Este artigo detalha o projeto, a montagem e o protocolo para um sistema de alimentação automatizado, juntamente com uma modificação alternativa de tampa e gaiola que pode ser implementada em gaiolas de roedores padrão com modificações mínimas para experimentos de fotometria optogenética ou de fibra amarrada. O sistema de alimentação oferece uma ferramenta econômica para alimentação cronometrada e/ou restrição calórica.
Artigo de método
Um sistema "faça você mesmo" para alimentação programada de roedores de laboratório em sua gaiola doméstica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O jejum intermitente e a pesquisa em torno da influência da restrição calórica cronometrada na regulação do peso corporal e nos resultados do envelhecimento são tendências, tanto na sociedade quanto no laboratório. Para estudar a alimentação com restrição de tempo e/ou restrição calórica em laboratório, as quantidades alocadas de alimentos são dispersas em intervalos de tempo programados. A tecnologia atual para alimentação programada de roedores envolve gaiolas especializadas com portas de entrada de alimentos fechadas, funis digitais bloqueados por tempo ou entrega manual de alimentos. Equipamentos especializados para tais experimentos podem ser caros e a alimentação manual geralmente exige que os investigadores venham para pontos de tempo tarde da noite/manhã cedo, impedindo estudos prolongados. O sistema de alimentação automatizado descrito aqui fornece uma ferramenta econômica para alimentação cronometrada e/ou restrição calórica que pode ser implementada em gaiolas de roedores padrão com modificações mínimas. O protocolo usa um alimentador automático pronto para uso que é equipado com uma tampa de gaiola de microisolador padrão (tampas de gaiola de camundongo, hamster, rato ou porquinho-da-índia) e pode administrar as cotas de comida desejadas em intervalos de tempo programados na gaiola doméstica do animal. Nosso projeto pode ser modificado para aceitar vários alimentadores ou pequenas variações nas dimensões da gaiola. Fornecemos o projeto, a montagem e o protocolo para o sistema de alimentação, juntamente com uma modificação alternativa da tampa e da gaiola para experimentos de fotometria optogenética ou de fibra amarrada.
Introdução
O jejum intermitente é uma área importante da pesquisa metabólica e do envelhecimento. O alinhamento adequado da alimentação e do ritmo circadiano pode alterar o efeito da dieta sobre o peso corporal 1,2,3,4. Além disso, o jejum intermitente prolongado está associado ao aumento da longevidade e à melhora dos distúrbios relacionados à idade 5,6,7,8. Estudos de pesquisa que implementam protocolos de jejum de longo prazo (>20 dias) geralmente requerem equipamentos especializados. Embora seja possível entregar alimentos manualmente para protocolos de alimentação programados, isso pode exigir que um investigador esteja presente em vários pontos fora do horário de expediente por um longo período. Por exemplo, três horários de alimentação com 4 h de intervalo exigiriam entrega manual às 20h00, 12h00 e 4h00; provavelmente um desafio de conformidade a ser sustentado por mais de alguns dias.
Alternativas à entrega manual de alimentos para roedores de laboratório são 1) gaiolas especializadas com acesso automatizado ao alimento ou 2) sistemas de tremonha digital que fornecem acesso automatizado e programado aos alimentos, como o FED39. Os sistemas de gaiola com acesso fechado a alimentos são caros e alguns não fornecem um ambiente adequado para estudos de longo prazo. Por exemplo, as caixas de condicionamento operantes tradicionais são capazes de entrega automatizada de alimentos, mas têm um piso com grade de arame que não é propício para moradias de longo prazo. O sistema BioDAQ da Research Diets fornece comida e água por meio de portas externas fechadas. Portões automatizados programáveis permitem estudos programados de alimentação ou bebida de longo prazo, no entanto, o sistema é um investimento caro. Os sistemas de tremonha mecanizada são mais uma ferramenta para protocolos automatizados de alimentação programada 9,10. Os dois funis mecanizados citados vêm com a ressalva de reduzir o espaço de vida da gaiola doméstica. Animais famintos com restrição alimentar podem mastigar os aparelhos de alimentação e/ou detritos da gaiola podem interferir na mecânica da tremonha para estudos de longo prazo. Finalmente, uma tremonha mecanizada desenvolvida pelo grupo de pesquisa Takahashi junto com a Phenome Technology foi projetada especificamente para estudos de alimentação programada de longo prazo3. Neste sistema, uma tremonha mecanizada é posicionada acima da grade de uma gaiola padrão com uma calha que entrega alimentos. O sistema Phenome, no entanto, não oferece flexibilidade para animais amarrados a um cabo de remendo (experimentos de optogenética/fotometria de fibra) e é relativamente caro em comparação com o aparelho de alimentação automática descrito aqui.
Em resposta aos desafios predominantes nos protocolos de alimentação programada, propomos um remédio econômico. Nosso sistema automatizado facilita a entrega precisa de alimentos em intervalos predeterminados. Com uma combinação de peças impressas em 3D junto com um alimentador automático de peixes disponível comercialmente, criamos um sistema de alimentação externa faça você mesmo (DIY) que pode ser equipado em gaiolas de roedores autônomas que usam tampas de microisoladores. O sistema de alimentação e as partes aqui descritas podem ser aplicados diretamente a qualquer uma das seguintes gaiolas de roedores: camundongo, rato, hamster ou porquinho-da-índia, desde que as gaiolas autônomas usem topos de microisoladores. Como as gaiolas variam em tamanho, as colocações podem variar um pouco, mas os suportes impressos em 3D, o sistema de alimentação e o design da garrafa de água externa são geralmente aplicáveis em gaiolas de roedores autônomas com tampas de microisoladores.
Apresentamos um exemplo de alimentador automático, mas muitos outros alimentadores automáticos prontos para uso estão disponíveis e podem ser instalados no sistema modular com pequenas alterações nas peças impressas em 3D. Para facilitar o ajuste do suporte impresso em 3D para alimentadores alternativos ou pequenas variações nas dimensões do enjaulamento, provamos um arquivo SolidWorks tridimensional modificável com um arquivo STL complementar.
A colocação externa do alimentador automático fornece espaço total dentro da gaiola doméstica e permite o desprendimento, esterilização e recarga ou substituição do alimentador sem interrupção do animal. O sistema de alimentação automatizado é eficiente para gravações de longo prazo, acessível e passível de vários protocolos de alimentação com restrição de tempo e/ou restrição calórica. Fornecemos desenhos técnicos detalhados dos conjuntos de gaiolas, design e protocolo para implementação do sistema de alimentação, juntamente com dados de amostra. Em segundo lugar, fornecemos um conjunto de instruções para modificar o enjaulamento padrão para o uso do alimentador automático com animais que estão presos a um cabo de conexão para experimentos optogenéticos ou de fotometria de fibra.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Massachusetts Amherst.
1. Montagem do alimentador automático em uma tampa de gaiola microisoladora padrão (Figura 1)
- Usando uma ferramenta rotativa com um disco de corte de 1,5", corte um quadrado de 20 x 25 mm em uma tampa de gaiola de microisolador. Posicione a abertura a 2.75 cm da borda da tampa e centralizada acima da grade (Figura 1B, esquerda).
- Imprima em 3D um suporte para acoplar o alimentador automático na tampa da gaiola (Figura 1A e Supplemental File 1). Encaixe o suporte no orifício da tampa da gaiola (passo 1.1; Figura 1B, centro) e deslize o alimentador automático na parte superior do suporte preso (Figura 1B [direita], C).
Figura 1: Modificação e montagem do suporte do alimentador automático e da tampa da gaiola. (A) Desenho técnico do suporte do alimentador automático (consulte os arquivos SolidWorks/STL no Arquivo Suplementar 1 para obter a escala em 3D). (B) Da esquerda para a direita, topo da gaiola com orifício de 20 x 25 mm; suporte instalado no topo da gaiola e montado com alimentador automático Petbank. (C) Alimentador automático Petbank montado na gaiola com pellets de comida deixados cair em uma gradinha padrão com garrafa de água. Barras de escala = 25 cm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Programação e uso do exemplo de alimentador automático pronto para uso
- Para experimentos cronometrados, defina os tempos de alimentação primeiro e o relógio do alimentador sincronizado por último, pois os ajustes subsequentes mudarão a hora do relógio.
- Certifique-se de que o alimentador esteja suficientemente carregado. Pressione e segure o botão Configurações até que a configuração da hora na tela comece a piscar.
- Continue para a configuração de tempo . Usando as setas para cima e para baixo, ajuste o tempo para o primeiro período de alimentação programado desejado.
- Defina o número de alocações para esse ponto de tempo (indicado pelo número de pontos ao lado da configuração do feed). Repita as etapas 2.2-2.4, para até mais dois pontos de tempo.
- Carregue as câmaras de alimentação automática com as cotas de alimentos desejadas de ≤ 1,5 g de ração padrão para roedores. Se for necessário mais alimento, configure o alimentador para entregar várias cotas em um determinado momento. O alimentador de exemplo tem 16 câmaras.
NOTA: Os alimentos podem ser encomendados no tamanho certo ou aparados com uma tesoura. - Rotule uma câmara com fita adesiva ou tinta para confirmar a rotação programada da câmara e a entrega de alimentos. Verifique diariamente durante a operação dos alimentadores.
3. Sistema de gaiola modificado para animais amarrados com o alimentador automático
- Inserção de tampa de substituição opcional para animais amarrados a um cabo de conexão (Figura 2)
- Corte a laser um pedaço de acrílico transparente de 3 mm de espessura de acordo com as especificações da Figura 2A (consulte também o Arquivo Suplementar 2). A inserção de acrílico é projetada com abas para encaixar no topo da gaiola. A fenda central (190 x 5 mm) permite a passagem do patch cable. O orifício quadrado de 20 x 25 mm se encaixa no suporte do alimentador automático; 20 orifícios de ventilação permitem a circulação de ar fresco.
- Usando uma chave de fenda ou uma ferramenta de cunha, retire a tampa superior da gaiola perfurada de uma tampa microisolada padrão. Trabalhe para liberar as abas dos slots da aba e remova a inserção perfurada e o papel de filtro (Figura 2C, esquerda e centro).
- Sob a parte superior perfurada e o papel de filtro há uma grade de suporte interna com nervuras. Use uma ferramenta rotativa e um disco de corte de 1,5 polegadas para remover a grade de suporte; seguindo os indicadores de seta mostrados no centro da Figura 2C. Após o corte para remover a grade de suporte, lime para alisar a borda cortada.
- Encaixe a inserção da placa de acrílico de substituição (etapa 3.1) na parte superior da gaiola. Inicie a instalação deslizando as abas da placa nas ranhuras da aba ao longo de uma das bordas curtas e, em seguida, de uma das bordas longas e pressione suavemente até que a placa se encaixe no lugar (Figura 2C [direita] ,D).
- Suporte externo opcional para garrafa de água para animais amarrados a um patch cord (Figura 3)
- Faça uma porta para o bebedor de garrafa de água: orifício de 11 mm de diâmetro, 50 mm do chão, centralizado na borda curta da gaiola (Figura 3B e Arquivo Suplementar 3).
- Em ambos os lados do orifício central (± 27,5 mm), faça dois furos de 6 mm de diâmetro. Opcionalmente, use uma ferramenta de punção quadrada de 8 mm para fazer furos quadrados (mostrado na Figura 3B).
- Imprima em 3D um suporte externo para garrafa de água (Figura 3A e Arquivo Suplementar 4). Monte o suporte da garrafa de água no fundo da gaiola com parafusos de transporte (2 cm de comprimento, 6 x 1 mm ou 0.75" de comprimento 1/4 x 20; Figura 2B, C).
- Para uma garrafa de água, coloque um tubo cônico padrão de 50 mL, tampado com um conjunto de sipper/rolha (#7 Stopper W/ 3-1/2" sipper curvo, consulte a Tabela de Materiais) no suporte externo. Reabasteça a água a cada 2-3 dias.
Figura 2: Montagem da placa de acrílico no topo da gaiola. (A, B) Desenhos técnicos da placa acrílica e do plugue da porta do alimentador. (C) Esquerda, topo de gaiola padrão com inserto perfurado e filtro. Centro, remoção do inserto perfurado e do filtro (a grade nervurada deve ser cortada ao longo das linhas indicadas pela seta). Direita, placa de acrílico encaixada no lugar. (D) Montagem completa da tampa. Barras de escala = 25 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Conjunto do suporte da garrafa de água. (A) Desenho técnico do suporte da garrafa de água impresso em 3D. (B) Modificações da gaiola e montagem do suporte da garrafa de água; (C) Suporte instalado; (D) Montagem completa da gaiola. Barras de escala = 10 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resumo da montagem completa da gaiola com o alimentador automático. (A) Gaiola padrão com grade de arame, (B) gaiola modificada para animais amarrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Resultados
Um estudo de restrição calórica (21 dias) para induzir infertilidade em camundongos fêmeas (autoalimentador e design de gaiola, Figura 4A)
A deficiência crônica de energia é suficiente para inibir a fertilidade em mamíferos, uma resposta que é conservada em roedores e humanos11,12. Neste estudo, usamos a restrição calórica para induzir a perda de peso corporal a longo prazo. Camundongos C57BL/6 fêmeas adultas, de ...
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Discussão
Em modelos animais pré-clínicos, a restrição calórica é uma poderosa ferramenta experimental para manipular e estudar com precisão o metabolismo. A perda de peso sustentada tem implicações na obesidade, diabetes, envelhecimento, fertilidade e menopausa (um tipo de envelhecimento reprodutivo), todos os quais são importantes desfechos translacionais. Os paradigmas de restrição calórica, no entanto, podem ser difíceis de sustentar por um longo tempo. Neste manuscrito, oferecemos uma solução...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Jason Lê é apoiado pelo programa de educação em pesquisa pós-bacharelado financiado pelo National Institutes of Health.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #7 Rolha W/ 3-1/2" tubo de bebedor curvo sem bola | Labex | 2067 | |
| AN75 fundo de gaiola de rato | Ancare | AN75HT | |
| Alimentador Automático de Peixes para Aquário | Petbank-tek.com | distribuição na Amazônia (#B0BRCWP16K) | |
| Tampas de Microfiltro de Roedores | Ancare | N10MBTPLF | |
| Rolhas de Borracha, Um Furo | United Scientific | S24009 | |
| Prolab IsoPro 3000 |
Referências
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