Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O

Resumo

Aqui, apresentamos o ensaio de deslocamento térmico, uma técnica baseada em fluorescência de alto rendimento usada para investigar a ligação de pequenas moléculas a proteínas de interesse.

Resumo

Definir a importância biológica de proteínas com funções desconhecidas representa um obstáculo significativo na compreensão dos processos celulares. Embora as previsões bioinformáticas e estruturais tenham contribuído para o estudo de proteínas desconhecidas, as validações experimentais in vitro são frequentemente dificultadas pelas condições ideais e cofatores necessários para a atividade bioquímica. A ligação ao cofator não é apenas essencial para a atividade de algumas enzimas, mas também pode aumentar a estabilidade térmica da proteína. Uma aplicação prática desse fenômeno reside na utilização da mudança na estabilidade térmica, medida por alterações na temperatura de fusão da proteína, para sondar a ligação do ligante.

O ensaio de deslocamento térmico (TSA) pode ser usado para analisar a ligação de diferentes ligantes à proteína de interesse ou encontrar uma condição estabilizadora para realizar experimentos como cristalografia de raios-X. Aqui, descreveremos um protocolo para TSA utilizando a pseudoquinase, Selenoproteína O (SelO), para um método simples e de alto rendimento para testar a ligação de metais e nucleotídeos. Em contraste com as quinases canônicas, o SelO se liga ao ATP em uma orientação invertida para catalisar a transferência de AMP para as cadeias laterais de hidroxila das proteínas em uma modificação pós-traducional conhecida como AMPilação da proteína. Ao alavancar a mudança nas temperaturas de fusão, fornecemos informações cruciais sobre as interações moleculares subjacentes à função do SelO.

Introdução

Grande parte do proteoma humano permanece mal caracterizado. O "efeito de iluminação pública" descrito por Dunham e Kustatscher et al. refere-se ao fenômeno em que proteínas extensivamente pesquisadas recebem mais atenção, deixando as proteínas pouco estudadas negligenciadas ^1,2. Os fatores que contribuem para esse efeito incluem a importância biológica e a relevância da doença de certas proteínas. Além disso, pesquisas prévias que oferecem conhecimento fundamental, bem como a disponibilidade de ferramentas para análise funcional, estimulam ainda mais a pesquisa sobre proteínas altamente estudadas ^1,2. Projetos como a Iniciativa de Proteínas Pouco Estudadas, o Consórcio de Genômica Estrutural e a Iniciativa de Função Enzimática visam caracterizar proteínas pouco estudadas usando proteômica estrutural e funcional ^2,3,4. Uma abordagem complementar para identificar as funções moleculares de proteínas pouco estudadas é examinar as interações dessas proteínas com pequenas moléculas para obter informações valiosas sobre a regulação e a especificidade do substrato.

A ligação de pequenas moléculas pode aumentar a estabilidade térmica de uma proteína⁵. Esse fenômeno, conhecido como estabilização de conformação induzida por ligante, geralmente resulta em um aumento na temperatura de fusão de uma proteína, fornecendo uma indicação mensurável de ligação ao ligante⁶. A estabilidade térmica de uma proteína pode ser medida usando Fluorimetria de Varredura Diferencial (DSF), também conhecida como Thermofluor, ou Thermal Shift Assay (TSA)7,8,9,10. No TSA, uma amostra de proteína é submetida a temperaturas crescentes na presença de um corante ambientalmente sensível⁶. À medida que a proteína se desdobra e se desnatura, o corante se liga às regiões hidrofóbicas expostas da proteína e emite fluorescência. Os corantes fluorescentes extrínsecos, ou corantes ambientalmente sensíveis, carecem de fluorescência intrínseca e, em vez disso, fluorescem ao interagir com sua molécula-alvo ^9,11,12. O corante mais comumente usado, SYPRO Orange, oferece várias vantagens, como maior estabilidade e fluorescência de fundo mínima ^8,9,12. Notavelmente, o SYPRO Orange é compatível com sistemas de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) devido aos seus comprimentos de onda de excitação e emissão em torno de 470 nm e 570 nm, respectivamente. Esse recurso exclusivo permite medições de alto rendimento, precisas e sensíveis que são compatíveis com os sistemas de detecção de fluorescência comumente usados em sistemas RT-PCR⁸.

O TSA é uma ferramenta versátil para investigar interações proteicas com potenciais cofatores ou drogas e para identificar condições estabilizadoras para cristalografia. Algumas de suas vantagens sobre outros métodos de triagem são sua relativa simplicidade de configuração e alto rendimento com placas de 96 ou 384 poços 13,14,15. O desenvolvimento dessa técnica tem sido transformador para estudos de descoberta de fármacos, oferecendo conveniência e possibilitando o estudo de diversos aditivos, como íons, ligantes e fármacos ^6,16. Além disso, a adaptabilidade do TSA encorajou os cientistas a expandir sua utilidade, facilitando a medição das afinidades de ligação ao lado dos ensaios de triagem^17,18. A TSA é uma ferramenta eficaz em estudos de biologia estrutural para identificar condições que promovam a estabilização da proteína de interesse para cristalização¹⁹. Assim, sua flexibilidade e relativa facilidade posicionaram a TSA como uma técnica fundamental na caracterização de proteínas. Aqui, usaremos TSA para analisar a ligação de metais e nucleotídeos à pseudoquinase pouco estudada, Selenoproteína O (SelO), como exemplo.

As quinases são uma das famílias de proteínas mais visadas na descoberta de medicamentos²⁰. Prevê-se que aproximadamente 10% das quinases humanas sejam inativas e denominadas pseudoquinases porque não possuem os principais resíduos catalíticos necessários para a catálise^21,22. A selenoproteína O (SelO) é uma pseudoquinase evolutivamente conservada que não possui o aspartato conservado no motivo catalítico HRD²³. Em eucariotos, o SelO localiza-se nas mitocôndrias e protege as células do estresse oxidativo^24,25. Análises estruturais e bioquímicas mostram que o SelO transfere monofosfato de adenosina (AMP) do ATP para substratos proteicos em uma modificação pós-traducional conhecida como AMPilação²⁵. Estudos recentes indicam que enzimas que catalisam a AMPilação podem se ligar a nucleotídeos alternativos, como UTP in vitro^26,27. Notavelmente, estudos demonstraram que o homólogo SelO de Salmonella typhimurium catalisa a proteína UMPilação, ou a transferência de UMP, de maneira dependente de manganês²⁸. Dadas essas observações intrigantes, testamos a ligação de SelO a ATP e UTP na presença de magnésio e manganês, servindo como um exemplo representativo das aplicações da TSA. O protocolo a seguir pode ser prontamente adaptado para otimizar e examinar as interações de outras proteínas e aditivos de interesse.

Protocolo

1. Configuração experimental

1. Use um termociclador que possa detectar fluorescência, como um instrumento RT-PCR, para executar o protocolo descrito. Se estiver usando o SYPRO Orange, conforme descrito neste protocolo, use um modo de varredura que permita excitação em torno de 470 nm e detecção de emissão em torno de 570 nm. Programe o termociclador para manter a amostra a 20 °C por 2 min, seguido de um aumento de temperatura de 0,5 °C/1 min até 95 °C; medir a intensidade da fluorescência a cada 1 °C.
   NOTA: Recomendamos uma etapa opcional no final do ciclo para retornar o sample bloco a 20 °C (Figura 1).
2. Cada reação contém quatro componentes: tampão, proteína de interesse, aditivo e corante fluorescente extrínseco. Projete o experimento para incluir controles como nenhuma proteína, nenhum corante, proteína sem aditivos e aditivos sozinhos para determinar qualquer fluorescência de fundo que possa influenciar a interpretação dos resultados. Se disponível, inclua um controle positivo, como um aditivo conhecido por ligar e estabilizar a proteína de interesse.
3. Use proteína purificada para o ensaio. Para seguir este exemplo, use E. coli SelO, expressa e purificada conforme descrito anteriormente^25,29. Resumidamente, expresse His-sumo marcado com SelO (E. coli SelO ppSumo) em células Rosetta DE3 e purifique-o usando afinidade Ni²⁺-NTA. Corte a etiqueta His-sumo usando protease Ulp e purifique ainda mais o SelO por cromatografia de filtração em gel.
4. A fluorescência do SYPRO Orange dependerá de sua interação com a proteína de interesse. Como essas interações variam de proteína para proteína, otimize a concentração de proteína e corante para obter o máximo de sinal para ruído do sinal de fluorescência.
   NOTA: SYPRO Orange não é compatível com algumas proteínas e aditivos como detergentes^11,30. Podem ser rastreados corantes extrínsecos adicionais enumerados no ^{ponto 12}, se necessário.

2. Determinação da concentração ideal de corante (Figura 2A)

1. Prepare diluições de 20 μL de 50x, 40x, 30x, 20x e 10x SYPRO Orange a partir da solução estoque, que é fornecida a 5.000x em DMSO.
2. Dispense 8 μL de proteína 6,25 μM diluída em tampão TSA em seis poços separados de uma placa de PCR de 384 poços.
   NOTA: Em nosso exemplo, usamos o seguinte tampão TSA para realizar as diluições: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl e 1 mM DTT. As amostras podem ser executadas em triplicata para melhorar a confiabilidade dos resultados.
3. Adicione 1 μL de tampão TSA a cada poço.
   NOTA: Este volume de tampão será substituído pela adição de pequenas moléculas após a otimização da concentração de corante e proteína.
4. Adicione 1 μL de cada diluição em série da solução de corante SYPRO Orange a cada poço. Adicione 1 μL de tampão sem corante ao poço final para o controle sem corante.
5. Cubra a placa com filme adesivo opticamente transparente.
6. Gire brevemente a placa a 1.000 × g por 1 min em uma centrífuga equipada com um adaptador de placa PCR.
7. Coloque a placa em uma máquina de RT-PCR e inicie o protocolo de termociclagem descrito na etapa 1.1.

3. Determinação da concentração ideal de proteínas (Figura 2B)

1. Prepare 20 μL de diluições seriadas de 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM e 1,56 μM de proteína usando tampão TSA (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl e 1 mM DTT).
2. Dispense 8 μL de diluições seriais da proteína em cinco poços separados de uma placa de 384 poços.
3. Dispense o tampão apenas no^6º poço como um controle sem proteína.
4. Adicione 1 μL de tampão TSA a cada poço.
   NOTA: Este volume de tampão será substituído pela adição de pequenas moléculas após a otimização da concentração de corante e proteína.
5. Adicione 1 μL de cada solução de corante 50x SYPRO Orange a cada poço.
6. Cubra a placa com filme adesivo opticamente transparente.
7. Gire brevemente a placa a 1.000 × g por 1 min em uma centrífuga equipada com um adaptador de placa PCR.
8. Coloque a placa em uma máquina de RT-PCR e inicie o protocolo de termociclagem descrito na etapa 1.1.

4. Configurando um experimento TSA (Figura 3A)

NOTA: Após a otimização das concentrações de proteína e corante SYPRO Orange, o ensaio pode ser realizado com a adição das pequenas moléculas desejadas para analisar a ligação.

1. Defina o número de condições considerando as réplicas e os controles adequados.
   NOTA: Por exemplo, testaremos a ligação de SelO a oito condições em triplicado. Incluindo os controles (sem aditivo, sem proteína e sem corante), temos 11 reações x 3 (triplicado) = 33 reações totais.
2. Com base na concentração ideal de proteína e corante observada para SelO, certifique-se de que cada reação contenha 8 μL de proteína 6,25 μM, 1 μL de aditivo e 1 μL de corante 50x SYPRO Orange para um total de 10 μL de volume de reação. Assim, a concentração final utilizada é de 5 μM de proteína e 5x corante SYPRO Orange.
3. Preparar 288 μL de solução proteica 6,25 μM utilizando tampão TSA. Este volume de solução de trabalho de proteína é responsável por 36 reações (33 reações com um adicional de 10% para variações na pipetagem).
4. Dispense 8 μL de proteína de 6,25 μM em poços separados de uma placa de 384 poços. Dispense o tampão apenas para o controle sem proteína.
5. Adicione 1 μL de moléculas pequenas na concentração de 10x para obter 1x final. Para seguir este exemplo, adicione 1 μL de 20 mM MgCl₂ para atingir uma concentração final de 2 mM. Dispense o tampão apenas para o controle sem aditivo.
6. Adicione 1 μL de cada solução de corante 50x SYPRO Orange a cada poço.
7. Cubra a placa com filme adesivo opticamente transparente.
8. Gire brevemente a placa a 1.000 × g por 1 min em uma centrífuga equipada com um adaptador de placa PCR.
9. Coloque a placa em uma máquina de RT-PCR e inicie o protocolo de termociclagem descrito na etapa 1.1.

5. Análise dos dados

1. Exporte dados da máquina RT-PCR para unidades de fluorescência relativa (RFU) em relação à temperatura (°C).
2. Use o software de sua escolha para extrair e plotar pontos de dados até a intensidade mais alta medida para cada curva de fusão. É importante ressaltar que confirme que os controles sem proteína e sem corante exibem baixa fluorescência de fundo sem aumentos de fluorescência dependentes da temperatura (Figura 3A, B e Tabela Suplementar S1). Realize a análise de dados usando software de acesso gratuito, como MoltenProt³¹ ou DSFWorld³².
3. Determine a temperatura de fusão usando o Boltzmann Sigmoidal Fit para os dados. A temperatura de fusão (T_m) é definida como a temperatura na qual 50% de desnaturação ou metade da intensidade máxima é observada (Figura 3C).
4. Uma mudança térmica na curva de fusão pode sugerir aditivos estabilizadores ou desestabilizadores. Para calcular a mudança da temperatura de fusão (T_m), use a fórmula: T_m = T_m aditivo_- T_m buffer. Um valor positivo descreve uma condição estabilizadora ou aditivo interativo; um valor negativo descreve uma condição desestabilizadora (Figura 3D).

Resultados

O SelO eucariótico consiste em uma sequência de direcionamento mitocondrial N-terminal, um domínio semelhante à quinase e uma selenocisteína altamente conservada no terminal C da proteína²³. Esta enzima residente mitocondrial codifica um domínio pseudoquinase que é conservado de bactérias para humanos²³. A análise estrutural do homólogo SelO de Pseudomonas syringae revelou alterações de aminoácidos no sítio ativo que facilitam a ligação do ATP em orientação invertida em comparação com as quinases canônicas²⁵. Assim, o SelO catalisa a AMPilação, em vez da fosforilação, de várias proteínas envolvidas na sinalização antioxidante para proteger as células do dano oxidativo e da morte celular²⁵. Além da AMPilação, algumas AMPilases procarióticas e eucarióticas demonstraram catalisar a UMPilação^27,28.

Usamos E. coli recombinante purificada SelO em TSA para examinar a ligação de nucleotídeos ATP e UTP a SelO na presença de cátions divalentes. Semelhante às quinases canônicas, SelO abriga o motivo DFG no qual o aspartato se liga ao íon metálico para coordenar o nucleotídeo no sítio ativo. Primeiro, otimizamos a concentração de proteína e corante para medições robustas de fluorescência em TSA, determinando que 5 μM a 10 μM de E. coli SelO era ideal com 5x SYPRO Orange (Figura 2). Além disso, mostramos que a proteína no, assim como os controles sem corante, tinham baixo sinal de fluorescência que não respondia ao aumento da temperatura. Detectamos aumentos de aproximadamente +4 °C e +12 °C na estabilidade térmica de E. coli SelO na presença de ATP-Mg²⁺ e ATP-Mn²⁺, respectivamente (Figura 3). No entanto, não observamos uma mudança na estabilidade térmica após a incubação com UTP, indicando que E. coli SelO pode não exibir ligação detectável ao UTP.

Figura 1: Configuração do termociclador. Um exemplo do programa termociclador usado para aumentar a temperatura da amostra em +0,5 °C/min durante a medição da fluorescência SYPRO Orange usando o canal FRET. A recomendação também inclui uma incubação à temperatura ambiente no início e no final do protocolo. Abreviatura: FRET = transferência de energia de ressonância de Förster. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Otimização das concentrações de proteínas e corantes. (A) Resultados representativos da otimização da concentração do corante SYPRO Orange usando 5 μM de Escherichia coli SelO. (B) Resultados representativos da otimização da concentração de E. coli SelO usando o corante 5x SYPRO Orange. A curva de desnaturação térmica representa unidades de fluorescência relativas (eixo y) em relação à temperatura (eixo x). Os resultados representam ± DP médio de poços triplicados (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Curvas de desnaturação térmica e análises ΔT_m de SelO na presença de nucleotídeos e cátions divalentes. (A) Dados brutos das curvas de desnaturação térmica das amostras (5 μM de Escherichia coli SelO na presença de 200 μM de ATP ou UTP e 2 mM de cátions divalentes, 5x SYPRO Orange) exportados da máquina de RT-PCR e plotados. SelO ATP-Mg representa amostras com SelO, ATP e MgCl₂, SelO ATP-Mn representa amostras com SelO, ATP e MnCl₂, SelO UTP-Mg representa amostras com SelO, UTP e MgCl₂, SelO UTP-Mn representa amostras com SelO, UTP e MnCl₂. Observe que os controles sem corante e sem proteína exibem baixa fluorescência. Os resultados representam ± DP médio de poços triplicados (n = 3). (B) Curvas de desnaturação térmica plotadas para a intensidade mais alta e ajustadas à equação sigmoidal de Boltzmann. Embora a desnaturação térmica de SelO não tenha sido afetada pelo UTP, observamos uma mudança acentuada na desnaturação térmica na presença de ATP (curvas roxas). Os resultados representam ± DP médio de poços triplicados (n = 3). (C) Histograma representando os valores de T_m derivados do ajuste sigmoidal de Boltzmann dos dados representados na Figura 3B. Os resultados representam ± DP médio de poços triplicados (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-Mg 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-Mn 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-Mn 39,9 °C ± 0,087. (D) Histograma que descreve a mudança na temperatura de fusão ΔT_m (T_m aditivo_- T_m tampão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar S1: Dados de exemplo para TSA de SelO na presença de metais e nucleotídeos. Planilha de dados brutos exportados da máquina RT-PCR e dados processados para excluir valores após a intensidade máxima de RFU, conforme descrito nas etapas 5.1 e 5.2 do protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O Thermal Shift Assay (TSA) serve como um método eficiente para rastrear interações proteína-ligante, incluindo aquelas com cofatores e inibidores. Neste protocolo, usamos TSA para medir a ligação da pseudoquinase SelO a nucleotídeos e cátions divalentes. Nossos achados mostram que o SelO exibe maior estabilidade térmica na presença de ATP e Mg²⁺/Mn²⁺. Esta observação se alinha com relatórios anteriores indicando que homólogos SelO de E. coli, S. cerevisiae e H. sapiens catalisam a transferência de AMP de ATP para a cadeia lateral hidroxila de substratos proteicos^25,29. Embora o TSA forneça informações valiosas sobre a ligação de nucleotídeos, ele pode não identificar o substrato in vivo. Outras moléculas, não apenas o substrato, também podem influenciar a estabilidade térmica de uma proteína. Para identificar com precisão um substrato, fatores como concentração celular e afinidade de ligação devem ser considerados. No entanto, o TSA é uma excelente ferramenta para rastrear uma grande variedade de condições, como a ligação de pequenas moléculas, usando a estabilização térmica como leitura.

A utilidade do TSA vai além de sua aplicação na análise de ligações de pequenas moléculas a sítios ativos ou reguladores de proteínas. A TSA contribuiu significativamente para a caracterização biofísica das proteínas, fornecendo condições estabilizadoras que tornam a proteína mais propícia aos experimentos de cristalografia. Notavelmente, a TSA oferece várias vantagens, incluindo sua configuração simples e recursos de alto rendimento usando materiais de laboratório comumente disponíveis, como placas de PCR e máquinas de RT-PCR. Essas vantagens permitem o teste de inúmeras condições que podem não ser viáveis ou tão diretas com outras técnicas. Vários estudos usaram TSA para medir a estabilidade térmica de proteínas recombinantes com uma biblioteca de compostos para determinar as condições ideais para a cristalização de proteínas^19,33.

A inclusão de controles apropriados é necessária para evitar interpretações errôneas das curvas de fusão, com a autofluorescência das placas ou aditivos sendo uma preocupação comum. O TSA pode não ser adequado para compostos que exibem autofluorescência ou extinguem a fluorescência da laranja SYPRO. Uma solução potencial é rastrear corantes alternativos descritos em ¹². O protocolo TSA descrito aqui pode ser facilmente adaptado para outras proteínas e aditivos de interesse. Os aditivos não se limitam apenas a compostos solúveis em água, como demonstrado em nosso protocolo com nucleotídeos e cátions divalentes. Em vez disso, os aditivos podem abranger uma ampla gama de condições, como pH variável, ligantes ou medicamentos solubilizados em DMSO⁸. Além disso, a pré-incubação do ligante com a proteína pode fornecer resultados mais reprodutíveis, reduzindo a interferência e os artefatos do corante. Aditivos como lipídios e detergentes podem levar a alta fluorescência devido às suas interações com SYPRO Orange. Um exemplo de uma curva de desnaturação é mostrado na Figura 3A , que mostra baixa fluorescência de fundo emparelhada com um aumento significativo na fluorescência após a desnaturação térmica da proteína. A concentração ideal de corante e proteína produzirá a relação sinal-ruído máxima, mantendo um sinal de fluorescência consistente entre as réplicas.

O TSA oferece a vantagem da simplicidade com seus componentes mínimos, reduzindo assim o número de variáveis para otimização. As etapas críticas incluem a determinação das concentrações ideais do corante e da proteína. É importante observar que o TSA requer proteína purificada e "bem comportada". A proteína e o aditivo devem ser estáveis no tampão nas concentrações utilizadas na TSA. Proteínas ou condições propensas a agregação ou oligomerização podem resultar em leituras de fluorescência errôneas. Proteínas agregadas ou desdobradas podem exibir alta fluorescência inicialmente, com apenas um pequeno aumento após a desnaturação. A oligomerização de proteínas também pode resultar em múltiplos estados de transição, complicando a análise¹⁰. A concentração de proteína pode ser ajustada para evitar a agregação.

O TSA é compatível com uma ampla gama de tampões e sais, permitindo a otimização das condições de estabilização da proteína e do aditivo¹¹. Os volumes das soluções proteicas e aditivas podem ser ajustados para superar as limitações das concentrações de proteínas e aditivos. Por exemplo, concentrações mais baixas de aditivo, como 5x, podem ser usadas em vez da solução 10x usada nos resultados representativos. Notavelmente, a quantidade relativa de proteína e aditivo necessária para realizar o ensaio é baixa, uma vez que as placas de PCR de 384 poços podem acomodar volumes tão baixos quanto 10 μL da amostra total.

Dados os pontos fortes do TSA, é ideal para investigar proteínas pouco estudadas, como pseudoquinases. As pseudoenzimas são proteínas cataliticamente inativas que são estruturalmente homólogas às enzimas ativas³⁴. Estudos estruturais e bioquímicos recentes demonstraram que algumas pseudoenzimas são enzimas ativas^, enquanto a maioria tem funções não catalíticas^35,36. Embora cataliticamente inativas, as pseudoenzimas estão implicadas em várias doenças e desempenham papéis importantes, incluindo andaimes e modulação alostérica³⁷. No entanto, o mecanismo de ação e o significado funcional de muitas pseudoenzimas são desconhecidos. As atividades de algumas pseudoenzimas são reguladas pela ligação do ligante, o que resulta em aumento da estabilidade térmica associada a alterações conformacionais da proteína¹⁴. Propomos que o TSA é uma ferramenta valiosa para examinar a ligação de ligantes a pseudoenzimas para determinar o ligante ideal para a atividade funcional.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Adenosina 5′-trifosfato dissódico sal hidratado	Sigma Aldrich	A2383-10G	usado para resultados representativos, mas não é necessário para realizar TSA
Avanti J-15R com conjunto de suporte de microplacas	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Sistema de PCR em tempo real	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, parede fina, rodapé, transparente/branco	Cloreto de magnésio Bio-Rad	HSP3805
	Sigma Aldrich	M8266-100G	usado para resultados representativos, mas não necessário para executar
cloreto de manganês (II) tetrahidratado	Sigma Aldrich	M3634-500G	usado para resultados representativos, mas não necessário para executar
filme de vedação de placa de PCR TSA Microseal 'B', adesivo, óptico	Bio-Rad	MSB1001
Mancha de gel de proteína laranja SYPRO	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridina 5′-trifosfato sal trissódico hidrato	Sigma Aldrich	U6625-100MG	usado para resultados representativos, mas não é necessário para realizar TSA