Quantificação de glicose de Bergmeyer para amostras microbiológicas

Summary

A quantificação de glicose de Bergmeyer é uma técnica enzimática espectrofotométrica usada principalmente para testes clínicos que medem com precisão e sensibilidade a quantidade de glicose. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso desse método para amostras microbiológicas.

Abstract

A concentração de glicose é um indicador-chave do metabolismo celular e pode indicar a taxa de metabolismo total, uma aberração no metabolismo da glicose e, em alguns casos, como as células acoplam o metabolismo da glicose ao metabolismo energético. Além disso, os níveis de glicose intracelular e extracelular são indicativos do estado metabólico celular. Técnicas enzimáticas, como a quantificação da glicose de Bergmeyer, são mais precisas e sensíveis do que outras técnicas, como ácido dinitrosalicílico ou métodos de fluorescência, que geralmente são utilizados em microbiologia. Embora usada principalmente na área clínica, a quantificação da glicose de Bergmeyer também pode ser aplicada a qualquer célula, mas não foi relatada em detalhes para bactérias, fungos, leveduras ou outros microrganismos.

Aqui, apresentamos uma metodologia para quantificar a glicose de amostras de bactérias e leveduras usando o método enzimático de quantificação de glicose de Bergmeyer. O procedimento envolveu as enzimas glicose oxidase, peroxidase e dicloridrato de o-dianisidina incubadas a 37 °C por 20 min, seguidas da adição de ácido sulfúrico. A absorbância é então medida a 545 nm. É importante destacar que, embora essa técnica apresente dificuldades na medição de altas concentrações de glicose (acima de 60 g/L), é possível medir concentrações abaixo de 50 g/L usando fatores de diluição. Essa abordagem enzimática é valiosa para pesquisa e análise em microbiologia e outras áreas científicas. A precisão e a sensibilidade do método o tornam útil para detectar até mesmo baixas concentrações de glicose em amostras microbiológicas.

Introduction

A glicose serve como fonte primária de energia e carbono para vários microrganismos, incluindo bactérias, leveduras e fungos. Esses microrganismos absorvem a glicose por meio de transportadores localizados na membrana extracelular, onde ela sofre uma série de reações bioquímicas dentro da via metabólica da glicólise para ser convertida em piruvato¹. Existem várias técnicas para a quantificação de açúcares redutores, como a glicose. Por exemplo, o reagente de Benedict², o uso de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)^3,4, o método da anthrona⁵ ou o ácido fenol-sulfúrico....

Protocol

1. Preparação da solução

1. Prepare 100 mL de tampão fosfato 0,1 M. Pesar 1,28 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH₂PO₄) e 0,1304 g de fosfato dipotássico (K₂HPO₄) e adicioná-los a um copo de vidro. Agora, adicione 70 mL de água deionizada (H₂Odi) e ajuste o pH para 5,5 usando ácido clorídrico (HCl) 1 M ou hidróxido de potássio (KOH). Transferir a solução para um balão volumétrico e ajustar o volume final para 100 ml. Em seguida, transfira a solução para um recipiente âmbar e armazene a solução a 4-8 °C por até 3 meses.
   CUIDADO: Use luvas de nitrilo durante todo o processo de prepa....

Results

A análise espectrofotométrica de GOX-H₂SO₄ revelou uma única absorbância máxima a 529 nm (λmax) (Figura 2A), com valores adicionais de absorbância observados a 545 nm. Analisando os valores de absorbância em diferentes concentrações de glicose, obtivemos uma linearidade (R²) de 0,9977 para λ529 nm e R² de 0,9967 para λ545 nm (Figura 2B). A linearidade, dentro de uma determinada faixa, refere-se à capacidade de fornecer resultados direta.......

Discussion

Quantificar a glicose em meios de cultura é essencial para entender o crescimento microbiano e a atividade metabólica, pois a glicose serve como fonte primária de energia para muitos microrganismos. Neste estudo, empregamos o método GOX-H₂SO₄ para medir com precisão os níveis de glicose em meios de cultura, com o objetivo de otimizar processos microbianos em fermentações de bactérias ou leveduras. Nossos achados são consistentes com os de Yuen e McNeill

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtubo de 1,5 mL	Eppendorf	-	-
Microtubo de 2,0 mL	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	Carbonato
de Cálcio D-Glicose	Meyer	50-99-7	D-Glicose
Drybath	FisherScientific	11-718-4	Série 911NO251. Bloco LxPxA mm/in: 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5
Glicose oxidase	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Enzima em pó
H2O	-	-	Água deionizada
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Ácido sulfúrico
HCl	Meyer	7647-01-0	Ácido clorídrico
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Fosfato dipotássico
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Fosfato monopotássico
KOH	Meyer	1310-58-3	Hidróxido de potássio
Lambda 35	PerkinMicrotubo de		espectrofotômetro
centrífuga	-		--
dicloridrato de dianisidina	Sigma Aldrich	D3252	Peroxidase Cromogênica
	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzima em pó
pH-meter	Hanna	1131	Hanna 1170
Acetato de sódio	Meyer	127-09-3	Meyer
Espátulas de pesagem	-	-	-