Quantificação de glicose de Bergmeyer para amostras microbiológicas

Summary

A quantificação de glicose de Bergmeyer é uma técnica enzimática espectrofotométrica usada principalmente para testes clínicos que medem com precisão e sensibilidade a quantidade de glicose. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso desse método para amostras microbiológicas.

Abstract

A concentração de glicose é um indicador-chave do metabolismo celular e pode indicar a taxa de metabolismo total, uma aberração no metabolismo da glicose e, em alguns casos, como as células acoplam o metabolismo da glicose ao metabolismo energético. Além disso, os níveis de glicose intracelular e extracelular são indicativos do estado metabólico celular. Técnicas enzimáticas, como a quantificação da glicose de Bergmeyer, são mais precisas e sensíveis do que outras técnicas, como ácido dinitrosalicílico ou métodos de fluorescência, que geralmente são utilizados em microbiologia. Embora usada principalmente na área clínica, a quantificação da glicose de Bergmeyer também pode ser aplicada a qualquer célula, mas não foi relatada em detalhes para bactérias, fungos, leveduras ou outros microrganismos.

Aqui, apresentamos uma metodologia para quantificar a glicose de amostras de bactérias e leveduras usando o método enzimático de quantificação de glicose de Bergmeyer. O procedimento envolveu as enzimas glicose oxidase, peroxidase e dicloridrato de o-dianisidina incubadas a 37 °C por 20 min, seguidas da adição de ácido sulfúrico. A absorbância é então medida a 545 nm. É importante destacar que, embora essa técnica apresente dificuldades na medição de altas concentrações de glicose (acima de 60 g/L), é possível medir concentrações abaixo de 50 g/L usando fatores de diluição. Essa abordagem enzimática é valiosa para pesquisa e análise em microbiologia e outras áreas científicas. A precisão e a sensibilidade do método o tornam útil para detectar até mesmo baixas concentrações de glicose em amostras microbiológicas.

Introduction

A glicose serve como fonte primária de energia e carbono para vários microrganismos, incluindo bactérias, leveduras e fungos. Esses microrganismos absorvem a glicose por meio de transportadores localizados na membrana extracelular, onde ela sofre uma série de reações bioquímicas dentro da via metabólica da glicólise para ser convertida em piruvato¹. Existem várias técnicas para a quantificação de açúcares redutores, como a glicose. Por exemplo, o reagente de Benedict², o uso de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)^3,4, o método da anthrona⁵ ou o ácido fenol-sulfúrico⁶ podem ser empregados. No entanto, esses métodos detectam qualquer açúcar redutor presente na amostra, como frutose e maltose, que pode contribuir para o sinal e complicar a quantificação precisa de um determinado açúcar.

Além disso, exigem um controle rigoroso da temperatura e o manuseio de substâncias perigosas, o que pode complicar o processo e afetar a precisão. Esses métodos também podem sofrer interferência de outros compostos presentes na amostra, dificultando a quantificação precisa da glicose. Por outro lado, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) oferece uma alternativa mais precisa, permitindo a discriminação entre glicose e outros açúcares redutores, embora com custos operacionais mais elevados. Esses métodos contrastantes destacam a necessidade contínua de desenvolvimento de técnicas de quantificação de glicose precisas e econômicas⁷.

O método glicose oxidase-peroxidase-ácido sulfúrico (GOX-H₂SO₄) emprega duas enzimas, glicose oxidase (GOD) e peroxidase (POD). GOD é uma enzima oxidorredutase muito seletiva para a oxidação da β-D-glicose⁸. Este complexo atua como um catalisador durante a reação que ocorre quando a glicose está na presença de oxigênio, produzindo ácido glucônico e peróxido de hidrogênio (H₂O₂). O H₂O₂ é detectado por meio de um aceptor cromogênico de oxigênio, a o-dianisidina, que, ao interagir com o POD, causa sua oxidação e liberação de H₂O₂ , impedindo que o ácido glucônico seja convertido novamente em glicose (ver Figura 1). A cor obtida é estabilizada pela adição de ácido sulfúrico (H₂SO₄), que também interrompe a reação enzimática, evitando assim possíveis interferências que poderiam ocorrer se a reação continuar⁹.

Figura 1: Visão geral do método de quantificação da glicose usando a enzima glicose oxidase. que reage com a glicose para produzir peróxido de hidrogênio (H₂O₂) e ácido glucônico. Posteriormente, a enzima peroxidase reage com H₂O₂ na presença de dicloridrato de O-dianisidina. Na etapa final, o ácido sulfúrico (H₂SO₄) é adicionado para interromper a reação enzimática, resultando em uma cor rosa que é medida em 529 nm. Abreviaturas: POD = peroxidase; DEUS = glicose oxidase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O método enzimático GOX-H₂SO₄ é uma técnica amplamente utilizada para medir a concentração de glicose em amostras biológicas, a maioria das quais são de interesse clínico. No entanto, poucos estudos investigaram uma técnica que permita quantificar a quantidade de glicose em um meio de crescimento para avaliar seu consumo. Portanto, no presente protocolo, é apresentada a metodologia para quantificar a glicose por meio da reação enzimática de glicose oxidase, peroxidase, dicloridrato de o-dianisidina e H₂SO₄ em amostras líquidas microbiológicas, que surge como uma modificação do trabalho realizado por Bergmeyer⁹, utilizando 50% (v/v) H₂SO₄ e quantidades menores de reagentes.

Protocol

1. Preparação da solução

1. Prepare 100 mL de tampão fosfato 0,1 M. Pesar 1,28 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH₂PO₄) e 0,1304 g de fosfato dipotássico (K₂HPO₄) e adicioná-los a um copo de vidro. Agora, adicione 70 mL de água deionizada (H₂Odi) e ajuste o pH para 5,5 usando ácido clorídrico (HCl) 1 M ou hidróxido de potássio (KOH). Transferir a solução para um balão volumétrico e ajustar o volume final para 100 ml. Em seguida, transfira a solução para um recipiente âmbar e armazene a solução a 4-8 °C por até 3 meses.
   CUIDADO: Use luvas de nitrilo durante todo o processo de preparação para evitar contato com a pele e possível contaminação, pois o dicloridrato de o-dianisidina é potencialmente cancerígeno.
2. Prepare uma solução a 1% p / v de dicloridrato de o-dianisidina. Pesar 0,01 g de dicloridrato de o-dianisidina e colocá-lo em um tubo de centrífuga de 2,0 mL. Usando uma micropipeta de 1.000 mL, adicione 1,0 mL de H₂Odi para dissolver o composto e, em seguida, misture lentamente pipetando para cima e para baixo. Proteja a solução da luz envolvendo o recipiente em papel alumínio e armazene-o a -20 ° C para manter a estabilidade.
   NOTA: Para facilitar o suporte do tubo durante a medição na balança analítica, um béquer de 10 mL pode ser usado como suporte adicional. Isso ajuda a estabilizar o tubo, garantindo uma medição precisa, minimizando o risco de deslocamento ou inclinação que pode alterar os resultados obtidos na balança.
3. Em um balão volumétrico de 100 mL, adicione 10 mL de solução tampão fosfato seguida de 1 mL da solução de dicloridrato de o-dianisidina a 1% v/v. Em seguida, ajuste o volume final para 100 mL com tampão fosfato para obter uma concentração final de 0,01% de mistura de tampão o-dianisidina. Transfira a solução para um frasco âmbar e envolva-o com papel alumínio para protegê-lo da luz. Conservar a solução a 4-8 °C durante um período máximo de 3-4 meses.
   NOTA: A refrigeração é essencial para evitar a decomposição, o que pode comprometer a integridade das medições experimentais. Para evitar a degradação da mistura de tampão o-dianisidina, uma pequena porção de 13 mL (suficiente para 12 amostras) pode ser colocada em um tubo plástico de 14 mL no gelo até o uso.
4. Prepare a solução 50% H₂SO₄ . Colocar um balão volumétrico de 100 ml com 30 ml de H₂Odi num banho de gelo e deixar arrefecer durante 10 min. Em seguida, despeje lentamente 51 mL de H₂SO₄ (98% v / v) nas paredes do frasco, agitando cuidadosamente para homogeneizar a solução. Espere a mistura esfriar, pois a reação é exotérmica (gera calor). Ajustar o volume final para 100 ml com H₂Odi e transferir a solução para um balão de vidro âmbar.
   NOTA: Use um exaustor e siga todos os protocolos de segurança, certifique-se de usar equipamento de proteção adequado. Prepare 50 mL de solução de carbonato de cálcio a 40% para neutralizar possíveis derramamentos que possam ocorrer.
5. Preparar 50 mM de solução de acetato de sódio dissolvendo 0,04 g de acetato de sódio em 5 ml de H₂Odi num copo. Ajuste o pH para 5,1 usando ácido acético glacial. Por fim, ajuste o volume para 10 mL com H₂Odi.

2. Preparação de enzimas

1. Em um microtubo estéril de 2,0 mL, pesar 0,01 g de glicose oxidase e misturar com 1 mL de acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, para obter uma concentração final de 10 mg / mL. Cubra o tubo com papel alumínio e armazene a -20 °C.
   NOTA: A solução pode ser conservada até 2 meses a -20 °C.
2. Calcule o volume de solução enzimática V₂ necessário para atingir a atividade enzimática desejada em cada cubeta plástica (com um volume total de 1,5 mL) usando Eq (1): V₁C₁ = V₂C₂, onde V₁ é 1.500 μL, C₁ é 28,5 U de atividade enzimática e C₂ (a concentração da solução enzimática) é 12.970 U / mL (10 mg da enzima [129.000 unidades / g] em 1 mL de H₂Odi).
   V₂ = (1.500 μL × 28,5 U)/12.970 U = 3,29 μL (1)
   NOTA: Para uma pipetagem mais precisa, o valor pode ser arredondado para 3.3 μL.
3. Em um novo microtubo de 2 mL, pesar 0,0031 g de enzima peroxidase e adicionar 1 mL de tampão fosfato, pH 5,5, para atingir uma concentração final de 3,1 mg/mL. Cubra o microtubo com papel alumínio e armazene a -20 °C.
4. Calcular o volume da solução de peroxidase necessário para atingir a actividade enzimática desejada por cubeta utilizando a Eq (1). Comece com um volume total de cubeta de 1.500 μL e uma atividade enzimática alvo de 1,25 U. Em seguida, determinar o volume necessário da solução enzimática, dada a sua concentração de 1,551 U.
   V₂ = (1.500 μL × 1,25 U)/1.551 U = 1,208 μL
   NOTA: Para uma pipetagem mais precisa, o valor foi arredondado para 1,20 μL.

3. Padrão de glicose

1. Preparar um padrão de D-glicose de 1 g/L adicionando 0,01 g de D-glicose a 10 ml de H₂Odi num balão volumétrico. Para diluir a concentração para 0,5 g/L, pegue 500 μL da solução estoque e misture com 500 μL de H₂Odi para obter um volume final de 1 mL.
   NOTA: Este processo de diluição é essencial para criar soluções padrão precisas.

4. Preparação da curva padrão

1. Usando um novo microtubo de 2 mL, adicione o tampão e os volumes de glicose indicados na Tabela 1.
2. Ajuste o banho térmico seco para 37 °C. Quando a temperatura estiver estável, adicione 3,3 μL de glicose oxidase a todos os tubos e, em seguida, adicione 1,2 μL de peroxidase a cada tubo. Incubar os tubos a 37 °C durante 20 min.
3. Após a incubação, adicione imediatamente 750 μL de 50% H₂SO₄ (v/v) a cada microtubo e deixe a mistura esfriar em banho de gelo por 2 min. Isso resulta em um volume final de 1.500 μL. Por fim, transferir a solução para uma cubeta de plástico e medir a absorvância a 529 nm.

Tabela 1: Curva de calibração de glicose para o método GOX-H₂SO₄ . Abreviaturas: GOD = glicose oxidase; DPO = peroxidase; H₂SO₄ = ácido sulfúrico. Clique aqui para baixar esta tabela.

5. Testando amostras microbiológicas

1. Obtenha a amostra cultivando bactérias ou leveduras em um meio de cultura líquido sob condições específicas, incluindo temperatura, velocidade de agitação e tempo de incubação. Quando a cultura atingir a densidade óptica (DO) ou concentração celular desejada, colete a cultura para processamento posterior.
   NOTA: Pseudomonas reptilivora foi cultivada a uma velocidade de agitação constante de 300 rpm e 28 °C, enquanto Debaryomyces hansenii foi cultivada com uma velocidade de agitação de 200 rpm a 30 °C em um agitador orbital. No caso específico de D. hansenii, o óleo de canola comestível também foi utilizado como indutor para a produção de lipase.
2. Limpe a área de trabalho com uma solução de álcool a 70% ou um agente de limpeza adequado de acordo com os protocolos de biossegurança. Acenda um queimador para garantir assepsia.
3. Transfira 100 μL do meio de cultura para um microtubo de 1,5 mL ou 2 mL usando pontas estéreis.
4. Centrifugar as amostras a 7.500 × g durante 7 min a 4 °C ou a 10.000 × g durante 7 min sem controlo de temperatura. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, que contém glicose em solução, e descarte o pellet.
5. Use 0,5 μL do sobrenadante para concentrações de glicose variando de 1 a 20 g / L e, em seguida, misture com 749,5 μL de tampão o-dianisidina, 3,3 μL de GOD e 1,2 μL de POD. Incube os microtubos por 20 min a 37 ° C, conforme detalhado na etapa 4.2 e adicione imediatamente 750 μL de 50% H₂SO₄ e deixe esfriar em banho de gelo por 2 min.
   1. Para concentrações acima de 20 g/L, execute uma diluição de 1:1 com H₂Odi estéril antes de prosseguir.
   2. Se as amostras sobrenadantes tiverem sido previamente congeladas a -80 °C ou -20 °C, descongelá-las à temperatura ambiente e vórtice durante 30 s antes da utilização. Se a diluição for necessária, use H₂Odi estéril.
   3. Para amostras com concentrações de glicose superiores a 30 g/l, realizar uma diluição de 1:1 com H₂Odi estéril, resultando em um fator de diluição de 2.
6. Calcule a concentração total de glicose em cada amostra usando a Eq (2) em um programa de planilha.
   (2)
   Onde:
   x = concentração de glicose (g/L) δ = Volume final da reação (0,0015 L)
   y = absorvância M.S. = quantidade de amostra utilizada*
   NOTA: Os valores b e m são da equação que modela a linha de tendência da curva de calibração para o método (y = mx + b). *O valor M.S. deve basear-se na quantidade de amostra utilizada para obter a proporção na diluição correspondente (ou seja, se tomar 0,5 μL do sobrenadante, M.S. = 0,0000005 L = 0,5 × ^10-6 L); se for utilizado um factor de diluição (DF), multiplicar a absorvância obtida pelo DF.
   Por exemplo, se uma absorbância de 0,5 for obtida e um DF de 2 for usado, o resultado seria 1,0. Portanto, y = 1,0, e esse valor deve ser inserido na Eq (2), conforme descrito anteriormente.

6. Validação analítica

1. Calcular os parâmetros de validação analítica do método GOX-H₂SO₄ de acordo com o estabelecido pelo Centro Nacional de Metrologia e pela Entidade Mexicana de Acreditação¹⁰ (CENAM-ema).
   1. Calcule a precisão como uma porcentagem do coeficiente de variação ou %CV = (S/x) × 100, onde x é a média do grupo amostral e S é o desvio padrão com um valor de aceitação de ≤10%.
   2. Determine a linearidade ajustando a curva padrão ao modelo linear R² acima de 0,995.
   3. Calcule o limite de quantificação (LOQ) usando a equação: LOQ = yB + 10sB, onde yB representa a concentração do analito que produz um sinal equivalente ao sinal alvo e 10sB denota 10x o desvio padrão do branco
   4. Calcule o erro sistemático usando esta equação: Inclinação = x - m, onde x = média da concentração experimental e m é a concentração teórica.
   5. Determine a precisão como o grau de concordância entre um valor real e um valor teórico.
      % de recuperação = (CR/CV) × 100
      Onde CR é a média da concentração experimental e CV é o coeficiente de variação da concentração teórica.

7. Interferência de outros açúcares redutores

1. Avalie quatro açúcares redutores separadamente: glicose, frutose, galactose e xilose de uma solução estoque de 0,5 g / L. Além disso, use trealose como controle negativo. Seguir o protocolo para todas as amostras e medir a absorvância a 545 e 529 nm.

Results

A análise espectrofotométrica de GOX-H₂SO₄ revelou uma única absorbância máxima a 529 nm (λmax) (Figura 2A), com valores adicionais de absorbância observados a 545 nm. Analisando os valores de absorbância em diferentes concentrações de glicose, obtivemos uma linearidade (R²) de 0,9977 para λ529 nm e R² de 0,9967 para λ545 nm (Figura 2B). A linearidade, dentro de uma determinada faixa, refere-se à capacidade de fornecer resultados direta...

Discussion

Quantificar a glicose em meios de cultura é essencial para entender o crescimento microbiano e a atividade metabólica, pois a glicose serve como fonte primária de energia para muitos microrganismos. Neste estudo, empregamos o método GOX-H₂SO₄ para medir com precisão os níveis de glicose em meios de cultura, com o objetivo de otimizar processos microbianos em fermentações de bactérias ou leveduras. Nossos achados são consistentes com os de Yuen e McNeill

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtubo de 1,5 mL	Eppendorf	-	-
Microtubo de 2,0 mL	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	Carbonato
de Cálcio D-Glicose	Meyer	50-99-7	D-Glicose
Drybath	FisherScientific	11-718-4	Série 911NO251. Bloco LxPxA mm/in: 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5
Glicose oxidase	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Enzima em pó
H2O	-	-	Água deionizada
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Ácido sulfúrico
HCl	Meyer	7647-01-0	Ácido clorídrico
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Fosfato dipotássico
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Fosfato monopotássico
KOH	Meyer	1310-58-3	Hidróxido de potássio
Lambda 35	PerkinMicrotubo de		espectrofotômetro
centrífuga	-		--
dicloridrato de dianisidina	Sigma Aldrich	D3252	Peroxidase Cromogênica
	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzima em pó
pH-meter	Hanna	1131	Hanna 1170
Acetato de sódio	Meyer	127-09-3	Meyer
Espátulas de pesagem	-	-	-