Um método automatizado de estrabismo para comportamento de sincronização de tempo e dinâmica cerebral em estudos de dor em camundongos

Summary

Este protocolo fornece um método para rastrear o estrabismo ocular automatizado em roedores ao longo do tempo de maneira compatível com o bloqueio de tempo para medidas neurofisiológicas. Espera-se que este protocolo seja útil para pesquisadores que estudam mecanismos de distúrbios dolorosos, como a enxaqueca.

Abstract

A dor espontânea tem sido um desafio para rastrear em tempo real e quantificar de uma forma que evite o viés humano. Isso é especialmente verdadeiro para métricas de dor de cabeça, como em distúrbios como a enxaqueca. O estrabismo ocular surgiu como uma métrica variável contínua que pode ser medida ao longo do tempo e é eficaz para prever estados de dor em tais ensaios. Este artigo fornece um protocolo para o uso do DeepLabCut (DLC) para automatizar e quantificar o estrabismo ocular (distância euclidiana entre as pálpebras) em camundongos contidos com movimentos de cabeça em rotação livre. Este protocolo permite que a quantificação imparcial do estrabismo ocular seja emparelhada e comparada diretamente com medidas mecanicistas, como neurofisiologia. Fornecemos uma avaliação dos parâmetros de treinamento de IA necessários para alcançar o sucesso, conforme definido pela discriminação de períodos de estrabismo e não estrabismo. Demonstramos a capacidade de rastrear e diferenciar de forma confiável o estrabismo em um fenótipo semelhante à enxaqueca induzido por CGRP em uma resolução inferior a um segundo.

Introduction

A enxaqueca é um dos distúrbios cerebrais mais prevalentes em todo o mundo, afetando mais de um bilhão de pessoas¹. Modelos pré-clínicos de enxaqueca em camundongos surgiram como uma forma informativa de estudar os mecanismos da enxaqueca, pois esses estudos podem ser mais facilmente controlados do que os estudos em humanos, permitindo assim o estudo causal do comportamento relacionado à enxaqueca². Tais modelos demonstraram uma resposta fenotípica forte e repetível a compostos indutores de enxaqueca, como o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP). A necessidade de medições robustas de comportamentos relevantes para a enxaqueca em modelos de roedores persiste, especialmente aquelas que podem ser acopladas a métricas mecanicistas, como abordagens de imagem e eletrofisiológicas.

Os estados cerebrais semelhantes à enxaqueca foram fenotipicamente caracterizados pela presença de aversão à luz, alodinia da pata, hiperalgesia facial a estímulos nocivos e careta facial³. Tais comportamentos são medidos pelo tempo total gasto na luz (aversão à luz) e pelos limiares de sensibilidade ao toque facial ou da pata (alodinia da pata e hiperalgesia facial) e são restritos a uma única leitura por grandes períodos de tempo (minutos ou mais). Comportamentos semelhantes à enxaqueca podem ser provocados em animais pela dosagem de compostos indutores de enxaqueca, como o CGRP, imitando os sintomas experimentados por pacientes humanos com enxaqueca³ (ou seja, demonstrando validade facial). Tais compostos também produzem sintomas de enxaqueca quando administrados em humanos, demonstrando a validade de construto desses modelos⁴. Estudos nos quais os fenótipos comportamentais foram atenuados farmacologicamente levaram a descobertas relacionadas ao tratamento da enxaqueca e fornecem mais comprovação desses modelos (ou seja, demonstrando validade preditiva)^5,6.

Por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-CGRP (ALD405) demonstrou reduzir o comportamento aversivo à luz⁵ e a careta facial em camundongos⁶ tratados com CGRP, e outros estudos demonstraram que as drogas antagonistas do CGRP reduzem comportamentos semelhantes à enxaqueca induzidos por óxido nitroso em animais ^7,8. Ensaios clínicos recentes mostraram sucesso no tratamento da enxaqueca, bloqueando o CGRP ^9,10, levando a vários medicamentos aprovados pela FDA direcionados ao CGRP ou seu receptor. A avaliação pré-clínica dos fenótipos relacionados à enxaqueca levou a avanços nos achados clínicos e, portanto, é essencial para a compreensão de alguns dos aspectos mais complexos da enxaqueca que são difíceis de testar diretamente em humanos.

Apesar das inúmeras vantagens, os experimentos que usam essas leituras comportamentais de enxaqueca em roedores são frequentemente restritos em suas habilidades de amostragem de pontos de tempo e podem ser subjetivos e propensos a erros experimentais humanos. Muitos ensaios comportamentais são limitados na capacidade de capturar a atividade em resoluções temporais mais finas, muitas vezes dificultando a captura de elementos mais dinâmicos que ocorrem em uma escala de tempo inferior a um segundo, como no nível da atividade cerebral. Tem se mostrado difícil quantificar os elementos de comportamento mais espontâneos e naturais ao longo do tempo em uma resolução temporal significativa para estudar os mecanismos neurofisiológicos. Criar uma maneira de identificar a atividade semelhante à enxaqueca em escalas de tempo mais rápidas permitiria validar externamente os estados cerebrais semelhantes à enxaqueca. Isso, por sua vez, pode ser sincronizado com a atividade cerebral para criar perfis de atividade cerebral mais robustos da enxaqueca.

Um desses fenótipos relacionados à enxaqueca, a careta facial, é utilizado em vários contextos como uma medida de dor em animais que pode ser medida instantaneamente e rastreada ao longo do tempo¹¹. A careta facial é frequentemente usada como um indicador de dor espontânea com base na ideia de que humanos (especialmente humanos não verbais) e outras espécies de mamíferos exibem mudanças naturais na expressão facial ao sentir dor¹¹. Estudos que mediram a careta facial como indicação de dor em camundongos na última década utilizaram escalas como a Escala de Carecas de Camundongos (MGS) para padronizar a caracterização da dor em roedores¹². As variáveis de expressão facial do MGS incluem aperto orbital (estrabismo), protuberância do nariz, protuberância da bochecha, posição da orelha e alteração do bigode. Embora o MGS tenha demonstrado caracterizar de forma confiável a dor em animais¹³, é notoriamente subjetivo e depende de pontuação precisa, que pode variar entre os experimentadores. Além disso, o MGS é limitado na medida em que utiliza uma escala não contínua e não possui a resolução temporal necessária para rastrear o comportamento que ocorre naturalmente ao longo do tempo.

Uma maneira de combater isso é quantificar objetivamente uma característica facial consistente. O estrabismo é a característica facial mais consistentemente rastreável⁶. O estrabismo é responsável pela maior parte da variabilidade total nos dados ao contabilizar todas as variáveis MGS (estrabismo, protuberância do nariz, protuberância da bochecha, posição da orelha e mudança do bigode)⁶. Como o estrabismo contribui mais para a pontuação geral obtida usando o MGS e rastreia de forma confiável a resposta ao CGRP ^6,14, é a maneira mais confiável de rastrear a dor espontânea em modelos de camundongos com enxaqueca. Isso torna o estrabismo um comportamento não homeostático quantificável induzido pelo CGRP. Vários laboratórios usaram características de expressão facial, incluindo estrabismo, para representar a potencial dor espontânea associada à enxaqueca ^6,15.

Vários desafios permaneceram em relação à realização de estrabismo automatizado de uma forma que possa ser combinada com estudos mecanicistas de enxaqueca. Por exemplo, tem sido difícil rastrear o estrabismo de forma confiável sem depender de uma posição fixa que deve ser calibrada da mesma maneira entre as sessões. Outro desafio é a capacidade de realizar esse tipo de análise em escala contínua em vez de escalas discretas como a MGS. Para mitigar esses desafios, pretendemos integrar o aprendizado de máquina, na forma de DeepLabCut (DLC), em nosso pipeline de análise de dados. O DLC é um modelo de aprendizado de máquina de estimativa de pose desenvolvido por Mathis e colegas e foi aplicado a uma ampla gama de comportamentos¹⁶. Usando seu software de estimativa de pose, fomos capazes de treinar modelos que podiam prever com precisão os pontos em um olho de rato com precisão quase humana. Isso resolve os problemas de pontuação manual repetitiva e, ao mesmo tempo, aumenta drasticamente a resolução temporal. Além disso, ao criar esses modelos, criamos um meio repetível de pontuar o estrabismo e estimar a atividade cerebral semelhante à enxaqueca em grupos experimentais maiores. Aqui, apresentamos o desenvolvimento e a validação desse método para rastrear comportamentos estrábicos de uma forma que pode ser bloqueada no tempo para outras medições mecanicistas, como a neurofisiologia. O objetivo geral é catalisar estudos mecanicistas que exigem comportamentos de estrabismo bloqueados no tempo em modelos de roedores.

Protocol

NOTA: Todos os animais utilizados nesses experimentos foram manejados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Iowa.

1. Preparar equipamentos para coleta de dados

1. Garanta a disponibilidade de todos os equipamentos necessários: certifique-se de que o hardware recomendado para executar o DLC tenha pelo menos 8 GB de memória. Consulte a Tabela de Materiais para obter informações relacionadas a hardware e software.
   NOTA: Os dados podem ser coletados em qualquer formato, mas devem ser convertidos para um formato legível pelo DLC antes da análise. Os formatos mais comuns são AVI e MP4.
2. Configure pelo menos uma câmera para que um olho de um animal possa ser detectado. Se ambos os olhos estiverem visíveis, execute uma filtragem adicional, pois isso pode causar interferência no rastreamento. Consulte a seção 10 para obter um exemplo dessa filtragem para os dados fornecidos aqui.
3. Instale o DLC usando o pacote encontrado em Deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.
4. Na configuração da câmera, inclua uma única câmera em um ângulo lateral (~90°) em relação ao mouse. Para seguir este exemplo, faça uma amostra a 10 Hz, com os camundongos contidos, mas livres para acessar toda a sua gama de movimentos da cabeça em relação ao corpo. Mantenha entre 2 e 4 polegadas da câmera para o animal.

2. Configurando o DLC

1. Depois de instalar o DLC, crie o ambiente para trabalhar. Para fazer isso, navegue até a pasta onde o software DLC foi baixado usando o diretório de alterações com o seguinte comando.
   cd folder_name
   NOTA: Este será o local onde o arquivo DEEPLABCUT.yaml está localizado.
2. Execute o primeiro comando para criar o ambiente e habilite-o digitando o segundo comando.
   conda env create -f DEEPLABCUT.yaml
   conda ativar o Deeplabcut
   NOTA: Certifique-se de que o ambiente esteja ativado antes de cada uso do DLC.
   Depois de ativar o ambiente, abra a interface gráfica do usuário (GUI) com o seguinte comando e comece a criar o modelo.
   python -m deeplabcut

3. Crie o modelo

1. Depois que a GUI for aberta, comece a criar um modelo clicando em Criar novo projeto na parte inferior.
2. Nomeie o projeto como algo significativo e exclusivo para identificá-lo mais tarde e insira um nome como experimentador. Verifique a seção Localização para ver onde o projeto será salvo.
3. Selecione Procurar pastas e encontre os vídeos para treinar o modelo. Selecione Copiar vídeos para a pasta do projeto se os vídeos não forem movidos de seu diretório original.
4. Selecione Criar para gerar um novo projeto no computador.
   NOTA: Os vídeos devem cobrir toda a gama do comportamento que você observará (ou seja, apertar os olhos, não apertar os olhos e todos os comportamentos intermediários). O modelo só será capaz de reconhecer um comportamento semelhante ao dos dados de treinamento e, se alguns componentes do comportamento estiverem ausentes, o modelo poderá ter problemas para reconhecê-lo.

4. Defina as configurações

NOTA: É aqui que detalhes como quais pontos rastrear, quantos quadros extrair de cada vídeo de treinamento, tamanho de ponto de rotulagem padrão e variáveis relacionadas a como o modelo será treinado podem ser definidos.

1. Depois de criar o modelo, edite as definições de configuração selecionando Editar config.yaml. Selecione editar para abrir o arquivo de definições de configuração para especificar as principais configurações relacionadas ao modelo.
2. Modifique as partes do corpo para incluir todas as partes do olho a serem rastreadas e, em seguida, modifique numframes2pick para o número de quadros necessários por vídeo de treinamento para obter 400 quadros no total. Por fim, altere o tamanho do ponto para seis para que o tamanho padrão ao rotular seja pequeno o suficiente para ser colocado com precisão nas bordas do olho.

5. Extraia quadros de treinamento

1. Após a configuração, navegue até a guia Extrair quadros na parte superior da GUI e selecione Extrair quadros no canto inferior direito da página.
2. Monitore o progresso usando a barra de carregamento na parte inferior da GUI.

6. Rotule os quadros de treinamento

1. Navegue até a guia Quadros de rótulo na GUI e selecione Quadros de rótulo. Encontre a nova janela que mostra as pastas de cada um dos vídeos de treinamento selecionados. Selecione a primeira pasta e uma nova GUI de rotulagem será aberta.
2. Rotule os pontos definidos durante a configuração para cada quadro do vídeo selecionado. Depois que todos os quadros forem rotulados, salve-os e repita o processo para o próximo vídeo.
3. Para uma rotulagem adequada do estrabismo, use dois pontos o mais próximo possível do maior pico do olho (centro) e indique as posições para cima/para baixo para cada ponto. Estrabismo aproximado como a média desses dois comprimentos.
   NOTA: Ao rotular, o DLC não salva automaticamente o progresso. Recomenda-se salvar periodicamente para evitar a perda de dados rotulados.

7. Criar um conjunto de dados de treinamento

1. Depois de rotular manualmente, navegue até a guia Treinar rede e selecione Treinar rede para solicitar que o software comece a treinar o modelo.
2. Monitore o progresso na janela de comando.

8. Avalie a rede

1. Após a conclusão do treinamento de rede, navegue até a guia Avaliar rede e selecione Avaliar rede. Aguarde alguns instantes até que o círculo de carregamento azul desapareça, indicando que ele terminou de se autoavaliar e o modelo está pronto para uso.

9. Analise dados/gere vídeos rotulados

1. Para analisar vídeos, navegue até a guia Analisar vídeos . Selecione Adicionar mais vídeos e selecione os vídeos a serem analisados.
2. Selecione Salvar resultado(s) como csv se uma saída csv dos dados for suficiente.
3. Quando todos os vídeos tiverem sido adquiridos, selecione Analisar vídeos na parte inferior para iniciar a análise dos vídeos.
   NOTA: Esta etapa deve ser concluída antes de gerar vídeos rotulados na etapa 9.5
4. Depois que os vídeos forem analisados, navegue até a guia Criar vídeos e selecione os vídeos analisados.
5. Selecione Criar vídeos e o software começará a gerar vídeos rotulados que representam os dados mostrados no .csv correspondente.

10. Processar dados finais

1. Aplique as macros encontradas em https://research-git.uiowa.edu/rainbo-hultman/facial-grimace-dlc para converter dados brutos no formato usado para esta análise (ou seja, distância euclidiana).
2. Importe e aplique macros rotuladas como Etapa 1 e Etapa 2 ao csv para filtrar todos os pontos de dados abaixo do ideal e converter os dados em uma distância euclidiana média para os pontos mais centrais na parte superior e inferior do olho.
3. Execute a macro chamada Step3 para marcar cada ponto como 0 sem estrabismo e 1 estrabismo com base no valor limite no script, que é definido em 75 pixels.
   NOTA: Os parâmetros para essas macros podem exigir ajustes dependendo da configuração experimental (consulte a discussão). O limite para estrabismo e o filtro automático para o valor máximo do olho são parâmetros que podem ser alterados dependendo do tamanho do animal e da distância da câmera. Você também pode ajustar os valores usados para remover pontos abaixo do ideal, dependendo de quão seletivamente os dados devem ser filtrados.

Results

Aqui, fornecemos um método para a detecção confiável de estrabismo em alta resolução temporal usando o DeepLabCut. Otimizamos os parâmetros de treinamento e fornecemos uma avaliação dos pontos fortes e fracos desse método (Figura 1).

Após o treinamento de nossos modelos, verificamos que eles foram capazes de estimar corretamente os pontos superior e inferior da pálpebra (Figura 2), que servem como pontos de coordenadas para a medida da distância euclidiana. A distância euclidiana é definida como os comprimentos médios das distâncias entre os dois pontos superior e inferior do olho. Nosso modelo foi capaz de detectar casos de não estrabismo (Figura 2A) e estrabismo (Figura 2B). Os pontos azuis indicam pontos usados para determinar a distância euclidiana para cada quadro. Os pontos verdes, amarelos, laranja e roxos foram usados para ajudar o modelo a estimar corretamente a distância euclidiana e diminuir o valor de probabilidade quando a cabeça está em uma posição abaixo do ideal (ou seja, contabilizando o movimento da cabeça e as mudanças de posição entre as sessões). Em seguida, validamos a precisão do modelo usando vários métodos diferentes.

Para validar o número ideal de quadros usados para o modelo, treinamos e testamos quatro modelos de tamanhos de quadro de amostra variados (Figura 3). Primeiro, comparamos os valores de erro quadrático médio (RMSE) entre os dados de teste e treinamento para validar o quão bem os modelos poderiam prever com precisão os dados de teste nos quais não haviam sido treinados. Essa comparação mostrou que a variabilidade entre os pontos rotulados manualmente e os pontos rotulados pelo modelo se estabilizou após 300 quadros. Essa tendência se correlacionou com as médias relatadas de probabilidade que também pareceram se estabilizar após 300 quadros rotulados. Usamos esses valores de verossimilhança relatados para filtrar pontos inferiores a 0,92. Esses valores de probabilidade indicam o quão confiante o modelo está de que um determinado ponto foi rotulado corretamente com base nos dados de treinamento. Calculamos a média desses valores para os pontos que contribuem para a métrica de distância euclidiana para examinar o desempenho dos modelos em relação uns aos outros. Embora não tenha havido diferença significativa entre 300 e 400 quadros, usamos 400 quadros porque a média ficou acima do valor de probabilidade de 0,95, que está se aproximando do nosso limite para filtragem manual e se alinha com o limite utilizado em modelos semelhantes para estimativa de pose¹⁶.

Outra maneira de validar a precisão do modelo foi com uma matriz de confusão comparando quadros anotados manualmente com quadros rotulados de DLC. Dois indivíduos cegos anotaram manualmente 300 quadros do mesmo olho em oito vídeos. Usamos esses dados para construir uma matriz de confusão para avaliar verdadeiros e falsos positivos e negativos (Figura 4), onde os dados pontuados manualmente foram usados como a verdade fundamental. Para DLC, um valor positivo de estrabismo foi registrado quando a distância euclidiana foi registrada como inferior a 75 pixels (ou seja, o animal aperta os olhos), e um valor negativo foi registrado para valores maiores que 75 pixels (ou seja, o animal não aperta os olhos). Encontramos um valor preditivo positivo de 96,96%, que é a porcentagem de tempo em que o modelo prevê com precisão o estrabismo em relação a um estrabismo anotado manualmente. Encontramos um valor preditivo negativo de 99,66%, que é a porcentagem de tempo em que o modelo prevê com precisão nenhum estrabismo em relação ao estrabismo anotado manualmente. Eles mostram a proporção de valores negativos e positivos que foram rotulados corretamente. Também encontramos uma taxa de verdadeiros positivos de 98,1% e uma taxa de verdadeiros negativos de 99,46%, que representam a previsão precisa do modelo de valores positivos e negativos em relação a todos os valores positivos e negativos, respectivamente. Nosso coeficiente de correlação de Matthews, ou CCM, foi de 93,8%, indicando o coeficiente de correlação entre os valores observados e previstos.

Uma vez que estávamos confiantes de que nosso modelo rastreia o estrabismo de forma confiável, comparamos esse método DLC com um método de rastreamento de estrabismo publicado anteriormente usando um conjunto de dados pré-clínicos de enxaqueca¹⁴. Vamos nos referir a esse outro método como o "modelo de estrabismo de área (ASM)" porque foi desenvolvido usando a área de olho aberto como a variável contínua de medição de estrabismo¹⁴. O modelo de estrabismo de área utiliza software de detecção facial treinado combinado com um script MATLAB personalizado para analisar a área média de pixels do olho, excluindo quadros com uma taxa de erro de rastreamento de >15%¹⁴. Uma grande limitação é que o "ASM" não é de código aberto e, portanto, não é amplamente acessível. O DLC permite maior otimização e adaptabilidade sem exigir uma compra significativa de software e hardware.

Usamos um conjunto de dados de 10 camundongos CD1 fêmeas e 10 machos. Experimentalmente, todos os animais foram aclimatados em restrições suaves por 30 min durante um total de 3 dias antes do início das gravações. Cada animal foi registrado por 5 min de linha de base e depois 5 min para gravações de tratamento. Durante as sessões de tratamento, os animais foram tratados com PBS (veículo) ou 0,1 mg / kg CGRP (tratamento) por via intraperitoneal para induzir um estado semelhante à enxaqueca. Os dados foram coletados em uma sala bem iluminada usando câmeras equipadas com luz infravermelha para iluminar o rosto, garantindo a detecção precisa de pontos de referência. A câmera infravermelha incluía uma lente Kowa LM35JC 2/3" 35 mm F1.6 manual iris C-mount com uma distância focal de 254 mm e uma abertura apropriadamente ajustada. Após a coleta dos dados, utilizamos o ASM e o DLC para analisar os dados. Como a pontuação manual tem sido convencionalmente utilizada no campo para quantificar a careta facial, com o estrabismo sendo um componente da careta facial¹⁴, também comparamos nossos dados com os dados pontuados manualmente.

Com base em descobertas anteriores de que a injeção periférica de CGRP induz uma resposta estrábica em camundongos, esperávamos observar diferenças significativas na resposta estrabística entre o veículo e o tratamento com CGRP ^6,14. Comparamos os métodos ASM, manual e DLC e descobrimos que nosso modelo detectou de forma robusta um fenótipo estrábico, assim como os métodos manual e ASM (Figura 5). É importante notar que o modelo ASM foi usado para avaliar a dor e o estrabismo induzidos por CGRP. Nesse estudo, Rea et al. compararam a resposta estrabística após CGRP com a resposta estrabismo após injeção de formalina na pata traseira como um ensaio de indução de dor "mais tradicional"¹⁴. Além disso, o CGRP está bem documentado como indutor de hipersensibilidade ao toque em camundongos através do uso de von Frey ^3,17. Consistente com o campo, normalizamos o estrabismo médio durante a sessão de tratamento para uma linha de base pré-tratamento de 5 minutos para cada animal e comparamos PBS (n = 10) versus animais tratados com CGRP (n = 11). As análises estatísticas dos grupos tratados com PBS versus CGRP são as seguintes. Descobrimos que os animais tratados com CGRP exibiram diminuição da área média de pixels usando o método de rastreamento de estrabismo de área (p = 0,012, Figura 5A) e exibiram diminuição da distância euclidiana quando pontuados manualmente (p = 0,0007, Figura 5B) e usando nosso modelo DLC (p = 0,007, Figura 5C). Quando comparamos cada método ao longo do tempo em um único animal representativo, o mesmo padrão foi observado (Figura 5). Este animal mostrou um fenótipo de estrabismo muito claro em resposta ao tratamento com CGRP, mas não ao PBS. Todos os modelos foram capazes de detectar essas diferenças, mas os dados foram mais claramente representados em nosso modelo DLC (Figura 5). Métricas precisas e exatas são especialmente importantes quando os dados devem ser analisados em resoluções mais finas, onde a média não é indicativa da leitura comportamental completa (por exemplo, atividade cerebral). O método DLC de detecção de estrabismo em camundongos nos permite coletar dados em uma escala de tempo de milissegundos e bloqueá-los em medidas de atividade cerebral (por exemplo, potenciais de campo locais), que ocorrem em uma escala de tempo de milissegundos. Podemos então utilizar essa técnica para construir um perfil mais robusto de um estado cerebral indicativo de dor espontânea no contexto de enxaqueca e outros distúrbios cerebrais complexos.

Figura 1: Visão geral do procedimento para gerar uma rede treinada com DLC. Esquema geral do processo pelo qual as características oculares de um animal são rastreadas e analisadas usando aprendizado de máquina. Abreviatura: DLC = DeepLabCut. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplo de rastreamento automatizado de estrabismo em um camundongo CD1 representativo. (A) Exemplo de um quadro mostrando DLC rastreando estrabismo (pontos coloridos) no contorno do olho durante o dia de tratamento quando o mouse não está apertando os olhos. (B) Exemplo de um quadro mostrando a detecção automatizada de estrabismo no dia do tratamento, usando nosso modelo DLC. A distância euclidiana foi medida usando a distância média entre B e C, os pontos azuis, na parte superior e inferior do olho. Os conjuntos azuis de pontos na parte superior e inferior do olho são usados ao rastrear a distância euclidiana. Os outros pontos (verde, amarelo, laranja, roxo) são pontos de referência de enquadramento usados para ajudar o modelo a estimar os pontos de distância euclidianos e filtrar o posicionamento da cabeça abaixo do ideal após a coleta de dados. Abreviatura: DLC = DeepLabCut. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Justificativa para o número de quadros usados para treinar o modelo. (A) A análise de erro quadrático médio indica a distância média entre os valores previstos e observados para conjuntos de dados de teste e trem. O conjunto de dados de treinamento representa os quadros amostrados ao treinar o modelo, e o conjunto de dados de teste representa os quadros não relacionados ao treinamento usados para validar o quão bem o modelo pode identificar imagens semelhantes, mas diferentes. Usamos cinco conjuntos de dados de treinamento e teste e descobrimos que os valores de RMSE se estabilizaram em torno de 300 quadros para o grupo de teste. (B) A probabilidade de um determinado ponto ser rotulado corretamente (média + SEM). Isso mostrou que 400 quadros rotulados manualmente eram ideais porque os conjuntos de dados brutos tinham uma média de probabilidade acima de 0,95, embora tivessem uma pontuação RMSE mais próxima da dos dados de treinamento. Isso significava que o modelo era capaz de aproximar os pontos em que havia sido treinado, ao mesmo tempo em que relatava a maioria dos quadros com alta probabilidade. Abreviação: RMSE = raiz quadrada média do erro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Matriz de confusão para medições de estrabismo DLC. Amostramos 300 s de oito vídeos (cinco CGRP e três PBS) e comparamos esses pontos com uma pontuação binária de sim ou não rotulada manualmente para estrabismo. Quantificamos os valores previstos como aqueles identificados pelo DLC e os valores reais como aqueles pontuados manualmente por um humano. Em seguida, comparamos isso com os dados pontuados manualmente para ver com que frequência o estrabismo foi identificado corretamente em relação ao binário sim ou não pontuado manualmente do estrabismo. Abreviaturas: DLC = DeepLabCut; CGRP = peptídeo relacionado ao gene da calcitonina; PBS = solução salina tamponada com fosfato; TP = verdadeiros positivos; FP = falsos positivos; FN = falsos negativos; TN = verdadeiros negativos; VPP = valor preditivo positivo; VPN = valor preditivo negativo; TPR = taxa de verdadeiros positivos; TNR = taxa negativa verdadeira; CCM = coeficiente de correlação de Mateus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Fenótipo de estrabismo em três modelos diferentes para detectar estrabismo. As duas primeiras linhas contêm o mesmo animal representativo com cada condição (PBS ou CGRP) em três modelos diferentes para detectar estrabismo. A linha inferior reflete as médias de todos os animais. (A) Houve uma diminuição na área média de pixels (área média geral de pixels / linha de base) em camundongos tratados com CGRP versus tratados com PBS (t (18) = 2,805, p = 0,012) após o processamento de todos os dados usando o modelo de estrabismo de área publicado e validado anteriormente¹⁴. (B) Houve uma resposta semelhante nos dados pontuados manualmente (t(18) = 4,064, p = 0,0007). (C) Os camundongos tratados com CGRP mostraram diminuição da distância média pálpebra a pálpebra (distância euclidiana do tratamento / distância euclidiana pré-tratamento, linha de base) do que os camundongos tratados com PBS (t (18) = 3,040, p = 0,007 ao utilizar DLC para processar todos os dados. N = 20 (10 fêmeas, 10 machos). As barras de erro indicam ± SEM médio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo fornece um método aprofundado e facilmente acessível para o uso de ferramentas baseadas em aprendizado de máquina que podem diferenciar o estrabismo com precisão quase humana, mantendo a mesma (ou melhor) resolução temporal das abordagens anteriores. Principalmente, torna a avaliação do estrabismo automatizado mais prontamente disponível para um público mais amplo. Nosso novo método para avaliar o estrabismo automatizado tem várias melhorias em comparação com os modelos anteriores. Primeiro, ele fornece uma métrica mais robusta do que o ASM, utilizando menos pontos que realmente contribuem para a quantificação do estrabismo. Isso diminui a probabilidade de falsos positivos e negativos, fazendo com que a análise dependa de menos pontos ao gerar os valores que denotam estrabismo. Em outras palavras, o modelo DLC torna cada ponto ao redor do olho necessário, mas não suficiente para a inclusão de um ponto no tempo. Isso nos permite filtrar dados abaixo do ideal usando o mesmo número de pontos que o ASM sem ter que depender da maior variabilidade que vem de confiar em tantos pontos constituintes. Além disso, reduzimos o erro humano potencial projetando modelos que não dependem totalmente da precisão de indivíduos treinados.

Ao processar os dados, descobrimos que nosso método filtrou com precisão pontos abaixo do ideal e pontos discrepantes maiores do que o possível, dado o tamanho máximo do olho do mouse (seção 10 do protocolo). Utilizamos macros que verificaram se cada um dos 10 pontos ao redor do olho individualmente tinham um valor de verossimilhança maior que 0,92 e filtramos qualquer um abaixo desse valor. No futuro, isso pode ser ajustado para tornar os dados processados mais ou menos seletivos. As macros também filtraram quaisquer valores de distância euclidiana maiores que 200 pixels, pois descobrimos que a maior distância possível entre a parte superior e inferior do olho era de 150 pixels. Isso pode precisar mudar dependendo da configuração experimental. Se a câmera não estiver à mesma distância do olho, o valor máximo pode ser significativamente maior ou menor. A força dessas macros é que elas nos permitiram extrair medições entre a parte superior e inferior do olho de uma forma que dependia do modelo relatar uma maior probabilidade para todos os pontos constituintes ao redor do olho.

O DLC e o ASM são limitados, pois dependem do mouse para estar em uma posição fixa a uma distância predeterminada da câmera para permitir uma escala de ampliação consistente entre as condições de linha de base e de tratamento. Assim, o movimento do próprio animal, o posicionamento incorreto dentro do aparelho ou uma mudança no procedimento experimental comprometeriam a capacidade do modelo de detectar a área total do olho. Nosso modelo melhora um pouco essas limitações utilizando a distância euclidiana, ou seja, a distância para cima e para baixo do comprimento do olho, que permite um rastreamento aprimorado, apesar das diferenças nos ângulos da câmera, movimento do animal e variação experimental em diferentes sessões sem exigir recalibração adicional. No entanto, reconhecemos que melhorias na normalização para levar em conta o movimento da cabeça podem resultar em um rastreamento ainda melhor do estrabismo em animais em movimento.

Outra limitação do nosso método é que ele filtrou pontos onde a distância euclidiana se aproximava de zero, denotando o fechamento do olho. Apesar de filtrar esses contribuintes significativos para o estrabismo, ainda fomos capazes de detectar uma resposta de estrabismo induzida por CGRP de forma mais robusta do que os métodos anteriores (p = 0,007). A remoção desse componente do estrabismo torna-se especialmente limitante ao tentar comparar com pontos de interesse adicionais, como a atividade cerebral. Achamos que encontrar significado ao remover esses pontos mostra a robustez desse método, mas reconhecemos que remover esses componentes do estrabismo não é o ideal. Estudos futuros utilizando esse método devem incluir um número maior de quadros discrepantes para treinar melhor os modelos no reconhecimento do estrabismo à medida que se aproxima de zero. No geral, o desenvolvimento de um método para rastrear de forma confiável o estrabismo automatizado pode permitir estudos destinados a associar características importantes do comportamento natural ao seu estado cerebral, permitindo uma investigação robusta dos perfis de atividade cerebral, como no contexto da enxaqueca.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de ferramentas CUDA 11.8
cuDNN SDK 8.6.0
Computadores Intel com Windows 11, 13ª geração
Módulo adicional LabFaceX 2D Eyelid Tracker para um mouse de roaming gratuito:	FaceX LLC	NA	Qualquer câmera que possa gravar o olho de um animal é suficiente, mas este é o nosso hardware de rastreamento ocular.
Driver de GPU NVIDIA versão 450.80.02 ou superior
NVIDIA RTX A5500, 24 GB DDR6	NVIDIA[	490-BHXV]	Qualquer GPU que atenda aos requisitos mínimos especificados para sua versão de DLC, atualmente 8 GB, é suficiente. Usamos NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti GPU
Python 3.9-3.11
TensorFlow versão 2.10