Artigo de método

Imagem longitudinal in vivo de células da retina com sorotipos de vírus adeno-associados personalizados por meio de oftalmoscopia a laser de varredura confocal

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DOI:

10.3791/67106

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11 de outubro de 2024

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1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o uso de vetores de vírus adeno-associados (AAV) para marcação específica de células e imagens in vivo usando um oftalmoscópio a laser de varredura confocal (CSLO). Este método permite a investigação de diferentes tipos de células da retina e suas contribuições para a função e doença da retina.

Resumo

A natureza dinâmica dos processos celulares da retina requer avanços na entrega de genes e técnicas de monitoramento ao vivo para melhorar a compreensão e o tratamento de doenças oculares. Este estudo apresenta uma abordagem otimizada de vírus adeno-associado (AAV), utilizando sorotipos e promotores específicos para alcançar a eficiência ideal de transfecção em células retinianas direcionadas, incluindo células ganglionares da retina (RGCs) e glia de Müller. Aproveitando a precisão da oftalmoscopia a laser de varredura confocal (CSLO), este trabalho apresenta um método não invasivo para imagens in vivo que captura a expressão longitudinal da proteína fluorescente verde mediada por AAV (GFP). Essa abordagem elimina a necessidade de procedimentos terminais, preservando a continuidade da observação e o bem-estar do sujeito. Além disso, o sinal GFP pode ser rastreado em RGCs infectados com AAV ao longo da via visual até o colículo superior (SC) e o núcleo geniculado lateral (LGN), permitindo o potencial para mapeamento direto da via visual. Essas descobertas fornecem um protocolo detalhado e demonstram a aplicação dessa poderosa ferramenta para estudos em tempo real do comportamento das células da retina, patogênese da doença e eficácia das intervenções de terapia genética, oferecendo informações valiosas sobre a retina viva e suas conexões.

Introdução

Sendo a única parte opticamente acessível do sistema nervoso central, a retina serve como um modelo valioso para a pesquisa em neurociência1. As células ganglionares da retina (RGCs), os neurônios de saída da retina que transmitem informações visuais ao cérebro, desempenham um papel crucial na função visual. Sua perda ou disfunção leva à deficiência visual e cegueira irreversível, como visto no glaucoma e outras neuropatias ópticas2. A glia de Müller, as principais células gliais da retina, são essenciais para manter a homeostase retiniana, fornecendo suporte estrutural e metabólico aos neurônios, regulando os níveis de neurotransmissores e contribuindo para o reparo e regeneração da retina3. Sua disfunção está implicada em várias doenças da retina, incluindo retinopatia diabética4, degeneração macular relacionada à idade5 e síndrome isquêmica ocular6. RGCs e Müller glia exibem interações próximas e interdependência; A glia de Müller fornece suporte essencial aos RGCs, enquanto a atividade do RGC pode influenciar a função da glia de Müller 3,7. Estudar os RGCs e a glia de Müller é crucial para entender a função da retina e desenvolver tratamentos eficazes para várias doenças da retina.

As avaliações atuais na pesquisa da retina utilizam principalmente técnicas como a tomografia de coerência óptica (OCT) para medir a espessura da camada de fibras nervosas da retina ou as trajetórias dos feixes de axônios 8,9. Embora esses métodos sejam inestimáveis para detectar a perda de RGC, eles não fornecem uma visão detalhada da morfologia do RGC e das células gliais devido à resolução limitada. Da mesma forma, embora técnicas avançadas como a oftalmoscopia a laser de varredura de óptica adaptativa (AO-SLO) permitam imagens em nível celular de RGCs, fotorreceptores e células gliais na retina humana viva10, sua complexidade técnica e acessibilidade limitada limitam seu uso principalmente a ambientes de pesquisa especializados. Dadas essas restrições, há uma necessidade contínua de desenvolver métodos mais acessíveis e confiáveis para o estudo aprofundado de populações específicas de células da retina in vivo.

Assim, este protocolo visa introduzir uma abordagem de imagem alternativa adequada para aplicações de pesquisa em células da retina. Ele combina o poder da marcação específica do tipo de célula mediada por AAV com a natureza não invasiva da imagem CSLO. Os vírus adeno-associados (AAVs) são vetores versáteis de entrega de genes, conhecidos por sua baixa imunogenicidade e capacidade de transduzir uma ampla gama de tipos de células, incluindo células em divisão e não em divisão11. Isso os torna ferramentas ideais para atingir populações de células específicas dentro do complexo ambiente retiniano. Ao utilizar vetores AAV com sorotipos e promotores cuidadosamente selecionados, a expressão seletiva de proteínas fluorescentes pode ser alcançada em vários tipos de células de interesse, como RGCs e glia de Müller. Por exemplo, o AAV2 é conhecido por sua maior eficiência de transdução em RGCs12,13, enquanto o AAV8 é marcadamente eficaz no direcionamento de fotorreceptores14, e o AAV9 demonstra fortes capacidades de transfecção na glia de Müller15, mostrando ampla eficiência em várias camadas de células da retina. É importante notar que a eficácia do AAV depende não apenas da escolha do sorotipo, mas também dos promotores, que ditam a intensidade e a especificidade celular da expressão do transgene, ressaltando a importância da seleção cuidadosa para alcançar a transdução ideal.

Para a marcação RGC, este protocolo emprega AAV2 com o promotor da sinapsina humana (hSyn). AAV2 exibe transdução eficiente de RGCs após injeção intravítrea13, e o promotor hSyn, um promotor neuronal onipresente, impulsiona a expressão transgênica forte e específica dentro dessas células16. Para a glia de Müller, o protocolo utiliza vetores AAV9 impulsionados pelo promotor GfaABC1D17, que demonstra forte expressão transgênica nessas células15. Essa abordagem de rotulagem direcionada permite que os pesquisadores distingam essas células do tecido retiniano circundante e as rastreiem ao longo do tempo, fornecendo uma base para a vigilância in vivo das células da retina e suas respostas às mudanças bioambientais.

A oftalmoscopia confocal a laser de varredura (CSLO) é uma técnica de imagem não invasiva que fornece imagens de alta resolução da retina viva, permitindo a visualização em tempo real de populações de células retinianas marcadas com fluorescência 18,19,20. Um feixe de laser focalizado varre a retina, capturando a luz emitida que passa por um orifício para eliminar sinais fora de foco, resultando em imagens mais nítidas com contraste aprimorado. Este protocolo utiliza um sistema Heidelberg Spectralis CSLO, que tem sido amplamente utilizado para imagens de células da retina em animais vivos, incluindo estudos que visualizam RGCs marcados transgênicos21,22 e microglia23. Ao empregar a unidade HRA CSLO com um laser de 488 nm e filtros apropriados, os pesquisadores podem obter imagens de RGCs marcados com fluorescência ou glia de Müller em animais vivos após injeção intravítrea de vetores AAV portadores de genes repórteres fluorescentes. O protocolo de imagem longitudinal, com sessões semanais cobrindo a retina central e periférica, rastreia as mudanças ao longo do tempo. Para priorizar o bem-estar animal, o protocolo utiliza o sistema automático de rastreamento ocular (ART) da unidade HRA CSLO, permitindo a aquisição precisa de imagens sem a necessidade de anestesia geral ou lentes de contato.

Este protocolo aproveita o poder combinado do AAV e do CSLO para permitir o monitoramento longitudinal de tipos específicos de células da retina in vivo. Ao emparelhar a especificidade do tipo de célula da marcação mediada por AAV com os recursos de imagem não invasivos e de alta resolução do CSLO, esse método permite que os pesquisadores estudem as mudanças dinâmicas nos RGCs e na glia de Müller em resposta a vários estímulos ou intervenções. Esses insights têm um potencial significativo para informar o desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para doenças da retina.

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Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Capital Medical University, Pequim. Camundongos C57BL/6J machos adultos de quatro semanas de idade (pesando entre 15-20 g) foram usados para todos os experimentos e alojados em salas com temperatura controlada com um ciclo claro/escuro de 12/12 horas. Ração e água padrão para roedores estavam disponíveis ad libitum. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Transfecção de células da retina mediada por AAV

NOTA: Para transdução direcionada de RGCs, este protocolo usa AAV2-hSyn-eGFP, que incorpora o promotor hSyn para conduzir a expressão robusta de GFP aprimorada. A glia de Müller é direcionada usando AAV9-GfaABC1D-eGFP. Para alcançar a eficiência de transdução ideal e a expressão transgênica robusta, recomenda-se um título mínimo de AAV de 1 x 1012 genomas virais (vg) / mL para injeções intravítreas em camundongos13.

  1. Siga protocolos de segurança rigorosos ao realizar procedimentos de transfecção de células da retina mediados por AAV para evitar exposição acidental e garantir um ambiente de trabalho seguro.
  2. Realize todos os procedimentos envolvendo vetores virais em um gabinete de biossegurança certificado (BSC). Equipe o pessoal com equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo jalecos, luvas e proteção para os olhos, durante todo o procedimento.
  3. Descarte todos os materiais perfurocortantes e de risco biológico adequadamente de acordo com os protocolos de segurança institucionais para manter a conformidade e proteger todo o pessoal do laboratório.

2. Preparação de vetores virais e animais

  1. Obtenha os vetores AAV2-hSyn-eGFP ou AAV9-GfaABC1D-eGFP armazenados a -80 °C. Descongele os vetores no gelo imediatamente antes do uso para preservar a integridade viral.
  2. Anestesiar os camundongos com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico na dose de 50 mg / kg. Confirme a profundidade da anestesia testando os reflexos do pé traseiro antes de outras ações.
  3. Apare os bigodes para evitar interferência na área cirúrgica durante o procedimento. Desinfete a órbita com uma solução de iodopovidona a 20% por 2 s e, em seguida, enxágue abundantemente com solução salina normal estéril.
  4. Aplique uma gota de proparacaína a 0,5% topicamente para minimizar o desconforto e evitar movimentos oculares involuntários.

3. Manuseio e injeção intravítrea de vetores virais

  1. Transfira 1 μL de solução de AAV selecionada (AAV2-hSyn-eGFP ou AAV9-GfaABC1D-eGFP) para um pedaço de filme de parafina limpo e pré-resfriado para evitar flutuações de temperatura que possam afetar a atividade viral.
  2. Aspire a solução de AAV usando uma seringa de vidro Hamilton com uma agulha chanfrada de 33 G sob o microscópio cirúrgico oftálmico.
  3. Coloque o mouse em decúbito ventral sob o microscópio. Incline ligeiramente a cabeça para elevar o lado ocular pretendido para injeção. Ajuste e otimize a ampliação do microscópio para identificar claramente a região superior da órbita do mouse.
  4. Insira a agulha 1-2 mm posterior ao limbo na margem escleral superior do olho na cavidade vítrea. Injete as soluções de AAV lentamente para evitar refluxo ou danos induzidos por pressão.
    NOTA: Localização do local da injeção: Realize a injeção no quadrante temporal superior do olho, aproximadamente 1 mm posterior ao limbo. Escolha este local para evitar grandes vasos sanguíneos e minimizar o risco de danos ao cristalino. Evite locais de injeção muito próximos ao limbo para evitar a penetração da íris ou abrasão do cristalino. Evitando vasculatura: Use um microscópio cirúrgico para examinar cuidadosamente o local de injeção planejado para vasos sanguíneos visíveis antes da injeção. Se houver embarcações, ajuste ligeiramente o ponto de entrada para evitá-las. Insira a agulha em um ângulo raso, paralelo à íris, para reduzir ainda mais o risco de danos vasculares. Evite injeções repetidas na mesma área para reduzir o risco de hemorragia sub-retiniana.
  5. Mantenha a agulha no lugar por 30 s para permitir que os vetores se dispersem dentro da câmara vítrea e se depositem na superfície da retina, maximizando assim as chances de transdução bem-sucedida.
  6. Retire a agulha lentamente para minimizar o risco de refluxo vítreo.
  7. Aplique uma pomada antibiótica tópica no local da injeção imediatamente após a injeção. Certifique-se de que a pomada seja aplicada uniformemente para cobrir totalmente a superfície ocular, evitando infecções e inflamações oculares.
    NOTA: A pomada antibiótica contém 1 mg / g de dexametasona, 3500 UI / g de sulfato de neomicina e 6000 UI / g de sulfato de polimixina B.
  8. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal durante a recuperação da anestesia e monitore-o de perto quanto a quaisquer sinais de angústia ou anormalidades. Uma vez totalmente recuperados e sem complicações, devolva-os às suas gaiolas com acesso a comida e água normais.

4. Imagens in vivo com CSLO

  1. Preparação animal
    1. Selecione o camundongo infectado com AAV2-hSyn-eGFP ou AAV9-GfaABC1D-eGFP após 4 semanas de injeção intravítrea. Aplicar uma gota de uma solução ocular contendo tropicamida a 0,5% e fenilefrina a 0,5% na superfície ocular para dilatar a pupila até aproximadamente 2 mm de diâmetro22.
      NOTA: Recomenda-se um intervalo de tempo mínimo de 4 semanas de transdução de AAV para a marcação fluorescente ideal das células da retina após a injeção intravítrea13. Além disso, em nossos experimentos de esmagamento do nervo óptico (ONC), as retinas foram fotografadas 4 semanas após a infecção, bem como nos dias 7 e 14 após a lesão por esmagamento. Esses pontos de tempo foram escolhidos para capturar a expressão inicial de AAV e a progressão das alterações retinianas após ONC.
    2. Cubra a plataforma de imagem com um pedaço da almofada limpa para evitar a possível contaminação de excrementos de animais durante o processo de operação.
      NOTA: A plataforma de imagem personalizada oferece amplo espaço para o animal deitar de bruços, garantindo estabilidade e minimizando o movimento durante a contenção manual para uma aquisição de imagem ideal.
    3. Transfira cuidadosamente o mouse para a plataforma de imagem e permita um período de aclimatação de 2 a 5 minutos antes da imagem para minimizar o estresse e facilitar a adaptação ao ambiente de imagem.
    4. Com a ajuda de um segundo técnico, contenha suavemente o animal, mantendo um estado consciente durante todo o procedimento. Forneça um intervalo de descanso de 10 s após 15 s de imagem para permitir o piscar dos olhos e manter a umidade da córnea.
      NOTA: Esfregue suavemente a pele do couro cabeludo para induzir o levantamento espontâneo das pálpebras, evitando o uso de contenção forçada das pálpebras ou dispositivos adicionais, como clipes, reduzindo assim o risco de lesões oculares. A anestesia geral não é empregada para preservar a clareza óptica durante sessões de imagem prolongadas, pois tem o potencial de exacerbar a opacidade transitória do cristalino. Equilibre a aquisição de imagens de alta qualidade com conforto e segurança animal durante todo o procedimento. Conclua todo o procedimento em 5 minutos para garantir o bem-estar do animal e manter a qualidade da imagem.
    5. Ajuste a postura da cabeça e alinhe a lente da câmera ajustando o botão de foco (Figura 1B) e o micromanipulador (Figura 1C) para direcionar a região de interesse (ROI) para imagens in vivo subsequentes.
  2. Configuração do sistema
    1. Conecte uma lente grande angular de 55° sem contato na câmera para expandir o campo de view da área do fundo de olho.
    2. Coloque a roda do filtro na posição A (angiografia) para permitir a aquisição do modo de imagem de infravermelho (IR) e angiografia fluorescente (FA) (Figura 1A). Ligue o laser e a fonte de alimentação para ativar o sistema de imagem CSLO.
    3. Abra o software Heidelberg Eye Explorer e crie um novo exame clicando no ícone Novo Paciente na parte superior da barra de menus. Insira as informações relevantes do animal e aceite a curvatura padrão da córnea de 7,7 mm na janela pop-up.
    4. Selecione o botão amarelo Iniciar (Figura 1E) na tela do painel de controle para iniciar o modo de imagem ao vivo.
  3. Imagem CSLO in vivo
    1. Selecione o modo IR (Figura 1G) com autofluorescência no comprimento de onda de excitação de 820 nm no painel de controle. Para obter imagens de alta resolução, o Filtro de Alta Resolução. O modo (HR) é ativado através da interface da janela ou do painel de controle manual (Figura 1F).
      NOTA: A imagem de refletância infravermelha (IR) é normalmente o primeiro passo na imagem oftálmica CLSO, adquirida antes da angiografia com fluoresceína (FA), para fornecer uma visão de linha de base. Mesmo iluminação, artefatos mínimos e foco nítido nos principais vasos da retina são cruciais para a confiabilidade do foco no plano z e a obtenção de imagens IR de alta qualidade.
    2. Mova a lente em direção ao olho do mouse usando o joystick com o micromanipulador XYZ para ajuste fino. Examine a transparência óptica e gire o botão de sensibilidade (Figura 1D) no sentido anti-horário para diminuir o brilho da imagem do fundo para 40% -60%, evitando assim a superexposição do fundo e melhorando a visualização dos detalhes da retina.
    3. Ajuste o botão de foco e o micromanipulador até que o disco óptico e os vasos da retina sejam identificados de forma inequívoca no fundo.
      NOTA: Critérios do plano focal ideal: (1) Vista do fundo de olho uniformemente iluminada sem cantos escuros. (2) Iluminação uniforme ao redor do disco óptico sem manchas escuras focais ou distorção. (3) Forma clara do lúmen dos grandes vasos da retina com o movimento visível do fluxo sanguíneo.
    4. Mudar para o modo FA (figura 1H) com um laser azul de estado sólido a um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um filtro de barreira a 500 nm. Gire o botão de sensibilidade (Figura 1D) no sentido horário para aumentar o brilho da imagem do fundo de olho para 50% -107% para iluminar a área retiniana alvo.
    5. Defina o valor médio do ART (uma barra azul na parte inferior esquerda da interface do software) para pelo menos 15 para melhorar a relação sinal-ruído. Esta função calcula a média de uma série de B-scans adquiridos no mesmo local, melhorando a qualidade da imagem.
      NOTA: Embora um valor médio de ART mais alto geralmente melhore a qualidade da imagem por meio da média, ele também estende a duração da digitalização. Essa duração prolongada pode aumentar o risco de desidratação da córnea e fadiga animal, fatores que precisam ser cuidadosamente considerados, especialmente em imagens de animais acordados.
    6. Realinhe-se ao plano interno da retina, visando especificamente os RGCs que expressam GFP ou as células gliais de Müller. Ajustes finos são feitos para garantir uma iluminação nítida da população de células desejada, como soma RGC e axônios, ou o corpo celular de Müller. A sensibilidade da imagem é equilibrada para obter uma visualização ideal e evitar a supersaturação das células GFP-positivas.
      NOTA: Para obter as imagens com clareza e brilho comparáveis do sinal GFP, a aquisição de sensibilidade deve ser constante para todos os camundongos no experimento.
    7. Pressione o botão de sensibilidade (Figura 1D) para iniciar o modo ART, que gera uma imagem média ao vivo online. Aguarde até que a barra azul (representando o valor médio do ART) na parte inferior esquerda da interface do software atinja o valor de ART definido (≥ 20 quadros) e toque no botão Adquirir na interface de controle para capturar as imagens do fundo de olho.
      NOTA: Para o modo ART, o rastreamento ocular é incorporado para compensar automaticamente pequenos movimentos oculares durante a imagem in vivo , permitindo um foco consistente no plano focal retiniano selecionado.
    8. Depois de adquirir as imagens desejadas, saia do modo ART pressionando o botão de sensibilidade no painel de toque.
      NOTA: Para evitar o ressecamento da córnea e permitir o piscar espontâneo dos olhos, foram implementadas pausas de 10 s a cada 15 s durante o processo de imagem.
    9. Para navegar pelas áreas nasais e temporais da retina, mova a cabeça da câmera horizontalmente enquanto observa a imagem ao vivo na tela. Quando a região alvo for alcançada, ajuste o foco e inicie o processo de imagem conforme descrito nas etapas 2.3.1-2.3.8.
      NOTA: Mantenha movimentos lentos e controlados da câmera, garantindo uma iluminação consistente e brilhante do fundo. Se aparecerem áreas escuras, utilize o micromanipulador para ajustar a posição da câmera verticalmente e centralizar novamente a retina.
    10. Para obter imagens da retina superior, ajuste suavemente a postura da cabeça do mouse para a posição voltada para cima. Incline moderadamente a cabeça da câmera para cima para alinhar com a região superior da retina. Reajuste o foco conforme necessário e prossiga com a imagem.
    11. Após a conclusão da imagem, todas as regiões retinianas desejadas saem da janela de aquisição e as imagens são salvas automaticamente. Aplique lubrificante tópico no olho fotografado para manter a hidratação da córnea.
    12. Para iniciar o exame do olho contralateral, reposicione o animal para o lado oposto da plataforma e repita os passos 2.3.1-2.3.11.

5. Processamento e análise de imagem

  1. Exportação e preparação de imagens
    1. Abra o software Heidelberg Eye Explorer e selecione a sessão de imagem CSLO desejada com boa qualidade. Escolha imagens únicas ou consecutivas da mesma localização da retina com configurações de sensibilidade consistentes ao longo do tempo.
    2. Exclua imagens borradas com foco ruim ou clareza da córnea, garantindo que apenas imagens com visualização clara das estruturas da retina sejam usadas para análise. Exporte essas imagens no formato TIFF para processamento posterior.
  2. Alinhamento e corte de imagem
    1. Agrupe imagens por olho de camundongo com base na mesma região da retina.
      NOTA: As imagens originais adquiridas do sistema CSLO são salvas no seguinte formato: TIFF, com uma dimensão de 1536 x 1536 pixels, uma resolução de 5,69 um/pixel e um valor ART de ≥15.
    2. Para exames de acompanhamento, importe imagens para um software de processamento de imagem adequado. Gire e alinhe as imagens conforme necessário para corresponder à orientação da imagem de linha de base. Ao salvar ou exportar as imagens processadas, use configurações que mantenham a mais alta qualidade de imagem possível para minimizar possíveis artefatos de compactação.
    3. Alinhe as imagens CSLO de uma série temporal do mesmo olho, girando-as para corresponder à respectiva imagem de linha de base usando a vasculatura e o disco óptico como pontos de referência.
      NOTA: Examine cuidadosamente cada imagem alinhada e, antes de prosseguir com o corte, certifique-se de que elas atendam aos seguintes critérios: (1) Captura completa da região da retina: A imagem deve abranger totalmente a região retiniana de interesse pretendida, incluindo pontos de referência importantes como o disco óptico e os principais vasos sanguíneos; (2) Ausência de artefatos de movimento: A imagem deve estar livre de desfoque, listras ou duplicação de estruturas causadas pelo movimento dos olhos durante a imagem; (3) Distorção mínima: A imagem deve representar com precisão a estrutura da retina sem artefatos de deformação, alongamento ou compressão que possam surgir de ângulos de imagem ou efeitos de lente. (4) Equilíbrio das métricas de qualidade de imagem: Avaliações dos níveis de ruído de fundo (desvio padrão das intensidades de pixel em áreas livres de estrutura < 5 (escala de 0-255)); relação sinal-ruído (SNR >20), consistência de iluminação (Coeficiente de variação entre seis quadrantes da imagem <10%) e uniformidade da imagem (Coeficiente de variação em regiões homogêneas <15%).
    4. Selecione a imagem girada e exporte-a no formato TIFF. Para cada ponto de tempo, use a ferramenta de corte para selecionar e cortar aleatoriamente de 5 a 10 áreas (300 x 300 pixels cada) contendo células GFP positivas das imagens com qualidade aprovada. Exporte cada imagem cortada individualmente no formato TIFF para análise posterior.
  3. Medição da intensidade de fluorescência
    1. Abra as imagens CSLO cortadas (escala de cinza de 8 bits, 300 x 300 pixels) no ImageJ/Fiji.
    2. Para examinar as alterações gerais nos sinais fluorescentes, meça a intensidade total de fluorescência por imagem recortada usando Analisar > Medir (ou Ctrl + M). Registre o valor "Médio", representando a intensidade média de fluorescência GFP de toda a imagem recortada.
  4. Quantificação de RGC
    1. No ImageJ/Fiji, ajuste o limite de intensidade das imagens CSLO recortadas usando Image > Adjust > Brightness/Contrast para obter a visualização ideal de corpos de soma brancos individuais contra o fundo preto.
      NOTA: Determine um limite individualizado após revisar o lote de imagens cortadas ou aplique um algoritmo de limite consistente (por exemplo, o método5 de Huang em ImageJ/Fiji). Para o método de Huang: (1) Converta imagens em tons de cinza de 8 bits (Tipo de > de imagem > 8 bits). (2) Acesse a ferramenta de limite (Imagem > Ajustar > limite). (3) Selecione Huang como o método de limiar. (4) Visualize a segmentação e clique em Aplicar. O limite será calculado automaticamente e exibido no histograma da imagem.
    2. Ative o plug-in Cell Counter e clique em cada soma RGC positivo para GFP para contagem. Registre o número total de células marcadas na região analisada. Repita esse processo para todas as imagens cortadas de cada ponto de tempo de acompanhamento.
  5. Análise de dados
    1. Exporte os dados de contagem de células e intensidade de fluorescência para uma planilha ou software estatístico (por exemplo, GraphPad Prism).
    2. Realizar testes estatísticos apropriados com base no desenho experimental e nas hipóteses correspondentes. Interprete os resultados e conclua.

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Resultados

Seguindo o protocolo apresentado, diferentes células da retina foram visualizadas e rastreadas com sucesso in vivo usando uma combinação de entrega de genes mediada por AAV e CSLO. AAV2-hSyn-eGFP transduziu efetivamente RGCs, resultando em expressão robusta de eGFP em toda a retina, conforme confirmado por CSLO e colocalização com o marcador específico de RGC, proteína de ligação a RNA com splicing múltiplo (RBPMS), encontrada especificamente na camada de células ganglionares (Figura 2

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Discussão

O protocolo apresentado detalha um método robusto e acessível para vigilância in vivo de populações específicas de células da retina, aproveitando o poder da entrega de genes mediada por AAV e da imagem CSLO. Essa abordagem oferece várias vantagens em relação aos métodos tradicionais, facilitando estudos longitudinais da dinâmica das células da retina e suas respostas a lesões ou doenças em condições fisiológicas ou patológicas.

O sucesso desse método...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130029). A Figura 2A e a Figura 4A foram criadas com BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha de 33 GaugeHamilton Corp., Reno, NV, EUA7803-05Para injeção intravítrea
0,5% proparacaína Fornecedor:Santen Pharmaceutical Co., Ltd.Anestesióticos tópicos
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., ChinaTítulo de vírus: 2,7 x 1012 genomas virais (vg)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., ChinaTítulo de vírus: 4,5 x 1012 genomas virais (vg)/mL 
BetadineHealthy medical company001651Anti-sépticos tópicos
Pinça escelar da córnea (dentada)Mingren Eye Instruments, ChinaMR-F301APara pálpebra segura durante injeção intravítrea
Dumont 05# fórcepsFST51-AGT5385Para esmagamento do nervo óptico
PrismaGraphPad Prisma GraphPad, EUADesenho gráfico e análise estatística
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, AlemanhaModo"IR" e "FA" para imagens CSLO
Imagem J/FijiNational Institutes of Health, EUAProcessamento de imagem
Pomada antibiótica MaxitrolAlcon Laboratories, INC. EUA0065-0631Antibióticos tópicos
Seringa de microlitroHamilton Corp., Reno, NV, EUA7633-01Para injeção intravítrea
Mydrin-P Solução oftálmicaSanten Pharmaceutical Co.,Ltd, JapãoDilatação da pupila
Microscópio cirúrgico oftálmico Leica AG, Heerbrugg, SuíçaM220Para operações cirúrgicas
Pentorbarbitol SódioSigma Aldrich, EUA57-33-0Anestesia Genérea
PowerpointMicrosoft Corporation, EUAAlinhamento e corte de imagens
VISCOTEARS Gel Líquido (Carbômero)Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, AlemanhaLubrificante tópico 

Referências

  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Prog Retin Eye Res. 57, 89-107 (2017).
  2. Ju, W. K., et al. Glaucomatous optic neuropathy: Mitochondrial dynamics, dysfunction and protection in retinal ganglion cells. Prog Retin Eye Res. 95, 101136(2023).
  3. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  4. Llorián-Salvador, M., Cabeza-Fernández, S., Gomez-Sanchez, J. A., De La Fuente, A. G. Glial cell alterations in diabetes-induced neurodegeneration. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 47(2024).
  5. Zhao, N., Hao, X. N., Huang, J. M., Song, Z. M., Tao, Y. Crosstalk between microglia and müller glia in the age-related macular degeneration: Role and therapeutic value of neuroinflammation. Aging Dis. 15 (3), 1132-1154 (2023).
  6. Minhas, G., Sharma, J., Khan, N. Cellular stress response and immune signaling in retinal ischemia-reperfusion injury. Front Immunol. 7, 444(2016).
  7. Miao, Y., Zhao, G. L., Cheng, S., Wang, Z., Yang, X. L. Activation of retinal glial cells contributes to the degeneration of ganglion cells in experimental glaucoma. Prog Retin Eye Res. 93, 101169(2023).
  8. Leung, C. K. S., et al. Diagnostic assessment of glaucoma and non-glaucomatous optic neuropathies via optical texture analysis of the retinal nerve fibre layer. Nat Biomed Eng. 6 (5), 593-604 (2022).
  9. Hood, D. C., et al. Detecting glaucoma with only OCT: Implications for the clinic, research, screening, and AI development. Prog Retin Eye Res. 90, 101052(2022).
  10. Burns, S. A., Elsner, A. E., Sapoznik, K. A., Warner, R. L., Gast, T. J. Adaptive optics imaging of the human retina. Prog Retin Eye Res. 68, 1-30 (2019).
  11. Dinculescu, A., Glushakova, L., Min, S. H., Hauswirth, W. W. Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease. Hum Gene Ther. 16 (6), 649-663 (2005).
  12. Nickells, R. W., Schmitt, H. M., Maes, M. E., Schlamp, C. L. AAV2-mediated transduction of the mouse retina after optic nerve injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (14), 6091-6104 (2017).
  13. Cao, X., Yung, J., Mak, H., Leung, C. K. S. Factors governing the transduction efficiency of adeno-associated virus in the retinal ganglion cells following intravitreal injection. Gene Ther. 26 (3-4), 109-120 (2019).
  14. Vandenberghe, L. H., et al. Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Sci Transl Med. 3 (88), 88ra54(2011).
  15. Gao, Y., et al. Develop an efficient and specific AAV-based labeling system for Muller glia in mice. Sci Rep. 12 (1), 22410(2022).
  16. Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: Comparison of five promoters. Gene Ther. 30 (6), 503-519 (2023).
  17. Kawabata, H., et al. Improving cell-specific recombination using AAV vectors in the murine CNS by capsid and expression cassette optimization. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (1), 101185(2024).
  18. Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Sci Rep. 8 (1), 1490(2018).
  19. Smith, C. A., Chauhan, B. C. Imaging retinal ganglion cells: Enabling experimental technology for clinical application. Prog Retin Eye Res. 44, 1-14 (2015).
  20. Leung, C. K. S., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (11), 4898(2008).
  21. Leung, C. K. S., et al. In vivo imaging of murine retinal ganglion cells. J Neurosci Methods. 168 (2), 475-478 (2008).
  22. Mak, H. K., Ng, S. H., Ren, T., Ye, C., Leung, C. K. S. Impact of PTEN/SOCS3 deletion on amelioration of dendritic shrinkage of retinal ganglion cells after optic nerve injury. Exp Eye Res. 192, 107938(2020).
  23. Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo imaging of Cx3CR1GFP/GFP reporter mice with spectral-domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy. J Vis Exp. (129), e55984(2017).
  24. Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
  25. Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: Oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
  26. LaRocca, F., et al. Optimization of confocal scanning laser ophthalmoscope design. J Biomed Opt. 18 (7), 076015(2013).
  27. Vienola, K. V., et al. Real-time eye motion compensation for OCT imaging with tracking SLO. Biomed Opt Express. 3 (11), 2950-2963 (2012).
  28. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  29. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: Confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731(2015).
  30. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157-6170 (2021).
  31. Chaffiol, A., et al. A new promoter allows optogenetic vision restoration with enhanced sensitivity in macaque retina. Mol Ther. 25 (11), 2546-2560 (2017).
  32. Li, L., et al. Longitudinal in vivo Ca2+ imaging reveals dynamic activity changes of diseased retinal ganglion cells at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (48), e2206829119(2022).
  33. Bille, J. F. Optical Coherence Tomography (OCT): Principle and technical realization. High-resolution imaging in microscopy and ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics. , Springer International Publishing. 59-85 (2019).
  34. Spaide, R. F., et al. Lateral resolution of a commercial optical coherence tomography instrument. Transl Vis Sci Technol. 11 (1), 28(2022).
  35. Franze, K., et al. Muller cells are living optical fibers in the vertebrate retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8287-8292 (2007).

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