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Artigo de método

Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

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DOI:

10.3791/67123

⸱

10 de janeiro de 2025

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

Neste artigo

Resumo

A modelagem da eritropoiese oferece uma chance valiosa de compreender o significado biológico dos atores nesse processo e avaliar novas abordagens terapêuticas que podem aliviar os defeitos de diferenciação. Aqui, descrevemos um método simples e confiável para diferenciar eficientemente células-tronco hematopoiéticas CD34+ e células progenitoras ex vivo.

Resumo

A eritropoiese, um processo notavelmente dinâmico e eficiente responsável por gerar a cota diária de glóbulos vermelhos (aproximadamente 280 ± 20 bilhões de células por dia), é crucial para a manutenção da saúde individual. Qualquer interrupção nesse caminho pode ter consequências significativas, levando a problemas de saúde. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que 25% da população global apresente sintomas de anemia. Este protocolo descreve como gerar células eritróides humanas in vitro usando células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) de fontes como sangue do cordão umbilical (UCB) ou sangue retirado de doadores saudáveis e ex vivo com HSPCs isolados da medula óssea dos pacientes. Usando abordagem genética, genes de interesse podem ser modulados em HSPCs, e seu impacto na eritropoiese pode ser monitorado em vários estágios do processo de diferenciação. Este método permite a triagem de compostos perturbando, aumentando ou resgatando a capacidade das HSPCs de se diferenciarem em células eritróides maduras e investigar o papel dos genes de interesse durante o processo de diferenciação eritróide.

Introdução

Todos os dias, cerca de 280 bilhões de glóbulos vermelhos (hemácias) são produzidos na medula óssea para garantir o transporte de oxigênio por todoo corpo. A eritropoiese é um processo de diferenciação finamente ajustado que produz glóbulos vermelhos maduros e funcionais a partir de células-tronco hematopoiéticas. Muitas doenças, tanto adquiridas quanto congênitas, podem afetar esse processo, incluindo síndrome mielodisplásica, anemia aplástica, talassemia e anemia diseritropoiética congênita2.

A manifestação clínica da eritropoiese interrompida é a anemia, uma das principais causas de morbidade em todo o mundo. Os sintomas da anemia variam de fadiga, falta de ar e tontura a condições com risco de vida, como insuficiência cardíaca e parada cardíaca3. Com a anemia afetando 1,8 bilhão de pessoas em todo o mundo4, a modelagem da eritropoiese ex vivo para investigar essas condições e seus mecanismos subjacentes continua sendo uma prioridade global. O método descrito aqui visa fornecer um modelo simples e robusto para estudar a diferenciação eritróide saudável e doente. Esse modelo permite a dissecação dos papéis de genes específicos nesse processo e permite o teste de compostos que podem beneficiar pacientes anêmicos. Historicamente, a modelagem de eritropoiese ineficaz teve muitos desafios, incluindo a escassez de células-tronco em algumas medulas-ósseas doentes e dificuldades em imitar o nicho da medula óssea.

Estudos anteriores usaram protocolos semelhantes ou mais complexos; por exemplo, Bondu et al. usaram um coquetel de citocinas, incluindo eritropoietina (EPO), fator de células-tronco (SCF) e interleucina-6 (IL6) por 4 dias antes de remover IL6 do coquetel de diferenciação eritróide, em contraste, Yip et al. só adicionaram EPO ao seu coquetel de citocinas após 7 dias de cultura líquida. Elvarsdóttir et al. desenvolveram um modelo de cultura tridimensional (3D) para células CD34+ para facilitar a maior expansão e maturação das células eritroides, incluindo a geração de ilhas eritroblásticas e eritrócitos enucleados, que são importantes para estudar fenômenos como sideroblastos em anel 5,6,7,8 . Este protocolo usa apenas três citocinas ao expandir as células (ou seja, SCF, trombopoetina [TPO] e tirosina quinase 3 semelhante à FMS [FLT3]) e três citocinas mantidas durante todo o processo de diferenciação (ou seja, EPO, IGF1 e SCF). Um dos principais critérios compartilhados entre esses diferentes estudos é o uso de células CD34+. Embora a origem dessas células varie, elas são consistentemente empregadas nesses diferentes protocolos. As fontes podem variar de coleta não invasiva de SCU a procedimentos mais invasivos para obter amostras de medula óssea adulta que podem ser colhidas de pacientes mobilizados com fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) ou punções de medula óssea. Em geral, os modelos de cultura líquida são transportados por 14 dias, enquanto os modelos 3D podem manter as células por períodos mais longos. Esses protocolos são essenciais para modelar doenças genéticas e interrupções na eritropoiese. Abordagens genéticas, como knockdowns de RNA em grampo curto (shRNA), podem ser empregadas para silenciar genes de interesse e estudar seus papéis na eritropoiese. O impacto do silenciamento de genes pode então ser monitorado em vários estágios de diferenciação, fornecendo um modelo humano ex vivo de produção de glóbulos vermelhos para estudar a anemia tanto na saúde quanto na doença. Este protocolo inclui a transdução de células do sangue do cordão umbilical CD34+ com shRNA que expressam constitutivamente um gene repórter, como a proteína de fluorescência verde aprimorada (EGFP), permitindo que as amostras sejam classificadas por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). As células são então incubadas em meios de diferenciação por 2 semanas e monitoradas por análise de citometria de fluxo e coloração imunoquímica.

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Protocolo

A pesquisa em amostras primárias foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais (referência REC: 21/EE/0133; ID do projeto IRAS: 283103).

1. Produção de lentivírus

NOTA Os lentivírus devem ser produzidos em um laboratório de nível de biossegurança L2 em condições estéreis. Todos os EPIs necessários para este laboratório devem ser usados, incluindo luvas duplas. O material contaminado é descontaminado com desinfetante virucida antes do descarte em uma lixeira autoclavada. Aqui, um scramble shRNA (controle) que abriga um gene repórter EGFP é usado para ilustrar o processo.

Dia 1

  1. Aqueça a gelatina a 37 °C em banho-maria até que se dissolva completamente. Dilua a gelatina a 0,1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
  2. Cubra um prato de 150 mm com 2 mL de gelatina a 0,1%. Use 2 pratos por vírus. Incubar a loiça durante 30 min a 37 °C.
  3. Semear 5 milhões de células HEK293T por placa revestida com gelatina em 20 ml de meio de Eagle modificado com 10% de Dulbecco (DMEM) e colocar as células numa incubadora a 37 °C.

Dia 2

  1. Verifique se as células atingiram cerca de 50% de confluência. Troque o meio com 22 mL de DMEM a 10% sem perturbar a camada celular 2 h antes da transfecção.
  2. Prepare a mistura de transfecção.
    NOTA: Uma mistura de transfecção é preparada por prato, pois um volume maior pode afetar a formação de precipitado de cálcio-fosfato.
    1. Preparar a mistura de reacção num tubo de centrifugação de 15 ml da seguinte forma: 32 μg de plasmídeo, 20 μg de plasmídeo PAX (pCMVdR8.74), 9 μg de plasmídeo VSVG (pMD.G2) e aumentar o volume até 1125 μL utilizando H2O.
    2. Adicione 125 μL de CaCl2 à reação e incube 5 min à temperatura ambiente (RT) em um rolo.
    3. Prepare 1,25 mL de 2x HEPES em um tubo de centrífuga separado de 15mL.
    4. Adicione 2x HEPES gota a gota à mistura de reação enquanto vórtice suavemente, depois coloque a mistura em um rolo por 10 min em RT.
  3. Dispensar a reacção gota a gota sobre as células em espiral e colocá-las numa incubadora a 37 °C, depois de mover suavemente a placa em forma de cruz para homogeneizar o meio.

Dia 3

  1. Troque o meio com 16 mL de DMEM a 10% sem perturbar a camada da célula.

Dia 4

  1. Recolher o sobrenadante e conservá-lo a 4 °C durante a noite. Adicione 16 mL de DMEM fresco a cada placa sem perturbar a camada celular.

Dia 5

  1. Colete o sobrenadante e junte-se ao sobrenadante a partir do dia 4. Filtre para eliminar detritos com um filtro de 0,45 μM.
  2. Transfira cada sobrenadante de 30 mL (dia 4 + dia 5) em um tubo cônico para ultracentrifugação. Adicione os tubos em um balde oscilante, com adaptadores para o fundo cônico, se necessário.
  3. Equilibre os tubos frente a frente com precisão de 0,02 g e ultracentrífuga a 90.000 x g por 2 h a 4 °C.
  4. Rejeitar o sobrenadante e adicionar 200 μL de meio de células estaminais por tubo. Feche os tubos com parafilme e incube o tubo em uma câmara fria por 2-4 h sob agitação.
  5. Faça 20 μL de alíquota de cada vírus e armazene os frascos a -80 °C. Mantenha 2 μL de cada vírus e adicione 400 μL de DMEM.
    NOTA: Esta diluição será usada para titulação.

2. Titulação de lentivírus

NOTA Os lentivírus devem ser manuseados em um laboratório de nível de biossegurança L2 em condições estéreis. Todos os EPIs necessários para este laboratório devem ser usados, incluindo luvas duplas. O material contaminado é descontaminado com desinfetante virucida antes do descarte em uma lixeira autoclavada.

  1. Semeie HEK293T em um prato de 24 poços. Adicionar 50.000 células/poço em 500 μL de 10% de DMEM.
    NOTA: Use 6 poços por vírus e mantenha um poço para células não transduzidas.
  2. Execute a transdução. Adicione os diferentes poços: 2 μL, 4 μL, 8 μL, 16 μL, 32 μL e 64 μL do vírus diluído da etapa 1.13. Homogeneizar suavemente.
  3. Troque o meio 24 h depois, adicionando 500 μL de DMEM a 10%.
  4. No dia 4 após a transdução, prepare as células para a citometria de fluxo.
    1. Prepare o tampão FACS com PBS, 2% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (P / S), 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 1/2.000 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
    2. Remova o sobrenadante e adicione 500 μL de tampão FACS diretamente com EDTA a cada poço.
    3. Separe as células pipetando para cima e para baixo.
  5. Filtrar as células através de um filtro de 40 μm e transferi-las para tubos FACS.
  6. Determine a porcentagem de células EGFP por citometria de fluxo.
  7. Configure os seguintes portões:
    1. Configure DAPI versus dispersão lateral (SSC-A) para excluir células mortas.
    2. Configure a altura do SSC (SSC-H) versus a área do SSC (SSC-A) para excluir agregados de células e selecionar células únicas.
    3. Configure a área de dispersão direta (FSC-A) versus SSC-A para bloquear as células e remover os detritos com base no tamanho.
    4. Configure a proteína de fluorescência verde (GFP) versus SSC-A para selecionar células GFP+ .
  8. Titule o vírus.
    1. Calcule a concentração de partículas (número de partículas/mL) para cada condição:
    2. Células EGFP x Fator de diluição vírus (200) x Número de células semeadas x1000)/ volume de vírus.
      NOTA: Por exemplo, as células foram tratadas com 64 μL de vírus diluído a 1/200. Após a análise por citometria de fluxo, 54% das células eram EGFP+. Nessas condições, o título será (54% x 200 x 50.000 x 1000)/64 = 8,44 x 107 partículas/mL.

3. Transdução de células CD34+ isoladas do sangue do cordão umbilical

NOTA Esta peça é realizada em condições estéreis. Aqui, as células CD34 + UCB (pureza >85%) são transduzidas com um shRNA (controle) abrigando um repórter eGFP. O experimento é realizado com três repetições técnicas. A proporção deve ser ajustada ao número de amostras.

Dia 1

  1. Prepare a seguinte mídia e buffer:
    1. Prepare o meio de descongelamento: FBS suplementado com 1% P/S e 10 μg/mL de DNAse
    2. Prepare o tampão FACS: PBS suplementado com 1% P/S e 2% FBS (± 10 μg/mL de DNAse)
    3. Prepare os meios de estimulação (em meio de células-tronco) adicionando 150 ng/mL SCF, 150 ng/mL FLT-3, 10 ng/mL IL-6, 25 ng/mL G-CSF, 20 ng/mL TPO e 1% de HEPES.
  2. Descongele 100.000 células CD34 + UCB mergulhando por 30 s no banho-maria a 37 ° C. Adicione 1 ml de meio de descongelação gota a gota a cada frasco e, em seguida, ressuspenda suavemente pipetando para cima e para baixo.
  3. Transfira a suspensão celular gota a gota em um total de 5 mL de meio de descongelamento suavemente.
    NOTA: Para evitar a perda de células, reserve uma alíquota de 2 mL de meio de descongelamento que será usada no final para lavar a ponta e o frasco.
  4. Centrifugue por 8 min a 320 x g em RT. Lave as células em 10 mL de tampão FACS + DNAse.
  5. Centrifugue por 8 min a 320 x g em RT. Ressuspenda o pellet celular em 2 mL de meio de estimulação (ponta de lavagem e tubo com meio de estimulação).
  6. Contar as células utilizando 5 μL de suspensão celular e 5 μL de azul de tripano.
    NOTA: Apontar para o mínimo total de 75.000 células (25.000 células/condição).
  7. Transfira os 2 ml de suspensão celular para uma placa de 24 poços e incube durante ≥4-6 h a 37 °C.
    NOTA: Todas as células (75.000-100.000) são semeadas em um poço nesta etapa.
  8. Colete as células em tubos FACS e complete com 1 mL de meio de células-tronco. Centrifugue por 8 min a 320 x g em RT.
  9. Descongele o vírus e adicione o volume necessário aos meios de estimulação em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 30.
  10. Ressuspenda as células peletizadas em meios contendo vírus a 100.000 células por 100 μL de vírus em 1 poço de uma placa de 96 poços. Adicione PBS aos poços vazios e incube durante a noite a 37 °C.

Dia 2

  1. Prepare o meio de expansão (em meio de células-tronco) adicionando 150 ng/mL de SCF, 150 ng/mL de FLT3-L e 20 ng/mL de TPO.
  2. Adicione todo o volume de suspensão celular do poço de placa de 96 poços aos tubos FACS com 1 mL de meio de células-tronco. Lave o poço e a ponta com meio de células-tronco, resultando na adição de 2 mL de meio de células-tronco à suspensão celular no tubo FACS.
  3. Centrifugue por 8 min a 320 x g em RT.
  4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 2 mL de meio de expansão. Adicione a suspensão celular em um poço de placa de 24 poços (lave o poço e a ponta no processo para obter um total de 2 mL). Incubar as células durante 4 dias a 37 °C.
    NOTA: A classificação de células é realizada no dia 7.

4. Classificação de células CD34 + EGFP + e diferenciação eritróide

NOTA Esta peça é realizada em condições estéreis.

  1. Prepare a mídia e o buffer a seguir.
    NOTA: Os meios com citocinas devem ser preparados recentemente:
    1. Prepare o buffer FACS suplementando o PBS com 1% P/S e 2% FBS.
    2. Prepare o meio de expansão (em meio de células-tronco) adicionando 150 ng/mL de SCF, 150 ng/mL de FLT3-L e 20 ng/mL de TPO.
    3. Prepare os meios de diferenciação eritrocitária (em meio de células-tronco) adicionando 25 ng/mL de SCF, 3 U/mL de EPO e 50 ng/mL de IGF1.
    4. Prepare 2x meios de diferenciação de eritrócitos (em meio de células-tronco) adicionando 50 ng/mL SCF, 6 U/mL EPO e 100 ng/mL IGF1.
  2. Adicione todo o volume de células a um tubo FACS separado (lave o poço e a ponta no processo com meio de células-tronco). Centrifugue por 8 min a 320 x g em RT. Ressuspenda as células peletizadas em 100 μL de tampão FACS.
  3. Adicionar 5 μL de CD34 Ab/tubo e incubar no escuro a 4 °C durante 20 min.
  4. Ressuspenda as células em 1 mL de tampão FACS com DAPI (diluição de 1/2000 em tampão FACS) e centrifugue por 8 min a 320 x g em RT.
  5. Ressuspenda as células em 200 μL de tampão FACS com DAPI (diluição de 1/2000 em tampão FACS) e filtre as células através de um filtro de 40 μM antes da classificação.
  6. Prepare as contas para controle:
    1. Adicione 0,5 μL de anticorpo CD34 (Ab) a 1 gota de grânulos em 100 μL de PBS e incube no escuro a 4 ° C por 20 min.
    2. Adicione 1 mL de PBS. Centrifugar durante 8 min a 320 x g à RT. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 μL de PBS.
  7. Prepare linhagens de células leucêmicas para controle de GFP.
    NOTA: Use qualquer linha celular GFP+ disponível como controle; contas podem ser usadas em vez disso.
    1. Adicione células GFP- (2 tubos FACS com 100.000 células) e GFP+ (1 tubo FACS com 100.000 células) no tubo FACS.
      NOTA: Um total de 3 tubos.
    2. Lave as células em 1 mL de tampão FACS. Centrifugue por 8 min a 320 x g em RT.
    3. Ressuspenda 100.000 células GFP- em 500 μL de tampão FACS (não corado), 100.000 células GFP- em 500 μL de tampão FACS com DAPI (diluição 1/2000 em tampão FACS) (corado com DAPI) e 100.000 de células GFP+ em 500 μL de tampão FACS (células GFP+ ).
      NOTA: Os tubos de controle serão usados para configurações de gating e compensação no citômetro de fluxo. Se as células usadas forem 100% GFP, as células GFP- podem ser adicionadas ao tubo (50.000 células GFP- e 50.000 células GFP+).
    4. Filtrar as células através de um filtro de 40 μm antes da triagem.
  8. Configure os seguintes portões:
    1. Configure DAPI versus dispersão lateral (SSC-A) para excluir células mortas.
    2. Configure a altura do SSC versus a área do SSC (SSC-A) para excluir agregados de células e selecionar células únicas.
    3. Configure a área de dispersão frontal (FSC-A) versus SSC-A para remover os detritos com base no tamanho.
    4. Configure GFP versus SSC-A para selecionar células GFP+ .
    5. Configure CD34 (PerCP-Cy5.5) versus SSC-A para selecionar células CD34+ .
  9. Vire o tubo FACS de coleta antes da coleta de células para revestir as paredes do tubo com FBS.
  10. Colete células no meio de células-tronco.
    NOTA: Aponte para 75.000-80.000 células (25.000 células x 3)
  11. Centrifugue por 8 min a 320 x g em RT e ressuspenda as células em 3 mL de meio de diferenciação eritróide.
  12. Ressuspenda e dispense 1 mL por poço em 3 poços de uma placa de 24 poços. Encha todos os poços externos com PBS.
  13. Realize uma metade da depleção do meio em dias alternados e substitua-o por um meio de diferenciação de eritrócitos 2x.
    1. Para atualizar a mídia, certifique-se de que as células estejam assentadas na parte inferior da placa. Incline suavemente a placa e retire 500 μL de mídia.
    2. Refresque adicionando 500 μL com um meio de diferenciação eritróide de citocina 2x.
    3. Transfira as células no dia 6 para uma placa de 12 poços e adicione 1 mL de meio para fazer um volume final de 2 mL.

5. Análise da diferenciação eritróide por citometria de fluxo duas vezes por semana do dia 6 ao dia 14

  1. Prepare a mídia e o buffer a seguir.
    1. Prepare o buffer FACS suplementando o PBS com 1% P/S e 2% FBS
    2. Prepare os meios de diferenciação eritrocitária (em meio de células-tronco) adicionando 25 ng/mL de SCF, 3 U/mL de EPO e 50 ng/mL de IGF1.
  2. Colete 200 μL de células de cada poço da placa de 12 poços e substitua-as por 250 μL de meio de diferenciação eritróide 2x. Adicione 1 mL de tampão FACS a cada tubo.
  3. Centrifugue por 8 min a 320 x g em RT. Ressuspenda as células peletizadas em 100 μL de tampão FACS.
  4. Adicione 1 μL de CD71 Ab (1/100), 1 μL de CD34 Ab (1/100) e 1 μL de CD235a Ab (1/100) e incube no escuro a 4 °C por 20 min.
  5. Ressuspenda as células em 1 mL de tampão FACS com DAPI (diluição de 1/2000 em tampão FACS). Centrifugue por 8 min a 320 x g em RT.
  6. Ressuspenda as células em 200 μL de tampão FACS com DAPI (diluição de 1/2000 em tampão FACS).
  7. Prepare as contas para controle:
    1. Adicione 1 gota de grânulos de compensação a dois tubos em 100 μL de PBS e, em seguida, adicione 0,55 μL de um único anticorpo a cada tubo para fazer controles de coloração única (um para CD34, um para CD71 e um para CD235a).
      NOTA: 1 gota é suficiente para ambos os controles.
    2. Incubar no escuro a 4 °C durante 20 min. Adicione 1 mL de PBS.
    3. Centrifugar durante 8 min a 320 x g à RT. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 μL de PBS.
  8. Prepare uma linhagem de células leucêmicas para controle.
    NOTA: As células K562 expressam o marcador CD71 e podem ser usadas como um controle positivo para configurar o FACS.
    1. Adicione células GFP- (2 tubos FACS com 100.000 células) e células GFP+ (1 tubo FACS com 100.000 células) no tubo FACS.
    2. Lave as células em 1 mL de tampão FACS. Centrifugue por 8 min a 320 x g em RT.
    3. Ressuspenda 100.000 células GFP- em tampão FACS (não corado), 100.000 células GFP- em tampão FACS com DAPI (diluição 1/2000 em tampão FACS) (corado com DAPI) e 100.000 células GFP+ em tampão FACS (células GFP+ ).
  9. Configure os seguintes portões:
    1. Configure DAPI versus dispersão lateral (SSC-A) para excluir células mortas.
    2. Configure a altura do SSC versus a área do SSC (SSC-A) para excluir agregados de células e selecionar células únicas.
    3. Configure a área de dispersão frontal (FSC-A) versus SSC-A para remover os detritos com base no tamanho.
    4. Configure CD235a (APC-Cy7) versus CD71 (PE).
    5. Configure CD34 (PerCP-Cy5.5) versus SSC-A.
  10. Execute uma amostra de células GFP não coradas e células totalmente coradas para ajustar as tensões para que as células fiquem no lugar correto.
  11. Execute contas, células GFP+ e células coradas com DAPI. Compense e aplique a compensação às configurações do citômetro.
  12. Execute os exemplos e registre os eventos.

6. Análise da diferenciação eritróide pela coloração de Giemsa

  1. Prepare 5 frascos de coloração de lâminas:
    1. Prepare um frasco de coloração de lâminas com solução de eosina-azul de metileno de May-Grünwald 1:1 e PBS.
    2. Prepare um frasco de coloração com 2,5 mL de caldo Giemsa + 50 mL de PBS.
    3. Prepare um frasco de coloração de lâminas com água destilada.
    4. Prepare um frasco de coloração de lâminas com PBS.
    5. Prepare um frasco de coloração de lâminas com metanol gelado e frio.
  2. Colete 100.000 células para uma coloração ideal, adicione 1 mL de PBS e centrifugue 300 x g por 5 min.
  3. Rejeitar o meio e ressuspender a 150 μL de PBS.
  4. Prepare lâminas, papel de filtro e adaptador cônico em uma citocentrífuga e solte a preparação de células lentamente no adaptador cônico.
  5. Gire a 800 x g por 3 min. Remova as lâminas e coloque-as no frasco de metanol com gelo por 15 min.
  6. Mergulhe as lâminas na solução de May-Grünwald por 5 min e agite ocasionalmente para garantir a coloração adequada.
  7. Em seguida, mergulhe as lâminas no frasco PBS até que nenhuma mancha escorra.
  8. Mergulhe as lâminas na solução de Giemsa por 20 min e agite ocasionalmente para garantir a coloração adequada.
  9. Mergulhe cuidadosamente as lâminas com PBS até que nenhuma mancha escorra.
  10. Deixe os slides permanecerem no PBS por mais 3 min.
  11. Mergulhe as lâminas rapidamente em água destilada e seque ao ar em RT.
  12. Adicione uma gota de resina sintética em cada ponto das células e adicione delicadamente uma lamínula por cima.
  13. Deixe as lâminas secarem por 1 h em RT e sele a lamínula com esmalte para evitar a secagem.

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Resultados

As células CD34 + do sangue do cordão umbilical ou da medula óssea são primeiro descongeladas, estimuladas e transduzidas com um shRNA que expressa GFP (Figura 1A). As células CD34 + GFP + são classificadas 4 dias após a transdução, de acordo com a estratégia de gating ilustrada na Figura 1B. Os resultados representativos mostraram a maturação das células CD34+ após transdução e classificação FACS. As células são anali...

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Discussão

Aqui, descrevemos um método eficiente e confiável para induzir a diferenciação eritróide de células-tronco hematopoiéticas CD34+ (HSPCs) isoladas da medula óssea adulta (MO) ou do sangue do cordão umbilical (SCU). Este pipeline inclui a edição/modificação de células primárias para investigar a função de qualquer gene de interesse durante o processo de diferenciação eritróide. Este método tem sido usado com sucesso para investigar a relevância funcional de genes que não estavam...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

C.P., S.B. e K.RP. foram apoiados pelo programa HARP, pela Barts Charity (G-002167), pelo fundo Kay Kendall Leukaemia (KKL1149) e pela Academia de Ciências Médicas (SBF004\1099). Agradecemos ao Dr. Pantelitsa Protopapa pela aquisição da coloração e microscopia MGG. Também reconhecemos as instalações de citometria de fluxo e microscopia do Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London. Agradecemos à instituição de caridade do Reino Unido, Anthony Nolan, por nos fornecer as unidades de sangue do cordão umbilical usadas neste manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2x HEPESMerck51558
BeadsThermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Cy5.5 anticorpoBD Biosciences347222
CD71 PEBiolegend334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX meio de montagem VWR1.00579.0500
FACSAria Fusion BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
GelatinaMerckG1393
Solução GiemsaAbcamab150670
HEPESMerckH0887-100mL
EPO HumanoPeproTech100-64
Ligante Humano Flt-3PeproTech300-19
G-CSF humanoPeproTech300-23
IGF1 humanoPeproTech100-11
IL-6 humanoPeproTech200-06
SCF humanoPeproTech300-07
TPO humanoPeproTechAF-300-18
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesNA
May-Grunwald solução Generon26250-01
Pannoramic 250 3DHISTECHNA
Penicilina/EstreptomicinaThermo Scientific15140-122
Shandon Cytospin 3 Thermo ScientificNA
Stem Cell Medium StemCell Technologies9655
Scanner de Alta Taxa de Transferência

Referências

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