A invasão é um fenômeno biológico importante no desenvolvimento e progressão do câncer. Esse processo é influenciado por células não neoplásicas e componentes do microambiente tumoral. O objetivo deste estudo é descrever um método alternativo para análise da invasão de células tumorais in vitro usando culturas tridimensionais (3D).
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Artigo de método
Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cultura esferóide é um modelo 3D que fornece uma replicação aprimorada do microambiente in vivo em comparação com as culturas bidimensionais (2D) tradicionais. A invasão é um resultado celular de grande interesse na biologia do câncer. Neste protocolo, desenvolvemos uma estratégia alternativa para avaliar a invasão de células cancerígenas in vitro, empregando heterosferóides compostos por carcinoma espinocelular oral (CEC), fibroblastos associados ao câncer (CAF) e monócitos. Esses heterosferóides visam imitar o microambiente tumoral (TME), incluindo dois tipos de células não neoplásicas relevantes ao lado das células cancerígenas. Cada tipo de célula foi marcado com marcadores fluorescentes vitais emitidos em comprimentos de onda distintos antes da formação do esferoide. Uma vez formados, os heterosferóides foram semeados em uma camada de matriz extracelular derivada do leiomioma humano no compartimento superior de uma membrana microporosa. A invasão foi avaliada no eixo z por meio de microscopia confocal. As imagens digitais foram obtidas nos canais fluorescentes correspondentes em intervalos de 10 μm, cobrindo uma profundidade de 90 μm no eixo z. A análise foi realizada usando software de imagem freeware, calculando a intensidade de fluorescência integrada em cada imagem e canal de fluorescência. Essa abordagem permite uma análise mais dinâmica dos padrões de invasão celular em um contexto multicamadas, bem como o exame da co-localização espacial de diferentes tipos de células durante a invasão.
Introdução
A invasão é um processo no qual as células neoplásicas migram através da matriz extracelular para o tecido circundante 1,2. À medida que o tumor progride, as células neoplásicas são expostas a microambientes cada vez mais complexos. O microambiente tumoral inclui vários componentes da matriz extracelular e tipos de células não neoplásicas. As células estromais, incluindo fibroblastos e macrófagos residentes, remodelam o microambiente secretando componentes da matriz extracelular e fatores de crescimento e citocinas, que por sua vez influenciam as funções das células neoplásicas3. As células leucocitárias estromais e infiltrantes também interagem diretamente com as células neoplásicas, entre si e com a matriz extracelular em um microambiente tridimensional. Em conjunto, a composição do TME influencia a eficácia e o padrão de invasão de células neoplásicas4.
A natureza intrincada do microambiente tumoral requer a implementação de metodologias eficazes para compreender as interações intercelulares dentro do tecido tumoral. A maioria dos ensaios in vitro usados para avaliar a invasão foi conduzida principalmente em modelos 2D tradicionais e / ou culturas de tipo de célula única 5,6,7,8, o que simplifica demais o complexo processo de invasão e tem múltiplas limitações, como a falta de arquitetura do tecido, componentes estromais e reprodutibilidade in vivo. As culturas esferoides representam um modelo de culturas 3D in vitro que mimetiza a morfologia da massa tumoral, permitindo interações célula-célula e célula-matriz envolvendo características físicas e bioquímicas9. O uso de modelos de cultura 3D tem crescido nas últimas décadas, e há evidências de que vários resultados biológicos, como resposta ao tratamento, morfologia celular e expressão gênica, são diferentes em comparação com o modelo 2D 9,10.
Este protocolo demonstra um método para avaliar a invasão in vitro em uma matriz extracelular humana usando cultura de células esferóides 3D. Além disso, empregamos heterosferóides compostos por células neoplásicas, fibroblastos e monócitos para mimetizar o microambiente tumoral com dois tipos de células não neoplásicas relevantes. A imagem de células por microscopia confocal ao longo de diferentes planos de invasão em direção a uma membrana microporosa permite a visualização desse processo em um contexto mais dinâmico e multicamadas.
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Protocolo
O uso de células humanas primárias foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Instituição (CAAE 57895822.0.0000.5416) da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de células para cultura de células 3D
NOTA: Todas as etapas desta seção devem ser executadas dentro de uma capela de fluxo laminar.
- Obtenha suspensões unicelulares das células que formarão o heterosferóide.
NOTA: Neste experimento, geramos esferóides (ver etapa 2) consistindo de linhagem celular OSCC (SCC9), fibroblastos (fibroblastos primários associados ao câncer de biópsias de câncer de língua) e monócitos (monócitos primários de doadores saudáveis). Selecione o tipo de células de acordo com os interesses experimentais. - Verifique o número de células e a viabilidade usando um hemocitômetro e coloração com azul de tripano.
NOTA: A proporção de células neste protocolo é de 5:3:2 (5.000 neoplásicos: 3.000 fibroblastos: 2.000 monócitos), totalizando 10.000 células por esferoide. Otimize a proporção e o número total de células de acordo com os interesses experimentais. - Dilua separadamente as células em tubos de 1,5 mL com meio não suplementado apropriado para cada tipo de célula (por exemplo, para células neoplásicas - DMEM/F12; para fibroblastos - DMEM; para monócitos - RPMI) para atingir uma densidade de semeadura apropriada de 5.000 células neoplásicas por poço, 3.000 fibroblastos por poço e 2.000 monócitos por poço, ou 500.000 células por mililitro.
NOTA: Para garantir um número adequado de células para o experimento, utilizar 20% a mais do que o total necessário, considerando possíveis perdas durante as etapas de coloração e centrifugação. - Rotule os diferentes tipos de células separadamente usando manchas vitais fluorescentes distintas que permanecem nas células vivas por várias gerações. Adicione concentrações otimizadas de corante fluorescente às células que contêm o meio (por exemplo, neoplásico: CFSE - corante verde; fibroblasto: CMTPX - corante vermelho; monócito, Violet BMQC - corante azul) e incube a 37 ° C por 20 min.
NOTA: Selecione sondas fluorescentes com diferentes espectros de excitação e emissão para evitar sobreposição espectral de acordo com as especificações do microscópio confocal que será usado. - Centrifugue as células a 400 x g por 5 min em temperatura ambiente para formar um pellet de célula. Aspire o meio usando uma pipeta de 200 μL e ressuspenda em 1 mL de 1x PBS.
- Centrifugue a 400 x g por 5 min para formar um pellet celular e ressuspenda o número total de células em 1 mL de meio de cultura suplementado de acordo com o tipo de célula/linhagem celular usada (por exemplo, neoplásico - 100 μg/mL de estreptomicina, 100 UI/mL de penicilina, 10% (vol) FBS e 400 μg/mL de hidrocortisona; fibroblastos e monócitos - 100 μg/mL de estreptomicina, 100 UI/mL de penicilina, 10% (vol) FBS). Verifique a intensidade da fluorescência no microscópio e conte as células com coloração de azul de tripano.
2. 3D cultura de células
NOTA: Este estudo empregou o método de campo magnético de bioimpressão11 para criar heterosferóides. Aqui, as células são magnetizadas usando nanopartículas magnéticas biocompatíveis e submetidas a forças magnéticas suaves. Otimize a proporção de nanopartículas para células de acordo com o tipo de célula. Métodos alternativos para estabelecer culturas de esferóides também podem ser usados. Conduza as etapas desta seção em uma capela de fluxo laminar.
- Adicione nanopartículas magnéticas na proporção de 1 μL de nanopartículas para 20.000 células e ressuspenda completamente misturando 10 vezes.
- Centrifugue as células a 400 x g, temperatura ambiente, por 5 min, e ressuspenda misturando 10 vezes. Repita este ciclo de centrifugação/ressuspensão mais duas vezes.
NOTA: As células magnetizadas formarão um pellet de cor acastanhada. - Após completar o último ciclo de centrifugação, aspirar o meio e ressuspender as células em 34 μL por poço (34 μL/5.000 células neoplásicas; 34 μL/3.000 células de fibroblastos; 34 μL/2.000 células de monócitos) de meio de cultura suplementado (DMEM/F12 contendo 100 μg/mL de estreptomicina, 100 UI/mL de penicilina e 5% (vol) de FBS) para as células neoplásicas.
NOTA: Calcule o volume com base no tamanho do poço. Este protocolo utilizou placas de 96 poços, totalizando 100 μL de meio por poço. - Misture todas as células em um novo tubo para co-cultura e, em seguida, ressuspenda.
- Transfira 100 μL de células co-cultivadas para cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa.
- Insira o campo magnético de acionamento esferóide sob a placa para induzir a agregação e a formação de esferóides e coloque-o na incubadora (5% CO2, 37 ° C) por 3 h.
NOTA: O tempo de exposição ao campo magnético pode variar de acordo com o tamanho ou composição do esferóide. - Remover o campo magnético e colocar a placa na incubadora (CO2 a 5%, 37 °C) durante, pelo menos, 24 h para permitir a produção de proteínas da matriz extracelular e de interacções célula a célula/célula a matriz.
3. Preparação de membrana microporosa revestida com matriz extracelular
NOTA: Conduza as etapas desta seção em uma capela de fluxo laminar.
- Adicione 50 μL da matriz extracelular disponível comercialmente ao centro de uma membrana microporosa de 24 poços usando uma ponta de 200 μL.
NOTA: Mantenha a matriz extracelular em gelo úmido. Não toque na membrana microporosa ao colocar a matriz por cima. - Remova as bolhas usando uma agulha estéril e certifique-se de que a matriz cubra toda a superfície da membrana.
- Coloque a membrana na incubadora (37 °C) por 1 h para permitir a formação de gel da matriz extracelular.
4. Ensaio de invasão
NOTA: Conduza as etapas desta seção em uma capela de fluxo laminar.
- Adicionar 500 μL de meio de cultura DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino na câmara inferior da membrana microporosa como quimioatraente.
- Remova cuidadosamente o meio dos esferóides formados e adicione suavemente 50 μL / poço de meio DMEM / F12 fresco não suplementado sobre o heterosferóide.
NOTA: Esta etapa pode ser executada usando uma unidade de retenção para o método de campo magnético de bioimpressão. - Corte a borda de uma ponta de baixa retenção de 200 μL com uma tesoura estéril.
NOTA: O tamanho da ponta dependerá do tamanho do esferoide. - Colete o esferóide e 50 μL de meio com a ponta de baixa retenção.
NOTA: Execute esta etapa lenta e cuidadosamente para evitar a desagregação do esferoide. - Coloque o esferóide suavemente no topo da matriz extracelular.
NOTA: Não toque na matriz extracelular gelificada. - Adicione cuidadosamente 150 μL de meio DMEM/F12 não suplementado gota a gota para atingir um volume total de 200 μL.
- Colocar a placa na incubadora (5% CO2, 37 °C) durante 48 h.
NOTA: O tempo de incubação pode variar dependendo da linha celular ou protocolo.
5. Aquisição de imagem
- Use um microscópio confocal para imagens.
- Configure o microscópio com base nas características de excitação e emissão de manchas fluorescentes vitais usadas (por exemplo, corante CFSE, laser de 488 nm e comprimento de onda de detecção de 520 nm; fibroblasto: corante CMTPX, laser de 561 nm e comprimento de onda de detecção de 610 nm; monócito, corante Violet BMQC, laser de 405 nm e comprimento de onda de detecção de 516 nm).
- Carregue a placa na platina do microscópio.
- Localize esferoides/células usando o campo claro com ampliação de 10x.
- Ajuste o zoom para ampliação de 40x.
- Defina a potência do laser e o ganho do detector para cada canal fluorescente.
- Identifique o ponto de partida do Z-Stack como o plano focal da membrana, localizando os poros da membrana usando o campo claro.
- Capture três imagens abaixo e cinco a oito imagens acima da membrana ao longo do eixo z para cada canal, incluindo o campo claro. Garanta intervalos de 10 μm entre as imagens, cobrindo uma profundidade total de 90-120 μm no eixo z.
- Salve o projeto como um arquivo de extensão .czi depois de gerar as imagens.
6. Extração de imagem
NOTA: O uso do software de imagem é explicado abaixo.
- Abra o arquivo .czi usando o software de edição de imagem (consulte Tabela de materiais).
- Clique em Processamento no canto superior direito e selecione Único. Em seguida, clique em Método e escolha Exportar imagem.
- Selecione o arquivo em Entrada.
- Clique no botão Parâmetros e selecione as seguintes configurações: Tipo de arquivo (Formato de arquivo de imagem marcada - . TIFF), Compressão (LZM), Redimensionar (100%), Aplicar Curva de Exibição e Cor do Canal, Imagens de Canais Individuais, Usar Nomes de Canais, Definir Subconjuntos (Canal, selecionar todos os canais), Posição Z (extrair tudo), Região (Completa), Blocos (Exportar blocos selecionados) e Exportar para (selecione o arquivo de destino).
NOTA: Para extrair imagens de canal mescladas, selecione as seguintes configurações: Tipo de arquivo (Formato de arquivo de imagem marcada - . TIFF), Compressão (LZM), Redimensionar (100%), Aplicar Curva de Exibição e Cor do Canal, Imagem de Canais Mesclados, Usar Nomes de Canais, Definir Subconjuntos (Canal, selecione os canais específicos a serem sobrepostos), Posição Z (extrair tudo), Região (Completa), Blocos (Exportar blocos selecionados) e Exportar para (selecione o arquivo de destino). - Clique no ícone Aplicar localizado no canto superior direito.
NOTA: Esta etapa exportará simultaneamente imagens dos diferentes canais.
7. Análise de imagem
NOTA: O uso de software livre é explicado nesta etapa.
- Clique em Arquivo no canto superior esquerdo, selecione Abrir, escolha a imagem e clique em OK.
- Clique em Analisar, depois em Definir Medidas e selecione Área, Densidade Integrada e Rótulo de Exibição. Clique em OK.
- Clique em Analisar e, em seguida, em Medir.
NOTA: Certifique-se de que a área de todas as imagens seja a mesma. "Densidade integrada" exibe dois valores: (1) Densidade integrada bruta (RawIntDen): soma de todos os valores de pixel na imagem; (2) Densidade Integrada (IntDen): Produto do valor médio de cinza e área. Como a imagem é de cor RGB e a área de todas as imagens é a mesma, considere usar RawIntDen como o valor de medição de fluorescência. Diferenças nos valores de fluorescência (intensidade e quantidade) entre as imagens podem indicar variações na intensidade de invasão e proliferação celular. Outro método para normalizar o padrão de invasão na matriz extracelular em direção à membrana microporosa usando co-culturas de diferentes tipos de células é calcular a proporção dos valores de RawIntDen:
Razão RawIntDen =
Uma proporção de 1 representa a imagem/localização ao longo do eixo z com a maior invasão/localização de células para esse tipo de célula específico.
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Resultados
Este estudo apresenta um método alternativo para avaliar a invasão celular in vitro utilizando esferoides compostos por diferentes tipos celulares. Ele permite a análise dos padrões de invasão celular em um contexto multicamadas e o exame da dinâmica de co-localização celular durante a invasão (Figura 1).
As imagens de campo claro representam a localização de esferóides/células, identificadas por aglomerados escuros/pretos (Figura 2A<...
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Discussão
As culturas de esferóides tridimensionais são uma abordagem poderosa para investigar vários aspectos da biologia celular. Neste estudo, relatamos um protocolo para avaliação da invasão de células neoplásicas usando heterosferóides que mimetizam o microambiente tumoral em uma abordagem multicamadas e mais dinâmica. Este método permite a avaliação da co-localização e padrões de invasão na presença de células estromais não neoplásicas.
Existem algumas etapas críticas que merecem consideração. Pri...
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Divulgações
Os autores declaram não ter conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 20/10544-1 e 20/10664-7). Algumas imagens foram geradas usando BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Bioimpressão de 96 Poços | Greiner Bio-one | 655840 | Campo magnético da unidade esferoidal. Segurando a unidade. Microplaca de 96 poços, superfície repelente de células |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| CellTracker Red CMTPX | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | C34552 | |
| CellTracker Violet BMQC Dye | Invitrogen, Thermo Fisher | C10094 | |
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 31600-034 | |
| DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12400-024 | |
| Matriz extracelular com Myogel | doi: 10.1186/s12885-015-1944-z | Mistura composta de myogel (2.4 mg/mL), colágeno (0.8 mg/mL) e meio não suplementado de célula neoplásica | |
| FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12657-029 | |
| Hidrocortisona | Sigma H088 | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | Software | |
| Nanoshuttle-PL | Greiner Bio-one | 657841 | Nanopartículas magnéticas |
| Agulha 23 G | Medix | AHMD004 | 25 x 0,60 mm (23 G x 1) |
| PBS pH 7,2 (1x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 2012-027 | |
| Penicilina-estreptomicina (5.000 U / mL) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Pipet Tips | Axygen, Corning Inc. | TF-200-L-R-S | Ponta de pipeta com barreira (filtro), 200 µ L Filtro de baixa retenção, curto, recuperação máxima |
| RPMI | Gibco, ThermoFisher Scientific | 31800-022 | |
| TransWell 24 poços | Costar, Corning Inc. | 3422 | Transwell Permeável Suporta Inserto de 6,5 mm, placa de 24 poços; 0,8 µ m Membrana de Policarbonato |
| Zen 3.4 (edição azul) | Software | do Grupo |
Referências
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- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21 (1), 1-19 (2021).
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Reimpressões e permissões
