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Artigo de método

Avaliação da hipóxia tumoral: imagens de oxigênio 3D in vivo por ressonância paramagnética eletrônica

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DOI:

10.3791/67129

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14 de fevereiro de 2025

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1Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Department of Biophysics and Cancer Biology, Jagiellonian University, 2Doctoral School of Exact and Natural Sciences Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Department of Biophysics and Cancer Biology, Jagiellonian University, 3Department of Radiation and Cellular Oncology, The University of Chicago, 4Center for EPR Imaging In Vivo Physiology, The University of Chicago, 5O2M Technologies

Neste artigo

Resumo

Mapas quantitativos de oxigênio 3D de tumores murinos foram fotografados de forma não invasiva usando ressonância paramagnética eletrônica de pulso. Ultrassom modo B e Power Doppler foram usados para anatomia e estrutura vascular. As imagens de ambas as modalidades foram sobrepostas, permitindo a análise multiparamétrica do tumor.

Resumo

A medição precisa e em tempo real da pressão parcial de oxigênio (pO2) traz informações valiosas em muitas patologias, incluindo o câncer. O baixo pO2 do tumor (ou seja, hipóxia) está ligado à agressividade do tumor e à má resposta à terapia. A quantificação do tumor pO2 permite avaliar a eficácia do tratamento. A Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPRI), particularmente a EPRI de Pulso, surgiu como um método tridimensional (3D) avançado de avaliação da oxigenação tecidual in vivo. Essa inovação foi possibilitada pelos desenvolvimentos tecnológicos em EPR (Ressonância Paramagnética Eletrônica) e pela aplicação das sondas de spin oximétricas solúveis em água da família das triarilas, oferecendo dados de oxigenação rápidos e sensíveis. O tempo de relaxamento da sonda de rotação (T1 e/ou T2) fornece informações precisas sobre pO2 em voxels selecionados.

Os tumores de glioblastoma humano LN229 foram cultivados na almofada da moda interescapular de camundongos nus BALB/c. A ultrassonografia (US) foi utilizada como referência para informações anatômicas do tumor. Para a imagem do tecido pO2, os animais foram colocados em posição fixa no leito do animal com fiduciais, possibilitando o registro entre as modalidades de imagem. Após a administração do agente de contraste OX071, foi realizada a IRE, seguida do modo B da US. Devido à baixa toxicidade da sonda de rotação, o procedimento pode ser repetido durante o crescimento ou tratamento do tumor. Após a realização da imagem, o processo de registro foi realizado por meio de um software escrito em MATLAB. Em última análise, a fração hipóxica pode ser calculada para um tumor específico, e o histograma da distribuição do tecido pO2 pode ser comparado ao longo do tempo. A EPRI combinada com ultrassom é uma excelente ferramenta para o mapeamento de tumores com oxigênio no ambiente pré-clínico.

Introdução

Compreender o microambiente tumoral (TME), com suas complexas interações espaciais e dinâmicas, traz uma compreensão mais completa da biologia tumoral. A hipóxia, ou baixos níveis de oxigênio, é o principal componente da TME e desempenha um papel crítico no desenvolvimento de outras condições com risco de vida, incluindo doenças cardiovasculares, distúrbios metabólicos como diabetes e doença renal crônica 1,2,3. A oxigenação tecidual é um fator fundamental, particularmente no contexto do câncer, onde a pressão parcial de oxigênio tecidual (pO2) está correlacionada com a resistência à terapia. Um nível de pO2 superior a 10 mm Hg está associado a um aumento na eficácia da radioterapia de baixa transferência linear de energia (LET) (efeito de aumento de oxigênio).

Estudos recentes usando Ressonância Magnética Eletrônica (EPRI) demonstraram que a radioterapia guiada por oxigênio pode resultar em uma melhora de duas vezes nas taxas de sobrevida em diferentes cânceres em modelos murinos 4,5. Isso é semelhante a indivíduos humanos cujo tumor pO2 foi medido com várias medições de eletrodos Eppendorf e apresentou valores médios ou médios de pO2 abaixo de 10 torr6. Além da radioterapia, a hipóxia tumoral tem sido diretamente correlacionada com a agressividade tumoral e o resultado de outras terapias, como a imunoterapia 7,8. Essa associação ressalta a importância de medições precisas de oxigênio para melhorar os resultados terapêuticos e entender a fisiopatologia das doenças.

A oximetria in vivo ideal requer uma medição direta da pressão parcial de oxigênio do tecido, independente de fatores como perfusão tecidual e saturação de hemoglobina. O procedimento deve ser não invasivo, com um tempo de imagem breve e preciso para evitar possíveis impactos no organismo, como anestesia prolongada, alterações na temperatura do tecido ou alterações significativas na pressão e no pH do tecido. A oximetria tecidual deve apresentar alta precisão e confiabilidade, garantindo medições consistentes, independentemente das variações no microambiente tecidual, incluindo diferenças no pH e no estado redox. Para um planejamento eficaz da terapia, a reconstrução dos dados de imagem em tempo real e a interpretação direta são cruciais. Isso implica não apenas alcançar resolução espacial preferencialmente inferior a 1 mm, mas também permitir uma coleta rápida de dados para monitorar mudanças dinâmicas no estado de oxigênio dos tecidos, como hipóxia cíclica.

Nesse contexto, várias técnicas para medir o oxigênio molecular ou avaliar a hipóxia foram desenvolvidas, cada uma com aplicabilidade e vantagens únicas. O eletrodo de platina, considerado o "padrão ouro" para oximetria de tecidos celulares e animais vivos, oferece medições consistentes por meio de inserção precisa nos tecidos. Outras abordagens, como métodos ópticos usando sondas fluorescentes, fotoacústica, monitoramento dos efeitos da hipóxia por meio da expressão gênica ou proteica ou ensaios cometas, são fáceis de usar, mas são indiretas ou limitadas pelo caminho óptico nos tecidos. Alternativas promissoras para avaliar a hipóxia e / ou oxigenação parecem ser a ressonância magnética (MRI) - OE-MRI10 - ou MOBILE11, tomografia por emissão de pósitrons (PET) com várias sondas sensíveis à hipóxia12 ou ressonância paramagnética eletrônica (EPR).

A EPR tem uma longa história no campo da biomedicina. O fenômeno em si foi relatado pela primeira vez em 1944 e foi amplamente adotado como uma ferramenta para analisar estruturas químicas e, mais recentemente, para sistemas biológicos e materiais com elétrons desemparelhados13. A espectroscopia EPR tem sido usada para estudar a dinâmica e a estrutura de sistemas biológicos, como fotossíntese, metaloproteínas, enzimas radicais e membranas fosfolipídicas 14,15,16. A espectroscopia e a tomografia por ressonância paramagnética eletrônica (EPR) surgiram como métodos não invasivos essenciais para estudar a oxigenação tumoral e o microambiente com resolução espacial de ~ 1 mm, resolução temporal de 1-10 min e resolução pO2 de 1-3 torr 5,17,18.

Os métodos EPR de onda contínua (CW) continuam sendo amplamente utilizados na maioria das aplicações devido à simplicidade de registrar e interpretar espectros. As interações da sonda de rotação de oxigênio funcionam avaliando alterações na intensidade do sinal EPR ou na forma da linha, fornecendo informações sobre os níveis de oxigênio na amostra. CW EPR tem uma vantagem notável na sensibilidade a uma faixa mais ampla de pO2 em comparação com os métodos de pulso. Ao aplicar várias sequências de pulso, informações como tempos de relaxamento do spin-spin do elétron, tempos de relaxamento do spin-rede e interações com spins vizinhos podem ser elucidadas 18,19. Técnicas de EPR de pulso, como recuperação de inversão com leitura de eco de spin de elétrons (IRESE), medem as taxas de relaxamento da rede de spin, evitando o relaxamento do artefato causado pelo relaxamento da sonda de spin-sonda de spin em baixas concentraçõesde oxigênio 19,20. O EPR pode ser usado para monitorar mudanças na concentração de oxigênio com alta resolução temporal e espacial; no entanto, na oximetria em altas concentrações de oxigênio, o EPR de pulso enfrenta limitações devido aos curtos tempos de relaxamento da magnetização transversal medidos com eco de spin de elétrons (ESE). Em última análise, CW e EPR de pulso são complementares, e uma compreensão confiável do sistema de spin requer a aplicação de ambos os métodos.

As técnicas de oximetria EPR dependem da relação linear entre os níveis de oxigênio e a rede de spin, bem como as taxas de relaxamento de spin-spin em solução. Todas as sondas oximétricas são frequentemente divididas em dois tipos: sondas de spin solúveis e particuladas. A escolha da sonda de rotação correta depende da configuração experimental e das informações necessárias 21,22,23. Sondas de spin solúveis, como nitróxidos ou derivados de tritila 24,25 como OX063 e sua forma deuterada OX071, distribuídas por todo o tecido, fornecem informações de todo o volume. Alternativamente, para medição de ponto único e para avaliações prolongadas e recorrentes de oxigênio, sondas de estado sólido como LiPc, LiBuO ou derivados de carbono podem ser usadas (ver Tabela 1)22,23,26.

A ultrassonografia em modo B é amplamente utilizada na clínica para imagens de tecidos moles. A resolução depende da frequência do transdutor usada e, para estudos pré-clínicos, 18 MHz e superior fornecem resolução suficiente no plano e na profundidade da imagem. Uma vantagem adicional da ultrassonografia é a possibilidade de obtenção de imagens da vasculatura funcional usando o modo Power Doppler. Aqui, apresentamos imagens de oxigênio por ressonância paramagnética eletrônica (EPROI) como um método para gerar mapas 3D de oxigênio de tumores em camundongos vivos. A ultrassonografia correspondente permite a referência anatômica necessária para a definição do tumor dentro do EPROI. Várias sessões de imagem são possíveis para cada animal. A última etapa é a análise, incluindo reconstrução da imagem e registro entre as modalidades para obtenção de um histograma pO2 do volume tumoral.

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Protocolo

Os camundongos foram obtidos de uma instalação de criação de animais aprovada e todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as diretrizes éticas (no nosso caso - Permissão nº 165/2023, Primeiro Comitê de Ética Local, Cracóvia, Polônia).

1. Animais e linha tumoral

NOTA: Os camundongos foram alojados em condições padrão de laboratório: Claro/escuro: 12 h/12 h, umidade: 60%, temperatura: 23 °C. Eles receberam uma dieta padrão de ração com acesso gratuito à água potável em gaiolas comunitárias.

  1. Cultura de linha celular LN229 de glioblastoma multiforme murino
    1. Cultura de células LN229 em frascos de cultura de tecidos de 25 cm2 em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS) e penicilina-estreptomicina nas concentrações de 10 U/mL e 0,1 mg/mL, respectivamente.
    2. Mantenha as células em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 a 37 ° C, passando a cada 48 h usando 0,25% de tripsina-EDTA e PBS sem íons magnésio e cálcio (pH 7,4).
  2. Inoculação de tumor
    1. Uma semana antes da inoculação, manuseie os ratos diariamente para familiarizá-los com o investigador.
    2. No dia da inoculação, pesar os ratos.
    3. Suspender 200.000 células LN229 em 50 μL de matriz extracelular sem fatores de crescimento. Usando uma agulha de 29 G, inocule a mistura de células por via subcutânea na almofada de gordura intraescapular de camundongos nus BALB/c de 16 semanas de idade (N = 5).

2. Imagem de US Doppler

A linha do tempo geral da imagem do tumor é mostrada na Figura 1. A ultrassonografia é usada tanto para imagens da vasculatura por Doppler US quanto para Anatomy US como referência imediatamente antes do EPROI (Figura 2). A imagem anatômica em modo B é essencial para a análise da oxigenação tumoral por EPR e é descrita na seção 3. Embora a ultrassonografia Doppler (seção 2) não seja obrigatória para o desempenho bem-sucedido do registro, ela fornece informações valiosas sobre a janela de tempo ideal para o estudo EPR e permite a determinação da vasculatura ativa na área do tumor.

  1. Preparação do mouse
    1. Aguarde até que os tumores atinjam cerca de 30 mm3. Se necessário, raspe os camundongos manualmente ao redor do local do tumor.
    2. Induza a anestesia com isoflurano a 2% e mantenha-a com isoflurano a 1-1,5%.
    3. Transfira o animal da câmara de anestesia para uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 °C durante a preparação (com base na sonda de temperatura retal). Estabilize a temperatura do animal para obter feedback adequado dos parâmetros fisiológicos.
  2. Ultra-sonografia
    1. Use o sistema de ultrassom com um transdutor de 57-25 MHz para imagens pré-clínicas (Figura 2, etapa 1).
    2. Adquira medições 3D em modo B para visualização da morfologia do tumor em uma direção sagital. Use o tamanho do passo de 0,1 mm.
      NOTA: Não mova o animal ou o transdutor para preservar exatamente as mesmas configurações.
    3. Empregue o modo Power Doppler para visualizar a vasculatura tumoral funcional com os seguintes parâmetros: Velocidade: 1,5 kHz, Filtro de parede: Baixa, Prioridade: 75%, Persistência: Média, Tamanho do passo 0,10 mm.
    4. Gire o transdutor para repetir as etapas 2.2.2 e 2.2.3 na direção axial.
    5. Realize a análise de dados com o software fornecido pelo fabricante do ultrassom. Marque a borda do tumor, carregue-a em uma imagem 3D e calcule o volume do tumor e a porcentagem de vasculatura.

3. EPROI

  1. Preparação da sonda
    1. Dissolva o pó de OX071 armazenado a -80 °C em H2O injetável até uma concentração final de 1 g/10 mL (~70 mM).
  2. Preparação do mouse
    1. Anestesiar os camundongos com isoflurano a 1% -3% misturado com ar ambiente e posicioná-los em um suporte para animais.
    2. Administre 1 mL de soro fisiológico por via subcutânea para manter o nível de hidratação adequado.
    3. Monitore a frequência respiratória (80 ± 20 BPM) e a temperatura (37 ± 1 °C) do animal usando um sensor de almofada respiratória e um termômetro de superfície conectado à pele do camundongo. Monitore a temperatura retal como ponto de referência (37 °C ± 1 °C).
    4. Insira o tubo de politetrafluoretileno (PTFE) (0,7 mm de diâmetro externo) por via intraperitoneal para administração da sonda de rotação. Prenda a cânula com o uso de polissiloxano vinílico (VPS) para evitar que ela caia da cavidade abdominal.
    5. Insira um cateter de urina (24 G) para coletar a sonda de rotação excretada.
    6. Prenda o mouse em uma cama de animal usando argila dental VPS para imobilização (Figura 2A).
  3. Imagem anatômica de US para registro
    1. Ligue a mesa controlada por 3D e a cama nivelada. Defina a temperatura da plataforma para 60 °C de modo que a temperatura do animal isolado pelo suporte de cama de plástico seja mantida em 37 °C.
    2. Coloque a cama do animal com o animal imobilizado no suporte da cama e transfira-o para uma mesa controlada por 3D para imagens anatômicas antes da medição do EPR (Figura 2B). Certifique-se de que o animal esteja preso dentro do suporte da cama e não toque na plataforma de aquecimento.
    3. Fixe a posição do suporte da cama em três dimensões para evitar a rotação, particularmente a rotação XZ (plano sagital), que é crucial para um registro preciso.
    4. Coloque um marcador de posição (fio de pesca na fita, 0.35 mm de diâmetro) no suporte da cama, marcando o início do ressonador.
    5. Realize imagens em modo B manualmente com um passo de 1 mm nas direções axial e sagital em direção ao eixo Y.
    6. Imagem da estrutura do tumor com os seguintes parâmetros, dependendo da frequência específica do transdutor; para um transdutor de 18 MHz, profundidade de 20 mm, faixa dinâmica de 84 dB, potência de 8 dB, ganho de 80%; para transdutor de 40 MHz, profundidade de 20 mm, faixa dinâmica de 32 dB, ganho de 100%; para transdutor de 57 MHz, profundidade 13 mm, ganho 6 dB, potência 100%. Ajuste a configuração no foco do transdutor de acordo com a localização específica do tumor.
    7. No final da imagem anatômica, limpe o excesso de gel do camundongo e remova o camundongo imobilizado na cama do animal do suporte da cama.
  4. Imagem de oxigênio EPR
    1. Utilize o gerador de imagens de oxigênio para Pulse EPR, operando em frequências de rádio que variam de 685 MHz a 735 MHz. Para configuração, empregue bobinas de deslocamento para imagens 3D e análise dos tempos de relaxamento. Use um ressonador horizontal de 32 mm x 35 m.
    2. Transfira o camundongo imobilizado no leito do animal imediatamente para o gerador de imagens EPR após ultrassom anatômico (Figura 2C). Mantenha a posição do leito animal com cuidado para minimizar as rotações dentro do ressonador, semelhante ao procedimento descrito na seção 3.3.
    3. Reconecte a sonda de temperatura para garantir o monitoramento e manutenção contínuos da temperatura do animal, correlacionando-a com a temperatura dentro do ressonador.
    4. No software do espectrômetro EPR, execute a sintonia do ressonador usando a roda de sintonia para centralizar a frequência em torno de 725 MHz (Figura 3A).
      NOTA: Um ressonador bem combinado deve ter uma queda de 25 dB ou melhor.
    5. Otimize a potência de microondas para obter um pico a 60 ns (Figura 3B) ajustando o valor de atenuação de 20 dB a 3 dB.
    6. Ajuste o instrumento de modo que o decaimento por indução livre (FID) dos fiduciais posicionados dentro do leito do animal seja centralizado no campo magnético e faseado (Figura 3C).
    7. Administre 100 μL de OXO71 por via intraperitoneal através da cânula previamente inserida, seguida de uma lavagem com 50-100 μL de solução salina.
    8. Usando uma sequência de filas programadas, adquira medições com parâmetros definidos; uma sequência típica contém T1, tempos de relaxamento T2, 3D Electron Spin Echo (ESE) para imagens fiduciais e 4D Inversion Recovery Electron Spin Echo (IRESE) para a imagem do animal. Colete a imagem IRESE com um gradiente de 1,5 G/cm, tempo de repetição de 55 μs, pré-disparo de -250 ns, t90 é de 60 ns e tau de 400 ns; Tempo total de aquisição ~12 min. Repita a imagem IRESE pelo menos por 30-40 min (3-4x) após a injeção da sonda.
    9. Após a imagem, transfira o mouse da cama do animal para a almofada de aquecimento. Administre 1 mL de soro fisiológico por via subcutânea para manter o nível de hidratação adequado. Monitore até que o mouse recupere a locomoção vertical.

4. Análise dos dados

  1. Análise de reconstrução 4D em "ProcessGUI"
    1. Antes da reconstrução, aplique a correção de linha de base nas projeções selecionando o cenário "PulseRecon.scn" e carregando o arquivo de parâmetros "IRESE_64pts_mouse_STANDARD_CHIRALITY.par" para analisar os dados brutos do IRESE.
    2. Filtre cada projeção com um filtro gaussiano de largura de 4 pontos, uma configuração padrão para o cenário selecionado.
    3. Subaponte as projeções filtradas para 64 pontos (tamanho da matriz), uma configuração padrão para o cenário selecionado.
    4. Filtre ainda mais as projeções com um filtro Ram-Lak com apodização a 0,6 vezes a frequência de Nyquist (clique em Parâmetro de reconstrução | FilterCutOff).
    5. Retroprojete as projeções filtradas para produzir uma imagem espectral-espacial 4D.
    6. Utilize um algoritmo de ajuste para extrair a largura de linha do pacote de spin do espectro em cada voxel. Configuração dos parâmetros de ajuste de seção: Extensor do último ponto - 3, método de ajuste - padrão.
    7. Use as configurações padrão para parâmetros no procedimento de ajuste, incluindo a amplitude do espectro, a fase, o centro espectral e a largura de linha do pacote de rotação espectral.
  2. Registro entre US anatômico e EPROI em "ArbuzGUI" (Figura 4)
    NOTA: O procedimento MATLAB "ArbuzGUI" desenvolvido por Boris Epel da Universidade de Chicago foi utilizado para realizar o registro. O software está disponível no EPR-IT https://github.com/o2mdev/eprit. A caixa de ferramentas de registro foi explicada anteriormente em outro lugar27. Consulte o manual do usuário para obter instruções detalhadas passo a passo28.
    1. Carregue imagens 2D US como uma pilha com passo de 1 mm (o passo está estritamente relacionado à aquisição de quadros na imagem em modo B, ponto 3.3.7) para criar imagens 3D US.
    2. Adicione imagens pO2 coletadas (reconstruídas na etapa 4.1) como tipo de imagem 3D definido como dados "PO2_pEPRI". Armazene dados no projeto.
    3. Crie uma sequência de registro e transformação selecionando Especial | Registro MRI-EPRI.
    4. Selecione a imagem que precisa ser ajustada nos dados EPRI (por exemplo, US axial 3D) selecionando Sequência | adicionar ação. Use o Stage 5:T2 para obter o melhor desempenho. No resultado, um símbolo de mais preto aparecerá na frente do nome da imagem selecionada.
    5. Abra a imagem dos EUA em SliceMaskEditPLG. Ajuste a escala da imagem dos EUA com base na régua apresentada nas imagens. Marque o marcador de posição US, o contorno do animal e a posição do tumor com base nos quadros selecionados.
    6. No SliceMaskEditPLG, marque o contorno do mapa pO2 e fiducial em imagens pO2 4D reconstruídas.
    7. Usando o visualizador de figuras e a caixa de ferramentas RotateImagePLG, gire a imagem US de acordo com o marcador de posição US versus posições fiduciais para registrar o mapa pO2 com o contorno US.
    8. Transforme a máscara tumoral da imagem dos EUA para o mapa pO2 .
    9. Visualize a máscara tumoral no mapa pO2 do camundongo e exporte os valores pO2 para cada voxel.

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Resultados

Um corte transversal representativo da imagem ultrassonográfica de um tumor LN229 crescendo no coxim adiposo intraescapular, juntamente com a vasculatura, é mostrado na Figura 5. Alguma vasculatura é vista fora da borda do tumor. Inesperadamente, a porcentagem de volume da vasculatura tumoral não diminuiu e permaneceu estável com o crescimento tumoral.

Conforme descrito na Figura 2, a etapa 2 envolve a imobilização do mouse na cama co...

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Discussão

Existem algumas etapas críticas no protocolo de imagem descrito. Primeiro, para registrar as imagens de anatomia com os mapas de oxigênio, a ressonância magnética pode ser uma escolha melhor do que o ultrassom devido à melhor resolução e à capacidade de fornecer dados 3D detalhados19. O ultrassom com um transdutor de alta frequência fornece excelente resolução e profundidade de imagem suficiente para estudos pré-clínicos. Tanto a ressonância magnética quanto a US,...

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Divulgações

O Prof. H. Halpern e B. Epel são cofundadores da O2M Technologies. Os outros autores: G. Dziurman, A. Bienia, A. Murzyn, B. Płóciennik, J. Kozik, G. Szewczyk, M. Szczygieł, M. Krzykawska-Serda e M. Elas não têm conflitos de interesses a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos à O2M Technology pelo suporte técnico gentil. As concessões do Centro Nacional de Ciência da Polônia nº 2020/37/B/NZ4/01313 (gerador de imagens Jiva-25) e NCBiR: ENM3/IV/18/RXnanoBRAIN/2022 (custos com animais) são reconhecidas. A compra do ultrassom VevoF2 foi apoiada pela Faculdade de Bioquímica, Biofísica e Biotecnologia no âmbito da Iniciativa de Excelência do Programa Estratégico da Universidade Jaguelônica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
aqua pro injectionePolpharma1280610-ArbuzGUI
 O2MTechnologies-acessívelno repositório github
fosfato dissódicoPOCH S.A.
′ s Águia Modificada′ s Glicose média - altaMerck Life ScienceD56484500 mg/L glicose e L-glutamina
soro fetal bovino Gibco, Thermo Fisher Scientificde10500064
Good FishA-55A-035Marcador de posição dos EUA - 0,35 mm
GeltrexGibco, Thermo Fisher ScientificA1413302fator de crescimento reduzido matriz de membrana basal
ibGUIO2M Technologies-acessívelno repositório github
injectio natrii chlorati isotonicaPolpharmaitens múltiplos foram usados9 mg/mL
29 G utilizados vários itensBecton, Dickinson and Company-
Jiva 25O2M Technologies-EPROI
MATLABMathWorks-versão R2021b
penicilina-estreptomicinaMerck Life ScienceP4333com 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL
cloreto de potássioPOCH S.A.de739740114-potássio
POCH S.A.742020112-ProcessGUI
O2MTechnologies-acessívelno repositório github
PTFE tubing Cole Palmer Instrument Co06412-11-cloretode
sódioPOCH SA
FEMIInstruments-versão3.4 CS 64bit
Surflash I.V. CateterTerumoSR*FF2419tamanho: 24G x ¾ "
fita3M foram usados vários itensmicropore
Tripsina-EDTA Gibco, Thermo Fisher Scientific
25200072-UltrasonografiaTelemed-AnatomicalUS
US gelKONIXNUG-0019-Vetflurane
Virbac1373171000 mg/g
Vevo F2FujiFilms, Visual Sonics-B-modee Doppler
vinil polissiloxano argila dental Vários itens 3M ESPEforam usados-
799280115-Dulbecco fio pesca agulhas de insulina Foram da de di-hidrogenofosfato 794121116-SpecMan4EPR

Referências

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