Traçando o perfil das respostas do comportamento materno durante imagens de todo o cérebro

Resumo

Apresentamos aqui um pipeline de análise de vídeo que supera os desafios do monitoramento comportamental em ambientes de ressonância magnética, permitindo a detecção de respostas comportamentais não instruídas a pistas externas. Esta análise facilitará uma compreensão mais abrangente das mudanças evocadas do estado interno e da atividade em todo o cérebro.

Resumo

Avanços recentes em ferramentas de imagem de todo o cérebro permitiram que os neurocientistas investigassem como a atividade cerebral coordenada processa pistas externas, influenciando mudanças internas de estado e provocando respostas comportamentais. Por exemplo, a ressonância magnética funcional (fMRI) é uma técnica não invasiva que permite a medição da atividade de todo o cérebro em camundongos acordados e comportados usando a resposta dependente do nível de oxigenação do sangue (BOLD). No entanto, para entender completamente as respostas BOLD evocadas por estímulos externos, é crucial que os experimentadores também avaliem as respostas comportamentais durante as varreduras. O ambiente de ressonância magnética apresenta desafios para esse objetivo, tornando incompatíveis os métodos comumente empregados de monitoramento comportamental. Esses desafios incluem (1) um campo de visão restrito e (2) a disponibilidade limitada de equipamentos sem componentes ferromagnéticos. Apresentamos aqui um pipeline de análise de vídeo comportamental que supera essas limitações, extraindo informações valiosas de vídeos adquiridos dentro dessas restrições ambientais, permitindo a avaliação do comportamento durante a aquisição de dados neurais de todo o cérebro. Empregando métodos como estimativa de fluxo óptico e redução de dimensionalidade, diferenças robustas podem ser detectadas nas respostas comportamentais aos estímulos apresentados durante os exames de fMRI. Por exemplo, resultados representativos sugerem que as vocalizações de filhotes de camundongos, mas não os tons puros, evocam respostas comportamentais significativamente diferentes em camundongos fêmeas maternas versus virgens. No futuro, esse pipeline de análise comportamental, inicialmente adaptado para superar desafios em experimentos de fMRI, pode ser estendido a vários métodos de gravação neural, fornecendo monitoramento comportamental versátil em ambientes restritos. A avaliação coordenada das respostas comportamentais e neurais oferecerá uma compreensão mais abrangente de como a percepção de estímulos leva à coordenação de saídas comportamentais complexas.

Introdução

Monitorar as respostas comportamentais durante as gravações neurais é essencial para entender a atividade coordenada evocada por estímulos em todo o cérebro. No caso de não se prever que os animais respondam a estímulos de maneira específica e orientada para objetivos, a observação de comportamentos não instruídos pode oferecer insights sobre como pistas externas informam seus estados internos ^1,2. Avanços recentes em ferramentas de neuroimagem, como imagens de cálcio de campo amplo e ressonância magnética funcional (fMRI), permitiram que os neurocientistas expandissem as investigações além de regiões cerebrais singulares. No entanto, para obter uma compreensão mais abrangente desses dados neurais de alta dimensão, a capacidade de avaliar as saídas comportamentais desses padrões complexos também deve avançar de acordo.

Métodos de última geração para caracterizar comportamentos instruídos por tarefas são amplamente utilizados em pesquisas em neurociência, incluindo sensores de temperatura e pressão para detectar cheiros ^3,4, feixes de luz para detectar lambidas⁵ e estimativa de pose sem marcador para rastrear partes do corpo predeterminadas⁶. No entanto, a avaliação baseada em dados de padrões comportamentais não instruídos continua sendo um desafio no campo⁷. Embora os métodos de análise comportamental baseada em dados estejam avançando rapidamente, os métodos existentes geralmente exigem poder computacional substancial, equipamento especializado ou uma visão particularmente clara do animal 2,6,8,9. Aqui é apresentado um pipeline de análise de vídeo comportamental que é facilmente receptivo a qualquer dado de videografia e permite a extração de medidas comportamentais valiosas de vídeos adquiridos durante a estimulação passiva.

Esse pipeline de análise comportamental foi projetado para ser compatível com a aquisição coordenada de dados neurais e de vídeo em animais com a cabeça fixa expostos a uma ampla gama de estímulos externos e vários ambientes de gravação, mesmo aqueles com restrições consideráveis. Por exemplo, o ambiente de ressonância magnética apresenta desafios específicos para o monitoramento comportamental, incluindo um campo de visão restrito e disponibilidade limitada de equipamentos sem componentes ferromagnéticos. Essas restrições tornam os métodos comumente empregados incompatíveis, deixando medidas como o movimento da cabeça (ou seja, como o cérebro se move entre as aquisições de volume) entre as formas mais acessíveis, porém limitadas, de avaliar as respostas corporais durante os exames¹⁰. Ao superar essas limitações, esse protocolo facilitou a análise de dados de videografia compatíveis com RM, mostrando que camundongos fêmeas com diferentes experiências maternas exibem respostas comportamentais distintas a estímulos auditivos. Mães e virgens foram apresentadas a estímulos auditivos durante exames de ressonância magnética funcional, incluindo vocalizações de filhotes angustiados ("chamadas de filhotes") e tons puros. Esses estímulos foram apresentados passivamente, portanto, sem nenhuma saída comportamental instruída. Embora se preveja que as mães mostrem respostas aumentadas aos chamados dos filhotes em comparação com as virgens, há pouca literatura sobre como os camundongos fêmeas respondem aos sinais do bebê em um ambiente com a cabeça fixa. Portanto, não houve saída comportamental específica para rastrear a priori, tornando este experimento o teste perfeito para as análises comportamentais baseadas em dados propostas. Empregando métodos como estimativa de fluxo óptico e redução de dimensionalidade, foram detectadas diferenças de grupo nas respostas comportamentais, tanto em magnitude quanto em manifestação espacial.

No futuro, a avaliação coordenada das respostas comportamentais e neurais pode ser aproveitada para obter uma compreensão mais abrangente de como os estímulos externos alteram os estados internos e informam resultados comportamentais complexos. Esse entendimento deve se estender aos estímulos apresentados na ausência de tarefas impostas e comportamentos instruídos. O pipeline de análise apresentado aqui pode ser estendido para várias técnicas de gravação neural, fornecendo monitoramento comportamental versátil mesmo em ambientes restritos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Columbia (IACUC), e todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes, regulamentos e recomendações relevantes. Os detalhes do equipamento e software utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Software

1. Baixe o MATLAB no site da Mathworks.
   NOTA: O código que compreende este pipeline de análise é executável exclusivamente por meio do MATLAB e foi escrito especificamente para ser compatível com o MATLAB 2023a.
2. Esse pipeline requer a Caixa de Ferramentas de Pesquisa Visual Computacional e a Caixa de Ferramentas de Processamento de Imagens no MATLAB. Adicione as caixas de ferramentas aos complementos do MATLAB clicando em Gerenciar complementos, Obter complementos e, em seguida, pesquise e adicione-os.
   NOTA: Cinco scripts MATLAB são fornecidos como arquivos suplementares, intitulados da seguinte forma: script1_videocoreg.m (Arquivo de Codificação Suplementar 1), script2_optflow_roiselect.m (Arquivo de Codificação Suplementar 2), script3_optflow_analysis.m (Arquivo de Codificação Suplementar 3), script4_optflow_pca.m (Arquivo de Codificação Suplementar 4) e script5_optflow_pca_analysis.m (Arquivo de Codificação Suplementar 5). Dois vídeos de exemplo (Vídeo 1 e Vídeo 2) e seus arquivos de tempo de evento correspondentes (Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2) também são fornecidos. É recomendável primeiro executar o pipeline com os dados de exemplo.
   CUIDADO: Cuidado com quaisquer comentários no código que incluam um ponto de exclamação, pois essas são áreas que exigem ação antes da execução. Por exemplo, há comentários como "edite o bloco de código abaixo!" para destacar onde as edições devem ser feitas para se adequar às estruturas de arquivo, detalhes do experimento ou necessidades de análise. Essas opções são definidas por padrão para se ajustarem aos dois vídeos de exemplo fornecidos, mas precisarão de ajustes quando um começar a executar o pipeline com seus próprios dados.
3. Para executar cada seção de cada script, clique em Executar e avançar no menu Editor .

2. Co-registro de vídeo

NOTA: O primeiro script fornecido neste pipeline de análise é o script1_videocoreg.m (Arquivo de Codificação Suplementar 1), que alinha espacialmente todos os vídeos entre si por meio de co-registro. As entradas para este script são os vídeos brutos e as principais saídas são os vídeos transformados.

1. Edite as seções 1, 2, 3, 4, 5 e 6 do script onde indicado para ajustar as estruturas de dados.
2. Execute a Seção 1.
3. Escolha três pontos em cada vídeo para rotular, como na Figura 1A. Esses três pontos serão usados para registrar todos os quadros entre si. Execute a Seção 2 do script para abrir o primeiro quadro de cada vídeo e use o mouse para clicar uma vez nos dois primeiros pontos e, em seguida, clique duas vezes no terceiro ponto. Depois que os pontos do último vídeo forem selecionados, pressione Enter.
4. Execute a Seção 3 e a Seção 4.
5. Defina o sinalizador alinhado como 0 e execute a Seção 5. Em seguida, defina o sinalizador alinhado como 1 e execute a Seção 5 novamente.
6. Execute a Seção 6 e compare a figura lado a lado resultante com a Figura 1B. Quaisquer aberrações observadas na imagem média não alinhada à esquerda devem ser reduzidas na imagem média alinhada à direita.

3. Estimativa de fluxo óptico: FOV completo

NOTA: Para avaliar o movimento através dos vídeos digitalizados, o fluxo óptico precisa ser estimado para cada vídeo transformado. Isso pode ser feito para o campo de visão completo (FOV) de cada vídeo com o script fornecido script2_optflow_roiselect.m (Arquivo de Codificação Suplementar 2). As entradas para esse script são os vídeos transformados e as saídas são matrizes 3D que indicam a magnitude do fluxo óptico de cada pixel ao longo do tempo para cada vídeo. A Figura 2A mostra um quadro de exemplo com vetores de fluxo óptico sobrepostos em azul, onde o comprimento de cada vetor representa a magnitude relativa do fluxo óptico desse pixel. Salvar as saídas como vídeos foi considerado mais eficiente do que salvá-las como matrizes 3D.

1. Edite a Seção 1 do script onde indicado para ajustar as estruturas de dados.
2. Execute a Seção 1.

4. Seleção de ROI

NOTA: As etapas de análise a seguir são muito mais gerenciáveis em termos de carga computacional e necessidades de armazenamento de dados, selecionando uma região de interesse (ROI) dentro do FOV completo no qual focar a análise. O ROI pode ser selecionado de acordo com o experimento e os comportamentos de interesse ou por meio de uma abordagem mais orientada por dados. Para os resultados representativos aqui apresentados, o desvio padrão da magnitude do fluxo óptico de cada pixel no FOV completo foi calculado com o script script2_optflow_roiselect.m, Seção 2 (Arquivo de Codificação Suplementar 2). As entradas para esta parte do script são as saídas da Seção 1, e a saída principal é uma visualização do desvio padrão da magnitude do fluxo óptico em todos os pixels em todos os vídeos. Nos resultados representativos apresentados, o FOV espelho apresentou um desvio padrão relativamente alto do fluxo óptico, o que orientou a escolha demonstrada da ROI.

1. Edite a Seção 2 do script onde indicado para ajustar as estruturas de dados.
2. Execute a Seção 2 e use a imagem resultante para ver onde o fluxo óptico flutua mais drasticamente nos vídeos analisados. Um exemplo dessa imagem é mostrado na Figura 2B.

5. Quantificação do fluxo óptico: ROI

NOTA: A seção 3 do script script2_optflow_roiselect.m (Arquivo de codificação suplementar 2) permite que o usuário selecione um ROI com uma ferramenta de desenho e salve as coordenadas de limite. As entradas para esta parte do script são as saídas da Seção 1, e as saídas são vetores 1D que indicam a magnitude média do fluxo óptico do ROI ao longo do tempo para cada vídeo.

1. Edite a Seção 3 do script quando indicado para atender às estruturas de dados e às necessidades de análise.
   NOTA: Existem algumas opções sobre como proceder com a seleção do ROI. Escolha uma opção:
   1. Opção 1: Analise o FOV completo do vídeo.
      1. Defina o sinalizador selectROI como 0 e defina provideROI como 0.
   2. Opção 2: Analise um novo ROI.
      1. Defina o sinalizador selectROI como 1 e defina provideROI como 0. Em seguida, edite newCoordsName.
   3. Opção 3: Analise um ROI desenhado anteriormente.
      NOTA: Selecione essa opção somente se alguém já tiver executado esse código e criado um ROI.
      1. Defina o sinalizador selectROI como 0 e defina provideROI como 1. Em seguida, edite inputCoords para fornecer um conjunto predeterminado de coordenadas.
2. Execute a Seção 3.

6. Comparação da magnitude do fluxo óptico

NOTA: O script fornecido script3_optflow_analysis.m (Arquivo de Codificação Suplementar 3) requer a maior especialização para se ajustar aos dados do usuário. As principais entradas são os vetores 1D que indicam a magnitude média do fluxo óptico do ROI ao longo do tempo para cada vídeo e, quando combinados adequadamente com inícios de eventos e informações de grupo/condição, as principais saídas são comparações estatísticas que podem ser adaptadas aos interesses de análise.

1. Edite as seções 1 a 3 do script para atender às estruturas de dados e às necessidades de análise.
2. Defina as opções de análise sinalizadores zsc, blrm, blzsc, demeanPerTrial e applyLPfilter como 0 ou 1 , conforme desejado na Seção 1. Nos resultados representativos apresentados, zsc, blrm e applyLPfilter foram definidos como 1 e todas as outras opções foram definidas como 0.
3. Defina LPfilter para um número que represente o filtro passa-baixa desejado em hertz (Hz). Nos resultados representativos apresentados, foi aplicado um filtro passa-baixa de 5 Hz, pois não se esperava que as respostas comportamentais flutuassem a uma taxa superior a 5 Hz.
4. Execute as seções 1-3. A seção 3 deve produzir gráficos para séries temporais de fluxo óptico médio de grupo, fluxo óptico cumulativo médio de grupo e fluxo óptico cumulativo resumido, incluindo gráficos como os mostrados na Figura 3. A seção 3 pode ser executada para qualquer combinação de comparações de grupo/condição.

7. Fluxo óptico PCA

NOTA: Com base na estimativa da magnitude do fluxo óptico, as saídas de script2_optflow_roiselect.m (Arquivo de Codificação Suplementar 2) também contêm informações sobre a distribuição espacial do fluxo óptico quadro a quadro por vídeo. A fim de reduzir a dimensionalidade dessas informações espaciais, o script fornecido script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4)  realiza a análise de componentes principais (PCA) no fluxo óptico estimado. As principais entradas são as matrizes de fluxo óptico 3D, previamente salvas como vídeos para cada vídeo comportamental, e a saída principal é um arquivo .mat por vídeo contendo PC e informações de variação explicadas.

1. Edite a Seção 1 do script para atender às estruturas de dados e às necessidades de análise.
2. Defina os sinalizadores de opções de análise stimnum, dsfactor e fnfactor conforme desejado na Seção 1. Nos resultados representativos apresentados, cada tipo de estímulo foi analisado separadamente, e o valor padrão de 1 foi mantido para dsfactor e fnfactor, resultando em nenhuma redução no espaço ou no tempo.
3. Execute a Seção 1.

8. Comparação de PCA de fluxo óptico

NOTA: O script fornecido script5_optflow_pca_analysis.m (Arquivo de Codificação Suplementar 5) realizará comparações exploratórias dos resultados do PCA entre os grupos. As principais entradas são o PC específico do estímulo e as informações de variância explicadas obtidas do script4_optflow_pca.m (Arquivo de Codificação Suplementar 4), e as principais saídas são mapas de calor estatisticamente limiares que descrevem as cargas do primeiro PC, embora outros PCs também possam ser analisados com este script.

1. Edite a Seção 1 do script para ajustar as estruturas e análises de dados.
2. Execute a Seção 1 e a Seção 2.
3. Edite as entradas da Seção 3 , especificamente as variáveis group e myTitle , para refletir a análise de grupo desejada, bem como threshT. threshT representa o limite da estatística T acima do qual os resultados serão considerados significativos, que pode ser calculado com base na estatística T disponível publicamente para tabelas de valores-p e os graus de liberdade.
4. Execute a Seção 3 para cada grupo de interesse. O código deve produzir um mapa estatístico de resumo de grupo, como os mostrados nos painéis esquerdo e central da Figura 4. Ajuste o intervalo de caxis e, portanto, os limites da barra de cores, conforme desejado para visualização.
5. Edite as entradas da Seção 4 , especificamente as variáveis mag e myTitle para refletir a comparação de grupo desejada, bem como threshT. threshT representa o limite da estatística T acima do qual os resultados serão considerados significativos, que pode ser calculado com base na estatística T disponível publicamente para tabelas de valores-p e os graus de liberdade.
6. Execute a Seção 4 para cada comparação de grupo de interesse. O código deve produzir um mapa estatístico de comparação de grupos, conforme mostrado no painel direito da Figura 4. Ajuste o intervalo de caxis e, portanto, os limites da barra de cores, conforme desejado para visualização.

Resultados

Para demonstrar o potencial desse pipeline de análise, vídeos comportamentais de camundongos fêmeas com a cabeça fixa - especificamente mães e virgens - foram adquiridos enquanto os camundongos recebiam estímulos auditivos durante exames de ressonância magnética funcional (fMRI). Os estímulos consistiram em cantos de filhotes e tons puros apresentados passivamente, portanto, sem nenhuma saída comportamental instruída. As chamadas dos filhotes eram gravações de vocalizações ultrassônicas emitidas por filhotes de camundongos de 6 dias temporariamente isolados de seu ninho. Essas chamadas de filhotes normalmente provocam o ato materno de recuperação do filhote, no qual a mãe localiza, se move, investiga, pega o filhote e o devolve à segurança do ninho - um comportamento que as fêmeas virgens normalmente não exibem¹¹. Trabalhos anteriores mostraram que as chamadas dos filhotes provocam atividade evocada robusta no córtex auditivo primário de mães, mas não de virgens, enquanto as respostas de tom puro não mostram diferenças de grupo¹². Portanto, foi levantada a hipótese de que as diferenças de grupo nas respostas comportamentais às chamadas dos filhotes, mas não os tons puros, seriam identificadas. No entanto, há pouca literatura sobre os comportamentos específicos de camundongos fêmeas em resposta a sinais de filhotes em um ambiente com a cabeça fixa. Portanto, nenhum resultado comportamental específico era esperado, tornando este experimento o teste perfeito para as análises comportamentais baseadas em dados propostas.

Ao longo de oito dias, todos os animais foram gradualmente habituados ao manuseio do experimentador, fixação da cabeça e ambiente de ressonância magnética. A habituação à fixação da cabeça e ao ambiente experimental é crucial para avaliar as respostas comportamentais aos estímulos apresentados. Se não estiverem devidamente habituados ao ambiente, os animais podem mostrar apenas respostas ao estresse, eliminando quaisquer efeitos impulsionados por estímulos que poderiam ser analisados por meio de videografia.

Embora a configuração do aparelho comportamental tenha sido geralmente a mesma para todas as sessões de aquisição de dados, é possível que o campo de visão (FOV) da câmera tenha mudado ligeiramente cada vez que um animal foi fixado na cabeça para exames de fMRI (veja exemplos de FOVs na Figura 1A). Isso provavelmente se deveu a pequenas mudanças no posicionamento do suporte da câmera, bem como variações individuais na fixação do crânio do poste da cabeça para cada animal. Portanto, os vídeos das varreduras precisavam ser alinhados uns com os outros por meio de corregistro linear para permitir a comparação das informações espaciais que eles continham entre as varreduras e os animais. O co-registro foi adaptado aos dados representativos. Por exemplo, em um dia de escaneamento padrão, 3 a 4 escaneamentos foram adquiridos por animal, resultando em 3 a 4 vídeos por animal por dia. Entre cada varredura, não houve movimento dos componentes do berço, incluindo a câmera e os componentes de fixação da cabeça. Assim, uma vez determinada a transformação de co-registro para um vídeo por animal por dia, ela poderia ser aplicada aos outros 2 a 3 vídeos desse animal no mesmo dia. Embora isso tenha economizado tempo na etapa de corregistro desse pipeline, as transformações espaciais também podem ser calculadas para cada vídeo individualmente, se necessário. Três características presentes em cada vídeo foram escolhidas como pontos para rotular e calcular a transformação espacial. Nos dados representativos mostrados, esses três pontos eram o centro do poste da cabeça, a visão frontal do olho direito do animal e a vista de perfil do olho direito do animal (visível em um espelho colocado em um ângulo de 45 graus). Exemplos de co-registro de vídeo são mostrados na Figura 1A, B, mostrando o quadro médio calculado a partir de todos os vídeos feitos durante este experimento, antes e depois do co-registro, para demonstrar o efeito desta etapa.

Esse pipeline depende muito do fluxo óptico, um método de visão computacional usado para estimar o movimento de objetos em um vídeo, estimando suas velocidades aparentes entre quadros consecutivos¹³. O fluxo óptico foi escolhido porque permite a quantificação do movimento - um proxy de respostas comportamentais - sem partes do corpo predeterminadas ou ações de interesse. Além disso, esse método foi receptivo à qualidade de imagem limitada dos vídeos representativos, que foram adquiridos com a única câmera compatível com RM acessível no momento do experimento. Neste pipeline, o algoritmo de Horn-Schunck de estimativa de fluxo óptico global e denso é usado; no entanto, outros algoritmos, como o algoritmo de Lucas-Kanade, podem ser facilmente empregados com pequenas alterações nos scripts MATLAB fornecidos 14,15,16. A Figura 2A mostra um exemplo de quadro de vídeo com vetores de velocidade de fluxo óptico relativos sobrepostos para cada pixel. Observe que os vetores maiores aparecem em áreas onde se esperaria movimento, como o focinho e as patas do animal.

Embora o pipeline estimasse o fluxo óptico para todos os vídeos em todo o FOV, as etapas de análise restantes foram muito mais gerenciáveis em termos de carga computacional e necessidades de armazenamento de dados, selecionando uma região de interesse (ROI) dentro do FOV. O ROI pode ser selecionado de acordo com o experimento e comportamentos predeterminados de interesse ou por meio de uma abordagem mais orientada por dados. Dado que os dados representativos não incluíam nenhuma saída comportamental específica para rastrear a priori, uma abordagem baseada em dados foi buscada. O desvio padrão da magnitude do fluxo óptico foi calculado em todos os vídeos em cada pixel, conforme visualizado na Figura 2B. As áreas de maior desvio padrão incluíram contornos do animal, como ao redor do olho e focinho, que inspiram confiança de que as flutuações do fluxo óptico observadas foram guiadas pelo movimento do animal e não pelo ruído nos vídeos. As áreas de menor desvio padrão incluíram os contornos do berço, que podem ser o resultado de pequenas vibrações na câmera e no berço que ocorreram durante a digitalização. O ambiente de ressonância magnética é inevitavelmente repleto de vibrações durante a aquisição de dados devido à mudança de gradientes, que podem se manifestar em flutuações de fluxo óptico observadas em componentes reflexivos do berço. Felizmente, essas vibrações são constantes ao longo da aquisição de dados, portanto, independentes da condição do estímulo e não se espera que afetem os resultados da análise comportamental. Desvios padrão de fluxo óptico particularmente elevados foram observados nos pixels do espelho, correspondendo à visão de perfil do rosto do animal, o que orientou a seleção do ROI para os dados representativos. Esta também foi uma região onde respostas comportamentais, como bater e cheirar, podem ser esperadas como parte do repertório comportamental típico de camundongos fêmeas que procuram um filhote isolado emitindo chamadas^{de filhotes 17}.

Depois de escolher um ROI e extrair a magnitude média do fluxo óptico para todos os vídeos, o fluxo óptico durante as épocas de interesse pode ser comparado entre grupos e condições. Observe que os primeiros 20 segundos (s) do vetor de fluxo óptico de cada vídeo foram mascarados para estabilização de brilho; no entanto, isso pode ser ajustado para atender às necessidades experimentais. Para cada vídeo, o vetor de fluxo óptico quadro para o ROI escolhido foi pontuado em Z e, em seguida, após o trabalho anterior na classificação de expressões faciais, foi filtrado em passa-baixa a 5 hertz (Hz) para levar em conta a taxa de quadros de 30 Hz da câmera sendo mais rápida do que quaisquer flutuações comportamentais esperadas². Finalmente, os vetores Z-scored e filtrados foram divididos em épocas de apresentação do estímulo para avaliar o efeito da apresentação do estímulo no fluxo óptico. Para cada época, o sinal médio da linha de base pré-estímulo foi subtraído para normalizar o fluxo óptico para o período pré-estímulo. A Figura 3A mostra séries temporais de fluxo óptico exemplares para dois vídeos, um mãe e um virgem, com dados resumidos do grupo na Figura 3B-E. A Figura 3B e a Figura 3D mostram o fluxo óptico cumulativo ao longo do tempo durante a apresentação do estímulo em relação à linha de base, enquanto a Figura 3C e a Figura 3E resumem o fluxo óptico cumulativo 2,5 s após o início do estímulo. O fluxo óptico cumulativo foi calculado para capturar o movimento geral ao longo do tempo sem assumir que as respostas comportamentais espontâneas ocorreriam de maneira bloqueada no tempo. No geral, esses resultados representativos demonstram que os cantos dos filhotes, mas não os tons puros, evocaram respostas comportamentais significativamente diferentes de camundongos fêmeas maternas versus virgens, conforme previsto (teste U de Mann-Whitney entre os grupos: p = 0,026; tons puros: p = 0,093). No entanto, esse efeito de estímulo não sobreviveu a uma ANOVA de 2 vias, enquanto o efeito de grupo sobreviveu (estímulo: F(1,10) = 0,19, p = 0,67; grupo: F(1,10) = 8,61, p = 0,015). No geral, esses resultados sugerem que as mães apresentaram maior movimento evocado por estímulo em comparação com as virgens, com a resposta materna aos chamados dos filhotes sendo mais consistente do que aos tons puros. Isso pode refletir maior atenção ou estresse nas mães, bem como a relevância comportamental dos chamados dos filhotes, que, ao contrário dos tons puros, evocam a resposta de recuperação dos filhotes em mães em ambientes naturalistas. Tomados em conjunto, esses resultados representativos sugerem que a estimativa do fluxo óptico durante a apresentação do estímulo externo pode extrair informações sobre respostas comportamentais espontâneas e diferenciadas.

Por fim, foi realizada uma análise mais exploratória para descobrir as características espaciais do comportamento captado nos dados representativos. Para investigar quais pixels no ROI flutuaram de forma coordenada durante a apresentação do estímulo, foi realizada a análise de componentes principais (PCA) nas informações do fluxo óptico espacial ao longo do tempo. Essa análise revelou pixels que mais contribuíram para o primeiro PC, bem como pixels que apresentaram diferenças de grupo para cada condição de estímulo, conforme ilustrado na Figura 4. Os painéis mais à direita da Figura 4A,B sugerem que as mães mostraram mais movimento no nariz em comparação com as virgens durante a apresentação de ambos os tipos de estímulo. Nos dois grupos e duas condições de estímulo, o primeiro PC explicou 5,41% ± 0,59% da variância total na análise do fluxo óptico. Embora o ROI espelho tenha sido mantido para esta parte de nossa análise, análises futuras podem se expandir para uma porção mais ampla do FOV para caracterizar movimentos coordenados além da face em resposta a estímulos. Por exemplo, comparar o movimento das patas pode revelar diferenças de grupo mais significativas, uma vez que as chamadas dos filhotes normalmente iniciam a recuperação dos filhotes em mães, mas não em virgens, e que as patas podem se mover mais livremente do que a cabeça do animal.

Embora os resultados representativos até agora sugerissem que esse pipeline pode avaliar respostas comportamentais não instruídas a estímulos externos em ambientes de videografia restritos, permaneceu uma questão sobre se as flutuações observadas no fluxo óptico realmente refletiam um comportamento animal significativo. Para responder a essa pergunta, um conjunto de dados de validação separado foi analisado usando o mesmo pipeline. Em um experimento separado, camundongos machos com restrição de água foram treinados para associar uma sugestão de luz com a entrega de uma recompensa de água de 6 μL ("alta recompensa") ou 1 μL ("baixa recompensa"). Notavelmente, ao contrário do experimento de estimulação auditiva, este experimento teve uma leitura comportamental a priori: taxa de lambida. Um lickômetro foi estabelecido por meio da detecção de licks baseada em vídeo, facilitada pela análise do brilho do pixel próximo à bica d'água. A leitura comportamental fornecida pelo lickômetro poderia, portanto, ser usada para comparar a leitura comportamental desse duto fornecida pela estimativa de fluxo óptico, apoiando sua validade na detecção de comportamentos espontâneos. Após o co-registro de vídeo, estimativa de fluxo óptico, seleção de ROI (mais uma vez contendo o FOV espelho) e quantificação do fluxo óptico, comparando a magnitude do fluxo óptico revelou uma diferença significativa entre as respostas comportamentais a recompensas altas e baixas. Os resultados dessa análise são mostrados na Figura 5A,B, onde a Figura 5A mostra a série temporal média do grupo, e a Figura 5B resume o fluxo óptico cumulativo 2,5 s após o início do estímulo (teste de Wilcoxon pareado entre condições: p = 0,031). Observe que os valores de fluxo óptico foram maiores em comparação com o comportamento espontâneo registrado nos dados representativos, enfatizando ainda mais o desafio de avaliar respostas comportamentais não instruídas e diferenciadas. A Figura 5C mostra a taxa real de lambida registrada pelo lickômetro para cada uma das duas condições de recompensa, enquanto a Figura 5D mostra que mais lambidas são registradas durante a condição de alta recompensa em comparação com a condição de baixa recompensa dentro de 2,5 s após a entrega da recompensa (teste de posto sinalizado de Wilcoxon emparelhado entre condições: p = 0,031). Juntas, ambas as análises revelaram uma tendência semelhante na comparação de respostas de alta versus baixa recompensa, validando o pipeline de análise de vídeo apresentado para capturar diferenças significativas no comportamento animal entre as condições.

Tomados em conjunto, os resultados representativos mostrados aqui sugerem que a apresentação de cantos de filhotes evocou respostas significativamente diferentes em camundongos fêmeas maternas versus virgens, enquanto os tons puros não. A análise de um conjunto de dados de validação confere confiança de que as diferenças observadas no fluxo óptico refletem diferenças significativas nas respostas comportamentais a estímulos externos.

Figura 1: Co-registro de vídeo. (A) Exemplos de co-registro de vídeo representando características predeterminadas (centro do poste de cabeça, vista frontal do olho direito, vista de perfil do olho direito) rotuladas em três quadros, cada um tirado de diferentes vídeos de diferentes animais. Observe na sobreposição como os três pontos não estavam alinhados, demonstrando como a configuração comportamental mudou ligeiramente entre as sessões de aquisição de dados. (B) O quadro médio nos últimos 10 segundos de cada vídeo antes (esquerda) e depois (direita) de realizar o co-registro de vídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Estimativa de fluxo óptico. (A) Exemplo de quadro com vetores de fluxo óptico relativo sobrepostos em azul. (B) O desvio padrão médio em pixels do fluxo óptico em todos os vídeos. O ROI escolhido em torno da visualização de perfil do rosto do animal através do espelho é delineado em magenta. A barra de cores corresponde ao desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Visualização e comparação do fluxo óptico entre grupos e condições. (A) Séries temporais exemplares de fluxo óptico filtradas por pontuação Z e passa-baixa de 5 Hz para um vídeo de uma mãe e um vídeo de uma virgem. (B) e (D) Fluxo óptico cumulativo medido durante o período de estímulo de chamadas de filhotes (B) e tons puros (D). O sombreamento representa o erro padrão da média (SEM). (C) e (E) Fluxo óptico cumulativo durante os primeiros 2,5 s de apresentação do estímulo para chamadas de filhotes (C) e tons puros (E). * Indica p < 0,05, teste U de Mann-Whitney entre grupos (chamadas de filhotes: p = 0,026; tons puros: p = 0,093), N = 6 por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação do PC₁ entre os grupos. (A,B) Mapas que descrevem as cargas do primeiro componente principal (PC₁) do fluxo óptico durante as chamadas do filhote (A) e tons puros (B) entre os grupos, estatisticamente limiares em p < 0,05 sem correção para comparações múltiplas. O mapa de calor indica o grau em que a flutuação do fluxo óptico de cada pixel contribuiu para o PC₁, em relação a outros pixels. Um pequeno texto em preto indica a porcentagem de variância explicada pelo PC₁ (chamadas de filhote de mães: 4,95% ± 0,72%; chamadas de filhote de virgens: 4,44% ± 0,59%; tons puros de mães: 4,95% ± 0,39%; tons puros de virgens: 4,72% ± 1,24% (média ± desvio padrão)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Validação do pipeline de análise comportamental. (A) Pontuação Z média, linha de base pré-estímulo subtraída e séries temporais filtradas passa-baixa de 5 Hz de fluxo óptico durante a entrega de recompensa alta e baixa. O sombreamento representa o MEV, a linha vertical branca indica a entrega da recompensa e os asteriscos vermelhos indicam artefatos de fluxo óptico temporários devido ao início e deslocamento da sugestão de luz. (B) Resumo do fluxo óptico cumulativo durante os primeiros 2,5 s após a entrega da recompensa. * Indica p < 0,05, teste de postos sinalizados de Wilcoxon pareado entre condições (p = 0,031). (C) Taxa média de lambida, obtida por licômetro, durante a entrega de recompensa alta e baixa. O sombreamento representa o SEM, e a linha vertical branca indica a entrega de recompensa. (D) Número de lambidas registradas durante os primeiros 2,5 s após a entrega da recompensa. * Indica p < 0,05, teste de postos sinalizados de Wilcoxon pareado entre condições (p = 0,031), N = 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Exemplo de vídeo 1. PCR_Br011_20231015_1842_output.avi. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Exemplo de vídeo 2. PCR_Br014_20231015_1722_output.avi. Clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo suplementar 1: Arquivo de tempo de evento para o vídeo 1. PCR_Br011_20231015_1842_output_videoTimestamps.mat. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Arquivo de cronometragem do evento para o vídeo 2. PCR_Br014_20231015_1722_output_videoTimestamps.mat. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: script1_videocoreg.m. Esse script alinha espacialmente todos os vídeos entre si por meio de co-registro. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: script2_optflow_roiselect.m. Esse script estima o fluxo óptico para o FOV completo de cada vídeo transformado e permite a seleção de um ROI para o restante do pipeline. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 3: script3_optflow_analysis.m. Este script compara a magnitude do fluxo óptico em diferentes grupos/condições para o ROI escolhido. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 4: script4_optflow_pca.m. Este script executa o PCA no fluxo óptico estimado do ROI escolhido. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 5: script5_optflow_pca_analysis.m. Este script compara os resultados do PCA entre grupos/condições para o ROI escolhido. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O pipeline de análise comportamental apresentado permite a extração de informações valiosas de vídeos de animais exibindo comportamentos não instruídos em resposta a estímulos apresentados passivamente. Esses vídeos comportamentais representativos foram adquiridos em conjunto com dados de ressonância magnética funcional (fMRI) de todo o cérebro, para os quais várias restrições foram superadas para capturar respostas comportamentais no ambiente de ressonância magnética. Empregando o método de estimativa de fluxo óptico, foram reveladas diferenças em como mães versus virgens respondem aos chamados dos filhotes - mas não aos tons puros - foram reveladas, apoiando a hipótese inicial^{13 , 14 , 15 , 16} . Aproveitando a redução da dimensionalidade das informações do fluxo óptico, esse achado foi estendido para uma análise exploratória da distribuição espacial desses comportamentos.

Este pipeline de análise é amplamente receptivo a vários paradigmas experimentais. É completamente agnóstico ao tipo de dados neurais adquiridos e não requer poder computacional excessivo ou equipamento especializado. O principal requisito experimental é que os dados da videografia sejam registrados com os carimbos de data/hora relevantes dos inícios de apresentação do estímulo. Além disso, ao fornecer os scripts MATLAB usados para realizar as análises demonstradas, a implementação desse pipeline deve ser bastante direta, mesmo para aqueles com experiência mínima em MATLAB. As etapas gerais, conforme descrito no protocolo, consistem em co-registro de vídeo, estimativa de fluxo óptico, seleção de região de interesse (ROI), quantificação de fluxo óptico específico de ROI, comparação de magnitude de fluxo óptico, análise de componentes principais (PCA) e comparação de PCA. Em cada etapa, o pipeline pode ser modificado para atender às necessidades experimentais e analíticas, conforme declarado no protocolo e destacado com comentários em todo o código.

Existem várias limitações a serem lembradas ao empregar o pipeline de análise de vídeo apresentado. Primeiro, o design do aparato comportamental deve ser cuidadosamente considerado. Se não estiver claro quais respostas comportamentais podem ser esperadas, pode ser benéfico para análises futuras ter o maior número possível de pontos de vista do animal. Portanto, recomenda-se a instalação de um ou vários espelhos para capturar simultaneamente as vistas frontal e de perfil do animal, conforme mostrado nos quadros de vídeo de exemplo na Figura 1A. Em segundo lugar, recomenda-se que a iluminação fornecida para aquisição de vídeo seja brilhante o suficiente para ver todos os recursos relevantes do campo de visão (FOV), mas não tão brilhante a ponto de atingir a saturação. Na Figura 1A, pode-se observar que a visão frontal do nariz do camundongo está em um ponto próximo à saturação, dificultando a captura de quaisquer flutuações no brilho que indiquem movimento. Isso pode ter contribuído para a falta de variação do fluxo óptico observada nesta parte do FOV, conforme mostrado na Figura 2B. Felizmente, a vista de perfil do nariz não enfrentou esse problema, permitindo a análise do ROI do espelho. Além disso, a possibilidade de saturação deve ser considerada se estímulos visuais estiverem envolvidos no experimento. No experimento do conjunto de dados de validação, uma sugestão de luz usada para sinalizar a entrega de uma recompensa de água introduziu saturação temporária nos vídeos adquiridos, representando um artefato temporário na estimativa do fluxo óptico. Esse artefato pode ser observado na Figura 5A, onde os dois picos agudos nos traços de fluxo óptico para ambas as condições de recompensa se alinham exatamente com quando a sugestão de luz foi ligada e desligada. Esse artefato dificultou a análise dessas janelas de tempo curtas com o pipeline apresentado e, se não estivesse presente, os resultados apresentados na Figura 5B poderiam ter sido ainda mais significativos. A iluminação constante da cena é uma suposição necessária para a maioria dos algoritmos de fluxo óptico^14,16. Portanto, esse pipeline de análise de vídeo não é recomendado para experimentos nos quais a iluminação do ambiente muda drasticamente, tanto dentro quanto entre os ensaios. Em terceiro e último lugar, a habituação suficiente dos animais ao ambiente de gravação é um componente-chave de qualquer experimento que aproveite esse pipeline. Se não forem devidamente habituados, os animais podem mostrar respostas significativas ao estresse, eliminando quaisquer efeitos sutis impulsionados por estímulos que, de outra forma, poderiam ser analisados por meio de análise de vídeo.

No futuro, esse pipeline de análise comportamental pode ser empregado para facilitar a avaliação coordenada de respostas comportamentais e neurais registradas simultaneamente. Como mostrado, a avaliação quantitativa de comportamentos não instruídos permite a avaliação da saliência de estímulos em um ambiente de registro complexo, bem como o teste de diferentes respostas comportamentais em grupos e condições experimentais. Outras análises podem ser conduzidas para explorar diferenças individuais ou tendências tentativa a tentativa nas respostas comportamentais, de modo que a atividade neural correspondente possa ser examinada. Além disso, a incorporação de PCA para obter informações espaciais sobre o movimento evocado por estímulo pode ser usada para investigar melhor se tipos específicos de sequências comportamentais observadas durante a apresentação do estímulo diferem entre grupos e condições. Esse pipeline de análise pode ser facilmente estendido para vários métodos de gravação neural, fornecendo monitoramento comportamental versátil em ambientes restritos. Ao investigar como os estímulos externos são representados no cérebro e no comportamento, os pesquisadores estão preparados para obter uma compreensão mais abrangente de como a percepção dos estímulos afeta os estados internos e suas manifestações externas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caixa de ferramentas de visão computacional MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/computer-vision.html
Caixa de ferramentas de processamento de imagem MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/image-processing.html
software MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
câmera compatível com MR " 12M-i" com iluminação LED integrada	MRC Systems GmbH	12M-i	https://www.mrc-systems.de/downloads/en/mri-compatible-cameras/manual_mrcam_12m-i.pdf