Fabricação e caracterização de adesivos de microagulhas para carregamento e entrega de exossomos

Resumo

Os exossomos possuem potencial clínico significativo, mas sua aplicação prática é limitada devido à fácil depuração in vivo e baixa estabilidade. As microagulhas apresentam uma solução ao permitir a entrega localizada, perfurando barreiras fisiológicas e preservação do estado seco, abordando assim as limitações da administração de exossomos e expandindo sua utilidade clínica.

Resumo

Os exossomos, como bioterapêuticos emergentes de "próxima geração" e vetores de entrega de medicamentos, possuem imenso potencial em diversos campos biomédicos, desde a administração de medicamentos e medicina regenerativa até o diagnóstico de doenças e imunoterapia tumoral. No entanto, a rápida depuração por injeção tradicional em bolus e a baixa estabilidade dos exossomos restringem sua aplicação clínica. As microagulhas servem como uma solução que prolonga o tempo de residência dos exossomos no local de administração, mantendo assim a concentração do medicamento e facilitando os efeitos terapêuticos sustentados. Além disso, as microagulhas também possuem a capacidade de manter a estabilidade de substâncias bioativas. Portanto, introduzimos um adesivo de microagulha para carregar e entregar exossomos e compartilhamos os métodos, incluindo isolamento de exossomos, fabricação e caracterização de adesivos de microagulhas carregados com exossomos. Os adesivos de microagulhas foram fabricados usando trealose e ácido hialurônico como materiais de ponta e polivinilpirrolidona como material de suporte por meio de um método de fundição em duas etapas. As microagulhas demonstraram resistência mecânica robusta, com pontas capazes de suportar 2 N. A pele de porco foi usada para simular a pele humana, e as pontas das microagulhas derreteram completamente dentro de 60 s após a punção da pele. Os exossomos liberados das microagulhas exibiram morfologia, tamanho de partícula, proteínas marcadoras e funções biológicas comparáveis às dos exossomos frescos, permitindo a captação de células dendríticas e promovendo sua maturação.

Introdução

Os exossomos, que são pequenas vesículas liberadas pelas células na matriz extracelular, têm sido propostos como potenciais vetores bioterapêuticos e de liberação de fármacos para o tratamento de diversas doenças e cânceres¹. Durante seu processo de biogênese, os exossomos encapsulam várias moléculas biologicamente ativas de dentro das células, incluindo proteínas funcionais e ácidos nucléicos². Como resultado, quando absorvidos pelas células receptoras durante o processo de transporte, os exossomos têm a capacidade de modular a expressão gênica e as funções celulares nas células-alvo³. Como uma espécie de mensageiro natural de informações, os exossomos foram totalmente aproveitados na regeneração de tecidos, regulação imunológica e como portador de entrega⁴. Por meio de técnicas de engenharia, ligantes específicos podem ser enriquecidos na superfície dos exossomos, permitindo a indução ou inibição de eventos de sinalização em células receptoras ou visando tipos específicos^{de células 5}. Agentes quimioterápicos também podem ser carregados em exossomos para tratamento do câncer⁶. Além disso, os exossomos têm a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica para entrega de carga terapêutica, tornando-os altamente promissores para o tratamento de distúrbios cerebrais⁷. Em comparação com os lipossomas, os exossomos exibem maior captação celular e melhor biocompatibilidade⁸. Eles são capazes de entrar com eficiência em outras células, demonstrando melhor tolerância e menor toxicidade⁹. No entanto, a injeção tradicional de exossomos em bolus é propensa a sequestro e rápida depuração pelo fígado, rins e baço na corrente sanguínea¹⁰. Além disso, os exossomos têm baixa estabilidade in vitro e são suscetíveis a condições de armazenamento, o que restringe suas aplicações clínicas¹¹.

As microagulhas, uma série de pontas de agulha de tamanho micrométrico, têm a capacidade de penetrar nas barreiras fisiológicas para a entrega de medicamentos de moléculas pequenas¹², proteínas¹³, ácidos nucléicos¹⁴ e nanomedicamentos¹⁵. As microagulhas são projetadas com precisão para atingir lesões na superfície da pele, e suas pontas dispersas garantem a distribuição uniforme do medicamento no local alvo, ampliando assim seu impacto terapêutico¹⁶. O design e a composição do material das microagulhas facilitam o armazenamento seco de substâncias bioativas, como proteínas e ácidos nucléicos, aumentando sua estabilidade¹⁷. Os métodos tradicionais de injeção têm uma duração de ação relativamente curta e podem causar dor, induzindo medo nos pacientes¹⁸. O comprimento micrométrico da microagulha minimiza o trauma tecidual e evita a estimulação nervosa, eliminando a dor e melhorando a adesão do paciente¹⁹. Além disso, a natureza amigável das microagulhas permite que os pacientes autoadministrem o tratamento sem a necessidade de pessoal especializado¹⁶. Além da pele, as microagulhas também podem ser usadas em tecidos como olhos²⁰, mucosa oral²¹, coração²² e vasos sanguíneos²³. A aplicação de microagulhas para a entrega clínica de exossomos fornece uma estratégia promissora e prospectiva.

Portanto, introduzimos um adesivo de microagulha (exo@MN) carregado com exossomos e divulgamos seu método de fabricação. Os adesivos de microagulhas foram fabricados usando um método de fundição em duas etapas, juntamente com centrifugação e secagem a vácuo, que promove a agregação de exossomos nas pontas das microagulhas, aumentando assim a eficiência da entrega. Tanto as pontas das agulhas quanto o suporte foram construídos com materiais que apresentam excelente biocompatibilidade e solubilidade em água. A trealose e o ácido hialurônico (AH) foram incorporados como materiais de ponta para fornecer proteção aos exossomos, e a polivinilpirrolidona (PVP) dissolvida em etanol absoluto foi escolhida como material de suporte. A morfologia do adesivo de microagulha foi caracterizada por microscopia e microscópio eletrônico de varredura (MEV). O teste mecânico da microagulha foi avaliado usando um medidor de tração para confirmar sua capacidade de penetrar na pele, e a taxa de liberação na pele de porco foi investigada em 60 s. Além disso, a morfologia, o tamanho e o conteúdo proteico dos exossomos frescos e dos exossomos em exo@MN foram caracterizados usando microscópio eletrônico de transmissão (TEM), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e western blotting (WB). A internalização dos exossomos pelas células dendríticas (DCs) foi caracterizada por meio de microscópio confocal de varredura a laser (CLSM), e a maturação das DCs foi avaliada por citometria de fluxo. A caracterização morfológica e as funções biológicas dos dois tipos de exossomos são essencialmente consistentes.

Protocolo

Este estudo não requer autorização ética, uma vez que a pele de suíno utilizada para as experiências descritas na secção 3 foi adquirida como orelhas de porco comestíveis no mercado e não proveniente de animais experimentais.

1. Isolamento de exossomos

1. Cultura de células
   1. Cultive células de câncer epitelial de ovário de camundongo ID8 no meio de cultura Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de solução de penicilina-estreptomicina (100×) (ver Tabela de Materiais) em placas de Petri com diâmetro de 15 cm.
   2. Incubar células ID8 em uma incubadora de CO₂ (ver Tabela de Materiais) a 37 ° C e 5% de CO₂ até que a densidade celular atinja 90%.
2. Isolamento de exossomos
   1. Remova o meio de cultura das placas de Petri e lave duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Adicione 20 mL de DMEM sem soro fetal bovino (ver Tabela de Materiais) e solução de penicilina-estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Continuar a incubação a 37 °C e 5% de CO₂ durante 48 h.
   2. Colher o sobrenadante da cultura celular de 20 placas de Petri de 15 cm de diâmetro. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante para remoção das células livres.
   3. Centrifugar a 2000 x g durante 10 min 4 °C e recolher o sobrenadante para remover os detritos celulares.
   4. Conecte o sistema de filtragem a vácuo descartável de 0.22 μm (consulte a Tabela de Materiais) à bomba de vácuo de água circulante (consulte a Tabela de Materiais). Crie um vácuo para permitir que o sobrenadante passe pela membrana de poliéter sulfona de 0,22 μm e entre na câmara inferior do sistema de filtração, removendo efetivamente vesículas ou impurezas maiores que 0,22 μm do sobrenadante.
      1. Para conectar a bomba de vácuo, ligue o interruptor da bomba e, em seguida, conecte-o à entrada de ar do sistema de filtragem a vácuo. Ao fechar, desconecte primeiro a conexão com a bomba e depois desligue a bomba de vácuo. Este procedimento ajuda a evitar o refluxo da bomba de vácuo e a contaminação do fluido de cultura.
   5. Adicione 15 mL de sobrenadante ao tubo interno do tubo de ultrafiltração de 100 kDa (consulte a Tabela de Materiais). Centrifugue a 3500 x g por 10 min a 4 °C e remova o líquido do tubo externo.
      NOTA: Retenha partículas maiores que 100 kDa na membrana do tubo interno, enquanto proteínas menores que 100 kDa serão centrifugadas no tubo externo junto com a solução. Os exossomos eram maiores que 100 kDa e estavam agregados na membrana do tubo interno.
   6. Repita as etapas acima até que o volume total do líquido esteja dentro de 5 mL. Colete o líquido do tubo interno e adicione 1 mL de DPBS. Use uma pipeta para pipetar repetidamente no tubo interno, garantindo a ressuspensão dos exossomos anexados na DPBS e, em seguida, colete-os.
   7. Centrifugue a 10000 x g durante 60 min a 4 °C e transfira o sobrenadante para um tubo de centrifugação rápida de 6 ml (ver Tabela de Materiais). Sele o tubo com um selador térmico.
   8. Centrifugue a 100.000 x g por 2 h 4 °C usando uma ultracentrífuga (ver Tabela de Materiais). Abra o tubo de centrífuga de encaixe rápido, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de DPBS. Esta é a solução do exossomo.
      NOTA: Durante o processo de ressuspensão do pellet, é necessário pipetar e agitar a parede do tubo pelo menos 200 vezes usando uma pipeta.

2. Fabricação de exo@MN

1. Preparação do molde mestre
   1. Construa um modelo de microagulha com uma matriz de 10 x 10 usando software CAD, apresentando pontas cônicas com os seguintes parâmetros: uma altura de 1200 μm, um diâmetro de base de 400 μm e um passo (distância entre microagulhas adjacentes) de 900 μm.
   2. Use resina HTL como material e imprima o molde mestre da microagulha usando uma impressora 3D (consulte a Tabela de Materiais).
   3. Mergulhe o molde mestre em etanol absoluto por 1 h para remover qualquer resina aderida à superfície.
   4. Exponha o molde à luz ultravioleta por 5 min para curá-lo.
   5. Mergulhar novamente o molde em etanol absoluto durante 1 h, seguido de secagem a 60 °C em estufa de secagem durante 1 h. O molde mestre está pronto.
2. Preparação do molde de produção
   1. Misture os componentes A e B do polidimetilsiloxano (PDMS, consulte a Tabela de Materiais) na proporção de 10:1. Mexa bem e despeje a mistura em um molde mestre.
   2. Coloque o molde PDMS sob uma pressão de 1 psi por 15 min para remover as bolhas de ar da mistura PDMS.
   3. Catalise o molde PDMS a 60 °C durante 2 h e depois desmolde para obter o molde de produção da microagulha.
   4. Limpe o molde de produção com água ultrapura antes de usar.
3. Preparação da solução
   1. Quantificar o teor proteico da solução de exossomas utilizando um kit de ensaio BCA (ver Tabela de Materiais). Adicione uma quantidade adequada de DPBS para atingir uma concentração de 10 μg/μL para a solução de exossomo.
   2. Preparar uma solução de trealose a 200 mg/ml (ver Tabela de Materiais) utilizando a DPBS como solvente. Mexa por 20 min para garantir a dissolução completa.
   3. Prepare uma solução de ácido hialurônico (HA) a 200 mg / mL, consulte a Tabela de Materiais) usando DPBS como solvente. Mexa durante a noite para garantir a dissolução total.
   4. Preparar uma solução de 150 mg/ml de polivinilpirrolidona (PVP, ver Tabela de Materiais) utilizando etanol absoluto como solvente. Mexa durante a noite para garantir a dissolução total.
   5. Misture a solução de exossomo (10 μg/μL) e a solução de trealose (200 mg/mL) em uma proporção de volume de 1:1. Em seguida, adicione um volume igual de solução de AH (200 mg/mL). Misture bem para obter a solução de ponta.
4. Fabricação de exo@MN
   1. Processe a superfície do molde PDMS usando um limpador de plasma (consulte a Tabela de Materiais) por 30 s em um grau baixo para aumentar sua hidrofilicidade.
   2. Adicione 40 μL da solução da ponta ao molde PDMS. Centrifugue à temperatura ambiente (RT) e 3000 x g por 3 min para garantir que o líquido preencha a camada de agulha do molde.
   3. Remova o excesso de líquido no molde e seque em RT em um forno de secagem a vácuo (consulte a Tabela de Materiais) por 1 dia.
   4. Adicione 200 μL de solução PVP ao molde PDMS. Centrifugue 3000 x g por 3 min em RT para garantir que o líquido preencha a camada de suporte do molde.
   5. Seque o molde em RT em um forno de secagem por 1 dia e, em seguida, desmolde para obter o adesivo exo@MN.
      NOTA: Mantenha o adesivo exo@MN armazenado em um forno de secagem até que esteja pronto para uso.

Figura 1: Processo de fabricação de patches exo@MN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Caracterização de manchas exo@MN

1. Observação da morfologia
   1. Cole o suporte do adesivo em uma superfície inclinada de 45° e posicione-o sob um microscópio estéreo (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Ligue o iluminador e capture a morfologia do adesivo usando uma objetiva 4x.
2. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
   1. Prenda o adesivo ao sample stage usando adesivo condutor e trate-o com um revestidor fino automático (consulte a Tabela de Materiais) por 30 s.
   2. Capture imagens do patch exo@MN usando SEM (consulte a Tabela de Materiais) com uma tensão de aceleração de 1 kV.
3. Testes mecânicos
   1. Corte uma matriz 3 x 3 do remendo e coloque-a com as pontas voltadas para cima na plataforma rígida de um medidor de tração (consulte a Tabela de Materiais). Ajuste a altura da sonda para aproximá-la das pontas da agulha sem tocá-las.
   2. Defina os parâmetros para parar quando a pressão atingir 20 N automaticamente. Comprima as pontas da agulha verticalmente a uma velocidade de 0,5 mm/min e registre a carga versus o perfil de deslocamento.
4. Dissolução
   1. Compre orelhas de porco frescas no mercado e corte-as em pedaços (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Espalhe a pele de porco sobre uma mesa e use papel para secar a umidade da superfície.
   2. Prepare quatro adesivos de microagulhas secos com as pontas das agulhas voltadas para baixo na pele do porco, espaçando cada adesivo ligeiramente. Usando o polegar e o indicador, pressione verticalmente cada adesivo de microagulha. Remova um adesivo a cada 15 s.
   3. Coloque imediatamente o adesivo removido em um forno de secagem e seque por 5 min. Corte uma coluna de pontas de microagulhas, coloque-as horizontalmente sob um microscópio (consulte a Tabela de Materiais) e use uma lente objetiva 4x para observar a dissolução das pontas.

4. Caracterização de exossomos em exo@MN patch

NOTA: As pontas das microagulhas de exo@MN são dissolvidas em 100 μL de solução de DPBS para realizar a seguinte caracterização nos exossomos liberados.

1. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
   1. Trate a malha de cobre (ver Tabela de Materiais) com um tratamento hidrofílico usando um limpador de íons (ver Tabela de Materiais) por 5 min.
   2. Dispense 10 μL da amostra no lado de carbono da malha de cobre. Deixe repousar por 1 min e, em seguida, remova o líquido enxugando-o com papel de filtro pelas bordas.
   3. Adicione 10 μL de acetato de uranilo a 3% (consulte a Tabela de Materiais) à amostra. Deixe repousar por 10 s e, em seguida, remova o líquido enxugando com papel de filtro das bordas.
   4. Adicione 10 μL de acetato de uranilo a 3% à amostra. Deixe repousar por 1 min, depois remova o líquido enxugando-o com papel de filtro das bordas e seque ao ar em RT.
   5. Capture imagens dos exossomos usando MET (consulte a Tabela de Materiais) com uma tensão de aceleração de 80 kV.
2. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
   1. Diluir a solução de exossomo com DPBS para atingir uma concentração de partículas de 1 x 10⁷ partículas/ml. Injete lentamente 1 ml da solução de exossoma na câmara de recolha da NTA utilizando uma seringa de 1 ml (ver Tabela de Materiais).
   2. Defina o tipo de procedimento operacional padrão (SOP) do instrumento para EV-488 para detectar a distribuição de tamanho dos exossomos.
3. Western blotting (WB)
   1. Prepare o tampão de lise misturando o tampão de lise do ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA): fluoreto de fenilmetanossulfonilo (ver Tabela de Materiais) na proporção de 100:1. Lise os exossomos no gelo por 20 min, fazendo vórtice a cada 10 min.
   2. Centrifugar a solução a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Colete o sobrenadante para medir a concentração de proteínas.
   3. Adicione 5x tampão de carregamento SDS-PAGE (consulte a Tabela de Materiais) ao sobrenadante em uma proporção de volume de 1: 4 e misture bem. Aqueça a 100 °C por 10 min para desnaturar as proteínas.
   4. Adicione 5 μL de um marcador de proteína pré-corado de 180 kDa (consulte a Tabela de Materiais) e 10 μg de amostra desnaturada a um gel pré-moldado a 4% -20% (consulte a Tabela de Materiais). Execute o sistema de eletroforese (consulte a Tabela de Materiais) a 60 V por 10 min e depois a 140 V por 50 min.
   5. Transfira as proteínas do gel para uma membrana de PVDF (ver Tabela de Materiais) pré-ativada com metanol. Execute o sistema de eletroforese a 290 mA por 90 min em gelo.
   6. Incube a membrana de PVDF em solução de leite desnatado a 5% por 1 h. Lave três vezes com solução salina tamponada com tris com tween (TBST, consulte a Tabela de Materiais) por 5 min cada.
   7. Corte as faixas-alvo com base na posição da proteína. Incubar as bandas com anticorpo CD63 anti-rato e anticorpo Alix anti-rato (ver Tabela de Materiais) diluídas até à concentração apropriada de acordo com as instruções do fabricante e incubar durante a noite a 4 °C.
   8. Lave as pulseiras três vezes com TBST. Incubar com IgG anti-coelho conjugada com HRP (ver Tabela de Materiais) em RT por 1 h. Em seguida, lave três vezes com TBST novamente.
   9. Aplique um reagente de detecção super ECL (consulte a Tabela de Materiais) para cobrir a superfície das bandas e exponha e capture imediatamente as bandas usando um gerador de imagens de gel (consulte a Tabela de Materiais).
4. Microscopia confocal de varredura a laser (CLSM)
   1. Cultive 5 x 10⁵ DCs em um prato confocal usando 2 mL de meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar exossomas ou exo@MN e incubar a 37 °C durante 24 h.
   2. Adicione uma gota de Hoechst 33342 a cada placa confocal e incube no escuro a 37 °C durante 20 min.
   3. Realize imagens com um CLSM (consulte a Tabela de Materiais) usando uma lente objetiva de 60x. Aplique uma gota de óleo de imersão (consulte a Tabela de Materiais) na lente e coloque o prato confocal no palco. Ajuste os eixos x/y/z para localizar o plano focal apropriado das células.
   4. Inicie a imagem com canais DAPI/TRITC/TD, selecione uma resolução de 1024 px e defina o modo rápido para 1/8 s.
5. Citometria de fluxo
   1. Cultive DCs em uma placa de 6 poços, cada poço contendo 5 x 10⁵ células e 2 mL de meio 1640. Adicionar volumes iguais de solução de DPBS, exossomas, microagulhas sem exossomas e exo@MN, respetivamente, e incubar a 37 °C durante 24 h.
   2. Transfira o meio de cada poço para tubos centrífugos. Centrifugue a 300 x g durante 3 min a 4 °C e retire o sobrenadante.
   3. Adicione 0,5 μL de anticorpo FITC-CD11c, 2,5 μL de anticorpo APC-CD80 e 0,5 μL de anticorpo Pacific Blue I-A/I-E (consulte a Tabela de Materiais) a 100 μL de solução BSA a 5% (consulte a Tabela de Materiais). Misture bem, ressuspenda as células e incube em uma coqueteleira no gelo e no escuro por 20 min.
   4. Adicione 1 mL de DPBS e centrifugue a 300 x g por 3 min a 4 ° C e, em seguida, remova o sobrenadante. Repita a lavagem duas vezes para remover os anticorpos não ligados e, em seguida, prossiga para analisar os canais fluorescentes correspondentes por citometria de fluxo (consulte a Tabela de Materiais).
      1. Primeiro, no gráfico de dispersão FSC-A/SSC-A, coloque a população de células principal como P1. No gráfico de dispersão SSC-A/SSC-H da população de células P1, faça o gate de uma região quadrada P2 ao longo da diagonal para remover as células agregadas.
      2. Realize a análise de fluorescência na população de células P2 usando os canais FITC, APC e Pacific Blue. Defina a condição de parada para coletar 10.000 células na porta P2.

5. Análise estatística

1. Expresse dados quantitativos como médias ± desvios padrão (DP). Avalie a significância estatística usando a análise do teste t usando um aplicativo de software de análise de dados apropriado. Considere valores de p menores que 0,05 para indicar significância estatística. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultados

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de exossomos, fabricação e caracterização de exo@MN patch. A Figura 1 ilustra o fluxograma do processo para a fabricação de exo@MN patch. Os exossomos foram misturados com trealose e AH, e a mistura foi então adicionada ao molde de microagulhas e centrifugada. Esse processo facilitou a agregação de exossomos nas pontas das agulhas, promovendo liberação rápida. Após a secagem, a solução de PVP foi adicionada e centrifugada para preencher completamente o molde. Após a secagem completa, o molde foi removido para obter os adesivos exo@MN. A morfologia das microagulhas foi caracterizada por microscopia e MEV, conforme mostrado na Figura 2. As pontas do remendo exo@MN exibiam uma forma cônica disposta em uma matriz de 10 x 10 com pontas de agulha afiadas e intactas. A ponta da microagulha pode suportar uma força de 2 N, permitindo que ela penetre através da barreira da pele. Além disso, a pele suína foi empregada como substituta da pele humana para simular a aplicação de adesivos exo@MN. Os adesivos foram pressionados sobre a pele do porco para observar o tempo de liberação, com as pontas das microagulhas derretendo completamente em 60 s. Os remendos exo@MN foram dissolvidos em DPBS e caracterizados, conforme mostrado na Figura 3. As imagens MET capturaram vesículas com estruturas típicas em forma de taça, consistentes com a morfologia dos exossomos. A distribuição granulométrica da solução exo@MN por NTA revelou que as partículas estavam predominantemente concentradas na faixa de 50-250 nm. No entanto, também havia algumas partículas maiores presentes, o que pode ser atribuído às propriedades adesivas do material HA, causando agregação de exossomos. A análise WB das proteínas CD63 / Alix na solução exo@MN demonstrou que exo@MN era capaz de reter parcialmente proteínas de exossomos. A funcionalidade biológica dos exossomos liberados do exo@MN foi validada na Figura 4, com foco na captação de exossomos pelas células e na ativação de células dendríticas em comparação com exossomos frescos. As imagens do CLSM confirmaram a captação eficiente de exossomos frescos e exossomos no exo@MN por DCs. Imagens representativas e estatísticas proporcionais da citometria de fluxo demonstram que os exossomos em exo@MN possuem funções biológicas que promovem a ativação de DCs semelhantes aos exossomos frescos.

Figura 2: Caracterização de exo@MN patches. (A) Imagens de microscópio estéreo de exo@MN patches. Barra de escala = 400 μm. (B) Imagem SEM de exo@MN patches. Barra de escala = 200 μm. (C) Os perfis de carga versus deslocamento de exo@MN patch. (D) Imagens microscópicas de manchas de exo@MN inseridas na pele de porco em momentos diferentes. Barra de escala = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Caracterização de exossomos frescos e exossomos em exo@MN. (A) Morfologia dos exossomos por TEM. Barra de escala = 100 nm. (B) Distribuição granulométrica dos exossomos por NTA. (C) CD63 e Alix de exossomos por WB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Testes biológicos de exossomos e exossomos frescos em exo@MN. (A) Imagens CLSM de exossomos captados por DCs. Barra de escala = 10 μm. (B) Gráficos representativos de ativação de DCs por citometria de fluxo. (C) Quantificação da porcentagem de CDs CD11c⁺CD80⁺MHCII⁺ . Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Atualmente, os principais métodos de isolamento de exossomos incluem ultracentrifugação, centrifugação com gradiente de densidade, ultrafiltração, precipitação, esferas magnéticas de imunoafinidade e microfluídica²⁴. Devido à capacidade de carga limitada das microagulhas causada por seu pequeno espaço na ponta da agulha, é necessário aumentar a concentração de exossomos para carregar mais. Portanto, escolhemos a ultrafiltração para concentrar o sobrenadante da cultura de células e, em seguida, usamos a ultracentrifugação para isolar os exossomos. A concentração de exossomos foi aumentada por uma pequena quantidade de ressuspensão líquida para que as microagulhas pudessem ser carregadas com dezenas a centenas de microgramas de exossomos. No entanto, este método resulta em uma presença significativa de proteínas na solução isolada do exossomo. Além disso, ocorre uma perda substancial de exossomos durante o processo de centrifugação. Atualmente, uma das limitações da aplicação terapêutica de exossomos é a falta de métodos eficazes para isolar exossomos com alta pureza e em grandes quantidades. Como o potencial clínico dos exossomos está sendo cada vez mais explorado, é necessário desenvolver técnicas mais avançadas no futuro para enfrentar os desafios associados à sua extração.

A tecnologia-chave neste estudo é o design de microagulhas baseadas em exossomos. A fim de minimizar o desperdício de exossomos e obter efeitos terapêuticos mais fortes, um método de fundição em duas etapas foi adotado para fabricar exo@MN adesivos. A trealose foi relatada anteriormente como um material adequado para a preservação liofilizada de exossomos²⁵, enquanto o AH exibe excelente biocompatibilidade, hidrofilicidade e funções na inibição da inflamação e promoção do reparo da pele²⁶. A fabricação de pontas de agulha carregadas de exossomos usando esses dois materiais ajuda a manter a atividade biológica dos exossomos, permitindo sua rápida dissolução e liberação na pele. Além disso, essa abordagem minimiza o risco de infecção e contribui para a rápida recuperação da pele. Por centrifugação e secagem a vácuo, os exossomos foram concentrados nas pontas das microagulhas. Considerando a incompatibilidade do etanol e da trealose, o PVP dissolvido em etanol absoluto foi selecionado como material de suporte. Este método de fabricação em camadas aumentou efetivamente a eficiência de entrega dos exossomos.

A fraca estabilidade dos exossomos in vitro, quer sejam armazenados a 4 °C, 37 °C ou -80 °C, pode levar a alterações na estrutura ou degradação dos exossomas¹¹. Para resolver esse problema, vários estudos têm explorado os métodos de armazenamento de exossomos, como a liofilização. A tecnologia de microagulhas fornece outra estratégia inovadora. Ao secar em RT, a tecnologia de microagulhas pode melhorar a estabilidade dos exossomos e pode ser usada diretamente para entrega de exossomos sem outros tratamentos. Além disso, o processo de extração de exossomos é complexo e propenso à degradação, tornando as aplicações em larga escala desafiadoras. O armazenamento de exossomos extraídos usando a tecnologia de microagulhas não simplifica as etapas de extração, mas reduz o número de extrações necessárias. Uma única extração pode produzir uma grande quantidade de exo@MN patches, que podem ser armazenados por um longo período. A utilização de microagulhas de exossomos do mesmo lote para cada tratamento minimiza o impacto potencial de variações entre diferentes lotes nos resultados terapêuticos, aumentando assim a repetibilidade e a confiabilidade da nanoplataforma de exossomos²⁷. Isso oferece mais possibilidades para a aplicação clínica de exossomos.

Em pesquisas futuras, vale a pena explorar métodos que permitam o controle preciso da carga útil e minimizem as variações de medicamentos entre as pontas das agulhas. Isso pode ser feito por meio da otimização de processos, implementação de medidas de controle de qualidade e utilização de técnicas avançadas. Abordar esses aspectos contribuirá significativamente para o desenvolvimento de sistemas de administração de medicamentos confiáveis e consistentes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100x soluções de penicilina-estreptomicina	Jrunbio Scientific	MA0110	Cultura de células
180 kDa marcador de proteína pré-corado	Thermo	26616	Western blotting
3% Acetato de uranila	Henan Ruixin Suprimentos experimentais	GZ02625	Caracterização morfológica de exossomos
Impressora 3D	Tecnologia BMF	nanoArch S130	Molde preparação
4%– 20% gel pré-moldado	Genscript	ExpressPlus PAGE GEL	Western blotting
5× Tampão de carregamento SDS-PAGE	Titan	04048254	Western blotting
Anticorpo Alix anti-rato	Biolegend	12422-1-AP	Western blotting
Anticorpo anti-rato CD63	Biolegend	ab217345	Western blotting
APC anti-rato CD80 anticorpo	Biolegend	104713	Anticorpo
Auto revestidor fino	ZIZHU	JBA5-100	Caracterização morfológica do kit de ensaio de microagulhas
BCA	Beyotime	P0012	Ensaio de concentração de proteína
Centrífuga	Thermo Fisher	Muitifuge X1R pro	Centrífuga
celular Bomba de vácuo de água circulante	Yuhua Instrument	SHZ-D(III)	filtração
Incubadora de CO2	Eppendorf	CellXpert C170	Cultura
de célulasMicroscópio de varredura a laser confocal	Nikon	A1HD25	Imagem de fluorescência
Malha de cobre	Tecnologia Beijing Zhongjingkeyi	JF-ZJKY/300	Caracterização morfológica de exossomos
D- (+) -Trealose di-hidratada	Aladdin	5138-23-4	Fabricação de microagulhas
Dulbecco' s Águia modificada' s meio	Meilunbio	MA0212	Cultura de células
Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato	Meilunbio	MA0010	Cultura celular
Sistema de eletroforese	Bio-rad	PowerPac-basic	Western blotting
Soro fetal bovino	Jrunbio Scientific	JR100	Cultura celular
FITC anticorpo anti-camundongo CD11c	Biolegend	117305	Anticorpo
Citometria de fluxo	BD	LSR Fortessa	Detecção de fluorescência
Gel imager	Cytiva	Amersham ImageQuant 800	Western blotting
HRP-conjugado anti-coelho IgG	CST	7074S	Western blotting
HTL resina	BMF tecnologia		Preparação do molde
Ácido hialurônico (MW = 300 kDa)	Bloomage Biotechnology	9004-61-9	Fabricação de microagulhas
Óleo de imersão	Nikon	MXA22168	Imagem de fluorescência
Limpeza de íons	JEOL	EC-52000IC	Caracterização morfológica de exossomos
Microscópio	Olympus	CKX53	Observe o processo de dissolução da ponta da microagulha
Célula de câncer epitelial ovariano de camundongo ID8	MeisenCTCC&	nbsp; CC90105	Cultura celular
Análise de rastreamento de nanopartículas	Partícula Metrix	ZetaView	Análise de tamanho de exossomos
Anticorpo anti-rato I-A/I-E	pacífico Biolegend	107619	Anticorpo
fluoreto de fenilmetanossulfonil	Beyotime	ST507	Inibidores de protease
Limpador de plasma	Hefei Kejing Tecnologia de material	PDC-36G	Fabricação de microagulhas
Polidimetilsiloxano	Dow Corning	9016-00-6	Preparação do molde
Polivinilpirrolidona (MW = 40 kDa)	Aladdin	9003-39-8	Fabricação de microagulhas
Prisma	GraphPad	Versão 9	Análise estatística
Membrana PVDF	Millipore	IPVH00010	Western blotting
Centrífuga de encaixe rápido	Beckman	344619	Extração de exossomos
Tampão de lise RIPA	Applygen	C1053	Membrana de lise
Roswell park memorial institute 1640	Meilunbio	MA0548	Cultura
de célulasMicroscópio eletrônico de varredura	JEOL	JSM-IT800	Caracterização morfológica de microagulhas
Microscópio estéreo	Olympus	SZX16	Caracterização da morfologia
Reagente de detecção Super ECL	Applygen	P1030	Western blotting
Medidor de tração	Instron	68SC-05	Teste mecânico
Microscópio eletrônico de transmissão	JEOL	JEM-2100plus	Caracterização morfológica de exossomos
Tris tamponado com solução salina	Sangon Biotech	JF-A500027-0004	Western blotting
Tween-20	Beyotime	ST825	Western blotting
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Extração de exossomos
Tubo de ultrafiltração	Millipore	UFC910096	Forno
de secagem a vácuo	Shanghai Yiheng Technology	DZF-6024	Fabricação de microagulhas Sistema de
filtragem a vácuo	Biosharp	BS-500-XT	Filtração