Artigo de método

Análise específica de fitas de proteínas em fitas de DNA replicantes por enriquecimento e sequenciamento do método de DNA nascente associado a proteínas

DOI:

10.3791/67120

⸱

2 de maio de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Hormel Institute, University of Minnesota, 2West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, 3Institute for Cancer Genetics, Department of Pediatrics and Department of Genetics and Development, Columbia University Medical Center

Neste artigo

Resumo

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O enriquecimento e sequenciamento do DNA nascente associado a proteínas (eSPAN) foi desenvolvido para detectar a abundância relativa de uma proteína associada à cromatina em duas fitas replicantes de DNA, revelando assim insights moleculares sobre a replicação da cromatina e seus processos acoplados. Este protocolo descreve procedimentos de eSPAN em células-tronco embrionárias (ES) de levedura e camundongo.

Resumo

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A duplicação do genoma é orquestrada por proteínas respondesomes, incluindo helicases, que desenrolam DNA de fita dupla em fitas simples antiparalelas individuais, cada uma exigindo modos distintos de replicação: contínua (antecipada) e descontínua (atrasada). Compreender as interações das proteínas associadas à cromatina com fitas de DNA replicantes in vivo é crucial para elucidar os mecanismos de montagem da cromatina e reparo do DNA acoplados à replicação do DNA. Este protocolo apresenta o método de enriquecimento e sequenciamento de DNA nascente associado a proteínas (eSPAN), projetado para quantificar os níveis relativos de proteínas em cadeias de DNA nascente e atrasadas em garfos de replicação. O procedimento eSPAN começa com imunoprecipitação de cromatina (ChIP, em levedura) ou clivagem sob alvos e marcação (CUT&Tag; em células de mamíferos) de uma proteína de interesse, seguido pelo enriquecimento do DNA nascente associado à proteína por imunoprecipitação de bromodeoxiuridina (BrdU). O sequenciamento de próxima geração específico para fita é aplicado ao ssDNA isolado. Essa técnica pode ser usada para determinar se uma proteína está enriquecida em forquilhados de replicação dianteiros ou atrasados. O eSPAN fornece preferência de cadeia genômica para proteínas associadas à cromatina, incluindo histonas em bifurcações de replicação.

Introdução

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Em organismos eucarióticos, a duplicação do genoma é iniciada a partir de múltiplos locais chamados origens de replicação, onde o complexo de reconhecimento de origem (ORC) se liga e inicia a maquinaria proteica de recrutamento, incluindo a helicase CMG, para iniciar a replicaçãodo DNA 1. A maquinaria respondesoma em cada origem de replicação forma dois forks de replicação que se movembidirecionalmente 2,3. Os bifurcadores de replicação dupla replicam as duas fitas parentais do DNA por meio da síntese contínua da fita líder e da síntese descontínua da fita retardada. Dada essa natureza assimétrica de cada garfo de replicação, os componentes de replicação, incluindo as DNA polimerases nas fitas dianteira e retardada, são diferentes. Análises genéticas anteriores baseadas em DNA polimerases mutantes demonstram que o DNA Pol ε e o DNA Pol δ são as principais polimerases responsáveis pela replicação da cadeia líder e atrasada,respectivamente 4,5. Vários métodos foram desenvolvidos para detectar a preferência da DNA polimerase pela cadeia, incluindo Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 e emRiboSeq ou RiboSeq 9,10. Esses métodos genéticos para dissecar a especificidade da cadeia são limitados a DNA polimerases e exigem a introdução de mutações em cadaproteína 4,5,11,12. Rastrear a associação de qualquer proteína-alvo com as cadeias dianteiras e atrasadas dos forquilhadores de replicação de DNA fornecerá insights valiosos sobre a replicação do DNA. Neste esforço, primeiro desenvolvemos a técnica eSPAN (enriquecimento e sequenciamento de DNA nascente associado a proteínas, Figura 1) em células de levedura. Como estudo de prova de princípio, mostramos inicialmente que Pol δ e Pol δ são enriquecidos em fios líderes e atrasados, respectivamente. Também descobrimos a preferência de fita dos principais componentes da replicação do DNA, incluindo a helicase replicativa de DNA, a proteína de ligação ao DNA de fita simples (proteína de replicação A), a lâmpada de antígeno nuclear de célula proliferante (PCNA) e seu fator de replicação carregador C (RFC)13. Importante, nós e outros usamos esse método para descobrir mecanismos de transferência parental de histonas, um processo que foi intratável por mais de 4 décadas14, 15, 16, 17.

O método eSPAN envolve duas etapas sequenciais: enriquecimento da proteína-alvo por ChIP18 ou CUT&Tag 19 e enriquecimento do DNA nascente associado à proteína por imunoprecipitação de BrdU. Em uma cepa padrão de levedura (W303 ou S288C), BrdU ou EdU extracelular não pode entrar nas células e incorporar-se aos cromossomos. Essas cepas não possuem um transportador de nucleósidos adequado para a captação de timidina, bem como a timidina quinase necessária para fosforilar a timidina em TMP, que converte BrdU (ou EdU) em BrdUMP (EdUMP). A expressão do transportador de nucleósidos equilibrados humanos 1 (hENT1) e do vírus do herpes simplex timidina quinase (HSV-TK) aumenta a absorção de timidina e a conversão de BrdU (ou EdU) em BrdUMP (EdUMP)20. Portanto, para realizar o experimento eSPAN em leveduras, as cepas tiveram que ser inseridas com uma estrutura BrdU-Incorporante (BrdU-Inc) (HSV-TK e hENT1)13,21.

Anteriormente, fornecemos o protocolo eSPAN para proteínas de replicação de DNA nalevedura 22. Recentemente, integramos o método CUT&Tag ao protocolo eSPAN em células de mamíferos para abordar etapas tecnicamente desafiadoras que exigem otimização, como reticulação, cisalhamento da cromatina, e para minimizar o número de célulasiniciais 17,23. Aqui, fornecemos eSPAN de histonas para visualização usando células de levedura (Figura 2). Esse método é usado principalmente para analisar a distribuição de formas modificadas de histonas em fitas de DNA replicantes. Embora tenhamos testado várias marcas de histonas, usamos H3K4me3, uma marca na histona parental H3, como exemplo. Para analisar componentes e fatores responsosas envolvidos na reparação do DNA em bifurcações de replicação, recomendamos a cisalhamento da cromatina em pequenos fragmentos usando sonicação, conforme descrito em nossa primeirapublicação 22. Para células de mamíferos, adotamos os procedimentos modificados Cut&Tag para substituir a etapa ChIP descrita nalevedura 23. Essa modificação reduz a quantidade de material inicial (células) e, mais importante, permite a geração de bibliotecas eSPAN para sequenciamento sem o uso de kits de preparação de DNA de fita simples. Para o protocolo de levedura, optamos por não usar o método Cut&Tag porque a quantidade de material inicial era suficiente. Mais importante ainda, descobrimos que os procedimentos Cut&Tag não foram consistentemente eficazes para as células de levedura em nossas mãos.

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Protocolo

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NOTA: Para diretrizes de preparação de tampão e reagente, veja as diretrizes de preparação de tampão e reagentes (Arquivo Suplementar 1).

1. Histone eSPAN em levedura de gemação

NOTA: A maioria das cepas de levedura não possui um transportador funcional de nucleósidos para a captação de timidina. Para marcar o DNA de forma eficiente com BrdU ou EdU para eSPAN, é necessária uma cepa21 de timidina quinase (TK+) positiva. Além disso, apenas cepas de levedura tipo 'A' de acasalamento podem ser usadas para a parada do ciclo celular usando o fator alfa.

  1. Sincronização das células de levedura e marcação de BrdU (8 h)
    1. Inocule uma única colônia de cepa de levedura apropriada (TK+) em 10 mL de meio YPD e cresça a 30 °C em uma incubadora agitada durante a noite a 220 rpm.
    2. Meça a densidade óptica, OD600 nm, com um espectrofotômetro e dilua a cultura em 200 mL frescos de meio YPD com OD600 ~0,2-0,3.
    3. Cultive a cultura até OD600 ~0,4-0,5 (geralmente leva 3-4 horas) a 30 °C em um incubador agitado a 220 rpm.
    4. Adicione 300 μL de fator α (5 mg/mL) e faça cultura por 1,5 h a 25 °C, 220 rpm.
    5. Adicione outra dose de 300 μL de α-fator (5 mg/mL) e cultive por mais 1,5 h a 25 °C, 220 rpm.
    6. Prepare a solução de fixação de paraformaldeído a 37,5% e pré-aqueça o meio (200 mL YPD +HU (hidroxiureia)+ BrdU) a 30°C durante a sincronização celular.
      ATENÇÃO: Manuseie o BrdU com cautela, pois é um potencial mutagênico e teratogênio. Prepare uma solução de paraformaldeído a 37,5% em uma exaustão química para evitar a exposição a vapores nocivos, pois o paraformaldeído é um potencial carcinógeno.
    7. Verifique a morfologia das células (em formato de barra) com um microscópio óptico para garantir que pelo menos 90% das células da levedura estejam na fase G1 15 minutos antes da parada de 3 horas do G1. Alternativamente, realize-se uma análise de separação celular ativada por fluorescência (FACS) para confirmar a paradaG1 24.
      NOTA: Verifique a morfologia celular e confirme a parada em G1 (90% com formato de barra) nesta etapa.
    8. Colete as células (pellet) por centrifugação a 1600 g por 5 minutos a 4 °C e lave o pellet de células duas vezes com 20 mL de água dupla destilada congelada.
    9. Resuspenda as células em 200 mL pré-aquecidos (30 °C) de YPD +HU+ BrdU.
      NOTA: O objetivo da liberação de HU é garantir que a maioria das células de levedura esteja na fase S de replicação inicial, o que melhorará a consistência e garantirá a reprodutibilidade dos resultados. Omitir o HU é aceitável se for necessário trabalhar com células de fase logarítmica.
    10. Cultive as células em uma incubadora agitada a 30 °C, 220 rpm por 45 minutos.
      NOTA: A análise FACS pode ser realizada para confirmar a fase S inicial. Para a análise FACS, é importante incluir uma amostra logarítmica como controle para definir com precisão a população celular G1. Para uma incorporação eficiente do BrdU, é vantajoso começar com células de crescimento rápido. Alguns mutantes com defeitos de crescimento lento tendem a apresentar baixa eficiência de marcação de BrdU. A eficiência da incorporação e desempenho do BrdU-IP é avaliada por PCR quantitativa comparando regiõesreplicadas e não replicadas 22 usando DNA isolado da etapa 1.6.7.
  2. Fixação e coleta da amostra (1 h)
    1. Adicione 6 mL de paraformaldeído a 37% preparados na hora até uma concentração final de 1%, misture bem e incube a 25 °C por 20 minutos com uma sacudida suave, 90 rpm.
    2. Apague a fixação adicionando 12 mL de 2,5 M glicina, misture bem e incube a 25 °C por 5 minutos com uma sacudida suave, 90 rpm.
    3. Faça pellets nas células a 1600 g por 5 minutos em temperatura ambiente (RT). Depois, lave as células duas vezes com 20 mL de água fria, centrifugando a 1600 g por 5 minutos.
    4. Colete as células em tubos de 2 mL com tampa roscada (50 mL de células/tubo) e armazene-as a -80 °C.
      NOTA: As células podem ser armazenadas por até um ano (ponto de pausa).
  3. Lise celular de levedura e fragmentação da cromatina (5 h)
    1. Descongele os pellets celulares, ressalte por meio de vórtice suave e lave com 0,4 mL de tampão de lise ChIP com inibidores de protease e mistura de antibióticos (prevenindo o crescimento de bactérias contaminantes) e centrifuge a 5.000 g por 1 minuto.
    2. Adicione 0,1 mL de tampão de lise ChIP contendo inibidores de protease e uma mistura de antibióticos, seguido por aproximadamente 100 μL de esferas de vidro (0,5 mm).
    3. Lisar por conta batendo por 3 ciclos (30 s ligando/desligando, 1 minuto apagado) em um quarto frio a 4 °C.
    4. Fure furos no fundo do tubo com uma agulha quente de 16 G.
      NOTA: Para manter a agulha quente, tente manter o tubo próximo ao fogo.
    5. Colete o lisato aninhando o tubo em um tubo vazio de baixa ligação de DNA de 1,5 mL e centrifuge a 1600 g por 2 min, RT.
    6. Aspire o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o pellet (a cromatina estará na fração de detritos celulares).
      CUIDADO: Tenha cuidado para não aspirar acidentalmente o pellet de células ao usar o vácuo.
    7. Ressuspenda os pellets celulares pipetando 0,35 mL de MNase Digestion Buffer suplementado com 0,5 mM de espermidina e 0,1 mM de 2-mercaptoetanol.
    8. Adicione 10 unidades de MNase às reações, misture suavemente invertendo de 4 a 6 vezes imediatamente e incube a 37 °C em banho-maria por 20 minutos.
      NOTA: As condições de digestão devem ser otimizadas para cada lote da enzima MNase para enriquecer frações mono, di- ou trinucleossomo.
    9. Tempere a digestão da MNase adicionando 5 μL de 0,5 M EDTA para uma concentração final de 10 mM de EDTA. Misture suavemente por inversão e mantenha os tubos imediatamente no gelo por pelo menos 30 minutos.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite nesta etapa. As condições de digestão da MNase devem ser otimizadas para obter a maioria das frações mono-, di- ou tri-nucleossômica (140-450 pb)
    10. Sonice a mistura de reação com microtubos bioruptores (1,5 mL) por 3 minutos (alta potência, 30 s liga/desligado). Centrifuge a 10.000 g por 5 minutos a 4 °C.
      NOTA: Essa breve sonicação ajuda a liberar a cromatina no buffer.
    11. Transfira o sobrenadante para novos tubos e centrifuge por mais 10 minutos a 10.000 g a 4 °C.
    12. Colete o sobrenadante (cerca de 400 μL), salve 30 μL da amostra como DNA de entrada e congele a -20 °C. Use o lisado celular restante (~370 μL) na próxima imunoprecipitação de cromatina (passo 1.4.1).
  4. Imunoprecipitação de cromatina histona (durante a noite)
    1. Adicione 0,5 μg de anticorpo H3K4me3 ao lisado e nute no rotor, 10 rpm a 4 °C durante a noite.
      NOTA: Aqui, H3K4me3 é usado como exemplo. A quantidade de anticorpos deve ser testada experimentalmente.
    2. Centrifuge a 15.800 × g por 10 minutos a 4 °C e transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
    3. Adicione 20 μL de esferas de proteína G pré-lavadas (3 vezes lavadas com tampão de lise ChIP, nutate no rotor por 3 minutos cada, colete esferas por centrifugação a 350 × g, 4 °C) e incube a 4 °C por 2 horas.
    4. Centrifuge a 350 × g na RT e lave as esferas de acordo com a seguinte ordem.
      1. Lave duas vezes com 1 mL de tampão de lise gelada por 3 minutos cada vez, em rotação a 10 rpm em um rotador em RT.
      2. Lave uma vez com 1 mL de tampão de lise gelada com 0,5 M de NaCl por 3 minutos por rotação a 10 rpm em um rotador em RT.
      3. Lave uma vez com 1 mL de tampão Tris/LiCl gelado por 3 minutos em rotação a 10 rpm em um rotador na RT.
      4. Lave um com 1 mL de buffer de lavagem RT Tris/EDTA (não buffer TE, Arquivo Suplementar 1 para a receita). Tire todo o líquido possível do pellet com uma agulha de 16 G 1/2.
  5. Extração de DNA (2 h)
    1. Adicione 0,1 mL de resina quelante bem misturada a 10% para extração de DNA às esferas lavadas (do passo 1.4.4.4.), à amostra de entrada (do passo 1.3.12) e ao vórtice.
    2. Ferva por 10 minutos em um bloco de aquecimento de 100 °C, depois resfrie para o RT para fazer a reticulação reversa.
      NOTA: Clipes de travamento stop-pop para tubos de centrífuga são fortemente recomendados para manter a vedação do fechamento.
    3. Adicione 5 μL de 20 mg/mL de protease K às esferas e incube a 55 °C por 30 minutos enquanto agite a 400 rpm.
    4. Ferva as esferas em um bloco de calor a 100 °C por mais 10 minutos para inativar a atividade da protease K.
      NOTA: Clipes de travamento stop-pop para tubos de centrífuga são fortemente recomendados para manter a vedação do fechamento.
    5. Reduza as esferas a 6000 g por 2 minutos em RT e guarde o sobrenadante.
    6. Adicione 100 μL de 2XTE ao pellet. Faça vórtice e desacelere a 6000 g por 2 minutos em RT.
    7. Misture e salve os supernadantes (dos passos 1.5.5 e 1.5.6) tomados acima (cerca de 180 μL).
    8. Purifique amostras de 30 μL em 18 μL de tampão de elução (EB, fornecido com kit de purificação por PCR) usando colunas de purificação de DNA para preparação da biblioteca de ssDNA (do passo 1.3.12 como entrada e do passo 1.5.7 como amostras de H3K4me3 ChIP-seq).
      NOTA: As amostras de DNA podem ser armazenadas a -20 °C por até um mês (ponto de pausa).
  6. Imunoprecipitação BrdU (5 h)
    1. Ferva amostras (cerca de 150 μL de entrada e H3K4me3 ChIP do passo 1.5.7) por 5 minutos em um bloco de calor a 100 °C, e imediatamente resfrie no gelo por 5 minutos. Adicione 15 μL de 10x PBS e + 1,35 mL de buffer IP BrdU + 0,5 μL de anti-BrdU Ab + 1 μL de tRNA de E.coli (10 mg/mL).
      NOTA: Este é um passo crítico. Use os tubos centrífugos de baixa ligação ao DNA para evitar ligação inespecífica ao DNA.
    2. Faça a nutate por 2 h em um rotor a 4 °C a 10 rpm.
    3. Transfira a mistura para um tubo de 1,5 mL contendo 20 μL de esferas de proteína G Sepharose (lavadas três vezes com 1 mL de buffer IP BrdU e gire por 3 minutos a 10 rpm para cada lavagem em RT) e nute por 1 h a 4 °C no rotor a 10 rpm.
    4. Centrifuge a 800 × g por 1 min em RT e lave conforme o seguinte: três vezes com 1 mL de buffer IP frio BrdU, 3 min em um rotor e uma vez com 1 mL de buffer TE por 3 min.
    5. Gire a 800 × g por 1 minuto em RT e aspire o sobrenadante.
    6. Adicione 100 × μL de TE + 1% de SDS buffer nas esferas restantes. Incube a 65 °C por 5 minutos. Gire a 800 × g por 1 minuto no tempo de descanso.
    7. Purifique o sobrenadante em 18 μL de EB usando colunas de purificação de DNA (amostra de IP de BrdU e amostra de eSPAN H3K4me3).
      NOTA: Use os tubos centrífugos de baixa ligação para evitar ligação inespecífica ao DNA. Amostras de DNA podem ser armazenadas a -20 °C por até um mês (ponto de pausa).
  7. Preparação e sequenciamento de bibliotecas de ssDNA (3 h)
    1. Prepare as bibliotecas de DNA de fita simples com 15 μL de amostras purificadas de entrada, IP BrdU, H3K4me3 ChIP e eSPAN (passos 1.5.8 e 1.6.7) (incluindo as etapas de adaptase, extensão e ligação) de acordo com os manuais fornecidos pelo kit de preparação de bibliotecas de DNA ssDNA e de baixa entrada e purifique o produto de ligação obtido em 20 μL de buffer de elução de baixo EDTA (fornecido pelo DNA Library Prep Kit).
      NOTA: Existem duas etapas de purificação por ligadura com o kit. Esse protocolo segue o procedimento de 200 pb, <1 ng.
    2. Amplifique a biblioteca de DNA usando uma mistura total de reação de 50 μL (reagentes fornecidos pelo kit de preparação da biblioteca ssDNA): 20 μL de biblioteca de DNA purificada, 4 μL de reagente W2, 10 μL de reagente W3, 1 μL de enzima W4, 1,5 μL de primers Indexes I7 (10 μM, veja Sequência Suplementar de Oligo) e 1,5 μL de primer Indexe I5 (10 μM, veja Sequência Suplementar de Oligo), 16 μL de ddH2O livre de DNase. Aqueça a mistura de PCR a 98 °C por 30 s, seguido por 18 ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 60 °C, 1 min a 68 °C e um ciclo de 10 min a 68 °C.
      NOTA: Cada biblioteca deve utilizar uma combinação única de primers i7 e i5. O número de ciclos de amplificação deve ser ajustado com base na quantidade da biblioteca para evitar superamplificação, que pode resultar em artefatos de PCR. Dada a quantidade tipicamente baixa de DNA nas amostras de eSPAN, use até 18 ciclos.
    3. Purifique os produtos de PCR misturando 60 μL (1,0x volume) de esferas (pré-aquecidas a 30 °C) (veja a Tabela de Materiais).
    4. Misture bem os produtos de PCR e as contas.
      1. Deixe no RT por 5 minutos. Prenda as esferas no suporte magnético por 3 minutos e lave as esferas duas vezes com (cada vez 200 μL) 80% de etanol recém-preparado.
      2. Seque as esferas ao ar por 2 minutos e elude em um tampão de 20 μL de baixo EDTA (fornecido no Kit de Preparação da Biblioteca de DNA).
    5. Meça a concentração da biblioteca e a distribuição do tamanho dos fragmentos usando sistemas de eletroforese de alta resolução (veja a Tabela de Materiais).
    6. Reunir uma quantidade igual de bibliotecas individuais, incluindo as amostras de entrada, H3K4me3 ChIP, BrdU IP e eSPAN, e realizar sequenciamento paralelo de extremidades pareadas com a plataforma de sequenciamento Illumina. Para o processo de análise de dados, consulte a seção 3.
      NOTA: Os critérios de avaliação para os resultados do controle de qualidade são: (i) Não são detectados picos de adaptador/primer-dímero (abaixo de 180 pb). (ii) Todas as bibliotecas a serem agrupadas têm uma distribuição de tamanho semelhante e estreita (~300 de largura de base). Secar excessivamente as contas pode resultar em baixo rendimento; Use uma estação de trabalho de DNA para evitar contaminação. Bibliotecas podem ser armazenadas indefinidamente a -20°C (ponto de pausa).

2. Histone eSPAN com célula ES do mouse

NOTA: O eSPAN de histonas com célula ES de camundongos é essencialmente idêntico a um protocolo23 publicado anteriormente.

  1. Marcagem BrdU e coleta de amostras para células ES de camundongos (3 h)
    1. Cultive células ES de camundongos em um meio de cultura celular ES a 37 °C com uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 para atingir 70%-80% de confluência. Em geral, cerca de 1 milhão de células eram necessárias para o eSPAN de histonas. Faça as células semente 1 dia antes dos experimentos para garantir que as células estejam crescendo em estágio exponencial.
    2. Mudar o meio e incubar as células com BrdU em concentração final de 50 μM por 30 minutos a 37 °C com uma atmosfera umidificada de 5% deCO2 .
      NOTA: A eficiência da rotulagem do BrdU pode ser monitorada por meio de análise quantitativa por PCR. Alternativamente, a imunofluorescência ou análise FACS pode ser usada para monitorar a eficiência da incorporação do BrdU. Células não marcadas podem ser usadas como controle negativo. Essas são as condições padrão de rotulagem para células ES de camundongo. Recomenda-se ajustar as condições de marcação de acordo com células com taxas de proliferação variadas e duração da fase S.
    3. Enxágue as células duas vezes suavemente com PBS gelado.
    4. Tripsinize e colete as células por pellets a 200 × g por 5 minutos.
    5. Pipete suavemente as células para o meio para resuspendê-las, depois conte-as. Centrifuge o número necessário de células a 500 × g por 5 minutos em RT.
    6. Resuspenda a célula em 4 mL de buffer de lavagem pipetando e descarte o sobrenadante. Centrifuge a 500 × g por 5 minutos em tempo de descanso.
    7. Ressuspenda os pellets novamente com 4 mL de buffer de lavagem e centrifuge a 500 × g por 5 minutos em RT.
    8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células no buffer de lavagem.
    9. Coloque as esferas magnéticas revestidas com (use 10 μL de esferas para 250000 células; aumente a escala ao usar mais células) e resuspenda em 1 mL de tampão de ligação. Após múltiplas inversões, coloque os tubos no suporte magnético para permitir que as contas assentem.
    10. Usando uma pipeta ou um aspirador de baixa velocidade, descarte os sobrenadantes. Repita os passos de lavagem duas vezes e resuspenda as esferas no buffer de fixação.
    11. Adicione contas magnéticas previamente lavadas com revestimento de às amostras. Misture bem e gire no RT por 10-20 minutos.
    12. Coloque os tubos em um suporte magnético para descartar todos os supernadantes.
  2. Marcação19 para células ES de camundongos (2 dias)
    1. Ressuspenda as esferas (esferas magnéticas revestidas com ligadas às células da etapa 2.1.10) em 200 μL de tampão de anticorpos gelados. Adicione IgG como controle negativo ou as concentrações apropriadas de anticorpos primários contra as proteínas de interesse.
    2. Misture bem e nute a 4 °C durante a noite.
    3. Misture 2 μg do anticorpo secundário e uma quantidade adequada de pA-Tn5 na razão molar de 1:2. Eleve o volume total para 8 μL/amostra com glicerol 50% (v/v). Pipete várias vezes para misturar bem e incubar em tempo de descanso por 1 hora.
    4. Coloque as amostras CUT&Tag em um suporte de ímã por 30 segundos e descarte todos os supernaçantes. Adicione 1 mL de buffer Dig-wash ao pellet de contas e inverta várias vezes.
      NOTA: A partir disso para as seguintes etapas de lavagem (etapas 2.2.5-2.2.6), é recomendado incubar as esferas nos buffers por 3-5 minutos após a etapa de inversão para evitar ligação inespecífica.
    5. Coloque os tubos em um suporte de ímã e remova todos os supernadantes. Adicione 200 μL de tampão Dig-300 para resuspender as esferas e adicione os 8 μL da mistura de anticorpo secundário e pA-Tn5 a cada amostra. Depois de misturar bem com pipeteamento várias vezes, incube em RT por 1 hora.
    6. Coloque os tubos em um suporte de ímã e remova todos os supernadantes. Adicione 1 mL de buffer Dig-300 para resuspender as esferas e inverta várias vezes.
    7. Coloque os tubos em um suporte de ímã e remova todos os supernadantes. Repita a etapa de lavagem mais 3 vezes.
    8. Remova completamente os supernadantes e adicione 250 μL de tampão de marcação para resuspender as esferas e incubar a 37 °C por 1 hora.
      NOTA: É recomendada uma sacudida suave na etapa de reação em um termomisturador porque as esferas podem sedimentar até o fundo dos tubos.
    9. Coloque os tubos em um suporte de ímã e remova todos os supernadantes. Use 1 mL de buffer de lavagem TAPS para resuspender as esferas e inverta várias vezes.
    10. Coloque os tubos em um suporte de ímã e descarte todos os supernadantes.
    11. Adicione 250 μL de tampão Dig-300 contendo 15 mM de EDTA, 0,1% (p/v) SDS e 0,1 mg/mL de proteinase K nas esferas restantes. Vórtice para misturar bem e incubar a 37 °C durante a noite com sacudidas suaves.
  3. Purificação genômica de DNA e marcação in vitro em células ES de camundongos (durante a noite)
    NOTA: DNA genômico das mesmas células para eSPAN é extraído e configurado para marcação in vitro , que é usada para BrdU-IP-ssSeq. A marcação genômica do DNA e seu subsequente BrdU-IP-ssSeq são para fins de normalização do eSPAN.
    1. Resuspenda as células em 300 μL de tampão de lise genômica de DNA e vórtice em velocidade máxima até que nenhum pellet seja visível.
    2. Para cada amostra, adicione RNase A a 100 μg/mL. Depois de combinados, incube a 37 °C por 10 minutos.
    3. Adicione 100 μL de solução de precipitação proteica a cada amostra. Misture bem por vortexing e centrifuge a 15.000 g em RT por 3 minutos.
    4. Salve o sobrenadante transferindo-o para novos tubos de 1,5 mL. Adicione 1x volume de isopropanol às amostras e misture bem.
    5. Gire na velocidade máxima em RT por 3 minutos para fazer pellets no DNA genômico. Despeje cuidadosamente os supernadantes.
    6. Adicione 1 mL de etanol 70% (v/v) recém-preparado a cada amostra e inverta várias vezes. Centrifuge na velocidade máxima em RT por 3 minutos.
    7. Centrifuge a 15.000 g por 1 minuto em RT e remova o etanol restante usando uma pipeta P20. Deixe secar ao ar livre por 5-10 minutos.
    8. Adicione 50 μL deddH 2O e faça um vórtice brevemente para ressuspender o DNA genômico. Dissolva a 65 °C por 30 minutos.
    9. Centrifuge brevemente e transfira os supernadantes para novos tubos de 1,5 mL. Quantifique a concentração de DNA por espectrofotômetro.
    10. Estabeleça a reação de marcação in vitro conforme listado na Tabela 1.
    11. Misture bem e incube por 30 minutos a 37 °C com sacudidas suaves.
    12. Adicione 10 mM de EDTA, 0,1% (v/v) de SDS e 0,1 mg/mL de Proteinase K a cada amostra. Misture bem por meio de vórtice e incube durante a noite a 37 °C com agitação.
  4. Extração de DNA e substituição de oligoterapia (3 h)
    NOTA: Tanto o álcool fenol-clorofórmio-isoamílico (PCI) quanto a purificação em colunas podem ser aplicados para extração de DNA. Aqui, são fornecidos procedimentos detalhados usando purificação de colunas.
    1. Adicione 1,25 mL (volume 5x) de buffer de ligação (fornecido com o kit de purificação PCR) às amostras (passos 2.2.11. e 2.3.12.) e misture bem invertendo várias vezes.
    2. Carregue a mistura em colunas de purificação de DNA (em tubos de coleta de 2 mL) e centrifuge por 30 s a 10.000 × g em RT. Descarte o fluxo contínuo.
    3. Adicione um buffer de elução de 600 μL (incluído no kit) às colunas e centrifuge por 1 min a 10.000 × g em RT. Descarte o fluxo-contínuo.
    4. Centrifuge na velocidade máxima por 2 minutos para remover completamente o tampão restante. Coloque as colunas em tubos novos de 1,5 mL com tampas abertas e deixe secar ao ar por 1 minuto.
    5. Adicione 32 μL de ddH2O livre de DNase (ou 10 mM Tris·HCl, pH = 8,0) no centro da membrana e deixe repousar por 1 minuto. Centrifuge na velocidade máxima por 2 minutos e o DNA CUT&Tag já está em solução.
    6. Adicione 32 μL de amostra de DNA CUT&Tag a um novo tubo de PCR e depois adicione 2 μL de mistura dNTP (2,5 mM cada), 4 μL de buffer 10x Ampligase e 2 μL de rep-B (10 μM). Bata suavemente e misture pipetando.
    7. Desligue brevemente e execute o seguinte programa para a substituição dooligo 23.
      50 °C, 1 min
      45 °C, 10 min
      Rampa para 37 °C, 0,1 °C/s
      37 °C, aguarde
    8. No termociclador, adicione 1 μL de DNA polimerase T4 e 1 μL de Ampligase a cada tubo (volume final, 40 μL/amostra). Misture pipetando suavemente.
    9. Continue a reação a 37 °C no termociclador por 30-60 minutos.
      NOTA: O DNA pode ser armazenado a -20 °C se não for avançado para o IP BrdU logo após essa etapa (ponto de pausa seguro).
  5. Imunoprecipitação BrdU (essencialmente igual ao protocolo de levedura) (2 h)
    1. Transfira as amostras para tubos de baixa ligação de DNA de 1,5 mL. Ferva amostras por 5 minutos em um bloco térmico de 100 °C e imediatamente resfrie no gelo por 5 minutos. Adicione 15 μL de 10x PBS e + 1,35 mL de buffer IP BrdU + 0,5 μL de anti-BrdU Ab + 1 μL de tRNA de E.coli (10 mg/mL).
    2. Faça nutate por 2 h em um rotor a 4 °C.
    3. Transfira a mistura para um tubo contendo 20 μL de esferas de proteína G Sepharose (lavadas três vezes com 1 mL de tampão IP BrdU, cada uma por 3 minutos).
    4. Incube a 4 °C por 1 hora.
    5. Gire a 800 × g por 1 minuto e lave conforme o seguinte: três vezes com 1 mL de buffer IP frio BrdU, 3 minutos em um rotor; uma vez com 1 mL de buffer de TE por 3 min.
    6. Centrifuge a 800 × g por 1 minuto e aspire o sobrenadante.
    7. Adicione 100 μL de TE + 1% de buffer SDS nas contas restantes. Incube a 65 °C por 15 minutos. Centrifuge a 800 × g por 1 minuto.
    8. Purifique o sobrenadante em 18 μL de tampão de elução (fornecido com o kit) usando colunas de purificação de DNA (amostra BrdU IP e H3K4me3 eSPAN).
  6. Amplificação e sequenciamento por PCR (1,5 h)
    1. Amplifique e rotule amostras de biblioteca de DNA de fita simples usando diferentes combinações de índices. Prepare a reação PCR adicionando os seguintes componentes ((DNA purificado [ChIP ou ESPAN], primer I5-indexador [1 μL], primer I7-indexador [1 μL], NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix (2x) [10 μL], ddH2O até 20 μL), misturando as amostras por pipeteamento e girando brevemente.
    2. Aqueça a mistura de PCR a 98 °C por 30 s, seguido por 12-14 ciclos de 10 s a 98 °C e 20 s a 63 °C, e um ciclo de 2 minutos a 72 °C.
    3. Purifique os produtos de PCR com 18 μL de esferas paramagnéticas (0,8x volume) em 20 μL de tampão de baixo EDTA.
    4. Meça a concentração da biblioteca e a distribuição do tamanho dos fragmentos usando sistemas de eletroforese de alta resolução.
    5. Reunir uma quantidade igual de bibliotecas individuais, incluindo as amostras de entrada, H3K4me3 ChIP, BrdU IP e eSPAN, e realizar sequenciamento paralelo de extremidades pareadas com a plataforma de sequenciamento Illumina.

3. Análise de dados eSPAN para células de levedura (1 dia)

NOTA: Este processo de análise de dados aplica-se apenas aos dados de levedura; a análise de dados eSPAN para células ES pode ser acompanhada, conforme descrito em uma publicaçãorecente 23.

  1. Extrair arquivos de sequência bruta, trimar sequências de adaptadores pelas ferramentas Trim Galore e remover leituras menores que 10 bp para reduzir o tamanho do arquivo de saída e evitar travamentos de programas de alinhamento. Certifique-se de que os arquivos estejam no formato file1_1.fq, file1_2.fq para leituras pareadas:
    /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --comprimento 10 - pareado
  2. Gerar arquivos índice bowtie para o genoma de referência:
    bowtie2-build genome.fa
  3. Mapee as leituras para o genoma de referência correspondente (genoma Saccharomyces (sacCer3) para leveduras) usando Bowtie 2:
    bowtie2 -x genoma -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --local --sem-cauda de andorinha ---não-discordante --maxins 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0,50
  4. Remova leituras multimap com ferramentas SAMtools e leituras duplicadas com ferramentas Sambamba:
    Visualização Samtools -BHS - Q 40 Input.BAM -O Output.BAM
    sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-markdup estático output.bam filtered.bam -r
  5. Use o deeptools para gerar os arquivos de maior quantidade de cobertura de leitura nas fianças Watson e Crick separadamente para cada amostra a partir de arquivos limpos de bam:
    bamCobertura -b filtrado.bam -o watson.bw --filtroRNAstrand reverso -bs 1 - extendReads
    bamCobertura -b filtro.bam -o crick.bw --filtroRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
  6. Calcule o viés médio em cada posiçãodo nucleossomo 25 para cada amostra com base na fórmula: log2 as leituras diretas (fita Watson)/reversa (fita Crick) após o posicionamento do nucleossomo de referência foramseparadas 25. Scripts R para esses cálculos estão disponíveis em https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias. Para um cálculo padrão, use os seguintes comandos.
    NOTA: Esta etapa se aplica apenas aos dados da levedura; o cálculo do viés para células ES pode ser seguido, conforme descrito em uma publicaçãorecente 23.
    Rscript cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
  7. Se necessário, ajuste o viés do fio pelo viés BrdU:
    Rscript normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --alvo target_list --controle control_list
    NOTA: "matrix_files" é uma lista de arquivos gerados pelo cal_bias. O script R é separado por vírgulas. por exemplo, 'arquivo1', 'arquivo2', 'arquivo3'. "classes_list" é uma lista de classes de exemplo correspondentes a cada arquivo separadas por vírgulas (por exemplo, 'brdu', 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "condition_list" é uma lista de condições de amostragem correspondentes a cada arquivo e separadas por vírgulas. Cada arquivo será pareado por classe e condição para ajuste de viés. "target_list" é uma lista de disciplinas retiradas do classes_list. Ele definirá as classes que atuarão como dados a serem ajustados pelos controles (por exemplo, 'H3K4me3_eSPAN','H3K56ac_eSPAN'). "control_list" é uma lista de disciplinas retiradas da lista de classes. Ele definirá as classes que atuarão como dados a serem ajustados pelos controles. Certifique-se de que o comprimento da lista seja o mesmo do target_list (por exemplo, 'brdu')
  8. Após o cálculo e ajuste, agrupe amostras e crie visualizações dos dados.
    Rscript draw_bias. R -s' bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g grupo 1,grupo 2 --intervalo=T
    -s requer uma lista de arquivos de viés gerados pelos scripts acima
    -o é o arquivo de saída
    -g define os grupos experimentais a calcular, ou seja, réplicas biológicas para plotar o viés médio.
    --intervalo T ou F, para exibir erros padrão nos gráficos dentro dos grupos experimentais.
    NOTA: As informações sobre as origens da replicação foram definidas pelos dados IP do BrdU. A informação sobre a posição de um nucleossomo único foi obtida a partir de um artigopublicado anteriormente 25. Para a análise de dados de células ES de camundongo, as informações de origem foram obtidas do conjunto de dadosOK-seq 26, e o cálculo médio do viés deve seguir o protocolo descrito no trabalhoanterior 23.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O eSPAN pode ser utilizado para adquirir informações específicas de fita sobre uma proteína-alvo, como histonas e modificações de histonas. Neste resultado representativo, a coleta de amostras e os processos eSPAN foram realizados seguindo o esquema descrito na Figura 2, utilizando o sistema de levedura de gemação. O tratamento e a coleta da amostra seguem a condição inicial da fase S tratada por hidroxiurea conforme este protocolo. Duas cepas de levedura, WT (tipo selvagem) e mutante mc...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A detecção de proteínas associadas a cadeias de replicação avançadas e atrasadas é importante para entender os mecanismos de replicação da cromatina e o processo associado, que são diretamente relevantes para a pesquisa em câncer humano e os mecanismos de resistência a medicamentos. Vários métodos, como gel 2D, imunoprecipitação nativa de Cromatina (nChIP), iPOND e captura nascente decromatina 29,30,31, foram empregados para estudar a replicação do DNA e processos relacionados, como o reparo do DN...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado por bolsas do National Institutes of Health R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) e pelo Hormel Startup Fund (C.Y.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575020
1,5 mL de DNA com baixa ligação & nbsp;Eppendorf22431021
Buffer Ampligase 10xLucigenA1905B
10x PBS Corning21-040-CV
10x TBSBioRad1706435
16 G x 1-1/2 pol. BD PrecisionAgulha DeslizanteBD em Biociências305198
KIT DE BIBLIOTECA DE DNA ACCEL-NGS 1S MAIS DNATecnologias Integradas de DNA10009817kit de preparação de bibliotecas de DNA ssDNA e baixa entrada  
Bioanalisador Agilent 2100  AgilentBioanálise de 2100
Kit Agilent DNA 1000 & nbsp;Agilent5607-1504
Ampligase LucigenA0110KManuseie o paraformaldeído com cuidado, pois é sólido inflamável e perigoso.
AMPure XPBeckmanA63881
Reagente SPRI AMPure XPBeckman CoulterA63882
Anticorpo anti-BrdU  BD em Biociências555627
Anticorpo anti-H3K4me3 Abcamab8580
Contador de células automatizado , modelo TC10BioRad145-0001
Bacitracina Sigma11702
Bacto peptona Thermo Fisher Scientific211830
Cloridrato de Benzamidina  SigmaB2417Sólidos Combustíveis
BrdU SigmaB5002Manuseie o BrdU com cuidado, pois é um possível mutagênico e teratogênio.
BSABiolaboratórios da Nova InglaterraB9000S
CaCl2SigmaC4901
Incubadora de cultura celular  Thermo Fisher Scientific  Incubadora de CO2 com camisa d'água modelo Forma série II3140
Meio de cultura celular  
Linha celular ES-E14 
Chelex-100 BioRad1422842200– Tamanho 400 de malha seca
Clorofórmio  Sigma366919
Esferas magnéticas revestidas com concanavinina A ()  Policiências86057-10
DigitoninaMillipore300410-5MG
DMSOSigmaD8418
E. coli  tRNA Sigma10109541001
Etanol Thermo Fisher ScientificBP2818100Manuseie o etanol com cuidado, ele é inflamável
glicoseSigmaG7021
Glicerol  SigmaG5516
HCl SigmaH1758
HEPES SigmaH3375
Isopropanol Thermo Fisher ScientificBP26324Manuseie o isopropoñol com cuidado, ele é inflamável
KAPA HiFi HotStart Ready MixRoche7958889001
KClSigmaP9541
KOHsigma221473Manuseie o KOH com cuidado, é corrosivo
Vácuo de baixa velocidade
Suporte de ímã  MilliporeLSKMAGS08
Mastercycler Gradient PCR Thermal CyclerEppendorf5331
MgCl2SigmaM8266
Nuclease microcócica   (MNase)WorthingtonLS004798
Kit de purificação PCR MinElute & nbsp;Qiagen28006
Batedor de mini-contasMini BeadBeater 24 Disruptor607
Mini-centrífuga  Eppendorf5424R
MnCl2Sigma244589
Agitador multiplataformaFisherbrand02-217-765
Incubadora de shakers multiplataformaReferênciaSHAKER INCU 10L
Bloco de calor multitérmico & nbsp;EppendorfTermomisturador C
N-[Tris(hidroximetil)metil]-3-aminopropanosulfônico  (BATIDAS)SigmaT5130200– Tamanho 400 de malha seca
NaCl SigmaS9888
NaOH SigmaS8045Manuseie o NaOH com cuidado, ele é corrosivo
NEBNext HiFi 2 vezes; Mistura master PCRBiolaboratórios da Nova InglaterraM0541
NP-40 Igepal CA-630Termo CientíficaJ61055. AP
Paraformaldídosigma158127Manuseie o paraformaldeído com cuidado, pois é sólido inflamável e perigoso.
enzima pA-Tn5  Addgene121137
PefablocSigma11429868001
Fenol-clorofórmio-isoamílico álcool  Invitrogen15593049
Pipeta P1000, P200, P20 e P2Eppendorf2231300004
PMSFSigma10837091001
Comprimido de coquetel inibidor de proteaseSigmaS8830
Comprimido de coquetel inibidor de protease & nbsp;SigmaS8830
Proteína G-esferas de sefarosa GE Healthcare17-0618-02
Solução de precipitação de proteínasQiagen848023
Solução de precipitação de proteínasQiagen848023Manuseie o KOH com cuidado, é corrosivo
Solução de precipitação de proteínas  Qiagen848023
Proteinase K Sigma311584401
QIAquick PCR de purificação & nbsp;Qiagen28106
RNase ASigma10109169001
SDS SigmaL3771
Espectrofotômetro  Termocientífica.2000/2000c
Espermidina SigmaS2626
T4 DNA PolNew England Biolabs,  M0203
centrífuga de tampo de mesa  Beckman CoulterAllegra X-5
Tris Sigma11814273001
Triton X-100 SigmaT8787
extrato de levedura & nbsp;Thermo Fisher Scientific212730

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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